（细胞生物学专业论文）il18信号上调csf1基因转录的机制研究.pdf

p ：专：0 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了 明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：j 军l 日期：毒“么惮 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编本学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名： 日期： 电话：! 堑至丝分口7 邮编：圭兰q 旦! 毪 j -，l 摘要 i l 一1 8 是i l - i 家族的一个成员，是一种必不可少的强有力促炎因子，能够促进天然免疫 矛f l t h l 一、t h 2 一驱动的免疫应答。i l - 1 8 束u 激免疫细胞产生效应因子能够抗细菌真菌感染， 抑制肿瘤生长。同时也参与许多慢性炎症和自身免疫性疾病炎性反应的放大过程，如类风 湿性关节炎( r a ) 、系统性红斑狼疮( s l e ) 、i 型糖尿病、动脉粥样硬化等，加重炎性 反应，对机体产生损伤。i l - 1 8 的多种生物学功能是通过它与细胞表面的i l 一1 8 受体 ( i l 一1 8 r ) 相互作用引起的信号通路实现的，i l 一1 8 r 属于i l 一1 受体t o l l 一1 i k e 受体( t i r ) 超家族。在经典的信号起始过程中，i l - 1 8 r 形成正确构象的异源二聚体，再与同源二聚化 的接头蛋白m y d 8 8 的t i r 结构域相互作用，进而招募下游信号分子，最终活化n f kb 和丝裂 原蛋白激酶( m a p k ) ，诱导促炎因子的表达。 炎症反应中细胞分泌c s f - i ，促进单核巨噬细胞的增殖和激活，并可以促进白细胞对血 管内皮细胞的粘附力，促进炎性反应，还可以通过刺激产生一些细胞因子和生长因子来调 节炎性反应。c s f - 1 在动脉粥样硬化等多种免疫疾病的致病机制中有重要作用，可以作为 炎症和疾病的有效标志。分析人c s f - i 启动子的调控序列，发现这段序列上存在n f kb 、 a p l 、s p 一1 等潜在的顺式调控元件，这些元件可能参与调节c s f - i 的基因转录。 本实验之前的研究表明，在炎症反应初期，被激活的白细胞会产生促炎因子c s f 一1 ，所 以我们选择c s f - i 基因的表达作为研究靶点，研究i l - 1 8 是否通过对c s f l 表达进行调节来 实现其促炎功能，以及i l - 1 8 调控c s f 一1 表达的机制。我们的工作证明i l 一1 8 能够上调c s f 一1 的启动子活性及其蛋白表达，其信号机制是i l 一1 8 通过m y d 8 8 依赖的信号途径来激活转录因 子n f kb ，推i 9 1 i n f kb 与c s f - i 启动子区域结合，从而调节c s f - i 的基因转录。我们的工作 进一步探讨了i l - 1 8 的信号转导通路，帮助深入理解i l 一1 8 引起生物学效应的机制，可以找 到信号途径中的关键位点，以期为疾病的诊断治疗提供一种有效的方法。 关键词： 炎症：i l 一1 8 ：m y d 8 8 ；n f kb ；c s f 一1 i 一 j i l f i 。 0 a bs t r a c t i l 18i sam e m b e ro ft h ei l 一1c 吼o h n ef a m i l ys e r v i n ga sap o t e n ta n di n d i s p e n s a b l e i n f l a m m a t o r yf a c t o r i l 18p r o m o t e st h ei n n a t ei m m u n i t ya sw e l la st h ea d a p t i v ei m m u n i t y m e d i a t e db yt h la n dt h 2c e l l s i l - l8s t i m u l a t e st h ec y t o k i n ep r o d u c t i o no ft h ei m m u n ec e l l s a n t a g o n i z i n gi n f e c t i o no fb a c t e r i aa n df u n g ia sw e l la ss u p p r e s s i n gt h et u m o rg r o w t h i l - 18i s a l s oi n v o l v e di nm a n yc h r o m ci n f l a m m a t i o na n da u t o i m m u n ed i s e