（内科学专业论文）ha141联合环磷酰胺调控肺癌小鼠bcl2、bax蛋白表达的研究.pdf

一、摘要 中文论著摘 英文论著摘 二、论文 1 l l 再u 舌 材料与方法 实验结果 讨论 结论 四、本研究创新 五、参考文献 六、附录 综述 致谢 个人简介 b a x 蛋白表达的研究 目的 探讨h a l 4 - 1 联合环磷酰胺对肺癌小鼠b c l - 2 、b a x 蛋白的表达的研究。 方法 建立小鼠肿瘤模型，分为生理盐水组、h a l 4 1 组、环磷酰胺组、h a l 4 1 + 环 磷酰胺组，应用w e s t e r nb l o t 和免疫组化方法检钡u b c l 一2 、b a x 的蛋白表达。 结果 h a l 4 - 1 组、环磷酰胺组、h a l 4 - 1 + 环磷酰胺组较生理盐水组b c l 一2 表达减少、 b a x 表达增加( p 0 0 5 ) ，h a l 4 1 + 环磷酰胺组较单一的h a l 4 1 组或环磷酰胺组 b c l - 2 表达明显减少、b a x 表达明显增加( p o 0 5 ) 。 结论 h a l 4 - 1 可以通过抑$ 1 j b c l - 2 的表达，增j j n b a x 的表达，从而促进肿瘤细胞的凋 亡，同时增加环磷酰胺的抗肿瘤特性。 关键词 h a l 4 1 ：b c l 一2 ：b a x ：w e s t e r nb l o t ：免疫细化 英文论著摘要 h a l 4 1c o m b i n e d t h ee x p r e s o b j e c t i v e t oe x p l o r et h ee f f e c to fh a l 4 - 1c o m b i n e dw i t h c y c l o p h o s p h a m i d e ( c t x ) i nt h e e x p r e s s i o no fb c l 一2 、b a xp r o t e i ni nl u n gc a n c e ro fm i c e m e t h o d s l u n gc a r c i n o m am o d e l s w e r ee s t a b l i s h e d ，w h i c hw e r ed i v i d e di n t of o u r g r o u p s ：n o r m a ls a l i n eg r o u p ，h a l 4 1g r o u p 、c t xg r o u p 、h a l 4 一i + c t xg r o u p w e s t e r nb l o ta n di m m u n o h i s t o c h e m i s t yw e r e a p p l i e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no f b c l 2 、b a x r e s u l t s c o m p a r e dt on o r m a ls a l i n eg r o u p ，b c l - 2p r o t e i ne x p r e s s i o no f h a l 4 1g r o u p 、 c t xg r o u p 、h a14 一l + c t x g r o u pd e c r e a s e d ，t h ee x p r e s s i o no fb a xi n c r e a s e d ( p 0 0 5 ) b c l - 2p r o t e i ne x p r e s s i o no fh a14 - i + c t x g r o u pd e c r e a s e dm a r k l y , b a x p r o t e i ne x p r e s s i o no f h a l 4 一i + c t xi n c r e a s e dm a r k l y ( p 0 0 5 ) ，c o m p a r e dt os i n g l e h a l 4 1o rc t x c o n c l u s i o n h a14 1c a np r o m o t et u m o rc e l l a p o p t o s i sa n de n h a n c et h er o l eo fc t x c h e m o t h e r a p yb yi n h i b i t i n gt h ee x p r e s s i o no fb c l - 2a n di n c r e a s i n gt h ee x p r e s s i o no f b a x k e yw o r d s h a l 4 - 1 ；b c l 一2 ；b a x ；w e s t e mb l o t ；i m m u n o h i s t o c h e m i s t y 论文 h a l4 b a x 蛋白表达的研究 刖舌 细胞凋亡是保持机体稳态的重要因素，凋亡是由一系列细胞因子调控的。 