（测试计量技术及仪器专业论文）基于mems技术的pcr生物芯片的研究.pdf

摘要 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，简称p c r ) 技术是发展很快、应用 很广的体外扩增基因片断技术，在生命科学研究及诸多相关领域已经得到了广泛应用。 集成化的p c r 生物芯片使得该项技术应用更加方便快捷、高效可靠、降低成本。 本文的工作是利用m b m s 技术在单晶硅上制作集成p c r 芯片。首先，利用氧化工艺和 l p c v d 技术，生长s i o 。掩膜层和s i n 绝缘层，以提高反应腔的热效率，保证扩增反应的 顺利进行：其次，用湿法腐蚀和干法刻蚀相结合的方法加工微型腔体，使之作为d n a 样 品进行p c r 扩增反应的容器；第三，用溅射、光刻等工艺在微型腔体底部制作微型加热 器和温度传感器，实现对反应腔体的加热及其温度的精确测量，提供p c r 扩增反应所需 的温度条件。第四，设计温度控制系统，保证p c r 反应的顺利进行。 经过不断地分析实验结果，改进制作方法，最终探索出了较好的工艺条件，制备出 了较理想的微型腔体、镍薄膜电阻温度传感器和镍铬合金薄膜电阻加热器，能提供和检 测p c r 扩增反应所需的温度，并实现了三温区的循环控制。本文的结果为今后进一步的 研究工作打下了良好的基础。 关键词：p c r ：m e m $ ；微制作：生物芯片：微全分析系统 a b s tr a c t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o ni sar a p i d l yd e v e l o p i n ga n dw i d e l yu s e dd n a a m p i f i c a t i o nt e c h n i q u e ，w h i c hi sw i d e l ya p p l i e di n l i f es c i e n c ea n do t h e r r e l a t e df i e l d s 。t h eu s a g eo fi n t e g r a t e dp c rb i o c h i pm a k e sp c rt e c h n o l o g ym o r e c o n v e n i e n t 、h i g h e f f i c i e n c y 、r e l i a b l e 、d e c r e a s e dc o s ti nm a n u f a c t u r e 。 t h ew o r kd e s c r i b e di nt h i sp a p e ri st ou s em e m st e c h n o l o g yt op r o d u c ep c r m i c r o c h i po ns i l i c o n 。t h ew o r km a i n l yc o n s i s t so ff o u rp a r t s ：t h ef i r s tp a r t i st ou s eo x i d a t i o na n dl p c v dt e c h n i q u et op r o d u c es i 0 2m a s k f i l ma n ds il n l i n s u l a t i o nf i i mi no r d e rt oe n h a n c et h eh e a t i n ge f f i c i e n c yo fm i c r oc h a m b e r ， a n dg u a r a n t e et h ec a r r yo u to ft h er e a c t i o n 。t h es e c o n dp a r ti st ouset h e c o m b i n a t i o no fd r ye t c h i n ga n dw e te t c h i n gt op r o d u c er e a c t i o nm i c r oc h a m b e r ， i t i st h ec o n t a i n e rw h i c hc a r r yo u tt h ep c rr e a c t i o n ，a n dd n as a m p l ec a r r yo u t a m p l i f i c a t i o nr e a c t i o nh e r e 。t h et h i r dp a r ti st ou s et h es p u t t e r i n g 、 p h o t o l i t h o g r a p h yt op r o d u c eh e a t e r sa n dt e m p e r a t u r es e n s o r sw h i c hh e a tt h e r e a c t i o nm i c r oc h a m b e ra n dp r o v i d et h et e m p e r a t u r ec o n d i t i o nf o r t h e p c r r e a c t i o n 。