（细胞生物学专业论文）pak4与p54蛋白相互作用的验证.pdf

目录 j!ifilil iirfll ll lrjif l l l r l l f i liflill y 17 6 9 4 2 8 摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 英文缩略语6 论文 前言1 日u 百 材料与方法9 实验结果2 1 讨论3 0 结论3 2 本研究创新性的自我评价3 3 参考文献3 4 附录 综述3 7 在学期间科研成绩4 5 致谢4 6 个人简介4 7 ， ， ， ， ， ， 一 二 三 四五六 中文著论摘要 p a k 4 与p 5 4 蛋白相互作用的验证 目的 p 2 1 活化激酶( p 2 1 a c t i v a t e dk i n a s e ，p a k ) 为一类进化上保守的丝氨酸苏氨酸 蛋白激酶。p a k 在许多组织中广泛表达，为r h o 家族小鸟苷三磷酸酶( r h o g t p a s e ) c d c 4 2 r a c 、生长因子和细胞外信号的下游主要靶蛋白，参与许多重要细胞活动。 p a k 家族共有6 个家族成员：皆含有氨基末端( n 末端) 调节区和羧基末端( c 末端) 激酶区。根据它们结构特点及相似性，可分为两大类：i 类p a k ( p a k l p a k 3 ) 和i i 类p a k ( p a k 4 p a k 6 ) 。两类p a l ( 在结构、活化方式、生物学功能上有着很 大的区别，它们具有不同的下游靶蛋白。p a k 4 是目前研究的最为广泛的i i 类p a k ， 其功能特点比较明确。随着p a k 4 下游蛋白的不断发现，已明确其在许多生物学 活动如细胞骨架重排、细胞迁移、细胞凋亡中发挥重要作用。最新研究发现，p a k 4 还参与神经系统的发育过程。 p 5 4 是本实验室利用酵母双杂交技术从人胎脑c d n a 文库中筛选出的p a k 4 新的 相互作用蛋白。p 5 4 蛋白是一种神经特异性的蛋白，在神经生长过程中能够在生长 核处富集，调节轴突的延伸，p 5 4 蛋白能够在中枢神经系统和( c n s ) 周围神经系 统( p n s ) 中表达，是有效的微管不稳定因子，膜相关蛋白。也有相关文章报道，p 5 4 蛋白与肿瘤有一定的联系。p 5 4 的发现为p a i “肿瘤信号通路的进一步完善提供了 新的依据，为p a k 4 参与神经元的发育以及迁移过程提供新的线索。本课题旨在证 实p a k 4 与p 5 4 的相互作用关系，进而初步探讨其生物学功能。 实验材料与方法 一、实验材料 1 、基因克隆相关分子生物学试剂。 2 、酵母双杂交和酵母质粒提取相关试剂。 3 、体外转录试剂盒。 二、实验方法 1 、顺序转染法筛选p a k 4 相互作用蛋白p 5 4 。 2 、在a h l 0 9 酵母菌中验证p a k 4 与p 5 4 相互作用。 3 、在大肠菌b l 2 1 中诱导p 5 4 蛋白的表达并纯化。 4 、利用g s t - p u l ld o w n 实验体外验证p a k 4 与p 5 4 相互作用。 5 、利用免疫沉淀验证p a k 4 与p 5 4 在体内相互作用。 6 、利用免疫荧光方法观察p 5 4 亚细胞定位及与p a k 4 的共定位。 结果 酵母双杂交实验筛选出p a k 4 新的相互作用蛋白p 5 4 ，将其共转到a h l 0 9 酵 母菌中，进行酵母体内验证，结果显示两者能够相互作用。g s t - p u l ld o w n 实验 结果进一步证实了两者在体外的相互作用。免疫沉淀实验验证了两者的体内相互 作用。通过共聚焦显微镜观察p 5 4 蛋白定位在细胞浆，且p 5 4 与p a k 4 两者在细 胞浆有共定位。 结论；口匕 1 、p 5 4 是p a k 4 新的相互作用蛋白。 2 、通过酵母双杂交共转染技术，验证了p a k 4 与p 5 4 之间发生相互结合。 3 、通过体内p 和体外g s t - p u l ld o w n 实验证实p a k 4 能与p 5 4 相互作用。 4 、通过共聚焦实验证实p 5 4 定位在细胞浆，且在细胞浆中两者有共定位。 关键词 p 触“；酵母双杂交；p 5 4 2 英文论著摘要 c o n f i r m i n g t h ei n t e r a c t i o no fp a k 4w i t hp 5 4 p r o t e i n o b j e c t i v e p 21 a c t i v a t e dk i n a s e ( p a k ) i so n eo ft h ee v o l u t i o n a r i l yc o n s e r v e df a m i l i e so f s e r i n e t h r e o n i n ep r o t i e i nk i n a s e s p a kw i d e l ye x p r e s s e di nm a n yt i s s u e s ，i sa d o w n s t r e a me f