b c l - 2 家族是凋亡的重要调节器，它包括促凋亡和抑凋亡蛋白，对抗着生物学功 能。他们之间的相互作用控制着细胞凋亡信号的传导。抗凋亡家族的成员，包 括b c l - 2 、b c l - x l 、m c l - 1 等，促凋亡家族成员包括b a x ，b a k ，b i d ，b a d 和b i m 乜1 。 抗凋亡b c l - 2 的过度表达不仅造成肿瘤的产生，而且能削弱肿瘤细胞对于化疗药 物或放疗引起细胞死亡的敏感性d 1 。针对抗凋亡b c l - 2 的过度表达，b c l - 2 的小 分子抑制剂代表新一类治疗癌症的药物，h a l 4 1 分子式：2 一乙基一6 氨基一4 一溴 ( 卜氰- 2 - 乙氧一2 表乙) - 4 - 色原烯一3 酸 ，第一个被认为是假定的b c l - 2 的抑制 剂h 1 。临床前研究表明针对抗凋亡h a l 4 一l 已处于临床前阶段作为单一制剂并同 抗肿瘤药物联合应用曙1 。本文就h a l 4 1 的作用方式及联合抗肿瘤药物环磷酰胺 应用于肺癌潜在的治疗价值加以探讨。 材料和方法 一、动物 荷l e w i s 肺癌小鼠2 只，雌性和雄性各1 只，购自上海斯莱克动物研究中心， 许可证号s c x k ( 沪) 2 0 0 7 - 0 0 0 5 。清洁级c 5 7 b l 6 j 小鼠4 0 只，体重1 6 2 0 克， 雌雄各半，4 - 6 周龄，由中国医科大学附属盛京医院动物实验室提供。 二、主要试剂 h a l 4 - 1 购自瑞士a l e x i a 公司，环磷酰胺( c y c l o p h o s p h a m i d e ，c t x ) 购自江苏 瑞恒医药股份有限公司，d m s o ( 二甲基亚砜) 购自美国s i g m a 公司，兔抗鼠b c l 一2 多克隆抗体、兔抗鼠b a x 多克隆抗体、山羊抗兔辣根过氧化酶标记的二抗购自 s a n t a 试剂公司，兔抗鼠b c l 一2 单克隆抗体、兔抗鼠b a x 单克隆抗体购自b i o w o r l d 试剂公司，r i p a 裂解液、 w a l t e r s o n 试剂公司。 三、实验步骤 1 、模型制备 取l e w i s 荷瘤小鼠，脱颈处死，分离瘤体，取生长良好、无坏死的肿瘤组织，置入 盛有生理盐水的培养皿中研磨，用眼科剪及镊子去除纤维结缔组织及坏死组织， 剪成大小约1 - 2 m m 3 组织块备用。用穿刺针吸取组织块接种于小鼠右腋皮下。 2 、动物分组及处理 将已成功接种l e w i s 肺癌成瘤( 成瘤率1 0 0 ) 的c 5 7 b l 6 d 、鼠随机分成4 组， 设生理盐水组，环磷酰胺组( 2 0 m g k g ) ，h a l 4 一l 组( 2 5 m g k g ) ，h a l 4 1 ( 2 5 m g k g ) + 环磷酰胺( 2 0 m g k g ) 组。h a l 4 - 1 经鼠尾静脉注射给药，c t x 经腹腔注射给药， 连续7 天，第2 2 天处死所有小鼠。小鼠处死后立即完整剥离出肿瘤组织。 3 、w e s t e r nb l o t 将肿瘤组织样品提取蛋白并应用b c a 方法检测蛋白浓度，取蛋白5 0 u g 利用 t f i s 甘氨酸s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) ，1 2 分离胶和6 浓缩胶。 电泳完成后，利用湿转将蛋白质转移到p v d f 膜。5 的脱脂奶粉的t b s t 封闭 p v d f 膜，加一抗( 1 ：1 0 0 0 ) ，4 度过夜，加h r p 标记的二抗，室温孵育2 小 时。e c l 化学发光试剂于暗室中显影并感光胶片，用p - a c t i n 作为内参。q u a n t i t y o n e 软件分析条带灰度值。 4 、免疫组织化学染色 按照免疫组化试剂盒说明书操作，抗鼠b c l 2 多抗1 ：2 0 0 ，抗鼠b a x 多抗 1 ：2 0 0 。