a s e ss u c ha s r h e u m a t o i d a r t h r i t i s ( r a ) ，s y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u s ( s l e ) ，t y p e id i a b e t e sa n da t h e r o s c l e r o s i s ， p r o m o t i n gi n f l a m m a t i o na n di m p a i r i n gh e a l t h t h em u l t i b i o l o g i c a lf u n c t i o n so fi l 18a r e m e d i a t e db yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ni l 18a n di t sr e c e p t o ri l 18 r w h i c hb e l o n g st ot h ei l 1 r e c e p t o 仉o l l l i k er e c e p t o r ( t l r ) s u p e r f a m i l y t oi n i t i a t et h es i g n a lt r a n s d u c t i o n ，i l 18 rf o r m s t h eh e t e r o d i m e rw i t hr i g h tc o n f o r m a t i o n ，i n t e r a c t e sw i t ht h et i rd o m a i no ft h em y d 8 8 h o m o d i m e rw h i c hi sa na d a p t o rp r o t e i n , t h e nr e c r u i t st h ed o w n s t r e a ms i g n a lm o l e c u l e sa n d f i n a l l ya c t i v a t e sn f k ba n dm a p k p r o m o t i n gt h ee x p r e s s i o no fo t h e ri n f l a m m a t o r yf a c t o r s t h ei n f l a m m a t o r yi m m u n ec e l l ss e c r e t ec o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o r - 1 ( c s f 1 ) ，a c c e l e r a t i n g t h ea c t i v a t i o na n dp r o l i f e r a t i o no fm o n o - n u c l e a rm a c r o p h a g e ，p r o m o t i n gt h ea d h e s i o no f l e u k o c y t et ot h ev e s s e le p i t h e l i aa n ds t i m u l a t i n gp r o d u c t i o no fs o m ec 1 ，t o l 【i n e sa n dg r o w t h f a c t o r st or e g u l a t et h ei n f l a m m a t i o n p l a y i n ga ni m p o r t a n tr o l ei na t h e r o s c l e r o s i sa n dm a n yo t h e r i l t l l n u n ed i s e a s e s c s f 1c a nb ei d e n t i f i e da sap o t e n t i a lm a r k e rf o ri n f l a m m a t i o na n dd i s e a s e a n a l y s i so ft h ec s f 1p r o m o t e rs e q u e n c er e v e a l st h a tn f 1 ( b ，a p 1a n ds p 1m a vb ei n v o l v e d i nt h er e g u l a t i o no fc s f 1v i at h ep o t e n t i a lc i s e l e m e n t s i no u rp r e v i o u ss t u d i e s w e r e p o r t e d t h a tt h ea c t i v a t i v e 1 e u k o c