t h ef o u r t hp a r ti st e m p e r a t u r ec o n t r o ls y s t e mw h i c he n s u r et h ep c r r e a c t i o np e r f o r m i n ga c c u r a t e l y 。 a f t e ra n a l y s i so ft h ee x p e r i m e n tr e s u l ta n do p t i m i z a t i o no ft e c h n i c s ，w e f i n a l l yc o m eu pw i t hr e l a t i v e l yi d e a lt e c h n i c ss i t u a t i o na n dp r o d u c er e l a t i v e l y i d e a lm i c r oc h a m b e r 、n it e m p e r a t u r es e n s o r sa n dn i c rh e a t e r s 。w h i c hcanp r o v i d e a n dt e s tt h et e m p e r a t u r ec o n d i t i o nf o rp c ra m p l i f i c a t i o n 。t h er e s u l to ft h i s e x p e r i m e n tl a y sas o l i df o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rr e s e a r c h 。 k e y w o r d ：p c r ；m k m $ ：邢i c r o f a b r i c a t i o n ：b i o c h i p ；p - t a s 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 0 前言 1 9 8 5 年，美国c e t u s 公司的k b m u l l i s 和r k s a i k i 等人发明了pcr ( 聚合酶 链式反应) 扩增技术。这项技术问世不久，便以其简便、快速、高效等特点迅速成为 分子生物学研究的基本技术和有力工具，并成为d n a 实验室不可缺少的组成部分，在 医学和生物学中得到了广泛应用，被誉为最近几年在分子生物学领域最具有革命性的技 术突破。 微机电系统( m i c r oe 1 e c t r o n i cm e c h a n i c a ls y s t e m ，m e m s ) 技术则是近十多年才发 展起来的把微执行器、微传感器、集成电路等集成于一体的高新技术。基于m e m s 技术 发展起来的微全分析系统( m i c f ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ，卜t a s ) 是最近十年才迅速 发展起来的一门崭新的微生化分析系统，国外也有人称这种微分析系统为芯片实验室 ( l a bo nac h i p ) 。这种微芯片是采用m e m s 技术在硅片、玻璃或塑料材料上制造出微驱 动泵、微控制阀、通道网络、样品处理器、混合池、扩增器、反应器、分离器以及检测 器等元器件，能实现微升、纳升级样品的进样、稀释、加试剂、混合、扩增、反应、分 离、检测以及后处理等分析全过程，从而把传统的整个分析实验室的功能微缩到一个小 芯片上。因此，m e m s 技术所具有的高精度、多功能集成、小型低功耗、坚固耐用和批量 制造等特点在此得到充分发挥。目前，芯片实验室已经成为分析仪器发展的重要方向与 学科前沿。 传统上把在数平方厘米大小的硅片等材料上加工出的应用于生化分析的芯片称为生 物芯片( b i o c h i p ) 。生物芯片是微全分析系统的核心，是当前的研究热点之。p c r 生 物芯片就是生物芯片的一个重要组成部分，可以在该芯片上实现p e r 扩增反应。 本课题源于国家自然基金项目，主要是利用m e m s 技术在 1 0 0 晶向的n 型单晶硅上 设计和制作单反应区集成p c r 生物芯片，并对它的性能进行分析，为进一步研制三反应 区集成p c r 芯片打好基础。本文的工作在大连理工大学微系统研究中心完成。 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 1 绪论 1 1 生物芯片 生物芯片是继2 0 世纪5 0 年代半导体芯片后，微芯片技术的又一重大发展。生物芯 片上的高通量生物信息及其广泛的应用范围受到了越来越多的科学家、投资商和政府的 重视，并以极快的速度发展。 生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系 统，能实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。 基因芯片是最重要的一种生物芯片，集成在芯片上的成千上万个网络状密集排列的基因 探针，能够在同一时间内分析大量的基因，使人们可以迅速地读取生命的篇章，准确高 效地破译遗传密码。这将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革 命。 