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神经病理性痛觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究 摘要 中文提要 目的：本实验旨在研究下丘脑弓状核( 越) 参与神经病理性痛觉过敏的受 体及受体后信号转导机制，探索脊髓上水平痛觉过敏的中枢敏感化机制。 方法：建立坐骨神经部分结扎( p s l ) 神经病理性疼痛模型，采用压爪缩腿 法和辐射热一缩腿法测定动物的机械痛阈和热痛阈，观测a r c 内微量注射m k 8 0 1 ( n m d a 受体非竞争性拮抗剂) 、a p v ( n m d a 受体竞争性拮抗剂) 、c n q x ( 非 n m d a 受体拮抗剂) 、p p 2 ( s r c 家族蛋白酪氨酸激酶抑制剂) 、g f l 0 9 2 0 3 x ( 蛋白 激酶c 抑制剂) 后7 0m i n 内p s l 模型大鼠痛阈的变化：以p s l 为实验组，假手术 组为对照组，运用免疫组织化学和w e s t e mb l o t 方法检测磷酸化的n r l 和n r 2 b 蛋白的表达情况。 结果：p s l 模型大鼠术后数小时痛闽即明显降低，出现机械痛敏和热痛敏。 a r c 内微量注射m k 8 0 1 ( 5n m 0 1 ) 、a p v ( 1 5n m 0 1 ) 、c n q x ( o 5n r n 0 1 ) 后，大 鼠机械痛阈和热痛阂明显升高，痛敏现象明显减轻；a r c 内微量注射p p 2 ( 5n m 0 1 ) 、 g f l 0 9 2 0 3 x ( o 0 4n m 0 1 ) 后，痛阈升高幅度更大，痛敏现象也明显减轻。免疫组 织化学和w e s t e r nb l o t 结果显示，p s l 大鼠a r c 内磷酸化的n r l 和n r 2 b 蛋白表 达高于假手术组。 结论：下丘脑弓状核中的n m d a 受体、非n m d a 受体及受体后s r c 蛋白酪 氨酸激酶、蛋白激酶c 在痛觉过敏的脊髓上中枢敏感化的形成中起到重要的作用。 关键词：下丘脑弓状核、神经病理性疼痛、n m d a 受体、痛觉过敏、中枢敏感 化、s r c 蛋白酪氨酸激酶、蛋白激酶c 作者：潘燕燕 指导教师：蒋星红教授 神经病理性痛觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究英文提要 m e c h a n i s m so fc e n t r a ls e n s i t i z a t i o no fn e u r o p a t h i c h y p e r a l g e s i ai nt h eh y p o t h a l a m i c a r c u a t en u c l e u s a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oe x p l o r et h em e c h a n i s m so fc e n t r a ls e n s i t i z a t i o no fh y p e r a l g e s i ao k s u p r a s p i n a ll e v e lb ys t u d y i n gt h es i g n a lt r a n s d u c t i o ni nt h eh y p o t h a l a m i ca r c u a t e n u c l e u si nn e u r o p a t h i cp a i n m e t h o d s ：t h em o d e lo fn e u r o p a t h i ch y p e r a l g e s i aw i mp a r t i a ls c i a t i cn e r v el i g a t u r e ( p s l ) w a se s t a b l i s h e dt om e a s u r et h em e c h a n i c a lp a i nt h r e s h o l da n dt h e r m a lp a i n t h r e s h o l du s i n gm e c h a n i c a lw i t h d r a w a la n dt h e r m a lw i t h d r a w a lm e t h o d s ，r e s p e c t i v e l y t h ec h a n g e so fm e c h a n i c a lp a i nt h r e s h o l da n dt h e r m a lp a i nt h r e s h o l dw e r em e a s u r e di n 7 0m i n u t e sa f t e rm i c r o i n j e e t i o no fm k 8 0 1 ( n o n - c o m p e t i t i v en m d ar e c e p t o r a n t a g o n i s t ) ，a p v ( c o m p