y t e ss e c r e t e t h e i n f l a m m a t o r yf a c t o rc s f 1i nt h ee a r l i e rp e r i o do fi n f l a m m a t i o n s o w ei n v e s t i g a t e dw h e t h e r i l 18p r o m o t e di n f l a m m a t i o nv i ar e g u l a t i o no fc s f 1e x p r e s s i o na n db yw h a tm e c h a n i s m c s f 1w a sr e g u l a t e db yi l 18 o u rr e s u l t ss h o w e dt h a ti l 18u p r e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no f c s f 1 b yt h ea c t i v a t i o no fn f 1 0 3v i at h em y d 8 8d e p e n d e n ts i g n a l i n gp a t h w a y w e h y p o t h e s i z e dt h eb i n d i n go fn f k bt ot h ep r o m o t e ro fc s f 1t 0u p r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no f c s f 1 o u rw o r kp r o v i d e d 距i n s i g h ti n t ot h es i g n a lt r a n s d u c t i o nm e c h a n i s mo fi l 18 r ，a sw e l l a st h eb i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c eo fi l l8 ，h e l p i n gp e o p l ef i n dt h ek e yp o i n to ft h es i g n a lp a t h w a yt o p r o v i d en e we f f e c t i v et h e r a p e u t i ct a r g e t s k e yw o r d s ：i n f l a m m a t o r y ；i l - - 18 ；m y d 8 8 ；n f - k b ；c s f 1 i i t ，1 f 目录 中文摘要 a b s t r a c t 目录 1 “l 日u吾 一、i l 1 8 的生物学作用及其信号转导 ( 一) i l - 1 8 的结构及表达 ( 二) i l - 1 8 的生物学作用 ( 三) i l - 1 8 r 及其信号通路 1 i l - 1 8 r 的结构和作用 2 接头蛋白- - m y d 8 8 在信号转导中的作用 3 信号起始过程中的t i r t i r 相互作用 4 m y d 8 8 - 依赖的信号途径7 二、转录因子n f - kb 及其功能研究8 ( 一) n f - kb 的基本结构和组份8 ( 二) n f - kb 信号转录途径的激活和调控1 0 ( 三) n f - kb 诱导的基因表达1 1 三、c s f - i 的基因表达调控1 2 ( 一) c s f - i 的生物学功能1 2 ( 二) c s f - i 的结构和表达1 2 ( 三) c s f - i 基因转录的调控元件1 3 四、本论文的研究目的和意义1 4 材料与方法1 5 一、实验材料1 5 ( 一) 菌株、细胞、质粒和抗体1 5 ( 二) 试剂和酶类1 5 ( 三) 主要仪器1 5 ( 四) 主要溶液和培养基1 5 二、实验方法1 6 ( 一) 双荧光素酶双报告基因检测1 6 ( 二) 反式聚合酶链式反应( r t p c r ) 1 7 ( 三) 质粒构建1 8 ( 四) w e s t e r nb o l t 2 0 实验结果与分析2 1 一、i l - 1 8 能够促进白细胞中c s f 一1 基因的表达上调2 1 二、i l - 1 8 活化了c s f - i 的启动子转录活性2 3 三、i l - 1 8 通过活化转录因子n f - kb 促进c s f l 的基因转录2 3 四、m y d 8 8 涉及i l - 1 8 刺激的c s f 一1 转录活性的上调2 4 讨论2 8 一、i l - 1 8 促进白细胞中c s f - i 的基因表达上调2 8 二、i l - 1 8 通过m y d 8 8 、n f - k b 信号通路完成对c s f l 基因表达的上调2 8 结论和主要创新点3 1 i l l 3 ： 3 7 3 8 i v 东北师范大学硕士学位论文 。