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l c m s m s 在体内滥用药物分析中的应用 中文摘要 滥用药物( d r u g so fa b u s e ) 是指连续使用后产生依赖性，并具有滥用倾向的精神活性物 质。滥用药物包括鸦片、海洛因、甲基苯丙胺( 冰毒) 、吗啡、大麻、可卡因以及国家规 定管制的其他能够使人形成瘾癖的麻醉药品和精神药品。滥用药物具有耐受性和依赖性， 不仅直接对人类身心健康造成重创，而且伴随着严重的社会问题。严厉打击毒品犯罪是世 界各国共同努力的目标。 滥用药物分析在这场打击毒品犯罪的斗争中担负着艰巨的任务，不仅要快速准确地分 析确认毒品的种类和质量，而且需要通过体内滥用药物分析以确定检验对象是否摄毒、摄 毒种类、摄毒程度和摄毒史，以及摄毒和死亡的关系，为涉毒案件的侦破及处理提供科学 证据。随着药物滥用的全球泛滥，相应地，对体内滥用药物分析提出了新的要求，主要表 现在：( 1 ) 涉及滥用药物的案件类型不断增加，例如麻醉抢劫案件、性犯罪案件、药后驾 车致交通事故案件等；( 2 ) 滥用药物分析所用生物检材不断变化，由目标物浓度相对较高 的尿液，发展为需要分析目标物浓度极低的血液，唾液和头发等生物检材；( 3 ) 为法庭提 供证据的分析方法必须保证具有非常高的灵敏度和可靠性，并且可以纳入质量控制和质量 保证范畴。( 4 ) 既需要针对一类滥用药物的分析方法，又需要涵盖尽可能多的滥用药物的 筛选方法。 目前，毒物分析实验室的体内滥用药物分析一般首先采用免疫分析等方法筛选，然后 经g c m s 迸一步确认，该方法已经比较成熟，成为国内外毒物分析实验室的常规操作”。 但是，传统的g c m s 费时、前处理过程繁琐、需要衍生化，已无法满足当代滥用药物分析 的需要。液相色谱一质谱联用技术的发展弥补了其不足，近几年的发展显示其强大的优势。 l c m s m s ( 1 i q u i dc h m m a t o g r a p h y - t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ) 是液相分离结合串联质谱检测 的新型分析仪器，近年来得到了迅速发展。l c m s m s 分析范围广，前处理简便，不需衍 生化，分析的专一性强，灵敏度高。基于这些比g c m s 更优越的性能，在国外，l c m s m s 已逐渐应用于法庭毒物分析。但是，l c - m s ，m s 研究在我国还刚起步。 本课题以血液、尿液和毛发为主要生物检材，研究、探索、建立了七类滥用药物的 l c m s m s 分析方法以及1 3 2 种常见滥用药物的l c m s m s 系统筛选方法，解决了l c m s m s 分析中存在的诸如样品处理、色谱分离、灵敏度、质谱条件的选择和优化等关键技术问题， 并对方法在实际检案中的应用进行了深入的研究和讨论。 1 生物检材中吗啡类药物的l c m s m s 分析，包括海洛因、单乙酰吗啡、吗啡、可待 因、乙酰可待因、二氢可待因酮和氢吗啡酮等。所建立的方法简便、快速、特异性强、灵 敏度高。尿液稀释法、尿液提取法和头发中吗啡的最低检测限( l o d ) 分别为1 0 n g m l 、0 0 1 n g m l 和0 0 1n g m g 。目标物中加入二氢可待因酮和氢吗啡酮扩大了方法的实用范围。在 国内首次报道唾液在吗啡类药物分析中的应用，研究结果揭示了同一时间唾液和尿液中吗 啡浓度的差异。所分析的1 0 个毛发样品中吗啡浓度明显高于单乙酰吗啡浓度，与此前本 作者采用g c m s 分析的结果一致。所建毛发前处理方法在检材量少、缺乏复核样的情况 下有非常重要的实用意义。 2 生物检材中苯丙胺类药物的l c m s ，m s 分析，包括苯丙胺、甲基苯丙胺、m d a 、 m d m a 等。所建立的方法简便、快速，检材用量少，特异性强，灵敏度高。l c m s ，m s 分析在3 m i n 内完成，可同时分析原体及其代谢物。并首次对产妇头发和胎毛进行苯丙胺 类兴奋剂和氯胺酮的分析。研究结果阐明了血、尿等生物检材的离子抑制作用是影响本方 法灵敏度的主要原因。 3 l c m s m s 分析尿液中岔一四氢大麻酸。t h c - c o o h 极性强，而应用l c m s m s 则无需衍生化，操作简便。 4 l c m s m s 同时分析体液中可卡因及其代谢物，包括可卡因、苯甲酰爱康宁、爱康 宁、爱康宁甲酯和古柯乙烯。优化选择提取溶剂，l c m s m s 分离良好，灵敏度高。尿液 提取法的最低检出限( l o d ) 在o ，0 1 0 5 n g m l 。 5 l c m s m s 同时分析体液中致幻剂类药物及其代谢物，包括l s d 、去甲l s d 、羟 化l s d 和p c p 。方法中l s d 和p c p 的最低检测限低于1 0 p g m l 。 