生物芯片的主要优点包括：( 1 ) 采用了平面微细加工技术，可实现大批量生产，通过 提高集成度，降低单个芯片的成本。( 2 ) 可组装大量的( 1 0 1 0 5 种) 生物分子探针，获 取信息量大，效率高，特别适合于基因信息的采集。( 3 ) 结合m e m s 技术，可把生物样品 的预处理、基因物质的提取、扩增、以及杂交后的信息检测等集成为芯片实验室，制备 成微型、全自动化、无污染、可用于微量试样检测的高度集成的智能化生物芯片。 随着微型化的发展，许多实验设备都可以变为便携式可掌上操作的仪器，已经有不 少研究人员试图将整个生化检测分析过程缩微到一个芯片上，形成所谓的“芯片实验室 ( l a b o n c h i p ) ”。“芯片实验室”包括通过微细加工工艺制作的微过滤器、微反应器、 微泵、微阀门、微电极等，能够实现对生物样品从制各、生化反应、到检测和分析的全 过程，从而极大地缩短了检测和分析时间，节省了实验材料。 生物芯片实验室包括生物分子信息检测所必需的所有步骤”，其组成如图1 1 所示。 ( 1 ) 样品制备，即生物分子( 包括基因、蛋白质等) 的分离提取。依据微流体( m i c r o f l u i d s ) 理论，在硅、玻璃上刻出微滤栅、微通道等，用微泵、微阔等微控制技术控制芯片内的 流体，从而实现靶细胞的分离、破碎和蛋白质、基因的分离提取。( 2 ) 对于基因，有时 有必要进行d n a ( r n a ) 的扩增，在芯片的微反应池中进行p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 或l c r ( l i g a s ec h a i nr e a c t i o n ) 扩增反应。( 3 ) 对处理过的生物分子进行分析测定。 利用毛细管电泳法或杂交分析法进行检测。根据检测方法的不同，生物芯片被分为两类， 即毛细管电泳型生物芯片和d n a 探针阵列型生物芯片。当然，也可以将以上所说的三个 步骤分别集成为不同用途的生物芯片，所以据此可将生物芯片分为不同的类型1 “。例如 用于样品制备的生物芯片、生化反应生物芯片及各种检测用生物芯片等。 在m e m s 的发展中，出现了一个新概念，微型全分析系统，它是指用m e m s 技术实现 的生化分析微缩系统，包括样品的注入、析取、浓缩、反应、分离、检测等分析步骤， 被广泛应用于医疗诊断、生物工程、化学分析控制等领域。仪器的微型化所带来的优点 是显著的降低了制造成本，易于运输和搬运，节省了人力、空间、资源、试剂等的消耗， 使得整个实验操作简单高效。极少的试剂、很小的能量消耗、便携式的芯片都使得实验 可以方便的进行，如同p c 机一样，在办公桌、膝上就可以时时处处进行检测。其变革 就如同从第一台笨重庞大的计算机，变革到今天的笔记本电脑一样。 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 图1 1 生物芯片的流程框图 1 2 聚合酶链式反应( p c r ) 1 9 8 5 年美国c e t u s 公司的k b m u l l i s 和r ，k s a i k i 等人”1 发明了一种特异性d n a 体外扩增技术。这种技术的实质是体外酶促合成特异性的d n a 片断，即无细胞分子克隆 系统，这一技术称为p c r 。它是一种体外特定核酸序列扩增技术，在很大程度上代替了 传统的d n a 克隆方法，利用该技术能够从复杂的d n a 分子群体中选择性地复制一段特 异的序列，使某一d n a 片段得到特异性的扩增。 p c r 扩增反应是在模板d n a 、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于d n a 聚合酶 的酶促合成反应，经过双链d n a 的高温变性、引物与模板的低温退火、适温条件下的引 物延伸这三个步聚的反复循环，实现特定d n a 序列产量随着循环次数呈指数级关系扩增， 达到迅速大量扩增模板d n a 的目的。其中每一循环所合成的新链又都可以作为下一个循 环的模板，参与到下一次扩增反应中。p c r 整个反应只需经过几个简单的温度变换即可 在短时间内于试管内完成，目前国内外已有多种较大型的p c r 扩增仪，可自动完成p c r 扩增反应的整个反应过程。 p c r 技术是分子生物学发展史上的一个重要里程碑，它使得d n a 分子可以在生物体 外进行放大扩增，实现扩增反应的自动化、快速、灵敏。一经问世，便以其简便、快速、 高效等特点迅速成为分子生物学研究的基本技术和有力工具，并成为d n a 实验室不可缺 少的组成部分。在医学、法学、生物化学等领域得到了广泛应用，具有广阔的发展前景， 被誉为最近几年分子生物学领域中具有革命性的技术突破。 。 在生物分析实验中，d n a 样品通常只有很低的浓度，不能进行任何的直接测试或试 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 验。因此，必须进行化学放大扩增，以增加d n a 样品的浓度。p c r 扩增反应由一系列的 反应组成，使d n a 分子或碎片得到复制，这样不断的循环，直到d n a 分子的数量足以被 用于试验。 