f e c t o ro fs m a l lg t p a s ec d c 4 2 r a ca n dg r o w t hf a c t o rs i g n a l i n g ，w h i c h h a sb e e ni m p l i c a t e di naw i d er a n g eo fb i o l o g i c a la c t i v i t i e s u n t i ln o w , p a kf a m i l yh a s 6m e m b e r sw h i c hc o n t a i na nn - t e r m i n a lr e g u l a t o r yd o m a i na n dac - t e r m i n a lc a t a l y t i c d o m a i n p a k sa r en o wc a t e g o r i z e di n t ot w os u b g r o u p sb a s e do na r c h i t e c t r u a l s i m i l a r i t i e s t h eg r o u pic o n t a i n sp a k l - 3 ，a n dt h eg r o u pi ic o n t a i n sp a k 4 - 6 t h e r e a r em a n yd i f f e r e n c e sb e t w e e nt h et w op a ks u b g r o u p so nt h es t r u c t r u e ，r e g u l a t i o no f a c t i v i t y , b i o l o g i c a lf u n c t i o na n dp a k sm a y h a v ed i f f e r e n td o w n - s t r e a mt a r g e tp r o t e i n s c u r r e n t l np a k 4i sm o s te x t e n s i v e l ys t u d i e dm e m b e r o ft h eg r o u pi ip a k s , t h ef e a t u r e a n df u n c t i o no fp a k 4i sm o s t l yc l e a r w i t ht h ei d e n t i f i c a t i o no fp a k 4d o w n - s t r e a m t a r g e tp r o t e i n s ，i ti sc l e a r t h a tp a k 4p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nm a n yb i o l o g i c a l a c t i v i t i e si n c l u d i n gc y t o s k e l e t o nr e a r r a n g e m e n t ，c e l lm i g r a t i o n ，a n dc e l la p o p t o s i s t h e l a t e s tr e p o r ts h o w st h a tp a k 4a l s oi n v o l v e si nt h ed e v e l o p m e n to fn e u r a ls y s t e m p 5 4i san e wp a k 4b i n d i n gp r o t e i nw h i c hh a sb e e ns c r e e n e df r o mt h eh u m a nf e t a l b r a i ne d n al i b r a r yb yu s i n gy e a s tt w oh y b r i da s s a y p 5 4i sb e l i e v e d t ob e n e u r o n a l s p e c i f i ct h a ti se n r i c h e di nt h eg r o w t hc o n e so fd e v e l o p i n gn e u r o n sa n dp l a y s ar o l ei nr e g u l a t i n gn e u r i t eo u t g r o w t h i na l ls p e c i e se x a m i n e ds of a r , p 5 4i se x p r e s s e d i nb o t ht h ec n sa n dp n s a n da l s op 5 4i sap o t e n tm i c r o t u b u l ed e s t a b i l i z i n gf a c t o ra n d m e m b r a n ea s s o c i a t e d t h e r