e t i t i v en m d ar e c e p t o ra n m g o n i s o ，c n q x ( n o n n m d a r e c e p t o ra n t a g o n i s t ) ，p p 2 ( s r ep r o t e i nt y r o s i n em n a s ei n h i b i t o r ) a n d g f10 9 2 0 3 x ( p r o t e i nk i n a s eci n h i b i t o r ) ；t h ep r o t e i nl e v e l so fp h o s p h o - n r la n dp h o s p h o - n r 2 bi n a r c u a t en u l e u sw e r ed e t e c t e du s i n gi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n dw e s t e r nb l o tm e t h o d s ， 、) l ，i t hp s lr a t sa st h ee x p e r i m e n t a lg r o u pa n ds h a mo p e r a t i o n 懿t h ec o n t r o lg r o u p r e s u l t s ：t h ep a i nt h r e s h o l d so ft h ep s lr a t sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ys e v e r a lh o u r s a f t e ro p e r a t i o n ，w i t ht h ea p p e a r a n c eo fm e c h a n i c a la n dt h e r m a lh y p e r a l g e s i a w i t h m i c r o i n j e c t i n gm k 8 0 1 ( 5n m 0 1 ) ，a p v ( 1 5n m 0 1 ) a n dc n q x ( 0 5n m 0 1 ) i n t oa r c u a t e n u l e u s ，t h ep a i nt h r e s h o l d si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y , m e c h a n i c a la n dt h e r m a lh y p e r a l g e s i a w e r ei n h i b i t e d ；谢t l lm i c r o i n j e c t i n gp p 2 ( 5n m 0 1 ) a n dg f10 9 2 0 3 x ( o 0 4n m 0 1 ) ，t h ep a i n t h r e s h o l d si n c r e a s e da l s os i g n i f i c a n t l ya n dh y p e r a l g e s i aw e r ea l s oi n h i b i t e d t h er e s u l t s o fi m m u n o h i s t o c h e m i c a lq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sa n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i sd e m o n s t r a t e d t h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fp h o s p h o - n r la n dp h o s p h o - n r 2 bi na r c u a t en u l e u si np s l r a t sw a sh i g h e rt h a nt h a ti nt h ec o n t r o lg r o u p c o n c l u s i o n s ：n m d ar e c e p t o r , n o n - n m d ar e c e p t o r , s mp r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e a n dp r o t e i nk i n a s eci nt h eh y p o t h a l a m i ca r c u a t en u l e u sp l a y e di m p o r t a n tr o l e si nt h e t l 神经病理性瘸觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究英文提要 p r o c e s so fc e n t r a ls e n s i t i z a t i o no fn e u r o p a t h i ch y p e r