6 l c m s m s 同时分析体液中苯二氮卓类药物及其代谢物，包括三唑仑及代谢物a 一 羟基三唑仑、安定及代谢物去甲安定、羟基安定、甲羟安定和去甲氧安定、阿普唑仑及代 谢物旷羟基阿普唑仑、艾司唑仑及代谢物o r , 一羟基艾司唑仑、氟硝安定及代谢物7 一氨基氟 硝安定、硝基安定及代谢物7 一氨基硝基安定、氟安定、氯硝安定、咪达唑仑和劳拉西泮等。 方法分离良好，灵敏度高，不仅分析药物原体，而且可同时分析其代谢物。一些用g c m s 无法分析的药物如氯硝安定等，应用本方法分析则可获得与其它苯二氮卓类药物同样的高 灵敏度。 7 血液中巴比妥类药物的l c - m s m s 分析，包括巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、 司可巴比妥和硫喷妥钠。通过质谱解析，确立了在电喷雾电离负离子模式下，巴比妥类药 物在碰撞池中子离子产生的规律。所建立的方法简便、快速、无需衍生化，其最低检测限 ( 1 0 n g m l ) 低于文献中l c 和g c - m s 方法。 8 体液中1 3 2 种毒药物的l c 。m s m s 筛选分析，包括违禁药物阿片类、苯丙胺类、 大麻酚类，杀虫剂有机磷类、氨基甲酸酯类，药物苯二氮卓类、抗抑郁药类、抗癫痫、哮 喘类、解热镇痛类以及常见治疗药物等。本研究确立了l c m s m s 定性认定准则，血液中 1 3 2 种毒药物筛选分析的最低检出限为0 1 1 0 r i g m e ，其中8 3 l n g m l 。鉴定应用表明 阳性检出率和可靠性优于g c m s 。该筛选分析体系能满足法医毒物学和临床毒物学检测中 毒或治疗浓度目标物的需要，且能扩展至其它生物检材。 应用l c m s m s ，有效地解决了目前体内滥用药物分析中存在的疑难问题。综上所述， 本文的创新点及研究的意义如下： 1 、分别建立生物检材中吗啡类、大麻酸、可卡因类、苯丙胺类、致幻剂类、巴比妥 类、苯二氮卓类药物的l c m s m s 分析方法，和生物检材中1 3 2 个药物的l c m s m s 筛 选分析方法，可根据不同的鉴定委托要求选择使用。所建方法均为国内首创，色谱分离、 灵敏度等技术指标达到国际先进水平。方法可满足法庭毒物分析的需要，并在鉴定实践中 得到了有效性验证。 2 、所建方法简便、省时、有效。生物检材的前处理方法或采用沉淀蛋白后离心上样， 或经过简单的液液提取法，无需衍生化；液相分离良好，减少了离子抑制作用，整个 l c m s ，m s 流程可在3 - 1 4 r a i n 内完成。 3 、分析目标化合物范围广，达1 4 0 余种，覆盖了国内外常见滥用药物及其代谢物， 增强了案件的阳性检出率，可满足日益完善的证据需求。l c m s m s 系统筛选分析的目标 物在司法实践中可不断增加。 4 、方法检测灵敏度高，体液中8 3 药物的最低检测5 、 1 3 ，摇匀后8 0 。c 水浴中水解3 0 r a i n ，冷却后加入h c l 调至p h 4 - 5 。 2 m l 血液、尿液或水解后的尿液加入0 5 m l 冰醋酸，加入3 m l 正己烷：乙酸乙酯 ( 9 ：1 ) ，混旋，离心，取上清液，6 0 。c 水浴中挥干，加入1 0 0 p l 流动相溶液，取5 此 进样。 结果与讨论 t h c c o o h 极性强，采用g c m s 分析必须首先衍生化，操作繁琐、费时，而l c m s m s 则操作简便。图3 为t h c c o o h 的m r m 色谱图。 2 0 ：4 n _ 1 图3t h c c o o h 对照品1 0 n g m l 图4 尿液直接液液提取 三咫 图5 尿液水解后液液提取 由图4 和图5 可看出，水解后t h c c o o h 的量明显升高。 2 1 笨、旃j 恕； 研究之四l c m s m s 同时分够竺鎏由可卡因及其代谢物 引言 可卡因属中枢神经系统精神运动兴奋剂，是从古柯植物中提炼出来的天然生物碱， 也可化学合成。可卡因代谢包括酯键的水解、胆碱酯酶作用和去甲基化途径，体内的 代谢物主要包括苯甲酰爱康宁、爱康宁、爱康宁甲酯和古柯乙稀，这几个化合物有极 性的，也有非极性的。代谢物间的极性差异给同时分析可卡因及其代谢物增加了困难。 可卡因在我国较少见，但是在外资公司招聘高级人员、保险、国际医疗中心等方面都 有体内检测可卡因的需要。随着全球大流通，建立生物检材中可卡因及其代谢物的检 测方法是非常有必要的。 材料与方法 一、检测方法 1 试剂 苯甲酰爱康宁、爱康宁、爱康宁甲酯和古柯乙稀均购自c e r i l l i a n t 公司，可卡因 购自国家麻醉品实验室，用于流动相的甲醇、乙腈、甲酸和乙酸胺购自f l u k a 公司， 其它试剂均为国产分析纯。 2 l c m s m s 方法 a p p l i e db i o s y s t e m s 公司的三极四极串联质谱系统l c 。m s m s ( a p i4 0 0 0 ) 液相柱为r e s t e c k 公司a l l u r ep f pp r o p y l5 p m1 0 0 x 2 1 m m ，此前接p h e n o m e n e x 的保护柱。