ei sa na r t i c l ew h i c hr e p o r t e dt h a tp 5 4i sa s s o c i a t e d 谢t ht h e i n v a s i o na n dm e t a s t a s i so ft u m o r t h ed i s c o v e r yo ft h eb i n d i n gb e t w e e np a k 4a n dp 5 4 p r o v i d e san e wb a s i sf o rt h ei n v e s t i g a t i o no ft u m o rs i g n a l i n gp a t h w a y m e a n w h i l e ，i t p r o v i d e sn e wc l u e s f o rt h ep a k 4p a r t i c i p a t i o no fn e u r o n a ld e v e l o p m e n ta n dt h e 3 m i g r a t i o np r o c e s s o u ra i mw a st oc o n f i r mt h ei n t e r a c t i o no fp a k 4 、析t hp 5 4a n dt o i n v e s t i g a t et h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no ft h en e wp a k 4b i n d i n gp r o t e i np 5 4i nt h i ss u b je c t m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 m a t e r i a l s ( 1 ) r e a g e n t sf o rg e n ec l o n i n g ( 2 ) r e a g e n t sf o ry e a s tt w oh y b r i da n de x t r a c tf o ry e a s tp l a s m i d s ( 3 ) t n tq u i c kc o u p l e dt r a n s c r i p t i o n t r a n s l a t i o ns y s t e m sk i t 2 m e t h o d s ( 1 ) s c r e e np a k 4i n t e r a c t e dp r o t e i np 5 4b ys e q u e n c i n gt r a n s f o r m a t i o nm e t h o do f y e a s tt w o - h y b r i d ( 2 ) c o n f i r mi n t e r a c t i o no fp a k 4a n dp 5 4i ny e a s ts t r a i na h 10 9 ( 3 ) e x p r e s sa n dp u n f yt h ep 5 4p r o t e i ni ne c o l ib l 2 1 ( 4 ) c o n f i r mi n t e r a c t i o no fp a k 4w i t hp 5 4i nv i t r ob yg s t - p u l ld o w n ( 5 ) c o n f i r mi n t e r a c t i o no fp a k 4w i t hp 5 4i nv i v ob yi m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( 6 ) c o n f i r mt h el o c a l i z a t i o no fp 5 4a n dt h ec o - l o c a l i z a t i o no fp 5 4a n dp a k 4b y i m m u n o f l u o r e s c e n c e r e s u l t s t h er e s u l to fy e a s tt w o h y b r i ds h o w e dt h a tp 5 4i st h en e wi n t e r a c t i n gp r o t e i no f p a k 4a n dt h er e s u l to fc o t r a n s f o r m a t i o nt e s ts h o w e dn u “c a ni n t e r a c tw i t hp 5 4 c o r f f l m a i n g i m e r a c t i o no fp a k 4w i t hp 5 4b ym e t h o do fg s t - p u l ld o w na n d i m m u n o p r e c i p i t a t i o nt