a l g e s i a k e yw o r d s ：h y p o t h a l a m i ca r c u a t en u c l e u s ，n e u r o p a t h i cp a i n ，n m d ar e c e p t o r , h y p e r a l g e s i a ，c e n t r a ls e n s i t i z a t i o n ，s r cp r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e ，p r o t e i nk i n a s ec i i i w r i t t e nb yy a n y a np a n s u p e r v i s e db yx i n g h o n gj i a n g 神经病理性痛觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究 缩略词表 缩略词表 a b ca v i d i n b i o t i nc o m p l e x a _ n o v a a n a l y s i so fv a r i a n c e a p v a r c b s a c n q x d a b d m s o d l 2 a m i n o 5 - p h o s p h o n o v a l e r a t e a r c u a t en u c l e u s b o v i n es e r u ma l b u m i n 6 - c y a n o 一7 一n i t r o q u i n o x a l i n e - 2 ，3 一d i o n e d i a m i n o b e n z i d i n e ( c h 3 ) 2 s o 3 一 1 - 【3 一( d i m e t h y l a m i n o ) p r o p y l 一1 h i n d o l - g f l0 9 2 0 3 x 3 - y 1 一4 ( i h i n d o l 一3 - y 1 ) 1 h - p y r r o l e - 2 ，5 - d i o n em o n o h y d r o c h l o r i d e m k 8 0 l n m d a p b p b s p f a p p 2 ( + ) 一5 m e t h y l - 1 0 ，1 1 - d i h y d r o - 5 h d i b e n z o a , d c y c l o h e p t e n - 5 ，1 0 - i m i n e 亲和素一生物素复合物 方差分析 d 2 氨基5 磷酰基戊酸 ( n m d a 受体拮抗剂) 弓状核 牛血清白蛋白 6 氰基7 硝基喹嗯啉 2 ，3 一二酮( 非n m d a 受 体拮抗剂) 二氨基联苯胺 二甲基亚砜 3 - 【1 一 3 一( 二甲氨基) 丙 基 _ 1 氢吲哚3 羟 基】- 4 ( 1 氢吲哚3 羟 基) 1 氢吡咯一2 ，5 土卫 四单一氢氧化物( 蛋白 激酶c 抑制剂) 5 甲基二氢丙环庚烯亚 胺马来酸( n m d a 受体 拮抗剂) n m e t h y l d - a s p a r t a t e n - 甲基- d 门冬氨酸 p h o s p h a t e b u f f e r p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p a r a f o r m a l d e h y d e 4 - a r n i n o - 5 一( 4 一c h l o r o p h e n y l ) 一7 一( t b u t y l ) p y r a z o l o 3 ，4 一d p y r i m i d i n e p s l p a r t i a ls c i a t i cn e r v el i g a t u r e 磷酸缓冲液 磷酸盐缓冲液 多聚甲醛 4 氨基5 ( 4 氯苯基) 7 ( 丁基) 3 , 4 一嘧啶】( 酪 氨酸激酶抑制剂) 坐骨神经部分结扎 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名： 磊鳢一日期：啦 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名： 导师签名：+ 邀e l 期：导师签名：聋坠班 期： 神经病理性痛觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究 引言 己i 言 jl目 疼痛( p a i n ) 是一种复杂的生理心理活动，是临床上最常见的症状之一。其主要 包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感，以及机体对伤害性刺激的痛反应( 躯体 运动性反应和或内脏植物性反应，常伴随有强烈的情绪色彩) 。临床上疼痛按其性 质可分为伤害感受性疼痛、神经病理性疼痛及混合性疼痛三种。