第一步r y9 2 9 4 摸板解链 第二步 第三步 ，丁矿 啕 ；| ：t r 蓐砖r d 硝 扩增产物的鉴定 图1 2 聚合酶链式反应示意图 f i 9 1 2s c h e m a t i cd r a w i n go fp c r 3 7 5 5 s l 物遇火 嚣_ 戮盏黧 图1 2 给出了p c r 扩增反应的一个周期”3 。首先在9 5 。c 的高温下加热具有双链结构 的样品d n a ，双链间的氢键会断裂，双链d n a 热分解成两条单链的分子，这一过程称为 高温变性。然后，迅速把温度降低到5 5 ，在这个温度下，单链d n a 与引物按碱基配 对的原则互补结合，这一过程称为退火。最后，把温度升高到7 2 。c 进行d n a 的延伸反应， 在聚合酶以及镁离子等存在的条件下，从引物的3 端开始结合单核苷酸，进而形成与 模板d n a 互补的新的双链d n a 。 为了能够有效地进行d n a 扩增，p c r 扩增反应系统必须满足以下几点基本要求：( 1 ) 热均匀性；( 2 ) 温度控制的精确性：( 3 ) 重复性；( 4 ) 加热和冷却的迅速性；( 5 ) 可靠 性；( 6 ) 试验和操作的综合成本低；( 7 ) 物理尺寸合适。另外，还有扩增反应器的自动 化程度及多功能等方面的要求。根据上述要求，用传统的p c r 扩增反应器设计方法很难 做到小型化、微型化，必须进行革命性的变革。利用在同一时期得到迅猛发展的m e 磁s 技术能够达到这一要求，因此， f e m s 技术与p c r 技术的结合就成为历史的必然。 1 3 微结构p c r 芯片技术的发展 发展微型结构的p e r 扩增反应器是必要的也是可行的，目前国内外在这一方面已经 进行了很多的研究，并已经取得了一定的成果。就目前来说，p c r 生物芯片主要分为以 4 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 下几种： 第一种是连续流动的p c r 芯片”1 。根据p c r 放大扩增的原理，一次循环的三个阶段 是在三个不同的温度下进行的。通常的做法是将d n a 样品装在试管或毛细管、载玻片上 进行加热和冷却。而流动式的p c r 扩增芯片设计类似于电子器件中的放大器，可以设计 成一个模块芯片，当d n a 样品从芯片的入口端不断注入，输出的产物即为d n a 的扩增产 反应z 物 变j 生区 延伸区 遇火区 图1 3 连续流动p c r 芯片结构图 f i 9 1 3c o n c e p t i v ev i e wo ff l o w t h r o u g hp c rc h a n n e l 物。该芯片主要有温度控制稳定的三个恒温带组成，它们的温度分别控制在9 5 ，6 0 和7 7 。样品通过在刻蚀在衬底上的通道内的流动实现温度循环。通道的设计应保证 样品在三个不同的温区通过，达到高温变性、低温退火和中温延伸的目的。而在不同温 度区的反应对间则是由不同温区内的通道长度和样品流动速度来决定。图1 3 ”1 所示的 就是一个连续流动p c r 扩增芯片。连续流动式p c r 扩增芯片的特点是：它是一个通过时 间和空间转换而实现p c r 扩增反应的器件。反应速度取决于样品泵入的速度，而在每一 个温度区中停留的时间则决定于设计的路径长度。最快的加热和冷却转换时间小于i 0 0 ms ，2 0 个循环所需时间约为9 0s 到1 8 7 m i n 。 第二种是硅微井结构p c r 芯片“”。传统p c r 扩增反应器的主要缺点就是体积大， 因而所需样品量多，热容量也大，降低了反应效率。利用m e m s 技术加工加热系统和反 应池，能够有效地改进上述不足。利用各向异性刻蚀方法在硅片上刻出的微井腔做为反 应池，反应池的底部是一层很薄的氮化硅薄膜，在薄膜上利用多晶硅掺杂或金属制作加 热器。这种结构基本上与许多硅微机械压力传感器相似。反应池的顶部用硼硅玻璃进行 键合，使得扩增反应在一个密闭环境中进行。另外，由于玻璃有很好的可视性，可以很 方便的实现对扩增反应的实时检测和分析。硅微井结构p c r 扩增芯片的特点是：利用 m e m s 技术使传统p c r 扩增器微型化，工艺简单，成本低，一致性好，可以大规模生产， 符合p c r 设计的要求。与连续流动型p c r 扩增芯片相比，体积更小，热循环次数不受限 制。图i 4 是一个完整的带有注入d n a 样品的硅微井结构p c r 芯片结构示意图。 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 图1 4 注入d n a 样品的p c r 芯片示意图 f i 9 1 4s c h e m a t i cd r a w i n go ft h ed n as a m p l ef i l l e d m i c r op c rc h i pw i t hah e a ts o u r c e 第三种是阵列型p c r 芯片“。硅微井结构p c r 扩增芯片的最大优点是可以制作成微 并阵列，阵列型芯片是在硅片或玻璃基片上刻蚀出整齐排列的微井型反应室，例如2 0 1 0 个反应室，具有同常规p c r 循环仪一样的平行扩增d n a 的功能。这样的芯片可以在 基因测序等方面发挥作用，降低成本，提高效率。在医学诊断应用方面可根据检测对象 的不同而设计不同阵列的芯片。 