流动相为甲醇：乙腈：缓冲液( 5 0 ：3 0 ：2 0 ) ，缓冲液为2 0 m m 乙酸胺和2 甲酸的溶液。恒流2 0 0 i _ t l m i n 。 质谱采用电喷雾电离正离子模式( e s i + ) ，操作参数分别为：碰撞气( c o l l i s i o n g a s ) ，7 ；气帘气( c u r t a i ng a s ) ，3 0 ；离子喷慰压( i o n s p r a yv o l t a g e ) ，5 5 0 0 ；温度 ( t e m p e r a t u r e ) ，5 0 0 。c 。每个化合物选取两个离子对，见表1 0 。 二、标准溶液的制备与贮存 精密称取可卡因标准对照品于1 0 m l 容量瓶中，加入甲醇溶解，定容，配成浓度 为l m g m l 的标准储备液，于4 0 c 贮存待用。所购买的苯甲酰爱康宁、爱康宁、爱康 宁甲酯和古柯乙稀均为1 0 0 耀加l l 甲醇液。实验中所用其它浓度的标准溶液均从上述 标准贮备液稀释而得。 三、样品前处理方法 1 尿液稀释法 2 0 皿尿液加入l m l 乙腈，混旋，离心，取5 皿迸样。 2 液液提取法 尿液l m l 加入2 m l p h 9 2 磷酸缓冲液，加入3 5 m l 氯仿：异丙醇( 9 ：1 ) ，混旋，离 心，取有机层，6 0 。c 水浴中吹干，加入1 0 0 肛l 乙腈：2 0 m m 乙酸胺和甲酸缓冲液( 7 0 ：3 0 ) ， 取5 “l 进样。 表1 0 可卡因及其代谢物的l c - m s m s 条件 结果与讨论 一、提取溶剂的选择 将2 0 n g 混合标准品添加入l m l 空白尿液中，优化选择提取溶剂。选用乙醚， 苯甲酰爱康宁不出峰；选用二氯甲烷，乳化严重：选用氯仿：异丙醇( 9 ：1 ) ，可卡因及 其代谢物可同时检出。最后确定选取氯仿：异丙醇( 9 ：1 ) 为提取溶剂。 二、方法评价 由图6 和表1 0 可看出，l c m s m s 分离良好，灵敏度高。尿液提取的最低检出 限( l o d ) 在0 0 1 - 0 5 n g m l ，明显低于文献报道m ( l o d1 - 1 6 n g m l ) 。 p 、一代1 蟹、丸弋。 砌+ _ _ 憎，- b 3j m u _ h 0 m 岫叫o o p 删j 删- r _ ( 4 2 - 4 删_ “_ - q _ 帅洲1 洲u ，吲 一 1 胃 “b e n z o y l e c o g n i n e 。1 f 石石l j 型掣r 、f 石葛丽1 f 1 f 石丽丌 籼h 叫1 2 卅删j 叶帅3 “州_ d 一4 m l 州_ 0 ： j ! | ：竺掣玉理 。扯百石_ f 1 r 石百万万石_ f 1 r - = 嚆罂_ 署业 t a 2 呻 ”，懦j 删椭山3 扣l o 删m _ - s p i l l ) ：jc o c a e t h y 1 e n e ：墨 1八 o “矗1 f 石= r ；i - ；f 石1 r 石_ ；f 磊1 f 荔勺f 专趟 删a 2 - 吣洲s _ - 3 - 删h 叫洲1 蚺哪 图6 可忙因及其代谢物的m r m 色谱图 2 4 研究之五生物检材中p c p 和l s d 及其代谢物的l c m s m s 分析 引言 p c p 和l s d 均为低剂量即使人意识、知觉和视觉异常，引起幻觉和情绪障碍的 致幻剂。随着全球化发展，p c p 和l s d 在我国己有滥用的趋势。 生物检材中分析l s d 非常困难，这是由于l s d 在很小剂量( 2 5 1 5 0 1 u g ) 下即可发 挥很强的作用。l s d 进入体内后很快代谢，通过去甲基化和羟化成无活性的代谢物。 p c p 的致幻作用亦非常强，中毒时血液中浓度仅为7 - 2 4 n g m l 。所以，生物检材中p c p 和l s d 及其代谢物的分析需要非常灵敏的方法。 材料与方法 一、检测方法 l 试剂 p c p 、l s d 、去甲l s d 和o h l s d 均购自c e r i l l i a n t 公司，用于流动相的甲醇、 乙腈、甲酸和乙酸胺购自f l u k a 公司，其它试剂均为国产分析纯。 2 l c m s m s 方法 a p p l i e db i o s y s t e m s 公司的三极四极串联质谱系统l c m s m s ( a p l 4 0 0 0 ) 液相液相柱为r e s t e c k 公司a l l u r ep f pp r o p y l5 p ml o o x 2 1 m m ，此前接p h e n o m e n e x 的保护柱。流动相为甲醇：乙腈：缓冲液( 5 0 ：3 0 ：2 0 ) ，缓冲液为2 0 m m 乙酸胺和2 甲酸的溶液。恒流2 0 0 i _ t l m i n 。 