前者直接由伤害 性刺激造成，是机体防御机制的关键组成部分，与组织损伤或炎症等有关，是一 种感受性疼痛；后者是神经病理性疼痛，是由于外周或中枢神经系统结构损伤或 功能紊乱所致，与损伤区域外触觉和温觉反应等异常有关。临床表现上，多种疾 病可引起神经病理性疼痛，其临床症状包括：进行性的自发性疼痛( s p o n t a n e o u s p a i n ) ，痛觉过敏( h y p e r a l g e s i a ) 2 3 z 痛觉超敏( a l l o d y n i a ) ，感觉缺失【1 ，2 】等。引起神经病 理性疼痛的原因多种多样，但迄今为止，其临床治疗效果不佳，因而寻求有效的 镇痛手段成为当前疼痛研究的热点之一。 神经病理性疼痛的发生机制可分为外周及中枢两个方面。神经损伤后，外周 局部伤害性感受器的敏感性提高，称为外周敏感化( p e r i p h e r a ls e n s i t i z a t i o n ) 。外周 伤害性冲动长期持续地兴奋脊髓及其以上中枢水平，使中枢神经系统神经元发生 可塑性变化【3 】，称为中枢敏感化( c e n t r a l s e n s i t i z a t i o n ) 。就研究水平而言，目前对于 脊髓( s p i n a l ) 枢敏感化的研究比较深入，而关于脊髓上( s u p r a s p i n a l ) 枢( 脑干、 丘脑、边缘系统、大脑皮层) 敏感化的机制尚不完全清楚。以往研究显示，脊髓 背角神经元敏感性的增高与n 甲基d - 天门冬氨酸( n m e t h y l d a s p a r t a t e ，n m d a ) 受体的激活以及受体激活后产生的细胞内第二信使和蛋白激酶密切相关【4 5 】。如： n m d a 活化受体可提高脊髓背角神经元的兴奋性，从而在中枢神经系统的可塑性 变化中扮演重要角色【6 ，7 】。在辣椒素诱导的机械痛敏和热痛敏中，鞘内注射n m d a 受体非竞争性拮抗剂m k 8 0 1 可以明显减轻机械痛敏和热痛敏【8 】；此外，鞘内给予 n m d a 受体拮抗剂能阻止神经病理性痛觉过敏的形成，并减轻神经病理性疼痛的 自发痛、痛觉过敏和痛觉超刨9 】等症状。因此，在受体水平，调控疼痛信号传导的 脊髓背角的过度兴奋和持久疼痛的发生，与n m d a 受体的激活及通道开放有直接 关系。另一方面，蛋白磷酸化作为体内蛋白调节的主要方式，在调节n m d a 受体 神经病理性痛觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究引言 功能方面起主要作用。研究显示，蛋白激酶与其他第二信使和亲离子受体相互作 用，可以增加n m d a 和非n m d a 受体通道对c a 2 + 的通透性，使兴奋性传入冲动 对细胞的影响增强，从而使伤害性信息向高位脑中枢的传递增加；另外蛋白激酶 也可通过降低对抑制性氨基酸的反应而使神经元的抑制效应减弱，提高神经元的 兴奋性【1o 1 1 1 。 下丘脑弓状核( a r c u a t en u c l e u s ，a r c ) 位于下丘脑内侧基底部，包围着第三 脑室腹侧面，紧靠中央隆起，是下丘脑中的一个较大核团。以往的研究显示，脑 内的1 3 内啡肽能神经元的胞体几乎全部集中于a r c 。同时，我们以往的研究表明 1 1 2 q 9 ，外周伤害性信息可到达下丘脑a r c ，从而改变其神经元的兴奋性；电刺激 a r c ，不仅可产生明显的镇痛效应，而且还能加强针刺镇痛的效应。新生期大鼠 腹腔注射谷氨酸单钠( m s g ) 选择性地破坏a r c * * 经元或电解毁损a r c 后，吗啡 镇痛、针刺镇痛及应激镇痛效应均明显降低。形态学研究显示，a r c 与中脑导水 管周围灰质( p a g ) 、中缝背核、及蓝斑核均有密切的纤维联系，而这些部位在痛 觉传导中起非常重要的作用。电刺激a r c 不仅抑制了这三个核团神经元的活动， 而且还抑制了它们对伤害性刺激的反应。由此可见，a r c 作为内源性痛觉调制系 统的重要组成部分，在痛觉信息的调制中起重要作用。m o n y e r 等【2 0 l 及k u s 等【2 1 1 的 研究发现：下丘脑有n m d a 受体( n m d a r l ) m r n a 的表达，其中包括a r c 有中 等水平的表达。在伤害性信息传递的脊髓上高位中枢调控中，也有n m d a 受体的 参与，在外周炎症导致脑干区神经元高度兴奋时，可见n m d a 的活性增加【2 2 】，外 周炎症后脑干区n r l 、n r 2 a 及n r 2 bm r n a 表达上调【巧j 。 近年来，我们使用离体脑片细胞外记录和行为学检测的方法，初步证实了a r c 神经元的电活动有谷氨酸机制( 介导于n m d a 受体) 的参与；并在佐剂诱导的炎 症痛模型的基础上，证实了a r c 神经元发生了敏感化。免疫组织化学的结果显示 佐剂性炎症大鼠a r c 区n m d a r l 的表达量高于正常大鼠【2 4 ，2 5 1 。本实验在前期的 研究基础上，以坐骨神经部分结扎的神经病理性疼痛模型，运用a r c 内微量注射 n m d a 受体拮抗剂、非n m d a 受体拮抗剂及蛋白激酶抑制剂的方法，以行为学作 为观测指标，探索脊髓以上中枢( 下丘脑弓状核) 水平痛觉过敏相关受体及受体 后信号转导机制。