1 ，4p g r 与c e 集成芯片 早在1 0 0 多年以前，人们就开始对毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ，缩写 为c e ) 技术进行研究，电泳的实质就是荷电离子在电场作用下做定向泳动。2 0 世纪中期 以后，电泳作为一种分离技术得到了快速发展，并与离心法、色谱法一起，成为研究生 物大分子的有效方法，在生物化学技术的发展中起到了重要作用。但是，传统的电泳技 术由于受焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长、效率低，使 分离受到严重限制。2 0 世纪8 0 年代初，高效毛细管电泳( h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ，缩写为h p c e ) 的出现，使电泳技术产生了一场深刻的变化。与传统 电泳技术相比，它具有分离效率高( 理论塔板数已达1 0 6 】0 。m ) 、分析速度快( 多数 、等离子体增强化学汽相淀积( p e c v d ) 、光致化学汽相淀积( p h o t o c v d ) 等。 2 6 蒸发与溅射 在半导体器件生产中，常用真空蒸发与溅射的方法在硅片表面淀积金属薄膜，以制 备芯片内的欧姆接触电极。为了满足半导体器件对金属材料的良好欧姆接触、低电阻连 接及稳定性、可靠性的要求，所用的金属材料必须满足以下几点要求：第一，有良好的 导电性能：第二，容易与p 型和n 型硅形成良好的欧姆接触：第三，与硅和二氧化硅粘 附性好，且不发生有害的反应；第四，能用蒸发或溅射的方法淀积成薄膜；第五，易于 进行光刻；第六，便于进行超声键合或热压键合。 金属层淀积工艺主要有两种，即真空蒸发方法和溅射技术。 1 ) 真空蒸发方法是在真空室中，把所要蒸发的金属加热到相当高的温度，使其原子 或分子获得足够高的能量，脱离金属表面束缚而蒸发到真空中，成为蒸气原子或分子。 当它们在飞行途中遇到待淀积的基片( 硅片) 时，就淀积在基片表面，形成一层金属薄 膜，因此，真空蒸发又称为真空镀膜。 按提供能量的方式不同，可分为两种：第一种是钨丝加热蒸发，在钨丝上挂有金属 材料( 如a 1 丝) ，当电流通过钨丝时产生欧姆热，使金属材料熔化蒸发。由于钨丝会带 来污染，特别是产生对半导体表面状态影响很大的钠离子玷污，而且用此法很难淀积高 熔点金属和合金薄膜，目前此法应用已逐渐减少。第二种是电子束蒸发，它是由加热灯 丝产生的电子束通过电磁场，在电场加速下变成具有高能量的电子束，由磁场控制偏转 运动方向，使其准确打到蒸发源材料的中心表面上。高速电子与蒸发源表面碰撞时放出 能量，使蒸发源材料熔融蒸发。这种方法的优点是淀积膜纯度高，钠离子污染小。 真空镀膜工艺过程如下：第一步，将处理后的铝丝，挂在蒸发源加热器上；第二步， 经过清洗的硅片，还应在5 1 0 的稀氢氟酸中浸泡，以除去引线孔中可能存在的薄氧 化层；第三步，抽真空；第四步，衬底预热，以除去硅片表面吸附的气体，并保证蒸发 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 时有一定的衬底温度；第五步，熔球和蒸发，逐步加热蒸发源，使铝熔化成球并开始预 蒸发，当熔融的铝表面杂质全部挥发掉后，即可开始蒸发。 2 ) 合金化铝蒸发淀积到硅片表面，并经光刻形成一定形状的电极图形以后，还 必须进行合金化，使铝、硅之间形成低欧姆接触。此外，合金化还可增加铝与二氧化硅 之间的附着力，使铝膜与二氧化硅层粘附牢固，防止热压或超声键合后压点脱开。 合金化就是把蒸铝后经反刻好的硅片，放在真空室或氮气保护的炉管中，进行一段 时间的热处理。合金化温度应低于硅铝共熔温度5 7 7 ，这时硅铝之间不熔融成为液相 合金，而是靠硅铝之问的固相扩散，在硅铝界面形成一层很薄的硅铝合金。经过合金化 处理后，硅铝之间应具有良好的欧姆接触特性，铝表面平整光滑。 3 ) 溅射技术溅射是与气体辉光放电现象相联系的一种薄膜淀积技术。若在真空 室内充入放电所需要的惰性气体( 如氩气) ，在高压电场作用下使气体分子电离，产生 大量正离子。带电离子被强电场加速，形成高能量的离子流，去轰击靶材料。由于离子 的动能超过靶材料的分子结合能，在离子轰击下，靶材料的原子或分子将离开固体表面， 以高速溅射到阳极( 硅片) 上并淀积成薄膜，这种薄膜淀积技术称为溅射。 真空溅射镀膜厚度易于控制，膜重复性好，膜与基片的附着力强，纯度高，可以制 各特殊材料等，几乎所有固体都可以用溅射方法制备薄膜。如合金膜、金属膜、介质膜、 氧化物膜、半导体膜等，只要能做成靶，就可以制备薄膜。 由于溅射在薄膜制备过程中具有“低温、高速”两大特点而得到迅速发展，且由于 设备的不断改进、完善，在工业生产中越来越广泛被采用。 影响溅射薄膜生成的因素主要有以下几点：第一是溅射气体，它应具备溅射产额高， 对靶材料呈惰性，价格便宜，易于获取。一般来说，氩气是较为理想的溅射气体。第二 是溅射电压和基片电压，它们不但影响溅射速度，而且还严重影响膜的结构。第三是基 片温度，它影响膜层的生长特性。第四是靶材，它是溅射的关键，一般来说只要有了合 乎要求的靶材，并严格控制工艺参数就可以得到所需要的膜层。靶材中的杂质和表面氧 化物等不纯物质是引起薄膜污染的重要来源，所以为了得到高纯度的膜层，除了采用高 纯靶材外，在每次溅射时应先对靶进行预打以清洗靶表面，去除靶表面的氧化层。