结果判定：以已知阳性组织切片作为阳性对照，p b s 液代替一抗作为每 次染色的阴性对照。以细胞膜或细胞浆内出现棕黄色颗粒，染色强度高于背景非 特异性染色者为阳性细胞。高倍镜下取5 个不同视野各计数1 0 0 0 个细胞，用免疫 组化软件测其积分光密度值并取其均值。 5 、统计学方法 4 h a l 4 1 组、环磷酰胺组，h a l 4 1 + 环磷酰胺组b c l 2 p a c t i n 显影灰度比较 生理盐水组低，而h a l 4 1 + 环磷酰胺组较单一的h a l 4 1 组、环磷酰胺组比值更 低( p o 0 5 ) ；h a l 4 1 组、环磷酰胺组，h a l 4 1 + 环磷酰胺组b a x p - a c t i n 显影灰度 比较生理盐水组高，h a l 4 1 + 环磷酰胺较单一的h a l 4 1 或环磷酰胺比值更高 ( p o 0 5 ) ( 图2 、图3 ) 。 a ：h a l 4 1 + 环磷酰胺组；b ：h a l 4 1 组；c ：环磷酰胺组；d ：生理盐水组 arcd b a x b c l 2 1 3 - a c t i n 图1 ，各组b a x 、b c l 一2 、1 3 一a c t i n 蛋白的表达水平 厘五五互五磊胺- h a l 4 1 _ 环磷酰胺! 薹羽 图2 ，b c l 2 d - a c t i n 的显影灰度值 4 2 1 8 6 4 2 o l l o o 0 0 ( p 0 0 5 ) ( 图4 ) ；b a x ：h a l 4 一l 组、环磷酰胺组、h a l 4 1 + 环磷酰胺组较生理盐水组表达增加( p 0 0 5 ) ，h a l 4 1 + 环磷酰胺组较单一h a l 4 1 或环磷酰胺表达增加( p o 0 5 ) ，h a l 4 1 较环磷酰胺组 表达增加( p 0 0 5 ) ( 图5 ) 。 表l ，比较各组b c l - 2 、b a x 积分光密度值的平均值 组别 b c l 一2 b a x 生理盐水 2 5 0 2 0 4 0 9 5 9 0 4 5 环磷酰胺 1 9 4 6 1 7 4 a 2 3 5 7 o 4 9 h a l 4 一l 1 5 3 5 0 6 9 2 8 6 7 o 8 0 # h a l 4 1 + 环磷酰胺 i 0 2 8 1 3 1 # 木 3 6 5 2 1 4 6 # 木 与生理盐水比较，p 0 0 5 ；与环磷酰胺比较，# p 0 0 5 ；与h a l 4 1 组比较， 水p o 0 5 ) ，增加b a x 的表 达( p 0 0 5 ) ，那么能否说明h a l 4 1 可以作为一种新的抗癌药物单独应用，还是 仅仅作为一线抗癌药物的增敏剂呢? 各种意见不，但是明确的是联合应用较单 独应用会明显促进细胞凋亡。本文探讨了h a l 4 - 1 单独及联合环磷酰胺对小鼠 b c l - 2 、b a x 的影响，为h a l 4 1 及合并化疗药物应用于临床创造条件。 结论 h m 4 - 1 可以通过抑$ l j b c l - 2 的表达，增2 h b a x 的表达，从而促进肿瘤细胞的凋 亡，同时增加环磷酰胺的抗肿瘤特性。 9 本研究创新性的自我评价 1 虽有报道h a l 4 1 可诱导白血病细胞h l 6 0 凋亡，但国i 为# l - 尚未见报道 h a l 4 1 对肺癌肿瘤细胞的影响。 2 根据小分子配体的特性，h a l 4 1 是一种可渗透入细胞的非肽类小分子化 合物，采用以体外实验的方式，观察其对肿瘤细胞的作用。 1 0 2 参考文献 t a n gy ，z h a n gd y ，w u ) 瑚p r o g r e s si ns m a l l - m o l e c u l ei n h i b i t o r so fb c l 一2f a m i l y p r o t ei n s y a ox u ex u eb a o 2 0 0 8j u l ：4 3 ( 7 ) ：6 6 9 7 7 y a m a g u c h i h ，p a r a n a w i t h a n a s r ，l e e m w ，e t a l e p o t h il o n e b a n a l o g u e ( b m s 一2 4 7 5 5 0 ) 一m e d i a t e dc y t o t o x i c i t yt h r o u g hi n d u c t i o no fb a xc o n f o r m a t i o n a lc h a n