此外，还运用免疫组织化学和w e s t e r nb l o t 方法检测磷酸化 n m d a 受体蛋白表达情况，从而在脊髓上水平探讨痛觉过敏的中枢敏感化机制。 2 神经病理性痛觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究 实验材料及方法 一、实验材料 实验材料及方法 1 实验对象 健康雄性w i s t a r 大鼠，体重2 0 0 2 5 0g ，由苏州大学医学部实验动物中心提供。 动物中心的卫生级核定文件编号：s y x k ( 苏) 2 0 0 2 0 0 3 7 。喂养条件如下：六只 一笼，室温2 2 c ，湿度5 0 6 0 ，通风良好，人工昼夜( 1 2h 1 2h ) ，自由摄食摄 水。实验前，将动物在饲养环境中适应三天。 2 主要试剂 a p v ( n m d a 受体竞争性拮抗剂) ，s i g m ac h e m i c a lc o m k 8 0 1 ( n m d a 受体非竞争性拮抗剂) ，s i g m ac h e m i c a lc o c n q x ( 非n m d a 受体拮抗剂) ，s i g m ac h e m i c a lc o p p 2 ( s r c 家族蛋白酪氨酸激酶抑制剂) ，m e r c kc a l b i o c h e mc o g f l 0 9 2 0 3 x ( 蛋白激酶c 抑制剂) ，s i g m ac h e m i c a lc o d m s o ，二甲基亚砜，s i g m ac h e m i c a lc o a n t i - p h o s p h o - n r l ( s e r 8 9 7 ) ，u p s t a t e a n t i p h o s p h o - n r 2 b ( s e r l3 0 3 ) ，u p s t a t e 生物素化羊抗兔i g o 二抗，v e c t o rl a b o r a t o r i e si n c h r p - c o n j u g a t e da n t i r a b b i ti g gj a c k s o ni m m u n o r e s e a r c hc o h r p c o n j u g a t e da n t i m o u s ei g qj a c k s o ni m m u n o r e s e a r c hc o 小鼠抗1 3 - a c t i n 单抗，s i g m ac h e m i c a lc o a b c ( a v i d i n b i o t i nc o m p l e x ) 试剂盒( p k 一6 1 0 1 ) ，v e c t o rl a b o r a t o r i e si n c d a b ( d i a m i n o b e n z i d i n e ) ，叠氮钠，s i g m ac h e m i c a lc o b c a 蛋白定量试剂盒，p i e r c ec o e c l 化学发光显色试剂盒，p i e r c ec o 青霉素，华北制药股份有限公司 k o d a kx - o m a tb tf i l m ( l o t # 0 3 8 3 218 0 4 ) ，k o d a k 产品 3 神经病理性痛觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究实验材料及方法 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、多聚甲醛、水合氯醛、蔗糖、明胶、双 氧水、硫堇、无水乙醇、二甲苯、中性树脂，均购自中国医药集团上海化学试剂 公司。 3 主要仪器 立体定位仪 光电分析天平 a n a l g e s y m e t e r t a i l f l i c ku n i t 微量注射泵 微量注射器 台式牙科钻 冰冻切片机 直立显微镜 体视显微镜 数码照相机 三维震荡仪 纯水蒸馏器 超声细胞破碎仪 蛋白核酸定量仪 迷你型蛋白电泳槽 i s 3 1 0 型 t g 3 2 8 a 型 3 7 2 1 5 型 7 3 6 0 型 k d s 3 1 0 型 h a m i l t o n 7 0 0 型 3 0 7 4 型 k d 2 0 2 型 c x - 4 0 8 0 i c 4 1 0 0 型 s d l 型 s z 9 3 型 j y 9 6 i i s m a r t s p e c 3 0 0 0 p o w e rp a c 2 0 0 0 k ds c i e n t i f i cu s a 上海分析天平厂 u g 0b a s i l e u g ob a s i l e 美国k j k i r b y 公司 美国k jk i r b y 公司 上海医疗器械六厂 浙江金华科迪仪器公司 o l y m p u s n i c k o n o l y m p u s 苏州大学科教仪器厂 上海玻璃仪器厂 宁波科生仪器厂 美国b i o r a d 公司 美国b i o r a d 公司 垂直转移电泳槽 s e r i a ln o 5 2 5 b r0 3 1 5 2 4 美国b i o r a d 公司 x 光自动洗片机x o m a t 2 0 0 0日本k o d a k 公司 二、实验方法 实验设计分两部分： 第一部分：探索n m d a 受体参与神经病理性疼痛的产生及受体后信号转导机 制。