质谱采用电喷雾电离正离子模式( e s i + ) ，操作参数分别为：碰撞气( c o l l i s i o ng a s ) ，7 ； 气帘气( c u r t a i ng a s ) ，3 0 ：离子啤射鬼压( i o n s p r a yv o l t a g e ) ，5 5 0 0 ；温度( t e m p e r a t u r e ) ， 5 0 0 。c 。每个化合物选取两个离子对，见表1 1 。 表1 1p c p 和l s d 及其代谢物的l c m s m s 条件 化合物 母离子i 子离子 d p ( v ) i c e ( e v ) l s d3 2 4 22 2 3 25 03 3 p c p n o t - l s d 2 4 4 2 3 1 0 2 2 - o x o - 3 - h y d r o x y - l s d 3 5 6 2 奶 侈 玎 舛 ” “ 2 o 3 2 2 2 2 猫睢坶 研 狮拼 勉 二、标准溶液的制备与贮存 所购买的p c p 、l s d 、去甲l s d 和o h l s d 均为1 0 0 p g m l 甲醇液。实验中所用 其它浓度的标准溶液均从上述标准贮备液稀释而得。 三、样品前处理方法 尿液l m l 加入2 m l p h 9 2 磷酸缓冲液，加入3 5 m l 氯仿：异丙醇( 9 ：1 ) ，混旋，离 心，取有机层，6 0 。c 水浴中吹干，加入1 0 0 p l 乙腈：2 0 m m 乙酸胺和甲酸缓冲液( 7 0 ：3 0 ) ， 取5 p l 进样。 结果与讨论 一、提取溶剂的选择 将l n g 混合标准品添加入l m l 空白尿液中，优化选择提取溶剂。采用乙醚提取， l s d 的代谢物出峰固难；一采用氯仿：异丙醇( 9 ：1 ) 作提取溶剂，l s d 的代谢物l o d 为 5 0 p g m l 。最后确定选取氯仿：异丙醇( 9 ：1 ) 为提取溶剂。 撩；。、厂岁 二、灵敏度 方法中l s d 和p c p 的最低检测限低于1 0 p g m l ，达到目前国际先进水平”1 。如图 7 图1 0 。 懈蝴_ h - 一1 _ - 呻_ 帅_ o - 时 j 。 一1 1 图7 空向血中l s d 的m r m 色谱图 黼- i 删_ _ _ 一 a 口洲删_ d _ 嘲- _ 1 4 0 0 , 0 - - ，帅捌舳惭。一，1 1 忡，n 删d 嘲嗍 一一一 图8 空白血中添加1 0 p g m ll s d 的m r m 色谱图 - - 州- 嶂撕- - 。_ i _ 峨_ - 呻r a m s 呻t l - h 呻_ d 。蝴i 图9 空白血中p c p 的m r m 色谱图 - _ b 洲1 柙，d 幽p 哪州 _ 黼啪- l 雕m _ “- _ 1 4 ( w 呻懒1 d _ - 一，埘j q 哪_ p _ 日_ p k l 4 ( 伽0 洲洲d 曲_ 枷 图1 0 空白血中涤加i o p m l p c p 的m r m 色谱| 璺i 研究之六体液中苯二氮卓类药物的l c m s m s 分析 引言 苯二氮卓类药物具有催眠镇静作用，目前临床上广泛应用。除了自杀或他杀 的中毒案件外，苯二氮卓类药物常被用作麻醉抢劫、迷奸等犯罪的工具，在社会上 影响极坏，特别是此类案件往往不能及时留取血液或尿液检材，所以亟需建立快速、 灵敏的方法，为临床抢救争取时间，为法庭提供有效、可靠的证据。 材料与方法 一、检测方法 1 试剂 7 一氨基氟硝安定、a - 羟基阿普唑仑、7 氨基硝基安定、a - 羟基三唑仑均购自 c e d l l i a n t 公司，其它对照品购自国家麻醉品实验室和生物制品检定所，用于流动相 的甲醇、乙腈、甲酸和乙酸胺购自f l u k a 公司，其它试剂均为国产分析纯。 2 l c m s m s 方法 a p p l i e db i o s y s t e m s 公司的四极杆l c m s m s ( a p i4 0 0 0 ) 液相液相柱为r e s t e e k 公司a l l u r ep f pp r o p y l5 唧l o o x 2 1 m m ，此前接 p h e n o m e n e x 的保护柱。流动相为乙腈：! 塑咝圣墼壁塑里墼墨独液：7 j ( ( 6 0 ：3 0 ：1 0 ) ， 恒流2 0 0 1 s l m i n 。p wi 狡弘爹茹、 质谱采用电喷雾电离一正离子模式( e s i + ) ，操作参数分别为：碰撞气( c o l l i s i o n g a s ) ，7 ；气帘气( c u r t a i ng a s ) ，3 0 ；离子哒射目g 玉, ( i o n s p r a yv o l t a g e ) ，5 5 0 0 ；温度 ( t e m p e r a t u r e ) ，5 0 0 0 c 。每个化合物选取两个离子对，见表1 2 。 二、标准溶液的制备与贮存 三唑仑及代谢物甜羟基三唑仑、安定及代谢物去甲安定、羟基安定、甲羟安定和 去甲氧安定、阿普唑仑及代谢物洳羟基阿普唑仑、艾司唑仑及代谢物a 羟基艾司唑仑、 氟硝安定及代谢物7 氨基氟硝安定、硝基安定及代谢物7 一氨基硝基安定、氟安定、氯 硝安定、咪达唑仑和劳拉西泮等1 7 种苯二氮卓类药物均配制成1 0 0 g m l 甲醇贮备液。 