g ei nh u m a nb r e a s t c a n c e rc e i l s c a n c e rr e s 2 0 0 2j a n1 5 ：6 2 ( 2 ) ：4 6 6 7 1 s k o m m e rj ，w l o d k o w i cd ，m a t t 5m ，e ta 1 h a l 4 1 ，as m a l lm o l e c u l eb c l 一2a n t a g o n i s t ， i n d u c e sa p o p t o s i sa n dm o d u l a t e sa c t i o no fs e l e c t e d a n t i c a n c e rd r u g s i n f o l l i c u l a rl y m p h o m abc e l l s l e u kr e s 2 0 0 6m a r ；3 0 ( 3 ) ：3 2 2 3 1 e p u b2 0 0 5o c t6 4 w a n gj l ，l i ud ，z h a n gz j ，e ta 1 s t r u c t u r e b a s e dd is c o v e r y o fa no r g a n icc o m p o u n d t h a tb i n d sb c l - 2p r o t e i na n di n d u c e sa p o p t o s i so ft u m o rc e l l s p r o cn a t la c a d s c iusa2 0 0 0 ：9 7 ：7 1 2 4 5 k a n gl m r e y n o l d sc p b c l 一2i n h i b i t o r s ：t a r g e t i n gm i t o c h o n d r i a la p o p t o t i c p a t h w a y si nc a n c e rt h e r a p y c l i nc a n c e rr e s 2 0 0 9f e b1 5 ：1 5 ( 4 ) ：1 1 2 6 3 2 6 h u r w it zj l ，m c c o yf ，s c u ll i np ，e ta 1 n e wa d v a n c e si nt h es e c o n d li n et r e a t m e n t o fs m a l lc e l ll u n gc a n c e r o n c o l o g i s t 2 0 0 9o c t ：1 4 ( 1 0 ) ：9 8 6 9 4 7m a n i o nm k ，h o c k e nb e r yd m t a r g e t i n gb c l 一2 一r e l a t e dp r o t e i n si nc a n c e rt h e r a p y c a n c e rb i o lt h e r 2 0 0 3j u 卜a u g ；2 ( 4s u p p l1 ) ：s 1 0 5 1 4 8c h e ny ，s a t om ，f u j i m u r as ，e ta 1 t h ee x p r e s s i o no fb c l 一2 、b a xa n dp 5 3p r o t e i n s i nc a r c i n o g e n e s i so fs q u a m o u sc e l ll u n gc a n c e r a n t i c a n c e rr e s ，1 9 9 9 ，1 9 ( 2 b ) ： 1 3 5 1 - 1 3 5 6 9b r a m b i l l ae ，g a z z e r is ，l a n tu e j o u ls ，e ta 1 p 5 3 m u t a n ti m m u n o p h e n o t y p ea n d d e r e g u l a t i o no fp 5 3t r a n s c i p t i o np a t h w a y ( b c l 一2 ，b a x 、a n dw a f l ) i np r e c u r s o r b r o n c h i a ll e s i o n so fl u n gc a n c e r c l i n c a n c e rr e s ，1 9 9 8 ，4 ( 7 ) ：1 6 0 9 1 6 1 