以大鼠坐骨神经部分结扎为神经病理性疼痛模型，采用a r c 内微量注射 n m d a 受体及非n m d a 受体拮抗剂的方法，研究参与神经病理性疼痛的受体机 制；采用a r c 内微量注射酪氨酸蛋白激酶抑制剂和蛋白激酶c 抑制剂的方法，研 4 神经病理性痛觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究实验材料及方法 究参与神经病理性疼痛的受体后信号转导机制。 第二部分：采用免疫组织化学和w e s t e r nb l o t 检测神经病理性疼痛模型大鼠 a r c 内磷酸化的n m d a 受体蛋白表达情况( 以坐骨神经部分结扎组作为实验组， 假结扎组作为对照组) 。 第一部分实验方法： 1 埋置套管及核团内微量注射 大鼠在测定痛阈的实验环境中适应三天后，腹腔注射4 的水合氯醛( 1m l 1 0 0 g 体重) 麻醉，俯卧位固定头部于立体定位仪上。剪毛、消毒头部皮肤后，于两耳 连线处剪一约1 5c m 长的切口，分离皮下组织及肌肉，用双氧水将颅骨表面擦洗 干净，即可清晰看到骨缝及前后囟。参照大鼠脑图谱2 6 1 ，按照下丘脑弓状核( a r c ) 的坐标，用牙钻头在b r e g m a 点和l a m b d a 点连线中点钻孔，埋置外径0 8m i l l 的 不锈钢套管，并以牙科水泥固定于颅骨表面。术后肌肉注射青霉素5 万单位天， 连续三天。动物分笼饲养，自由进食进水，术后5 7 天进行实验。实验时将外径 o 4i 砌的不锈钢注射针经套管插入a r c ( 坐标：b r e g m a 点和l a m b d a 点连线中点， 颅骨表面下9 6 1 0 0m m ) ，通过微量注射泵缓慢注射药液，注射速度0 2 5i t l m i n ， 注射容积0 5 “l 。注毕留针2m i n 以防药液外溢。 2 神经病理性疼痛模型的建立 采用坐骨神经部分结扎( p a r t i a ls c i a t i cn e r v el i g a t u r e ，p s l ) 模型2 7 1 。动物经4 的水合氯醛腹腔注射麻醉，常规消毒皮肤后，于左侧大腿中部切开，分离坐骨神 经干，用丝线紧紧结扎坐骨神经干的1 3 或1 2 ，结扎后于伤口表面洒少许青霉素 粉末，之后依次缝合肌肉和皮肤。假手术组大鼠只暴露神经干不进行结扎，其余 步骤同上。 3 痛阈测定 采用压爪缩腿法和辐射热缩腿法来分别测定实验动物的机械缩腿阈值 ( m e c h a n i c a lw i t h d r a w a lt h r e s h o l d ，m w t ) 和热缩腿潜伏期( t h e r m a lw i t h d r a w a l l a t e n c y , t w l ) ，作为痛反应指标。所有各组大鼠均在手术前1 天测定基础痛阂， 术后5 7 天测定术后痛阈( 即给药前痛阈) 。给药后每隔1 0m i n 测一次痛阂，直至 痛阈基本恢复至给药前水平。 3 1 压爪缩腿法：参照文献报道【2 羽，清醒动物在室温、安静状态下适应l o 2 0 神经病理性痛觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究实验材料及方法 r a i n 后，手抓大鼠并把左后肢足背部置于压爪仪压杆下，并在足背部皮肤做一标记， 脚踩踏板不断加大压爪强度，当大鼠出现缩腿反应时，记下此时的游标读数，作 为缩腿阈值。当游标达到2 5g ，而大鼠仍无反应时便停止压爪，以免损伤皮肤， 并以2 5g 作为最高痛阈。痛阈测定时连测三次，每次间隔1 2r a i n ，取三次的平均 值作为m w t 。 3 2 辐射热缩腿法：参照文献报道【2 9 】，清醒动物在室温、安静状态下适应1 0 2 0 m i n 后，用5 0 。c 辐射热光源照射大鼠左后肢足垫部，当大鼠出现缩腿反应时，记 下此时的时间值，作为缩腿潜伏期。当时间达到1 0s ，而大鼠仍无反应时便停止照 射，以免损伤皮肤，并以1 0s 作为最高痛阂。痛阈测定时连测三次，每次时间间 隔为1 2m i n ，取三次的平均值作为t w l 。 4 a r c 微量注射部位的鉴定 实验结束后退出注射针，按原坐标插入尖端裸露、其他部位均匀涂绝缘漆的 不锈钢针作为电极，通以直流电1m a m i n ，造成局部电解毁损灶作为注入部位标 记。用硫堇染色做损毁的组织学鉴定：每只动物取脑后经1 0 福尔马林固定后做 冰冻切片，取毁损灶附近2 张切片，片厚4 0 “m ，切片直接裱于明胶包被的载玻片 上，过夜自然晾干后入0 5 的硫堇溶液中染色3 0 4 5m i n ，风干，7 0 、8 0 、9 0 、 1 0 0 酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。最后在光学显微镜下鉴定，毁 损灶在a r c 内的，将实验数据列入统计。 5 数据处理及统计 分别以引起大鼠缩腿的压力数值( d 、照射时间( s ) 来表示机械痛阈和热痛阈。 