_ - 前言 月i j 舌 人类和其他哺乳动物的免疫系反应包括天然免疫和适应性免疫。天然免疫是机体抵御 病原微生物感染的第一道防线，以前认为天然免疫是非特异性免疫，以巨噬细胞、白细胞 对微生物和外源物质的吞噬和消化为特征，实际上天然免疫具有一定的特异性，能够区别 自己和病原体口1 。天然免疫的识别依靠于有限数量的微生物编码的受体( p r r s ) ，其中作为 天然免疫系统最重要的模式识别受体之一的t o l l 一1 i k e 受体( t l r s ) 在病原的识别和炎性 反应及免疫反应的启动中起重要的作用。t o l l l i k e 受体激活可以引导相应的信号转导途 径，产生细胞因子，导致炎性反应的产生和适应性免疫的进行乜1 。适应性免疫参与感染晚 期的病原体清除，同时也参与免疫记忆的形成，由克隆化分布的t 淋巴细胞和b 淋巴细胞介 导，具有特异性和记忆性。适应性免疫主要包括体液免疫和细胞免疫，通过调控t h i 和t h 2 的平衡以维持内环境的稳态。天然免疫应答的激活是激发适应性免疫的先决条件口4 1 。 炎症( i n f l a m m a t i o n ) 是机体对致炎因子的损伤所发生的一种以防御反应为主的基本 病理过程。炎症可以抵消内部和外界刺激对人体的伤害，通常会引起炎症部位红肿发热， 甚至全身伴有不同程度的发热，白细胞增多、代谢增强等。局部发生的一系列变化，有利 于局限、消灭致炎因子和清除坏死组织，促进局部修复，对机体是有利的。一般来说，急 性的炎性反应持续时间较短，比较容易治愈，但慢性的炎性反应通常会持续很长时间，是 许多疾病的标志旧。大量的组织病理学和临床研究表明免疫激活是急性冠状动脉综合症的 的致病原因阳】，并且血清流行病研究表明炎症标志升高的幅度与严重程度相一致，最终易 患上疾病盯1 。例如，炎症被认为是导致机体动脉粥样硬化的一个主要驱动因素，研究表明 大量的细胞、分子中促炎成分参与该疾病的发展，主要入侵炎症部位的单核巨噬细胞和t 淋巴细胞产生很多炎症介质( 细胞因子，趋化因子) ，这些因子在动脉粥样硬化的起始和 延续起十分重要的作用呻。所以有人将炎症比作“双刃剑 。 在炎性反应发生过程中，血液中的白细胞会穿过血管内皮细胞，渗透到炎症发生部位， 白细胞的持续积累和激活是慢性炎症的一个重要标志n 们。炎症的发展包括一系列炎症因子 的释放和白细胞的招募聚集，白细胞在炎症部位激活并释放更多的细胞因子。产生的细胞 因子能够表现出促炎或抗炎效应，分别称为促炎因子和抗炎因子。白细胞介素一1 ( i l 一1 ) 、 i l 一6 、i l 一8 、i l 一1 2 、i l - 1 5 、i l - 1 8 、t n f 、 f n - y 、g m - c s f 等都是促炎因子，促进炎症 发展：而i l 一4 、i l 1 0 、i l - 1 3 、i f n - q 、t g f - b 等是抗炎因子删，在大多数情况下，炎 性反应受内源抗炎因子的控制，因此炎性细胞能够被及时清除。促炎因子和抗炎因子在体 内存在动态平衡，这种平衡对机体的健康有重要作用，当两者不平衡时，则会加剧炎性损 伤产生疾病h 1 。 白细胞介素在慢性血管炎性反应中起关键作用，促炎的i l s 及其相应的受体在炎症部 位的表达水平与疾病的发展程度呈正相关。i l - 1 8 是i l - i 细胞因子家族的一个成员，是近 年来发现的细胞因子，它是天然免疫和适应性免疫应答的重要介导者，它的功能主要表现 l 不同于i l - 1b 、t n f q 等其他促炎因子，i l 一1 8 可在多种人类细胞中组成型表达，其 表达主要取决于尼。躔因的特定的结构和特征n 明。i l 一1 8 不仅在免疫细胞中表达，还可以 在非免疫细胞中表达，包括淋巴细胞、外周血单个核细胞、角质形成细胞、关节滑膜巨噬 细胞、成纤维细胞、骨细胞中的成骨细胞、小肠的上皮细胞、软骨细胞等n 扎憎1 。i l - 1 8 在细胞中组成型表达，并推测是在炎症中一系列促炎因子的早期释放，它的产生需要经 过多个水平层次的调节。以小鼠皿一，蹉因为例( 图1 1 ) ：外显子1 、2 是非编码的。存在 两个启动子，一个位于外显子1 上游，正常情况下关闭但是受l p s 上调，有i c s b p 结合位点， i c s b p 这个蛋白受i f n - y 和i f n - 1 3 上调；另一个位于外显子2 上游，这个启动子组成型 表达较高，有p u 1 结合位点，p u 1 是i l - 1 8 启动子的弱转录因子，必须与其他转录因子共 同作用，其表达受i f n y 和l p s 上调。儿占基因组成型表达非活性的i l - 1 8 前体分子，在 l p s 刺激下巨噬细胞以一个c a s p a s e - 1 依赖的方式分泌有生物活性的成熟i l - 1 8 ，而在f a s l 的刺激下i l - 1 8 以一个c a s p a s e 但不是c a s p a s e - 1 依赖的方式分泌n 们卜矧。 