第五 是预备真空，它是在充入工作气体以前真空系统所能达到的真空度，它的高低直接反映 了系统中残余气体的多少，而残余气体也是膜层的重要污染源，故应尽可能提高预备真 空度。第六是溅射气压，它直接影响膜的溅射速率。 另外，由于不同溅射装置中的电场、气氛、靶材、基片温度及几何结构参数间的相 互影响，要制取合乎要求的膜，必须通过大量的实验，从中选取最佳工艺条件。 2 7 键合 键合是指不利用任何粘合剂，通过化学键和物理作用将硅片与硅片、玻璃或其他材 料紧密结合起来。键合虽然不是微机械加工的直接手段，却在微机械加工中有着重要的 地位。它往往与其它手段结合使用，即可以对微结构进行支撑和保护，又可以实现微结 构之间或机械结构与电路之间的电学连接。 键合的主要方法有静电键合和热压键合两种。静电键合用于硅与玻璃之问的键合。 其装置示意于图2 2 ，基本原理是通过外加电压使玻璃中的纳离子向负极移动，使玻璃 临近硅片的表面形成空间电荷区，通过静电力使玻璃和硅片紧密接触，进入原子尺度， 1 6 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 形成化学键，实现键合。我们所用到的主要是热压键合，它主要起连接引线的作用。常 用的键合引线有金丝和硅铝丝，金丝延展性好，抗拉强度高。但是，金丝和铝电极形成 的金铝系统，在高温贮存或高温条件下使用时，会生成各种金铝化合物，使导电性能下 降，并极易脆裂而使键合点脱开，造成器件的失败。硅铝丝就不存在这种现象，但是它 的机械强度比金丝差，且铝丝表面容易氧化。用金丝球焊机进行热压焊接时将底座加热， 将键合引线放在电极焊接处，用压刀在键合引线和金属化电极之间旋加一定的压力，使 引线的一端与管芯的铝层压焊到一起，引线的 图2 2 静电键合装置 另一端与管座上的外引线相连接。热压焊接的作用原理是对引线金属和管芯上的铝层同 时加热和加压，使两者接触面产生塑性变形，并破坏其表面的氧化膜，当两个接触面几 乎接近原子间距时，引线金属表面原予和铝层表面原子之间就产生了吸引力。其次，引 线金属和铝层表面总存在不平整，加压后高低不平处相互填充而产生弹性嵌合作用，使 两者紧密结合。 总之，只有充分了解各工艺的基本原理，才能据此改进各工艺条件，以获取最佳结 果。 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 3 集成p c r 芯片的结构设计 生物芯片器件的制造不同于i c 芯片的制造，其中一个重要的区别就是其在材料、物 理结构、输入输出方式、产品种类等方面具有多样性、可变性，并且需要不断寻找更 有效、更廉价的制造材料，寻求更好的结掏和更先进的铡造工艺。 集成p c r 芯片的结构设计主要包括各部分材料的选取，各功能单元的设计以及尺寸 参数的确定等。集成p c r 芯片的结构设计应满足如下使用要求： 1 ) 反应器和反应体系间有良好的惰性或相容性； 2 ) 芯片应具有良好的电绝缘性和散热性； 3 ) 反应器应该具有很好的可修饰性； 4 ) 样品进样、混合、反应和分离时，应该流动均匀，不挥发及溢流，并尽可能减 小死区体积； 5 ) 容易检测： 6 ) 加工制作容易、可以批量生产、成本低。 根据p c r 微芯片的使用要求和目前研究中存在的问题，在查阅大量文献的基础上， 本文提出了如下的设计方案。 3 1 集成p c r 芯片的材料选择 p c r 微芯片作为微全分析系统的一个重要组成部分，其加工技术是起源于半导体加 工技术和集成电路芯片的微细加工技术，但它又不同于以硅材料为主的集成电路芯片加 工技术。 目前，微芯片加工材料主要有三大类”，由于这三种材料的特性不同，在p c r 微 芯片的加工及设计上也要采取不同方法。表3 71 列出了不同芯片材料的优缺点。 表3 1 芯片加工材料的性能比较 t a b l e3 1c o m p a r j s o no fm i c r o f a b r i c a t i o nm a t e r i a l s 集成p c r 芯片是应用m e m s 技术，在硅、玻片及有机聚合物上制作集成p c r 微反应器， 运用集成在芯片上的加热器和温度传感器实现对反应区温度的精确控制，充分体现微芯 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 片高效、快速、试剂用量少、节约药品等优点。虽然在玻璃和有机聚合物上很容易实现 各个温区之间的热绝缘，但是，很难在他们上面集成加热器和传感器，而这恰恰是集成 p c r 扩增微芯片的关键。由表3 1 可以看出，硅加工技术已经发展的相当成熟，比较容 易实现在硅上集成加热器和传感器。另外，成熟的薄膜技术和微加工技术也使得把加热、 控制热传递以及温度测量等部件集成到一块芯片上成为可能。另外，由于在晶向为 的单晶硅上比较容易腐蚀出规刚的微沟道图形，并且n 型单晶硅上便于进行硼扩散制作 电子元件。借鉴研究所以往的工作经验并结合实验室现有的条件，本文选取晶向为 的n 型单晶硅作为芯片材料。 3 2 集成p o r 芯片的反应腔 采用m e m s 技术制造的p c r 微芯片主要有两种结构形式：第一种是单反应区结构形式， 即扩增反应全过程在一个反应腔内进行，通过周期性迅速改变该反应池内的温度，实现 p c r 扩增反应的高温变性、中温退火和低温延伸三个过程的不断循环。