采用m i c r o s o f te x c e l2 0 0 3 和s p s s1 0 0 软件进行统计分析，实验数据以均数4 - 标准 差( - 士s ) 表示，组间对比和自身对比用o n e w a y a n o v a 或，检验，p o 0 5 为有 统计学意义。做图采用s i g m ap l o t l 0 0 软件。 第二部分实验方法： 1 免疫组织化学 大鼠经水合氯醛腹腔麻醉后，快速开胸，经左心室插管至升主动脉，先快速 灌注o 0 1 m 磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ，p h 7 4 ) 2 0 分钟，直至全身 苍白，肝脏颜色变淡，接着灌注4 。c 预冷的4 多聚甲醛( p a r a f o r m a l d e h y d e ，p f a ， p h 7 4 ) 约4 0 分钟，速度先快后慢，直至动物肢体变硬。之后断头取脑，将脑组织 置于4 p f a 中固定6 8 小时，之后移入2 5 蔗糖中过夜直至脑组织下沉到瓶底。 6 神经躺理性摘觉过敏下丘脑b 状核中枢域辱化的机w 研究 实验材料敷方法 自b r e g m a 后17 2m m 到43 6 f i l m 将包括整个a r c 在内的脑组织做连续冠状冰冻 切片，切片厚4 0g m ，每隔六张取张，每只动物取l o 张用于染色。切片放入o0 1 m p b s 中漂洗( 5m i n ) ( 3 次) ，转入一抗( a n t i p h o s p h o - n r l 1 ：5 0 0 ，a n t i - p h o s p h o - n r 2 b 1 ：5 0 0 ) 中室温孵育1 6 2 0h ，o0 1 mp b s 中漂洗( 5m i n x 3 次) 后， 二抗( 生物素化 i g g ，羊抗兔，l ：2 0 0 ) 中室温孵育1 - 2h ，再用o0 1 mp b s 漂洗( 5 m i n x 3 次) ，移入亲 和紊生物素试剂( a v i d i n b i o t i nc o m p l e x ，a b c ，1 ：1 ：2 0 0 ) 中室温孵育1 2h o0 1 m p b s 中漂洗( 5 m i n x 3 次) ，昂后用含00 3 h 2 0 2 的00 5 d a b 显色5 m i n ，用00 1 mp b s 清洗两次终止显色。贴片于明胶包被的玻片上，风干后，八7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。 2 无偏差体视学定量分析 2 1 组成 体视学( s t e r e o l o g y ) 是由二维结构信息定量推论三维结构信息的一门跨形态 学与数学方面的新兴边缘学科，就是利用所测结构的图像的几何特征来定量研究 所测结构本身的几何特征( 如长度、面积、表面积、体积、数目等) 的一种方法。 免疫组织化学研究经常要求对某组织结构内特异性表达某抗原的阳性细胞数做定 量研究。体视学方法的出现很好的解决了这一问题。体视学系统主要由三部分组 成：显微镜系统、z 轴可调的电动载物台，图像采集测量系统( 图1 ) 。电动载物 台由外接的操纵杆或鼠标滚轮控制，配以相应的软件模块可以由软件编程控制。 图像系统包括连接显微镜的数码c c d 及测量数据的体视学软件。本实验用改良的 无偏差体视学方法【3 ”定量研究标记细胞，采用美国m b f ( m i c r o b r i g h t f i e l d ，i n c ) 的体视学系统及其软件s t e r e o i n v e s t i g a t o r 7 。具体操作步骤详见说明书。 图1 s t e r e o l o g i c a ls y s t e m ( 从左至右：图像采集系统、电动载物台，显微镜系统) 神经病理性痛觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究实验材料及方法 2 2 数据处理与统计学方法 体视学结果主要关注的是细胞计数结果( c o u n t i n gs i t e ) 及估计误差( e s t i m a t e d c e ) ，理想的c e 小于o 1 。计算实验组和对照组免疫反应阳性细胞总数，采用f 检 验进行统计分析，p 0 0 5 为有统计学意义。s i g m ap l o t1 0 0 软件作图分析。 3 w e s t e r nb l o t 检测 3 1 溶液配制 ( 1 ) 细胞裂解液( 4 0m 1 ) ：1 0 r a m i r i s - h c l ( p h7 4 ) ，4 8 4 4m g ；1 5 0m m n a c i ，3 5 0 6m g ；1 t r i t o nx 一1 0 0 ，0 4m l ；1 去氧胆酸钠，4 0 0m g ；0 1 s d s ， 0 4m 1 1 0 s d s 溶液；5m me d t a ，7 4 4m g ；1m mp m s f ，7m g ；蛋白酶抑制剂， 4 片； ( 2 ) 分离胶缓冲液( 6 ) ：h z o ，5 3m l ；3 0 聚丙烯酰胺，2 0m l ；1 5 m i r i s ( p h8 8 ) ，2 5m l ；1 