h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tp 5 4c a ni n t e r a c t 、析t l lp a k 4i nv i t r oa n d v i v o w ef o u n dt h a tt h el o c a l i z a t i o no fp 5 4i sa tc y t o p l a s ma n da tt h es a m et i m et h et w o p r o t e i n sh a v ec o - l o c a l i z a t i o n c o n c l u s i o n s 1 p 5 4i st h en e w i n t e r a c t i n gp r o t e i no f p a k 4 2 t h r o u g ht h ey e a s tt w o - h y b r i dc o t r a n s f e c t i o nt e c h n i q u e s t o v e r i f y t h e i n t e r a c t i o no fp a k 4a n dp 5 4 4 3 c o n f i r m i n gi n t e r a c t i o no fp a k 4a n dp 5 4b ym e t h o do fg s t - p u l ld o w na n d i m m u n o p r e c i p i t a t i o ni nv i t r oa n dv i v o 4 t h r o u g ht h ei m m u n o f l u o r e s c e n c ec o n f i r mt h a tt h el o c a l i z a t i o no fp 5 4i s a t c y t o p l a s ma n da tt h es a m et i m et h et w op r o t e i n sh a v ec o - l o c a l i z a t i o n p a k 4 ，y e a s tt w o - h y b r i d ，p 5 4 k e y w o r d s 5 英文缩略语 6 论文 p a k 4 与p 5 4 蛋白相互作用的验证 前言 p 2 1 活化激酶( p 2 1 a c t i v a t e dk i n a s e ，p a k ) 为一类进化上保守的丝氨酸苏氨酸 蛋白激酶。p a k 在许多组织中广泛表达，为r h o 家族小鸟苷三磷酸酶( r h o g t p a s e ) c d c 4 2 r a c 、生长因子和细胞外信号的下游主要靶蛋白，参与许多重要细胞活动， 发挥多种生物学效应。p a k 家族共有6 个家族成员：p a k l 一p a k 6 ，根据它们结构 特点及相似性，可分为两大类：i 类p a k ( p a k l p a k 3 ) 和i i 类p a k ( p a i “p a k 6 ) 【l 】。其中存在于大多数被检测的组织中，如在前列腺和睾丸、大肠、脑组织、 肾、胎盘中含量较高1 2 。p a l “也是目前研究的最为广泛的i i 类p a k ，其功能特 点比较明确。 p a k 4 是p a k 家族i i 类p a k 成员之一，其结构与其他成员既有相似性，也有 不同点。p a k s 均包含n 一末端调控域，其中包括p 2 1 ( c d c r a c l ) 结合域 ( p 2 1 b i n d i n gd o m a i n ，p b d ) 和i 高度保守的c 一末端激酶域。其中p a k l 的n 一末端调 节区含g t p 酶结合域( g t p a s eb i n d i n gd o m a i n ，g b d ) ，它可介导p a k l 与r a c 和 c d c 4 2 的结合1 3 ，在c 末端有一个高度保守的激酶域。n 末端调节区有数个富含 脯氨酸区域，可结合含有s h 3 结构域的接头蛋白n c k 介导生长因子信号【4 】，在 p a k l 的调节区有一个与p b d 部分重叠的自我抑制域( a u t o i n h i b i t o r yd o m a i n ， a i d ) ，可以形成与p b d 部分重叠的“抑制开关 ，调节p a k l 的激酶活性。在g b d 和激酶区间含有s h 3 结合点，可结合p a k 相互作用交换因子p d u c o o l 家族【5 j 。 p a k 4 的n 末端虽含有g b d ，但它缺乏自我抑制域、p d u c o o l 结合域。其g b d 和激酶区只与p a k l 具有不到5 0 同源性，其余氨基酸序列则完全不同【6 】。 p a k 4 的结构不同于i 类p a k 成员，其活化机制、活性调节也表现出明显的 不同，具有其独特的方式。