8 1 0p e ix y ，d a iy ，g r a n ts t h es m a l l l o l e c u l eb c l 一2i n h i b i t o rh a l 4 1i n t e r a c t s s y n e r g i s t i c a l l yw i t hf l a v o p i r i d o lt oi n d u c em i t o c h o n d r i a li n j u r ya n da p o p t o s i s i nh u m a nm y e l o m ac e l l st h r o u 【g haf r e er a d i c a l d e p e n d e n ta n dj u nn h 2 一t e r m i n a l k i n a s e d e p e n d e n tm e c h a n i s m m o lc a n c e rt h e r 2 0 0 4d e c ：3 ( 1 2 ) ：1 5 1 3 2 4 1 1 谭明旗，边明艳h a l 4 1 对环磷酰胺治疗小鼠l e w i s 肺癌增敏作用的实验研究中国医科 “ 1 2 综述 肺癌治疗的新进展 引言 肺癌是癌症相关死亡的首要原因，小细胞组织来源的占1 5 至2 0 ，最初小 细胞肺癌是一化疗敏感的疾病。但是复发常见，而且这组病人由于预后较差仍然 是一个快速致死的疾病。对于复发型的小细胞肺癌的患者来说二线化疗药物对于 肿瘤学家来说仍然是比较棘手。至今尚无证据证明获得最佳支持。在这篇文章中 我们回顾了二线化疗药物的应用及新的药物和靶向治疗。尤其我们发现了b c l 一2 蛋白家族，它是线粒体凋亡的重要调节器，并且参与到抗癌治疗中。8 0 的小细 胞肺癌过度表达b c l 一2 家族成员，许多b c l 一2 抑制剂，正在进入临床阶段，对于 复发情况是一个很好的药物研究领域。 肺癌在世界范围内是最常见的肿瘤，每年有很多新发病例，它是癌症相关死 亡的主要原因。小细胞肺癌占肺癌的1 5 - 2 0 ，生存率特别差，不经治疗生存期 仅2 - 4 个月。在所有癌症中，小细胞肺癌取决于疾病阶段，分为原位癌和转移癌 【1 小细胞肺癌是一个全身性疾病，因为基本无法行手术治疗，所以首选化疗药 物。在一线治疗中是以铂为基础的。最常见的是顺铂、依托泊苷旺1 ，依托泊苷被 证明优于环磷酰胺、表柔比星和长春新碱，显著提高2 - 5 年的生存率，卡铂是一 个可以替代顺铂，相比之下更有效率和毒性的药物1 ，试验中三种、四种药物疗 法，剂量强化疗程、第三代抗癌药物和高剂量化疗都无法改善这种结果n 1 。尽管 在小细胞治疗方面取得新的进展，但是在提高生存率方面进展仍较小，预后仍然 很差，原位癌生存率提高1 0 ，转移癌提高2 畸1 。这说明一个事实，尽管小细胞 肺癌是对化疗敏感的，但是对治疗的抵抗仍然是一主要问题。治疗后病人5 年复 发率仍然很常见。根据对一线治疗的反应，二线治疗的效果可被预测，在那些患 有“敏感疾病”的患者中，也就是那些完成一线治疗后超过6 0 天或9 0 天未复发 的患者，被认为可以通过二线治疗获得最大收获。“难治型 意思是指那些在6 0 天或者9 0 天病情进展的患者。“抵抗型”指那些对一线治疗无反应或复发的患者。 在复发过程中体力状态和重量减轻是与较差预后相关的。现根据特异的神经内分 泌标志物将小细胞肺癌分为两个亚型，“经典和变异型”。有报道说这种差异可能 与临床相关】。小细胞肺癌患者预后仍然很差，我们相信在细胞毒性的二线治疗 条件下，生存率能够提高。近年来我们研究新的药物和靶向治疗。其包括抗血管 生成剂、生长因子受体抑制剂、抑制下游信号传导途径，b c l 一2 家族抑制剂。相 对于其他，b c l - 2 家族抑制剂更有前景，是新兴的凋亡促进剂，化疗药物包括铂， 证明通过线粒体途径诱导凋亡进而发挥细胞毒作用。因此细胞凋亡不仅是癌症的 标志，而且是化疗药物失败的重要机制口1 。线粒体凋亡途径通过b c l 一2 家族蛋白 的相互作用调控。这组蛋白共享一个或多个b h 结构域，基于它们结构和功能的 特点分为3 组，b a x 和b a k 是促凋亡成员包括b h i 一3 ，参与化疗有关的死亡。别的 促凋亡成员只有b h 3 结构域，因此被称为单一b h 3 蛋白( 如b i d 、b i m 、b a d 、n o x a 、 p u m a ) ，和抗凋亡成员有四个b h 结构域? ( 如b c l 一2 ，b c l x l ，b c l w ，m c l 一1 ，a 1 ) 。 