2 东北师范大学硕 图1 - 1i l - 1 8 分泌的调节( k e n j in a k a n i s h ie ta l , 2 0 0 i ) ( 二) i l - 1 8 的生物学作用 i l - 1 8 是一种多效因子。i l - 1 8 诱导单核细胞产生t n f q 和i l lb ，还能够起始一系 列具有促炎功能的细胞因子产生，如趋化因子、巨噬细胞炎性蛋白一1q 、金属蛋白酶一9 、 粘附因子( v c a m 一1 ) 等乜劓。i l - 1 8 最重要的生物学活性之一，是诱导t 细胞和n k 细胞产生 i f n y 。i l 一1 8 与i l - 1 2 协同作用可产生大量的i f n - yn 叼。i l _ 1 8 联合i l - 1 2 促进天然t 细胞分化为t h l 细胞，并激活细胞产生i f n y 、t n f a 、g m c s f 和i l 一1 ，上调一定趋化 因子受体的表达。相比较t h 2 细胞，只有t h l 细胞表达i l 一1 8 ra ，i l 一1 8 联合i l 一2 促进 天然t 细胞分化为t h 2 细胞产生i l - 4 和i l - 1 3 汹崩3 。诱导细胞生成的i f n - y 和一氧化氮， 可触发胞内杀菌机制，清除的胞内细菌、真菌和原生生物，在抵御严重感染中起作用心。 i l - 1 8 还可上调依赖穿孔蛋白的细胞毒性和f a s l 介导n k 细胞的杀伤效应，清除病毒啪1 。 因此，i l - 1 8 作为强有力的促炎因子能够促进天然免疫和t h l 一、t h 2 一驱动的免疫应答。 i l 一1 8 除了作为炎症的介导者，还具有抑制肿瘤的特性。 i l 一1 8 更重要的作用是参与许多慢性炎症和自身免疫性疾病炎性反应的放大过程，如 类风湿性关节炎( r a ) 啪3 、系统性红斑狼疮( s l e ) 啪1 、i 型糖尿病。、动脉粥样硬化伍门 等，对机体产生损伤，加重炎性反应。i l - 1 8 参与了类风湿性关节炎的发病机制，i l 1 8 通过诱导前列腺素e 2 的生成，刺激关节软骨细胞产生n 0 合酶，诱导i l 一6 等的表达，氨基 葡萄糖释放增加，使关节软骨病变恶化。另一方面，i l - 1 8 在i l 一1 2 、i l 1 5 的协同下可诱 导生成i f n - y 、g m - c s f 、n o 等，并诱导c d l 4 + 巨噬细胞合成t n f - q 。t n f - a 反过来又促进 i l - 1 8 的合成，从而形成正反馈，加重反应口羽。在心脏疾病中，i l - 1 8 也扮演了重要角色，在 动脉粥样硬化患者中，i l - 1 8 的升高可看作为冠状动脉疾病患者死亡的预兆，因为i l 一1 8 可 增加动脉粥样硬化的易损害性。i l 一1 8 作为促炎性因子能诱导细胞间粘附分子( i c a m 一1 ) 、 血管细胞粘附分子( v c a m - i ) 和i l - ib 的产生，而这些都与心脏功能障碍的发生有关口3 1 。 3 东北师范大学硕士学位论文 ( 三) i l - 1 8 r 及其信号通路 i l 1 8 在宿主防御及致病过程中的多种生物学功能，是通过它与细胞表面i l - 1 8 受体 i l - 1 8 r ) 相互作用引起的信号转导通路实现的。 1 i l - 1 8 r 的结构和作用 i l 一1 8 r 属于i l 一1 受体t o l l l i k e 受体( t i r ) 超家族，这个家族包含一组结构同源的 白，在天然免疫和获得性免疫方面有重要作用。胞浆内段的t i r 结构域是t i r 超家族的共 特征，它高度进化保守，是下游信号的核心结构1 。t i r 结构域依赖于构型变化来启动 号，相应的t i r 结构域能够招募其他含有t i r 结构域的蛋白，在信号转导过程中通过同型 白一蛋白相互作用来转导信号。t i r 结构域大约有2 0 0 多个氨基酸，包含三个保守框 b o x l - 3 ) 啪1 。根据t i r 家族的结构特点，可以分为三类：( 1 ) i l - i 受体亚家族；( 2 ) t o l i - i i k e 体亚家族；( 3 ) 接头蛋白亚家族( 图1 2 ) m 1 。 i l 一1 8 r 是i l 一1 r 家族成员，为i 型跨膜蛋白，胞外区有3 个免疫球蛋白样结构域，胞浆 段为t i r 结构域口7 1 。i l 一1 8 r 与i l - i 受体家族相似，此受体由i l - 1 8 rq 链( 又叫i l - 1 8 r ) i l 一1 8rb 链( i l 一1 8r a c p ) 组成，它们都与i l l r 家族有序列同源性。i l - 1 8 rq 链胞外 与配体i l 一1 8 的结合，为结合链；i l - 1 8rb 链与的i l - 1 8 亲和性较低，但是与a 链结合 会增加b 链与配体亲和性，为信号链。