i 类p a k 的活化包括g t p a s e 依赖的活化机制和非 g t p a s e 依赖的活化机制，r h o 家族g t p a s e ( r a c l 、r a c 2 、r a c 3 、c d c 4 2 、c h p 、 t c p l 0 及w r c h - 1 ) 可以结合并活化p a k l 7 ，引，r a c 和c d c 4 2 可作为膜结合蛋白， 7 使p a k l 3 与其结合后定位到细胞膜，在质膜内被鞘磷脂及p d k l 所活化【9 】。p a k s 激活后并不需要g t p a s e 继续结合来维持其活性。i 类p a k 的非g t p a s e 依赖的活 化机制。p a k s 可被限制性蛋白酶消化，产生有激酶活性的c 末端。p a k 2 被 c a s p a s e 3 消化，产生3 4 k d 的c 末端片断，具有完全的激酶活性1 9 。p a k l 被含有 s h 3 结构域的接头蛋白( n e k 、g r b 2 ) 引导到细胞膜后，由酪氨酸受体激酶活化。 许多生长因子受体可以刺激鞘磷脂的代谢反应，直接激活p a k l 。外源性激酶如 p d k l 依赖于鞘磷脂磷酸化p a k l 的t h r 4 2 3 位点使其活化【l o 】。i i 类p a k 虽可结合 c d c 4 2 r a c l ，却不能被其活化。g t p c d c 4 2 结合p a k 4 5 并不激活其激酶活性【1 l ， 1 2 1 。只含有c 末端激酶域的截短p a k 4 6 9 1 2 】比全长具有更强的活性，提示类 p a k 也可通过分子内的方式调节活性。 p a k 4 在许多生物学活性的调节过程中起着重要作用。如细胞骨架的重组，丝 状伪足的形成，细胞黏合、细胞信号转导途径的激活、胚胎的正常发育及细胞的 致癌性转化中有着重要的生物学作用。p a k 4 是第一个被发现的具有连接c d c 4 2 和 肌动蛋白细胞骨架的p a k s 家族成员。p a k 4 通过g t p 酶结合域( g b d ) 与活化的 c d c 4 2 结合，尽而诱导丝状伪足形成和肌动蛋白的聚集。同时p a k 4 通过磷酸化r h o 家族鸟嘌呤核苷交换因子g e f h 1 的s e r 8 1 0 位点来阻断g e f h 1 依赖的应力纤维的 形成，而促进了细胞片状伪足的形成【1 3 】。p a k 4 通过磷酸化丝氨酸激酶l i m k - 1 2 t h r 5 0 8 和5 0 5 位点，调节肌动蛋白细胞骨架动力学。同时，在肿瘤的发生、发展过 程中，p a k 4 也起了重要的作用。也有研究发现p a k 4 与神经元的发育以及迁移过 程有关。 本课题主要是利用酵母双杂交的方法，从人胎脑e d n a 文库中筛选p a k 4 相 互作用蛋白p 5 4 ，通过体内体外实验进一步验证两者的相互作用，为p a k 4 信号 通路的研究提供了新线索。 p 5 4 是本实验室利用酵母双杂交技术从人胎脑c d n a 文库中筛选出的p a k 4 新 的相互作用蛋白。p 5 4 蛋白是一种神经特异性的蛋白，在神经生长过程中能够在生 长核处富集，调节轴突的延伸，p 5 4 蛋白能在中枢神经系统( c n s ) 和周围神经系 统( p n s ) q b 同时表达【1 4 1 。它是有效的微管不稳定因子，膜相关蛋白。 p 5 4 是一个蛋白家族，在这个家族中共有4 个蛋白分子，这个蛋白家族的主要 8 功能是通过抑制微管聚合促进微管解聚来调节微管动力学【1 5 】。p 5 4 作为家族中的一 员，其自身结构上有三个功能区域，分别是n 末端的膜结合区域，中心调节区域 和一个c 末端的卷曲螺旋区域【】6 - 1 。在中心调节区域中有m a p 和p k a 激酶的磷酸化 位点，这些磷酸化位点能够调节微管蛋白的解聚【1 7 1 。它的c 末端的卷曲螺旋区域 被认为是蛋白的相互作用区域也；是p 5 4 与微管蛋白和细胞骨架相互结合的区域【1 8 1 。 n 末端含有3 5 个氨基酸，这3 5 个氨基酸是家族中其他成员所不具有的。这3 5 个氨 基酸对其在高尔基体定位及在生长核的富集起着至关重要的作用1 9 2 0 1 。 微管对于神经系统发展和成熟至关重要，在分化的神经元细胞中微管的主要功 能是作为细胞骨架的结构元件，同时对胞内运输也有重要作用。在神经系统的发 展过程中，微管动力学对轴突的定向延伸以及分化也是十分重要“2 。p 5 4 蛋白作 为一种微管不稳定因子，是新的p a k 4 相互作用蛋白。p 5 4 的发现为p a k 4 参与神经 元的发育以及迁移过程提供新的线索。同时，也有文章报道，p 5 4 与肿瘤的发生发 展有一定的联系，所以p 5 4 的发现也为p 蛆“肿瘤信号通路的进一步完善提供了新 的依据。 本课题旨在证实p a k 4 与p 5 4 的相互作用关系，进而初步探讨其生物学功能。 材料和方法 一、材料 ( 一) 菌株、载体、细胞 l 、大肠杆菌( e c o l i ) d h 5 0 t ，b l 2 1 ( 本实验室保存菌种) 。 2 、酵母菌a h l 0 9 ( c l o n t e c h 公司) 。 