实验中所用其它浓度的标准溶液均从上述标准贮备液稀释而得。 三、样品前处理方法 血液或尿液l m l 加入2 r n l p h 9 2 磷酸缓冲液，加入3 5 m l 乙醚，混旋，离心， 取上清液，6 0 。c 水浴中挥干，加入l o o k t l 乙腈：2 0 r a m 乙酸胺和甲酸缓冲液( 7 0 ：3 0 ) ， 取5 吐进样。 结果与讨论 由图1 1 可看到，l c 分离良好。本方法灵敏度高，不仅分析原药，而且可同时分 析其代谢物。 运用本方法对g c m s 分析阳性、医院送检的怀疑安眠镇静类药物中毒患者的血 液样本进行分析，结果比较见表1 3 。结果表明，运用g c m s 只能检测原药，极性强 的代谢物无法检出。另外，一些苯二氮卓类药物极性强如氯硝安定，g c m s 灵敏度很 差，但液质上l o d 与安定一致。 表1 2 苯二氮卓类药物及其代谢物的l c m s m s 条件 氟硝安定f l u n i t m z e p a m 3 1 4 22 6 8 38 53 5 2 3 9 34 5 7 - 氨基氟硝安定7 - a m i n o f l u n i t r a z e p a m 2 8 4 21 3 5 28 03 9 2 2 6 24 l 硝基安定 n i w a z e p a m 2 8 2 22 3 6 27 03 2 1 8 0 2 5 2 7 一氨基硝基安定7 - a n f i n o n i t r a z e p a m 2 5 2 21 2 1 18 03 7 1 4 6 23 8 三唑仑 n i a z o l a m3 4 3 23 0 8 28 03 6 3 1 5 23 5 a _ 羟基三唑仑 a - h y d r o x y t r i a z o l a m 3 5 9 2 3 3 1 2 8 0 3 8 1 7 6 13 7 安定d i a z e p a m 2 8 5 11 9 3 38 04 5 去甲安定 n o r c l l a z e p a m 甲羟安定t e m a z e p a m 阿普唑仑 a l p r a z o l a m 1 5 4 1 2 7 1 21 4 0 27 0 2 0 8 1 2 8 7 22 4 1 25 0 2 6 9 3 3 0 1 22 5 5 27 0 2 8 3 1 3 0 9 1 2 8 1 18 0 2 8 3 0 1 1 8 lo 1 2 2 30 1 2 7 20 1 1 7 8 3 2 50 1 2 3 8 2 4 9 2 8 20 1 2 7 4 23 2 羟基阿普唑仑a - h y d r o x y a l p r a z o l a m 3 2 5 22 9 7 29 03 51 8 1 3 0 弘 拍弱 孔舡拍 挎 驺 氯硝安定 c l o n a z e p a m 咪哒唑仑 m i d a z o l a m 劳拉两泮l o r a z e p a m 艾司唑仑 e s t a z o l a m 去甲氧安定d e m o x e p a m 2 7 9 23 3 3 1 6 22 7 0 17 53 6 2 1 4 14 9 3 2 6 22 9 1 46 53 7 2 4 4 ，23 5 3 2 1 12 7 5 16 03 0 3 0 3 12 1 2 9 5 22 6 7 37 03 4 2 0 5 25 3 2 8 7 11 8 0 27 03 2 2 6 9 33 8 2 3 0o 1 6 1 0o 1 1 9 6 2 3 00 1 1 7 3o 1 八fi 。匙杰垒一。一一八。，t 妇- 0 呔脚# b 图111 7 个苯：氦卓类药物及其代谢物的m r m 色谱图 表1 35 例阳性血液检材分析并与g c m s 对照 3 1 研究之七l c - m s m s 同时分析血液中五种巴比妥类药物 前言 巴比妥类药物属于镇静催眠类药物，已有近百年的临床应用和滥用历史。由于巴比妥 类药物的安全性远不及苯二氮卓类，且较易发生依赖性，所以已很少应用于镇静和催眠。 目前，巴比妥类药物主要用作麻醉诱导剂和治疗癫痫，毒鼠强中毒时强烈的抽搐症状多数 采用苯巴比妥解痉。常见巴比妥类药物包括巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥 和硫喷妥钠。 生物检材中巴比妥类药物的定性定量分析在法庭毒物分析和临床毒物分析方面有非 常大的应用价值，多年来，新技术方法在不断的探索中。液相色谱( h p l c ) 和气质联用 ( g c m s ) 方法已有很多报道，但是，巴比妥类药物极性很强，生物检材基质复杂，所以， h p l c 无法满足法庭毒物分析特异性强、定性准确的要求，而g c m s 方法灵敏度低、需要 衍生化。本文以血液为生物检材，以乙酰水杨酸为内标，建立快速、灵敏、特异性强、灵 敏度高的l c m s m s 分析常见巴比妥类药物方法，分析子离子产生的机制，并将方法应用 于实践。 