虽然i l - 1 8 r 和i l - i r 在结构上十分相近的，但是 们并不能相互替换，受体特异性识别相应的配体。i l - 1 8 刺激后，i l - 1 8rq 链和i l - 1 8r 链要形成一个跨膜的异源二聚体才能引发下游信号转导( 图1 3 ) 。这两个受体分子对信 转导是必不可少的，缺少这个共受体会导致对i l 一1 8 无应答反应m 1 。 2 接头蛋白_ m y d 8 8 在信号转导中的作用 接头蛋白亚家族不同于另两个亚家族，它没有跨膜区域，是一类胞质中的蛋白，但都 含有t i r 结构域。主要包括m y d 8 8 、m a l 、t i r a p 、t r i f 、t r a m 侧，它们都不是受体蛋白而 是作为接头蛋白连接受体复合物和下游信号分子，介导信号转导，不同的接头蛋白决定了 不同的信号转导途径。i l 一1 r 家族和t l r 家族在起始信号时要招募相应的接头蛋白，引导 的信号途径可以分为m y d 8 8 一依赖途径和非m y d 8 8 ( t r i f ) 一依赖途径嘧1 。m y d 8 8 最初发现为骨 髓分化时表达的蛋白啪1 ，含有羧基末端t i r 结构域和氨基末端死亡结构域( d dd o m a i n ) ， 两个结构域被一小段中间区域所分隔，由2 9 6 个氨基酸组成，其蛋白分子量为3 3 k d n 0 。在 配体刺激下，m y d 8 8 可通过自身的t i r 结构域相互作用成二聚化，并且m y d 8 8 的t i r 结构 域和受体复合物的t i r 结构域发生同源性蛋白一蛋白相互作用。m y d 8 8 形成同源二聚体， 促进了下游受体相关激酶i r a k 一1 、i r a k 一4 的活化，m y d 8 8 的叻区与i r a k 家族d d 区发生 同源性相互作用，形成信号转导复合物。接头蛋白m y d 8 8 是信号转导通路中的关键蛋白。 3 信号起始过程中的t i r - t i r 相互作用 在信号起始过程中，受体形成正确构象的异源二聚体，再与二聚化的接头蛋白m y d 8 8 的t i r 结构域相互作用，创造一个招募下游信号分子的必要信号平台，这个异四聚体是通 过t i r t i r 相互作用形成的。可见t i r 结构域的相互作用在信号转导起始中起重要作用，但 是大多数研究都是对表面现象的阐述，而这种相互作用的结构信息了解的很有限。精确了 解受体和接头蛋白作用面的晶体结构，对于理解t i r 家族受体信号转导的起始是十分必要 4 东北师范大学硕士学位论文 的。突变和结构研究帮助我们建立t i r t i r 相互作用的机制。 y i n g w ux ue ta 7 h 第一次阐明了t i r 结构域的晶体结构，为我们现在探索t i r 结构域 在信号通路中的作用做了铺垫。他们阐明了t l r i 和t l r 2t i r 结构域的晶体结构，后来对 接研究中采用的晶体结构基本都是以这两种t i r 结构域的晶体结构为模板。 i l 1 r i i l 1 r a c p i l 1 8 r i l 1 8 r a d p s t 2 l l 1 r r 口2 l l l r a p l t i g i r r s i g i r r t l r l t l r 2 t l r 3 t l m t 1 r 5 t l r b t l r 7 t l r b t 乙r 9 t l r o m y d 明 m a i t 耐 t r a m & a r m 一 = ) 霉= 乏= = = = = = 亡 t i rd o m a i a i g 曲m a i n l e u c m e - + n c l h 他碱, d o r l l m d , 蚰l hd o n w m l l i l 1 8 ) = 删引枷叱1 蝴 i t ， i u t l m r l1 1r 2 + o rb l p b l p i z y m o u n d s r n a l p s fp r o t e i n h l p 6 0 ，f nh a g s f l a g m l h n p a r t n e r st l r 2f o ru a lp i m 嵋u i m 喇 i m e l u i m o d c p g d h a o r p t u m p 嗣a c l 刚e r a d a p t e rf o rt l r 2a n dt l r 4 a d a p t e r 佃rt l r 3 a d a p t e rf o rt l r 4 细h , l m l o ro ft 憎? 图1 2 ：i l - 1 受体t o l l - l i k e 受体( t i r ) 超家族( l u k ea j 0 n e i l l ，2 0 0 8 ) i l - i r t l r 超家族共有2 4 个成员，分为三个亚家族，每个蛋白都含有t i r 结构域。 