这些蛋白相互作用和引起细胞凋亡的方式仍存在争议，但是众所周知，一旦 激活，b a x 和b a k 经历构向改变，深插入线粒体外膜发生低聚反应。这些引起线 粒体膜通透性改变，进而使促凋亡蛋白释放，激活下游半胱氨酸蛋白酶，引起细 胞死亡1 在小细胞肺癌中，8 0 的患者高表达b c l 一2 1 9 1 小细胞肺癌的化疗耐药性 中b c l - 2 已经被萨特罩厄斯等人强调n0 。，他们证明在体外产生化疗耐药细胞 b c l - 2 表达上调。b c l - 2 的过度表达细胞株更容易差生化疗耐药。抑制b c l 一2 的 表达能够产生化疗敏感。 目前为止，已发现3 种b c l - 2 抑制剂：b c l 一2 反义寡核苷酸、b c l 一2 结合肽、 b c l - 2 小分子非肽类抑制剂，前两者在应用上存在一定局限性，寡核苷酸不能通 过血脑屏障，缺乏酶稳定性，细胞膜渗透性和口服活性差，加上基因治疗的诸多 问题和花费昂贵，限制了反义寡核苷酸的应用，结合肽与b c l 一2 蛋白的结合缺乏 特异性，加之肽类分子的弱膜通透性，在细胞内很难达到b c l 一2 的靶标。b c l 一2 小分子非肽类制剂作为一种新型药物阻断b c l 一2 的凋亡抑制作用将为肿瘤的防 治提供新的思路。 1 4 参考文献 r o s t ig ，b e v i l a c q u ag ，b i d o l ipe ta 1 s m a l lc e l ll u n gc a n c e r a n no n c o l 2 0 0 6 ：1 7 ( s u p p l2 ) ：i i 5 一i i l o 2s u n d s t r e ms ，b r e m n e sr m ，k a a s ase ta 1 c i s p l a t i na n de t o p o s i d er e g i m e ni s 3 s u p e r i o rt oc y c l o p h o s p h a m i d e ，e p i r u b i c i n ，a n dv i n c r i s t i n er e g i m e ni ns m a l l c e l l l u n gc a n c e r ：r e s u l t sf r o mar a n d o m i z e dp h a s ei i it r i a lw i t h5y e a r s f o l l o w u p jc l i no n c o l2 0 0 2 ：2 0 ：4 6 6 5 4 6 7 2 k o s m i d i sp a ，s a m a n t a se ，f o u n t z i l a sge ta 1 c i s p l a t i n e t o p o s i d ev e r s u s c a r b o p l a t i n e t o p o s i d ec h e m o t h e r a p ya n di r r a d i a t i o ni ns m a l lc e l ll u n gc a n c e r ： ar a n d o m i z e dp h a s ei i is t u d y h e l l e n i cc o o p e r a t i v eo n c o l o g yg r o u pf o rl u n g c a n c e rt r i a l s s e m i no n c o l1 9 9 4 ：2 1 ( s u p p l6 ) ：2 3 3 0 4f e r r a l d e s c h ir ，b a k as ，j y o t ibe ta 1 m o d e r nm a n a g e m e n to fs m a l l c e l ll u n g 6 c a n c e r d r u g s2 0 0 7 ：6 7 ：2 1 3 5 2 1 5 2 n a v a d as ，l a ip ，s c h w a r t zae ta 1 t e m p o r a lt r e n d si ns m a l lc e l ll u n gc a n c e r ： a n a l y s i so ft h en a t i o n a ls u r v e i l l a n c e ，e p i d e m i o l o g ya n de n dr e s u l t s ( s e e r ) d a t a b a