材料与方法 一、试剂 巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、硫喷妥钠和内标乙酰水杨酸等均购自 上海药物所，用于流动相的乙腈、甲酸和乙酸胺购自f l u k a 公司，其它试剂均为国产分析 纯。 二、仪器及条件 2 1 仪器a p p l i e db i o s y s t e m s 公司的四极杆l c m s m s ( a p i4 0 0 0 ) 2 2 条件液相：液相柱为c o s m o s i lp a c k e dc o l u m n ( 1 5 0 m m x 2 0 m m x 5 r m a ) ，前接p h e n o m e n e x 的保护柱。流动相为乙腈：缓冲液( 7 0 ：3 0 ) ，缓冲液为2 0 m m o l l 乙酸胺和2 甲酸的溶液。 恒流2 0 0 i t l m i n 。 质谱：采用电喷雾电离负离子模式( e s i ) ，操作参数分别为：碰撞气( c o l l i s i o ng a s ) ，7 ；气 帘气( c u r t a i ng a s ) ，3 0 ：离子喷雾电e , ( i o n s p r a yv o l t a g e ) ，5 5 0 0 ：温度( t e m p e r a t u r e ) ，5 0 0 。c 。 2 3 样品前处理方法 血液l m l 加入内标1 0 1 t l ( 1 m g m l 乙酰水杨酸) ，加入2 滴o 1 m o l l h c l ，加入3 5 m l 乙醚，混旋，离心，取有机层，6 0 。c 水浴中氮气流下吹干，残余物中加入2 0 0 肛l 流动相， 取5 吐进样。 一护娜矿嚣霹砸、蛰篓! 童_ 一、质谱解析村。譬与每矿嘭夸彩乜、嚣i 肇贸、岛一。f ! 毒7 ， 巴比妥类药物极性强，采用电喷雾里离一正随塑式( e s i + ) 离子化效果差巧z 敏度菲常哆 低。某雨奄磺季百酉j 丽氟矗i 骑大大提高灵敏度，更可避免金属离子的干扰3 l 】。也 串联质谱中，在电喷雾电离负离子模式下，巴比妥类药物脱离一个质子形成负的分子 离子 m h 】一。在碰撞池中，巴比妥类药物( 硫喷妥除外) 经过反d i e l s a l d e r 重排( r d a 彳 反应) ，脱去州z 4 3 ( h n c o ) 成为丰度最强的子离子。另一碎片离子产生方式，是环断裂后： 脱去相连的边链，形成碎片离子r r d z 8 5 ( h n = c ( o - ) 一n = c = o ) ( 硫喷妥除外) ；硫喷妥在环断 裂后脱去相连的边链，形成碎片离子t r d z l 0 1 ( h n = c ( s ) 一n = c = o ) ，再脱左m z 4 3 ( 一h n c o ) 形成丰度最强的子离子m z 5 8 。巴比妥类药物的质谱数据见表1 4 。 表1 4 巴比妥类药物的质谱数据 中文名英文名 母离子( m z ) 子离子( m z )d p ( v ) c e ( m v ) 笨巴比妥p h e n o b a r b i t a l 2 3 1 0 - 4 51 8 8 01 4 二、方法的建立与评价 由图1 2 可看到，液相色谱分离良好，减少离子抑制作用。 l 一心j 睦一 图1 2 五种巴比妥类约物的m r m 色谱图 每个化合物选取两个离子对定性，采用第一个离子对定量分析，空白血液添加目标物 ( 混合物) ，以第二个离子对峰强度信噪比s n 3 确定最低检测限( l d d ) ，增加了分析的准 确性和特异性。 参照巴比妥类药物的治疗浓度，准确取不同量的巴比妥类药物，分别加至l m l 空白血 液中，按1 3 法提取，然后进行l c m s m s 分析。以待测物峰面积和内标峰面积之比y 对 浓度x 作线性回归，结果表明在所实验的浓度范围内均成良好的线性关系，见表1 5 。方法 的l o d 均为1 0 n g m l ，足以满足临床和法庭毒物分析的需要。 表1 5 巴比妥类药物的标准曲线及最低检测限 2 2 精密度与回收率 取空白血液l m l ，分别添加2 0 n g m l 和1 u g m l 浓度，按1 3 法提取，然后进行 l c m s m s 分析。测得各物质与内标峰面积的比值，计算变异系数，均小于1 2 。回收率 以2 0 n g m l 和l u g m l 浓度的空白血液添加与同样浓度对照品的峰面积比率计算。见表1 6 。 表1 6 方法的精密度与回收率( n = 6 ) 结论 本研究所建立的同时分析五种巴比妥类药物的方法简便、快速、无需衍生化、特异性强、 灵敏度高，分析范围广，可以满足i 临床毒物和法庭毒物分析的需要。 研究之八体液中1 3 2 种药物的l c m s m s 筛选分析 引言 生物检材中毒药物筛选分析始终是法医毒物学和临床毒物学面临的一个重要研 究课题，方法的高灵敏度、高可靠性是筛选分析具有实际应用价值的基本要求。