第二种是三反应 区结构形式，即扩增反应在三个不同的反应区进行，其中每一个反应区都保持在一个恒 定温度，样品在外力的作用下通过芯片上的沟道，在三个反应区之间流动，实现样品在 三个温区的变换，从而实现p c r 扩增反应的周期循环过程。 在单反应区p c r 微芯片中，温区之间的过渡时间较长，扩增效果不太理想。与它相比， 三反应区p c r 微芯片就不存在这样的问题，因而在扩增效果上有一定的优越性。但是， 它的制作过程要比单反应区p c r 芯片复杂的多，如何实现各温区之间的热隔离，如何对 反应区温度进行精确控制，是制作三反应区p c r 芯片所要解决的主要问题，也是今后p c r 微芯片研究中所要解决的主要问题。 由于硅具有很好的导热性，因此如何做好硅上各温区间的热绝缘工作，是当前开发 三温区p c r 微芯片所面临的主要问题。在查阅大量文献的基础上，根据集成p c r 微芯片 的使用要求以及目前研究中所存在的问题，我们的设计方案是：首先研制出比较理想的 单反应区集成p c r 芯片，然后在此基础上迸一步研制三反应区集成芯片。本文的主要工 作就是在 1 0 0 晶向的n 型单晶硅材料上制作单反应区集成p c r 芯片，其结构简图如图 3 1 所示。 在一块2 0 1 5 眦2 ，晶向为 1 0 0 1 的n 型 单晶硅上，一次性刻蚀出4 个4 x 3 衄2 的p c r 反应腔，在其底部制作微型加热器和温度传 感器。 另外，p c r 扩增反应所需样品量一般在微 升量级，样品量如果太少，不能得到很好的 扩增效果，同时也不便于进行有效的检测， 因此，所选取的硅片厚度在3 5 0 5 0 0um 范 围之内。 3 3 集成p o r 芯片的绝缘层 硅具有良好的导热性，为了防止散热， 提高加热效率，在硅与加热器之间生长一层 9 雷3 1 单反应区p c r 芯片的结构简图 f i g3 1s t r u c t u 3 c es i m p l i f i e dd i a g r a mo f s i n g l er e a q ti o ns y s t e mp c rc h i p s 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 s i _ i n ，绝缘层。s i n 4 膜的厚度在集成p c r 芯片工作中具有重要的作用，不仅支撑着反应腔 的底部，同时还影响反应腔内的热场分布。膜比较厚则温度均匀性变好，但导热性变差， 升降温速度变慢。反之，膜比较薄则温度均匀性变差，升降温速度变快，但膜的强度降 低。 一般地说，氮化硅膜是一种理想的绝缘介质膜，它具有结构致密、硬度大，介电强 度高，对钠离子具有很强的阻挡能力等优点，这是其它绝缘介质膜所不能比拟的。另外， 它的化学性质极其稳定，除了与氢氟酸，热磷酸有微弱作用外，几乎不和其它酸类发生 反应。氮化硅不仅能掩蔽二氧化硅所能掩蔽的硼、磷、砷等杂质扩散，而且还能掩蔽s i 0 。 所不能掩蔽的镓和锌等杂质。由于氮化硅的掩蔽能力强，因而只需很薄的氮化硅膜就能 掩蔽杂质扩散，从而提高光刻分辨能力。另外，氮化硅膜的台阶覆盖性好，针孔密度小， 缺陷密度低，导热性能比二氧化硅好，结构致密，气体和水难以透入，同时，可以在较 低温度下生成，因此，本实验选用氮化硅作为绝缘层。 氮化硅和硅界面存在较高的界面态和陷阱密度，具有“滞后效应”( 这是因为氮化硅 与硅形成的势垒较低，因此在电场作用下，电子或空穴很容易注入到氮化硅中，被氮化 硅中陷阱所捕获) 和极化效应，并存在一个电压阈值。因此，氮化硅若直接做在硅衬底 上，其电学性能不稳定，绝缘性也不是很好，故不能直接淀积在硅表面作纯化层和绝缘 层。制作在二氧化硅膜上的s 训。一s i 0 ：双层结构最好，一层薄薄的氮化硅即耐腐蚀又能 阻止碱金属离子的沾污，厚的s i 0 1 层则可以降低界面态和陷阱，解决电荷不稳定问题。 另外，在s i 。n 和s i 之间加一层热生长的氧化膜，即使在电压高到使介质膜被击穿时也 不会有捕获效应。s i 。n 和s i 之间的s i o ：层还可以改善氮化硅的附着能力，从而提供一 个连续的界面，这个界面在高温下附着力很好且能阻止杂质的扩散。因此，在实验中， 我们采取s i 。n - - s i o ：双层结构作为绝缘层。 3 4 集成p c r 芯片的加热器和温度传感器 作为实现d n a 样品扩增的主要器件，p c r 微芯片必须能够满足热均匀性、温度控制 的精确性和物理尺寸的准确性。因此，加热器和温度传感器的材料选取和结构设计，就 成为决定集成p c r 芯片性能好坏的一个重要因素。 常用的加热器和温度传感器制作方法主要有两种，一种是金属薄膜电阻法，一种是 多晶硅掺杂法。由于本实验室扩散工艺是采用热扩散法，扩散深度和离子扩散浓度都不 稳定，因此，我们采用金属薄膜电阻来制作加热器和温度传感器。 金属电热元件材料主要有铁铬铝合金、镍铬合金和纯金属钼、钨、铂等。它们在物 理性能和机械性能方面存在着各自的优缺点，而对电热元件所要求的抗高温性、高电阻 率、较小的电阻温度系数、较小的热膨胀系数及良好的加工性能和低成本等性能方面， 薄膜电阻加热元件基本上满足了上述要求，尤其在降低成本和功耗等方面远远优于其它 的电加热元件。 目前，最适合用来制作薄膜电阻加热器和温度传感器的材料是金属铂，它即具有很 好的加热特性，又具有很好的温度特性。但是，由于铂是一种贵重金属，制作铂加热器 和温度传感器代价太高，因此本文希望用一些比较廉价的金属来制作加热器和温度传感 器。 