0 s d s ，0 1m l ；1 0 过硫酸铵，0 1m l ；t e m e d ，0 0 0 8m l ； ( 3 ) 积层胶缓冲液：h 2 0 ，2 1m l ；3 0 聚丙烯酰胺，o 5m l ；1 0 mt r i s ( p h6 8 ) ， 0 3 8m l ；1 0 s d s ，0 0 3m l ；1 0 过硫酸铵，o 0 3 ；t e m e d ，0 0 0 3m l ； ( 4 ) s t a c k i n gg e lb u f f e r ：0 5m t r i sb a s e ；0 4 ( w v ) s d s ；用h c l 调至p h 6 8 ； ( 5 ) 5 x 上样缓冲液( 1 0m 1 ) ：5m ls t a c k i n gg e lb u f f e r ( p h 6 8 ) ；1 0gs d s ； 2 5m l 巯基乙醇；2 5m l 甘油；2 5m l 溴酚蓝( s i g m a b - 8 0 2 6 ) ； ( 6 ) 1 0 x 电泳缓冲液( 1 0 0 0m 1 ) - t r i sb a s e ，3 0 2 7 5g ；g l y c i n e ，1 4 4 1 3g ；1 0 s d s ，1 0 i n l ；临用时将1 0 电泳缓冲液稀释为i x ( p h 8 3 ) ； ( 7 ) 转移缓冲液( 8 0 0m 1 ) - g l y c i n e ，1 1 5 3g ；lm i r i s ( p h 8 3 ) ，2 0m l ；甲 醇，1 6 0r n l ：1 0 s d s ，1 6m l ；临用前配制，低温预冷； ( 8 ) 1 0 t r i s b u f f e r e ds a l i n e ( i 0 t b s ) 1 0 0 0m l ：8 0gn a c l ；2 4gt r i sb a s e ； 加h c l 至p h7 6 室温保存； ( 9 ) 漂洗液( t b s t ，1 0 0 0m 1 ) ：i xt b s ；0 1 ( v v ) t w e e n 一2 0 ，1m l ； ( 1 0 ) 封闭缓冲液：5 ( w v ) 脱脂奶粉，用t b s t 配制。 3 2 蛋白样品制备 ( 1 ) 将实验组( 坐骨神经结扎组) 和对照组( 假结扎组) 大鼠于手术一周后 处死，取出a r c 。 8 神经病理性痛觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究 实验材料及方法 ( 2 ) 将a r c 置于1 5 0g l 细胞裂解液中，超声细胞破碎仪低温匀浆。1 2 0 0 0r p m 4 。c 离心1 0 m i n ，取上清，8 0 冰箱保存。 ( 3 ) 取1 斗l 蛋白溶液，b c a 法测定所提取蛋白的浓度( t y 法详见产品说明) ， 调整上样量使各组蛋白总量一致，各样品上样总量控制在4 0 - 8 0g g ，用细胞裂解 液将上样蛋白体积调成一致。 ( 4 ) 样品按4 ：1 加入5 上样缓冲液，混匀后9 5 c5m i n 变性。 3 3s d s p a g e 电泳 ( 1 ) 准备玻璃板，用乙醇清洗，干燥，安装好。 ( 2 ) 配制6 分离胶，小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为积层胶 留有足够的空间( 梳齿长加1e r a ) 。在顶层缓慢加入11 1 l l 饱和正丁醇做覆盖液， 以阻止空气氧对凝胶的抑制作用。 ( 3 ) 凝胶聚合完毕之后，倒掉正丁醇，用去离子水冲洗凝胶上部数次，尽可 能用吸水纸吸干凝胶顶部的残留液体。 ( 4 ) 配制积层胶，将积层胶注入分离胶上端，迅速插入梳子。 ( 5 ) 浓缩胶聚合完毕后，用去离子水冲洗梳孔，将玻璃板安装至电泳槽中， 加入1 电极缓冲液，并浸没胶及梳孔，检查是否泄漏。 ( 6 ) 按次序上样，每孔2 5 山，安排已知分子量的标准物。 ( 7 ) 电泳。开始时电压为8 0 v ，约3 0m i n ，待染料进入分离胶后，将电压增 加到1 1 0 v ，继续电泳直到染料抵达分离胶底部时断开电源，约2h 。 3 4w e s t e r nb l o t 印迹 电泳结束后，用蛋白转移装置将蛋白转到p v d f 膜上，按转移蛋白的常规方 法进行： ( 1 ) 将与凝胶同样大小的膜用去离子水润湿，再浸入1 x 转移缓冲液中平衡 5 - 1 5r a i n 。 ( 2 ) 将电泳完毕的凝胶取出并做上记号，切去积层胶，剥离至盛有转移缓冲 液的器皿中，平衡5m i n ，洗去胶上的s d s 等离子。 ( 3 ) 在转移缓冲液中，按从下到上的顺序，将海绵、滤纸、纤维素膜、凝胶 重叠，各层之间应避免气泡。 ( 4 ) 再一次确定膜与胶之间有无气泡。 9 神经病理性痛觉过敏下丘脑弓状核中枢敏感化的机理研究实验材料及方法 ( 5 ) 在胶上再盖好浸湿转移缓冲液的滤纸，加上另一块海绵，整体夹入三明 治转移装置，移入已置有冰盒的转移槽缓冲液中，胶侧置负极，膜侧置正极。通 电转移，根据电流和目的蛋白的分子量调整转膜时间。如缓冲液转膜时发热，可 于3 0m i n 时换冰盒。本次实验转膜时间5 0 6 0m i n 。 ( 6 )