bt h ei l - 18r e c e p t o rc o m p l e x i l - 1 r 墨i l - 1 i l 一1 8 i l 1 8 b p 图1 3i l - 1 8 r 复合物的异源二聚化 ( m i c h a e lu m a r t i n ，h o l g e rw e s c h e ，2 0 0 2 ) 5 8 r f 同源二聚化的作用位点，所以用模仿不同蛋白的t i r 结构域中b b 环结构的八肽分子来探 究t i r 结构域在m y d 8 8 同源二聚化的功能。其中，模拟m y d 8 8 ( 1 9 6 - 2 0 2 ) 和i l - 1 8 r ( 4 1 7 - 4 2 3 ) 的b b 环合成的八肽分子能强烈抑制m y d 8 8 的同源二聚化，特异干扰i l - i 信号通路，抑制 n f - kb 的活性。提示模拟m y d 8 8 结构，干扰m y d 8 8 的功能来阻断t l r s i l - i r s 信号通路， 这种方法可以用来治疗慢性炎症。 在大多数的t i r 结构域的明环上有一个不变的p r o ，小鼠t l r 4 的这个位点发生突变 ( p 7 1 2 h ) ，使得c 3 h h e j 小鼠对l p s 完全无应答。研究t l r 2 ( p 6 8 1 h ) 的晶体结构，表明 这种突变不会形成导致受体信号消除的结构，认为b b 环上的p r o 突变是抑制了t l r 2 与其 他含t i r 结构域的蛋白的相互作用。经典突变的结论是根据t l r 2 晶体结构模型和体外 实验得到的，但是现在的一些发现并不支持这个结论。l ie ta l h 刀认为m y d 8 8t i r 结构域 上的p r o 并不能抑制t i r 结构域的二聚化。最终推断，在i l - lb 信号通路中，i l 一1 r a c pt i r 结构域先于m y d 8 8t i r 结构域异源二聚化，然后m y d 8 8 再同源二聚化，则b o x 2 中 a s p l 9 5 a r 9 1 9 6 a s p l 9 7 是m y d 8 8 和i l 一1 p 认c p 的主要作用位点，b o x 3 中be 链上a s p 2 7 5 和 p h e 2 8 5 、t r p 2 8 6 是m y d 8 8 同源二聚化及其下游蛋白结合的作用位点。而高度保守的p r o 可 。 6 东北师范大学硕士学位论文 能起到塑造构型的作用。b b 环在t i r 结构域中相互作用的作用仍然不清楚。 人类i l - 1 r a p lt i r 结构域的晶体结构是i l 一1 r 家族提出的第一个t i r 结构，与t l r i 和t l r 2 的t i r 晶体结构有很大差异。在i l 一1 r a p lt i r 结构域二聚化作用中，qc 螺旋上 的s e r 4 8 8 残基与相对应的另一个s e r 4 8 8 残基形成氢键。i l - 1 r a p l 的t i r 结构域与t i g i r r 同源性较高，但是其二聚化中相互作用的特点可能是唯一的，可能不能应用于i l 一1 r 家族 的其他受体二聚化的研究中h 刖。目前对于t i r t i r 相互作用的研究有很多矛盾的发现，研 究表明不同配体与它们相应受体在结构上以不同的方式利用m y d 8 8 ，t i r 二聚化的作用机 制也存在差异，这种作用机制还不清楚。 4 m y d 8 8 - 依赖的信号途径 i l - 1 8 r 和其他利用接头蛋白m y d 8 8 转导信号的i l - i r 受体家族成员，均依赖于t i r 结构域 向细胞内转导其识别的信号，最终活化n f - kb 和丝裂原蛋白激酶( m a p k ) ，诱导靶基因表 达。这一过程中细胞因子的诱导大多依赖于一个共同的分子途径- - m y d 8 8 依赖型信号通路。 m y d 8 8 缺失的细胞上除了t l r 4 、t l r 3 之外的所有t l r 都不能应答相应刺激，n f kb 、j n k 和 p 3 8 都不能激活h 劓。 在i l - 1 8 刺激下，i l - 1 8 r 受体形成异源二聚体，m y d 8 8 同源二聚体以其t i r 结构域被招募 到活化的受体胞浆尾部t i r 结构域，并以d d 结构域招募下游s e r t h r 激酶一i r a k 家族： i r a k 一1 、i r a k 一2 、i r a k 一4 、i r a k m 。i r a k 4 似乎是m y d 8 8 重要的下游激酶，缺失中间区域的 m y d 8 8 s 阻碍i r a k 4 被招募至u m y d 8 8 ，因此抑s u n f - kb 的激活，这个中间结构域也涉及i r a k 4 和m y d 8 8 之间的相互作用。