3 、p g b k t 7 ，p g a d t 7 ，p a c t 2 ，p g a d t 7 - t ，p g b k t 7 5 3 ，p g b k t 7 一l a r n ( c l o n t e c h 公司) ，p e g f p c ( c l o n t e c h 公司) ，p e g f p - p 5 4 ，p g e x 一5 x 一1 - p 5 4 ， p e b g - p 5 4 。p g b k t 7 和p a c t 2 质粒含有t r p l 基因、g a i a ( 1 - 1 4 7 ) d n a 结合 区( g a i a b d ) ，p g a d t 7 质粒含有l e u 2 基因和g a i a ( 7 6 8 8 8 1 ) 激活区 ( g a l 4 a d ) ，p g a d t 7 t 和p g b k t 7 5 3 质粒分别含有s v 4 0 大t 抗原( 8 4 7 0 8 ) 和鼠p 5 3 ( 7 2 3 9 0 ) 的a d 和b d 的融合蛋白，作为双杂交的阳性对照；p g b k t 7 l a m 质粒含有人l a m i nc ( 6 6 2 3 0 ) 与b d 的融合蛋白，作为双杂交的阴性对照。 9 4 、人胎脑m a t c h m a k e re d n a 文库( c l o n t e c h 公司) 。 5 、真核表达载体p c d n a 3 1 - m y e h i sa ( 美国i n v i t r o g e n 公司) 。 6 、实验所用细胞均有中国医科大学细胞生物实验室提供。 ( 二) 主要实验试剂 1 、p c r 扩增试剂( t a k a r a 公司) 。 2 、胶回收纯化试剂盒( t a k a r a 公司) 。 3 、限制性内切酶( t a k a r a 公司) 。 4 、t 4d n a 连接酶( n e b 公司) 。 5 、丙烯酰胺( b i o s h a r p 公司) 。 6 、琼脂糖( b b i 公司) 。 7 、凝胶回收试剂盒( 宝信生物公司) 。 8 、质粒提取试剂盒( p r o m e g a 公司) 。 9 、l b 培养基、胰化蛋白胨和酵母提取物( o x o i d 公司) 。 1 0 、x q g a l ( c l o n t e c h 公司) 。 1 1 、酵母y p d a 培养基的蛋白胨( b b i 公司) 。 1 2 、s d 培养基、d o - t r p 、d o - l e u 、d o - t r p - l e u 、d o - t r p - l e u 一h i s 、 d o - t r p - l e u - h i s - a d e0 3 d 公司) 。 1 3 、半硫酸腺苷( s i g m a 公司) 。 1 4 、玻璃珠( s i g m a 公司) 15 、三氨基三唑( 3 - a m i n o - 1 ，2 ，4 一t r i a z o l e ，3 一a t ) ( s i g m a 公司) 。 1 6 、鲑精d n a ( h e r r i n gt e s t e sc a r r i e rd n a ) ( b d 公司) 。 1 7 、d m s o ( b b i 公司) 。 1 8 、p e g 4 0 0 0 ( b b i 公司) 。 、 19 、l y t i c a s e ( s i g m a 公司) 。 2 0 、t n tq u i c k c o u p l e dt r a n s c r i p t i o n t r a n s l a t i o ns y s t e m sk i t ( p r o m e g a 公司) 。 2 1 、脂质体转染试剂l i p o f e c t a m i n t m2 0 0 0 ( 美国i n v i t r o g e n 公司) 。 2 2 、t a qd n a 聚合酶、d n t p 、t 4 连接酶、限制性内切酶b g li i 和h i n d l i i 购 自日本t a k a r a 公司。 1 0 2 3 、琼脂粉( a g a r ) 、胰化蛋白胨( t r y p t o n e ) 、酵母浸出粉( y e a s te x t r a c t ) 购自英 国o x o i d 公司。 2 4 、胰蛋白酶、新生牛血清、r p m i1 6 4 0 干粉培养基购自美国g i b c o 公司。 2 5 、p a k 4 兔抗人( c e l ls i g n a l i n g 公司) 。 2 6 、a l e x 5 4 6 标记的二抗，t o p r 0 3 ( 美国m o l e c l al a r p r o b e s 公司) 。 其他常用试剂：1 mt r i s h c l 、p h 7 4 t e 、3 mn a a c 、2 0 s d s 、t e m e d 、p m s f 、 乙醇、异丙醇、酚、氯仿、葡萄糖均为分析纯、p b s 缓冲液( p h7 2 7 4 ) 、 0 5 m o l le d t a 缓冲液( p h8 o ) 。 ( 三) 主要实验仪器 1 、凝胶成像仪( k o d a kt r 3 0 2 公司) 。 2 、聚丙烯酰胺凝胶电泳系统( 美国b i o r a d 公司) 。 3 、p c r 扩增仪( p e r k i ne l m e r9 6 0 0 b i o m e t r at 1 t h e r m o c y c l e r ) 。 4 、台式高速低温离心机( s i g m a1 1 5 k s o r v a l lb i o f u g ep r i m or 公司) 。 5 、台式高速离心机( e p p e n d o r f 公司) 。 6 、恒温振荡器( 哈尔滨东联电子技术开发有限公司) 。 7 、超净工作台( 苏净集团安泰公司) 。 8 、细菌恒温培养箱( m m m 公司) 。 9 、水平摇床脱色摇床( 北京六一) 。 1 0 、c 0 2 孵箱( 美国q u e u l l ) 。 1 1 、倒置显微镜( 日本o l y m p u s ) 。 1 2 、荧光倒置显微镜( o l y m p u s ) 。 1 3 、l u m a tl b9 5 0 7 化学发光仪( 德国b e r t h o l dt e c h n o l o g i e s 公司) 。 1 4 、多通道共聚焦激光扫描显微镜( 德国l e i c at c s s p 2 ) 。 1 5 、激光扫描图像分析系统( 美国b i o r a d ) 。 二、方法 ( 一) p g b k t 7 p a k 4 b d 和p g b k t 7 一p a k 4 k d 质粒的酶切及测 序鉴定 根据p g b k t 7 质粒多克隆位点和p u “基因的酶切分析，最初选用的是n d e i 和b a m hi 作为克隆位点，所以验证时选用这两个酶切位点。酶切( 2 0l x l ) 反应 体系： 1 0 x kb u f f e r p g b k t 7 p a k 4 b d k d b a m h i n d e i 2 i l l 各1 p l o 5 1 x l o 5 1 x l 加d d h 2 0 补至总体积至2 0 t l 反应条件：3 7 酶切2 小时，用1 琼脂糖凝胶电泳检测 经酶消化后的片段大小分别与载体及插入片段大小对应，测序后比对结果正 确。 ( 二) 转染酵母蛋白表达的验证 按照c l o n t e c h 说明书上提供的p e g l i a c 的方法，将质粒p g b k t 7 p a k 4 b d 和p g b k t 7 p a k 4 k d 转染酵母菌a h l 0 9 。 1 、酵母感受态制备过程 ( 1 ) 取a h l 0 9 酵母菌一定量涂在y p d a 平皿上，3 0 倒置培养3 5 天。 ( 2 ) 挑取1 3 个a h l 0 9 酵母菌放入1 5 m l 的e p 管中打散( 1 m l y p d a 培养 基) ，将液体导入玻璃试管中，3 0 。c2 5 0 r p m 摇菌6 8 小时，再将其离心用l m l 培 养基重悬转入含有4 m l y p d a 培养基的玻璃试管中，3 0 c2 5 0 r p m1 5 2 0 小时震荡 培养制备菌液( o d 6 0 0 1 5 ) 。 ( 3 ) 取酵母菌液5 m l 加到含有5 0 m ly p d a 培养基的三角烧瓶中，3 0 c2 2 5 r p m 4 小时震荡培养( o d 6 0 0 达到o 5 + 0 1 ) 。 ( 4 ) 在超净工作台中取出菌液，常温1 , 0 0 0 x g 离心5m i n ，立即弃去培养基。 ( 5 ) 用5 0 m l 的灭菌水将酵母菌重悬，常温1 , 0 0 0 x g 离心5m i n ，弃去上清。 ( 6 ) 1 5 m l 的1 x t e l i a c ( d d h 2 01 2 m l ；1 0 x t e1 5 0 1 x l ；1 ml i a c1 5 0 b t l ) 重悬 酵母菌，反复吹打。将其转入灭菌的1 5 m le p 离心管中，1 4 ，0 0 0 g 离心1m i n ， 弃上清，加入3 0 0 t x l1x t e l i a c 制成感受态细胞。 1 2 2 、小量转染酵母过程 ( 1 ) 在1 5 m l 的e p 管中分别加入感受态酵母菌1 0 0l al ；质粒o 1 u g ( p g b k t 7 p a k 4 b d l 1 5 ) 。 ( a h10 9 p g b k t 7 一p a k 4 b d p g b k t 7 - p a k 4 k d - 5 m ls d - t r p ) ( 2 ) 将5 m l 的菌液加入到5 0 m l 的培养基中2 5 0 r p m3 0 * ( 2 震荡培养4 小时 ( o d 6 0 0 达0 4 0 6 ) 。 ( 3 ) 在1 0 0 m l 离心管中加入一半体积的冰，加入一半体积的菌液，使菌液迅 速冷确下来。1 , 0 0 0 x g4 5 m i n 离心，弃去上清。 ( 4 ) 加预冷的5 0 m ld d h 2 0 ，重悬菌液，1 , 0 0 0 x g4 c5 m i n 离心，弃上清。 ( 5 ) 将c r a c k i n gb u f f e r ( 含1 3 巯基乙醇) 预热到6 00 0 ，加入1 0 0 x p m s f 、 l e u p e p t i n 、a p e p t i n ，每7 5o d 6 0 0 单位菌中加入1 0 0 l al 的c o m p l e t ec r a c k i n g b u f f e r ( o d 6 0 0 单位菌= v 菌液o d 6 0 0 ) 。 ( 6 ) 将菌和c o m p l e t ec r a c k i n gb u f f e r 共同转到1 5 e p 管中，加入玻璃珠( 8 0 1 3 ul 7 5o d 6 0 0 单位菌) ，加热7 0 ，1 0 m i n 。 ( 7 ) 高速涡旋l m i n ，1 4 ，0 0 0 x g4 1 2 离心5 m i n ，吸取上清至另一灭菌1 5 m l e p 管中，放置于冰上冷却。 ( 8 ) 在沉淀中加入1 0 0l alc o m p l e t ec r a c k i n gb u f f e r ，1 0 0 。c 水浴中加热5 m i n ， 高速涡旋l m i n ，1 4 ，0 0 0 x g4 离心5 m i n ，再次吸取上清加入到第一管上清中。 w e s t e r nb l o t t i n g ： 制胶：配制1 0 的分离胶，5 的浓缩胶 s d s p a g e 电泳上样顺序为：a 蛋白m a k e r6l al ；b a h l 0 93 0ui ic a h l 0 9 - p g b k t 7 一p a k 4 k d3 0l al ：d a h l 0 9 p g b k t 7 删b d3 0i xi i 电压8 0 1 1 0 v 。 ( 1 ) 7 0 v 电压，4 c 快速转印3 h ，取出p v d f 膜，切膜，t b s t 清洗一次。 ( 2 ) 用t b s t 配5 的脱脂奶粉封闭p v d f 膜常温2 小时，t b s t 清洗一次。 ( 3 ) a n t i c m y c 一抗1 ：5 0 0 稀释孵育p v d f 膜4 过夜，次日t b s t 清洗 三次( 1 0 m i n 次) 。 ( 4 ) 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠( 1 ：5 0 0 0 稀释) 二抗常温孵育2 小时， t b s t 清洗三次( 1 0 m i n 次) 。 ( 5 ) 、e c l 发光。 ( 三) 顺序转染法筛选p a k 4 相互作用蛋白 按照c l o n t e c h 说明书上提供的小剂量p e g l i a c 酵母转染的方法，将胎脑文 库质粒顺转到已转入p g b k t 7 p a k 4 b d 和p g b k t 7 - p a k 4 k d 的a h l0 9 菌中。 1 、酵母感受态制备过程 ( 1 ) 取a h l0 9 ( p g b k t 7 p a k 4 b d p g b k t 7 - p a k 4 k d ) 酵母菌在s i ) - t r p 平板上划线，3 0 倒置培养4 - 6 天。 ( 2 ) 挑取2 3 个2 - 3 m m 的a h 10 9 ( p g b k t 7 - p a k 4 b d p g b k t 7 - p a k 4 k d ) 菌落于5 m ls d - t r p 培养基中，3 0 c2 5 0 r p m1 5 2 0 小时震荡培养制备菌液 ( o d 6 0 0 1 5 ) 。 ( 3 ) 取酵母菌液5 m l 加到含有5 0 m l s d - t r p 培养基的三角烧瓶中，3 0 c 1 4 2 5 0 r p m4 小时震荡培养( o d 6 0 0 达到0 5 + 0 1 ) 。 ( 4 ) 取出菌液，常温1 , 0 0 0 x g 离心5m i n ，立即弃去培养基。 ( 5 ) 用5 0 m l 的灭菌水将酵母菌重悬，常温1 , 0 0 0 x g 离心5 m i n ，弃去上清。 ( 6 ) 1 5 m l 的1 x t e l i a c ( d d h 2 01 2 m l ；1 0 x t e1 5 0 p l ；1 ml i a c1 5 0 p i ) 重悬 酵母菌，反复吹打。将其转入灭菌的1 5 m le p 离心管中，1 3 ，0 0 0 x g 离心l m i n ，弃 上清，加入3 0 0 p 11 x t e l i a c - 制成感受态细胞。 2 、小量转染酵母过程 ( 1 ) 在1 5 m l 的e p 离心管中分别加入感受态酵母菌l o o l 上l ；a d 质粒文库1 斗l ； 热变性后的h e r r i n gt e s t e sc a r t i e rd n a0 1 m g ， 涡旋充分混匀。 ( 2 ) 在e p 离心管中加入6 0 0 “1 的p e g l i a c ( 1 2 m l p e g 4 0 0 0 ；1 5 0 斗1i o