血液 由于血药浓度反映了药物作用强度和中毒程度而成为法医毒物学中最常见、最重要的 检材，但同时受低血药浓度的限制，通常仅用于定量分析。随着分析技术的发展，高 灵敏度、高选择性的l c m s 和g c m s 技术使低药浓的血液检材用于毒药物筛选分析 成为可能。本研究以低药浓的血液检材为对象，建立基于l c m s m s 的m r m 技术的 血液毒药物筛选和确认方法，并考察了方法的有效性。 材料与方法 一、检测方法 1 试剂 1 3 2 种毒药物标准品、对照品和氘代内标来源于s i g m a 公司、c e r i l l i a n t 公司和 国家麻醉品实验窒，用于流动相的甲醇、乙腈、甲酸和乙酸胺购自f l u k a 公司，其 它试剂均为国产分析纯。 2 l c m s m s 方法 a p p l i e db i o s y s t e m s 公司的四极杆l c m s m s ( a p i4 0 0 0 ) 色谱条件：液相柱：a l l u r ep f pp r o p y l5 1 a n1 0 0 x 2 1 m m ( r e s t e c k 公司) ，接 p h e n o m e n e x 保护柱。流动相：乙腈：2 0 r a m 乙酸胺和o 1 甲酸缓冲液( 7 0 ：3 0 ) ，恒流 2 0 0 k t l m i n 质谱条件：电喷雾电离一正离子模式( e s i + ) ，操作参数：碰撞气( c a d ) ：7 ；气帘气 ( c u r ) ：3 0 ；离子喷射电压( i s ) ：5 5 0 0 ：雾化气温度( t e m ) ：5 0 0 0 c 。 筛选分析选取毒药物的一对母离子，子离子。在各毒药物的最佳碰撞电压( c e ) 和 去簇电压( d p ) 条件下，m r m 包含检测1 3 2 种离子反应，离子驻留时间d w e l l t i m e 5 1 0 i l l s ，总循环时间2 s 。确认分析选取毒药物两对母离子，子离子。1 3 2 种毒药物的m s m s 条件见表1 。 二、标准溶液的制备与贮存 1 3 2 种毒药物标准品、对照品均配制成1 0 0 9 9 m l 甲醇贮备液，实验中所用其它浓 度的标准溶液均从上述标准贮备液稀释而得。 三、样品前处理方法 1 液液提取法：血液、尿液提取参照沈敏4 报导方法。 取空白血液或尿液l m l ，添加适量混合物工作液和内标，加入2 m l p h 9 2 磷酸缓 冲液后用3 5 m l 乙醚，混旋，离心，提取。有机层于6 0 。c 水浴中挥干，加入1 0 0 - t l 流动相，取5 “l 进样。检血或检尿同上处理。 2 取尿液或唾液5 0 ：，添加内标后加入o 9 5 m l 流动相，混旋，离心，取上清液5 “l 进样。 结果与讨论 筛选分析范围为预选定的常见毒药物，包括违禁药物阿片类、苯丙胺类、大麻酚 类，杀虫剂有机磷类、氨基甲酸酯类，药物苯二氮卓类、抗抑郁药类、抗癫痫、哮喘 类、解热镇痛类以及常见治疗药物等。1 3 2 种目标物以及m s m s 条件、保留时间和最 低检出限见表。 以两个母离子子离子对和保留时间建立目标物的l c m s m s 库。筛选分析若出现 可疑色谱峰，可通过l c m s m s 库检索提供可能的化合物。在此基础上用已建立的各 类化合物的更灵敏、更特异性的方法进行确认，包括增加至两个母离子子离子对，更 换流动相或液相柱等。 表1 7 血液中1 3 4 种毒药物的l c m s m s 分析 去甲麻黄碱 n o r e p h d r i n e 苯丙胺 a m p h e t a m i n e 甲胺磷 m e t h a m i d o p h o s 苯丁胺p h e n t e r m i n e 甲基苯丙胺 m e t h a m p h e t a m i n e 苯丙醇胺p h e n y l p r o p a n o l a m i n e 扑热息痛 a c e t a m i n o p h e n o l 甲基苯丙胺- d 5m e t h a m p h e t a m i n e - d 5 尼古丁m c o t m c 麻黄碱e p h d r i 速灭威 m e t o l c a r b 尼古丁埘 n i c o t l n e - d 4 可铁宁c o t i n i n e 尼克刹米 n i k e t h a m i d e m d am d a ；i；1 l o 0 1 o o 1 o o 0 0 o o o n 跖屹拍n盯9 4凹卵：2鳄鼹竹叭 王i l & & 3 t t l t l l i 孔 n 狮 协撕 殂 纺堪 拇 勰 u 拍蝤 加 加 如 如 粥 柏 如 ：2 j j j 3 2 2 j j 2 2 j ! 