从所查的资料来看，铬和镍铬合金都是很好的加热器材料，但是用它们作为温度传 2 0 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 感器的文章还没有看到。同样，镍是一种很好的温度传感器材料，也未见报导用它制作 加热器的文献。本文希望用同一种材料制作加热器和温度传感器，因为工艺过程的减少 就意味着芯片成品率的增加，但目前除了铂以外，还没有其它金属可以满足这个要求。 因此，本文将分别用镍和镍铬合金薄膜电阻制作温度传感器和加热器。其中镍铬合金的 成分是n i ：c r = 8 0 ：2 0 。 3 5 集成p o r 芯片的总体结构和版图设计 为了提高加热效率和保证对温度的精确控制，必须考虑加热器和温度传感器的位置 及阻值大小。在反应腔底部面积内尽可能的加大加热器的面积，使反应腔底部受热均匀， 同时，把温度传感器的位置放在反应池底部的中间位置。图3 2 给出了本文所设计的加 热器和温度传感器结构。其中较长的电阻条是加热器，较短的是传感器。电阻条的线条 宽度是5 0um ，。加热器的线条间距是0 2 5 蛐，传感器的线条间距也是o 2 5 硼，加热器 与温度传感器线条之间的问距2 0 0 p m 。图3 2 中电阻条顶端的焊盘面积是1 0 0 1 0 0 1 3 m 2 ，图3 3 中的焊盘面积是0 2 6 x 0 2 6 咖2 0 图3 2 加热器和温度传感器的光刻掩模版 图3 3 制作铝压焊点的光刻掩模版 f i 9 3 3p h o t o m a s ko fa 1s e a l e d p o i n t s 图3 ，4 温度传感器的光刻掩模版 图3 5 加热器的光刻掩模版 f i 9 3 4p h o t o m a s ko fs e n s o r sf i 9 3 ，5p h o t o m a s ko fh e a t e r s 本文一共制作了五块光刻掩模版。第一块如图3 1 所示，用来在硅上刻蚀p c r 反应 池。第二块如图3 2 所示，用来制作加热器和温度传感器。第三块光刻掩模版用来刻蚀 铝，如图3 3 所示。因为制作出来的加热器和传感器只有通过引线连接到外部电路中才 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 能够工作，而制作加热器和温度传感器的材料一般都不能直接连接到外部。通常采取的 方法是在加热器和温度传感器表面用真空蒸发镀膜法镀一层金属铝，刻蚀出所需的压焊 点，然后进行合金，实现铝与加热器及温度传感器之间的良好接触。合金后的芯片用金 丝作为内引线，利用铝的低熔点特性，用压焊机把金属铝和金丝压焊到一起，金丝的另 端连接到有导电银浆的陶瓷底座上，通过外引线连接到外部控制电路中。图3 4 和3 5 分别是制作温度传感器和加热器的光刻掩模版。在制作过程中，要确保这几个图形完全 对应重合，使加热器和温度传感器准确地位于反应腔底部，否则会影响该芯片的加热效 率和对温度控制的准确性。因此，为了保证套刻精度，在设计上述五块光刻掩模版时， 在矩形边框的对角位置设置两个小三角，作为套刻时的定位线。 基于m e m s 技术的p c r 芯片的设计与制作 4 集成p o r 芯片的工艺实现 4 1 基本工艺流程 在参考大量文献并借鉴本教研室以往工作经验的基础上，本文提出了自己的设计方 案“3 1 ”。下面以湿法腐蚀和金属铬溅射工艺为例，来说明基本工艺流程： 1 ) 根据设计，在坐标纸上绘制出所 需图形。然后刻红膜，再经过曝光、显 影、定影，得到所需的光刻掩模版。根 据实验室的条件，绘制图形的放大倍率 为2 0 ，获得的图形最小线条宽度是5 0 um 。本文一共制作了五块版，分别如 图3 1 、图3 2 、图3 3 、图3 4 和图 3 5 所示。 2 ) 用热氧化法在单晶硅表面双面 生长约1 “m 厚的s i o ：薄膜，然后用 l p c v d 法在一面的s i o ：上淀积一层约 1 8 4 0 a 的s i 。n 。薄膜，作为绝缘层。 3 ) 在衬底上没有s i 。m 的一面，用 图3 1 所示的光刻掩模版进行光刻，在 s i 砚上刻出图3 1 所示图形的窗口，如 图4 1 ( b ) 所示。所用的腐蚀液成分 是h f ：n h d f ：h ：o = 3 m l ：6 9 ：l o m l ，温 度条件为3 5 左右。 4 ) 以s i o ：为掩膜，用k o h 水溶液对 硅片进行各向异性腐蚀，在硅上腐蚀出 u 淼 ( c ) 图4 1p c r 芯片的加工流程。， f i 9 4 1m i c r o f a b r i c a t i o np r o c e s so fp 僳c h i p s p c r 反应腔。反应腔的深度接近于硅片的厚度，如图4 1 ( c ) 所示。k o h 水溶液的成分 是k o h ：水：异丙醇= 5 0 9 ：1 3 0 m l ：3 0 9 ，操作温度是7 0 左右。 5 ) 由于硅材料与p c r 扩增反应不相容，因此，需要在刻蚀出来的p c r 反应腔内壁上 生长一层p c r 相容物。”2 “。本文采用热氧化法，在反应腔内壁生长了一层很薄的s i o ： 薄膜。 6 ) 用真空溅射法在s i ，心上溅射一层金属铬薄膜，用图3 。2 所示的光刻掩模舨进行 光刻，然后用腐蚀液腐蚀金属