m y d 8 8 s 并不能抑制j n k 的激活，显示i r a k 4 并不涉及这个途径。 i r a k 一2 、i r a k m 似乎能够阻止i r a k 一1 和i r a k 一4 与m y d 8 8 分离。i r a k 4 被招募后， t o l l i p i r a k - 1 复合体快速移位到激活的受体复合物上，i r a k 一1 与m y d 8 8 通过各自的d d 结构 域紧密联系。i r a k 一1 被自身和i r a k 一4 磷酸化，t o l l i p 脱落，几个负电荷的引入使磷酸化的 i r a k 一1 从i l - 1 8 r 复合物脱离下来，并且发生二聚化。随后i r a k 一1 与t r a f 6 相互作用，导致 其寡聚化并被激活。t r a f 6 是一种e 3 泛素连接酶，结合两种泛素连接酶u b c l 3 和u e v l a ，在 t r a f 6 的6 3 位l y s 处催化合成多聚泛素链。泛素化的t r a f 6 招募t a b 2 并且激活t a b 2 相关的 t a k i 激酶。在m a p k 信号途径中，i r a k 一1 也与t a b 2 、接头蛋白t a k i 相互作用咖“。表明i r a k 一1 具有将t a b 2 6 i 入到包含t r a f 6 和t a k i 以及激活蛋白t a b l 的复合体中的作用。t r a f 6 缺失，则 t i r 家族完全不能介导相应的信号隋羽，说明t r a f 6 是t i r 家族的信号通路中的必须组分。一 方面，自体磷酸化的t a k i 激活了i k k 复合物，使得n f _ kb 的抑制物一ikb 被磷酸化和泛素化， 最终被蛋白酶体水解。活化的n f - kb 转移到细胞核内，诱导促炎症因子和炎症因子的表达。 另一方面，t a k i 还可以激活m k k 6 ，m k k 6 磷酸化并激活激酶j n k 和p 3 8 ，最终导致a p 一1 的激活， 调控相关基因表达m 钆嘲。过度磷酸化的i r a k - i 会被快速水解清除，这主要依赖其磷酸化 的状态嵋朝。猜测i r a k 一1 一旦被降解，以t r a f 6 为中心的多蛋白复合体也会解离，以此来限 f l ：t j l l - i 的应答。所以在i l - i 刺激后，n f kb 、j n k 和p 3 8 的活化是短暂的。 7 东北师范大学硕士学位论文 图1 4i l - 1 r 和i l - 18 r 介导的信号途径( k e n j in a k a n i s h ie ta t , 2 0 0 1 ) i l - 1 和i l - 1 8 结合上各自的受体复合物，招募接头蛋白m y d 8 8 ，依赖m y d 8 8 信号转导途径激活转录因 子n f kb 和a p 一1 。诱导炎症因子表达。 二、转录因子n f kb 及其功能研究 在过去很多年，研究者们认为n f - kb 能够调节在人类生理学和病理学中起重要作用的 信号系统，对它的研究大多立足于b 细胞。近二十多年来，人们花费很多精力去研究n f kb 在免疫系统中的功能，发现n f - kb 在免疫细胞的分化、淋巴器官的生成和免疫激活等 免疫系统的不同方面都起重要作用。 ( 一) 肿kb 的基本结构和组份 最初发现，n f - kb ( n u c l e a rf a c t o r k a p p a b ) 在活化的b 细胞中具有结合d n a 的活性， 它特异亲和一种免疫球蛋白k 链基因的增强子kb 序列嘲1 。曾经认为n f - k b 是抗体产生的 重要调节者，实际上它既不是抗体k 轻链基因的关键调节者，也不特异存在b 细胞中。n f 一 8 p lo o p s 2 o s i p s o 区= i 卜j 情羹k m h 旷遄p 1 e 互= 互 1 国盟 图1 5n f - kb 家族( s i v a k u m a rv a ll a b h a p u r a p ua n dm i c h a e lk a r i n ，2 0 0 9 ) n f - kb 家族共有五个成员，包含r e l - 同源结构域( r h d ) 、转录激活结构域( t a d ) 、锌指模块、甘 氨酸富集区( g r r ) 和锚蛋白重复序列( a n k ) 。翻译后修饰磷酸化、乙酰化、泛素化分别用p 、a c 和u b 来表示。 在哺乳动物中，有五个n f - k b 家族成员：r e l a ( p 6 5 ) 、c r e l 、r e l b 、p 5 0 和p 5 2 ( 图1 5 ) 。 前体蛋白p 1 0 5 和p 1 0 0 分别水解掉含有锚蛋白重复序列的c 端ik by 和ikb6 ，剩下的n 端部 分则为p 5 0 和p 5 2 。每个家族成员都含有n 端r e l - 同源结构域( r h d ) ，具有两个近似免疫 球蛋白折叠，它包括d n