宝m 舛 虬m m m 虬 啪 m 瑚m m 瑚m 2 1 1 ， l 1 3 2 2 1 1 l 2 3 1 弭弱舵坝钇记鲐酯 的卵丌侈舳 美西律 m e x i l e t i n e 乙酰甲胺磷 a c e p h a t e 爱康宁 e c o g n i a e 叶蝉散 i s o p r o e a r b m d m a m d m a b d b b d b 咖啡因 c a f f e i n e 爱康宁甲酯 e c o g m a e e s t e r 西维因 c a r b a r y l m d em d e m b d b m b d b 氧乐果 o m c d o a t e 眠尔通 m e p r o b a m a t e 扑米酮p r i m i d o n e m d p am d p a 呋喃丹f u r a d a a 敌敌畏d i c h l o r v o s 去甲氯胺酮n o r k e t a m i n e 久效磷 m o n o c r o t o p h o s 乐果d i m e t h o a t e 萘普生 n a p r o x e n 可乐定c l o n i d i n e 芬氟拉明f e n f l u t a m i n e 氨基比林 a m i n o p h e n a z o n e 去甲度冷丁 n o n n c p e r i d i n e 利多卡因l i d o c a i n e 普鲁卡因p r o c a i n e 卡马西平 c a r b a m a z e p i n e 氯胺酮k e t a m i n e 抗蚜威p i r i m i c a r b 舒喘宁 s a l b u t a m o 氯胺酮d 4k e t a m i n e - d 4 度冷丁 m e p e r i d i n e 7 - 氨基硝基安定7 a m i n o n i t r a z e p m 1 8 0 25 8 2 5 0 1 8 4 1 4 3 15 5 1 8 6 2 1 6 8 35 7 1 9 4 1 1 3 7 25 5 1 9 4 21 6 3 4 3 5 1 9 4 21 3 5 35 0 1 9 5 2 1 3 8 25 0 2 0 0 21 8 2 2 5 2 2 0 2 11 4 5 25 0 2 0 8 2 1 6 3 35 0 2 0 8 31 7 7 5 0 2 1 41 5 5 1 5 0 2 1 9 21 5 8 25 0 2 1 9 2 1 6 2 35 5 2 2 2 21 6 3 3 5 0 2 2 2 21 6 5 2 5 0 2 2 3 1 1 2 7 16 0 2 2 4 i2 0 7 1 4 0 2 2 4 1 1 2 7 1 5 0 2 3 01 9 94 5 2 3 1 21 8 5 46 0 2 3 2 11 6 2 3 6 0 2 3 2 21 5 9 32 0 2 3 2 31 1 1 25 0 2 3 4 21 6 0 3 7 5 2 3 5 2 8 6 33 5 2 3 7 21 0 0 2 5 0 2 3 7 31 9 4 36 0 2 3 8 1 1 7 9 14 0 2 3 9 17 2 5 0 2 4 0 11 4 8 25 0 2 4 2 2 1 8 3 14 0 2 4 8 32 2 0 3 5 0 2 5 2 21 2 1 18 0 3 7 7 0 2o 1 2 2 31 1 3 1 2 2 30 1 5 9 30 1 5 8 1 0 1 2 8 6 0 1 3 8 31 2 2 0 1 6 8 l 0 1 6 8 80 1 1 3 61 1 4 9 0 1 1 4 1 1 0 8 30 1 2 o l0 1 2 1 7 0 1 3 5 40 1 1 4 60 1 1 6 70 1 2 4 41 0 6 0 71 0 1 0 3 80 1 2 1 11 8 3 20 1 6 6 50 1 5 3 71 0 1 7 6 0 1 5 30 1 2 7 40 1 3 0 7 1 0 5 3 1o ，1 8 4 90 1 1 51 忽屹 巧 ”堪挎 捞笱 h 均 塔恐! 坶 笛 垮加n 驰 弛n 为勰娩 拍 巧绚勰拍如 拉莫三嗪l a m o 唧 苯海拉明d i p h e i l l l y d m m i 敌百虫 n i c i l l o 渤n 甲拌磷p h o r a t e 肌安宁c a 【i s o p m l o l 甲基对硫磷p a r a t h i 一m 劬y l 曲马多t r a m a d o l 去甲替林 n o 耐p t y b n e 丁卡因t r f r a c a i n c 阿替洛尔a t e n o l o i 去甲安定 n o r d i a z e p a m 美沙芬d c x k 血o r p h u m 扑尔敏c m 唧h e m r a 酝m 去氢替林c y c l o b e n z a p i i n e 克仑特罗d e n b u 酬 杀螟松 f e i l i 仰t l i i 仰 阿米替林 a m i m p $ y h n e e d d p e d d p 多虑平d o x e p i n 丙昧嗪 i l l l i p m 嘶 酚妥拉明p l l e n t o l a