（细胞生物学专业论文）neuronatin基因表达及功能的初步研究.pdf

n e u r o n a t i n 基冈表达及功能初步研究 n e u r o n a t i n 基因表达及功能初步研究 博士后：余利红 合作导师：余新炳教授 中山大学干细胞与组织工程研究中心，广州5 1 0 0 8 0 中文摘要 n n a t 是一个脑特异表达的新基因，在大脑发育过程中被选择性地表达。该 基因的全长c d n a 最初在小鼠胎脑中被克隆，随后又克隆了人n n a t 基凶的全序 列。人n n a t 基因全长3 9 7 3 b p ，含有三个外显子和两个内含子。n n a tm r n a 有 伐和1 3 两种剪接形式，前者编码8 1 个氨基酸，后者编码5 4 个氨基酸，两者具有 相同的开放阅读框，差别在于1 3 形式中间的外显子被剪切掉。人n n a t 是单拷贝 基因，定位于染色体2 0 q l1 2 1 2 。小鼠n n a t 基因定位于2 号染色体末端。该基 因是印记基因( i m p r i n t e dg e n e ) ，仅在父本来源的等位基因表达，而母本来源的 等位基因则被甲基化不能表达。该基因在胚胎期及出生后早期大量表达，而在成 年和衰老大脑中表达明显降低，因此推测该基因与大脑的发育与分化密切相关。 除了在正常脑中检测到n n a t 基因的表达外，在部分肿瘤及非神经组织中也检测 到它的表达，但其确切功能目前还不清楚。本研究采用牛物信息学分析、基因转 染技术、流式细胞仪技术、免疫荧光技术、r t p c r 以及r n a t 扰等技术得到 如下结果： ( 一) 采用生物信息学方法进行了n n a t 核酸和蛋白质相关分析，发现n n a t 在人、小鼠、大鼠、猕猴、黑猩猩、牛、猪和狗有同源序列，而在其它物种中未 查到同源序列。n e t p h o s 服务器进行蛋白磷酸化分析，没发现任何磷酸化位点； p s o r t 蛋白定位分析结果认为内质网定位的可能性为4 4 4 ，细胞质定位为 2 2 2 ，s m a r t 服务器分析n n a t 蛋白n 端有信号肽和跨膜区。s a g e 谱显示， 该基因在成神经管细胞瘤、室鼓膜瘤、间皮瘤、横纹肌肉瘤中呈高表达；在星形 n e u r o n a t i n 基因表达及功能初步研究 胶质细胞瘤、眼癌中呈中度表达；在正常大脑皮层、视网膜、胎盘、脊髓、胚胎 干细胞和腹膜中呈低表达。 ( 二) 构建重组载体，利用基因转染技术，使用荧光显微镜观察发现在h e p g 2 细胞中表达n n a t e g f p ，两种融合蛋白都具有细胞质内定位方式，在c 6 转染 细胞中使用g 4 18 药物筛选获得稳定表达n n a t 的细胞克隆。流式细胞仪检测细 胞牛长周期，三种细胞无明显差异，也未观察到表达n n a v e g f p 的c 6 细胞发 生明显凋亡。 ( 三) 使用r t p c r 检测到n n a t 基因在胚胎期大脑，从e 9 已开始表达，但 表达量较低，随着发育时间的增加，n n a tm r n a 的表达量逐渐增加，出生前后 表达量最高。出生后无论是在大脑还是小脑中，n n a tm r n a 表达都是随发育时 期的增加，呈明显下降趋势，并在p 6 0 降到最低。 ( 四) 免疫组织化学染色发现，n n a t 蛋白在大脑的外囊，胼胝体，大脑深自质， 背侧海马联合，扣带束等处高表达，而在大脑皮层，海马，尾壳核，丘脑等处低 表达或没有表达。n n a t 蛋白表达阳性部位呈束状排列，内部有纤维状染色，周 围有胶质细胞包绕。n n a t 蛋白可能是髓鞘相关蛋白。 ( 五) r n a 干扰p c i 2 细胞n n a t 的表达后，细胞的形态发生明显变化，由无 规则的多角形或长梭形变为有规则多角形或圆形，且细胞与细胞间的界限清晰， 长出尖细的突起，细胞集落消失，呈散在生长。但免疫组化并没有检测到神经系 统标记基因的明显变化。 ( 六) r n a 干扰能促进n g f 诱导下p c i 2 细胞突起生长。野牛p c i 2 在n g f 作用6 h 以后细胞开始长出神经突起，至4 8 h 时细胞变得扁平，呈梭形或多角形， 胞体增大，部分细胞长出突起，突起长度约为胞体直径一半左右，细胞分化不均， 部分细胞没有明显的形态变化。r na p c i 2 细胞在n g f 作用6 h 可观察到细胞 折光度发牛改变，突起部位明显延伸，至4 8 小时细胞几乎全部有长的突起长出， 每个细胞周围有3 5 个突起，突起上有分支，突起长度约为胞体直径2 倍以上， 个别长的突起能达到细胞直径的5 倍左右，细胞分化程度基本相同，很少看到无 突起的细胞。n g f 诱导后突起增长比例相对于对照的p c i 2 细胞明显增高，说 明r n a 干扰可促进n g f 诱导下细胞的突起牛长。 本研究通过对n n a t 蛋白在真核细胞中异位表达情况和正常生理条件下大鼠 n c u r o n a t i n 基冈表达及功能初步研究 脑中的表达特征的观察，为n n a t 分子功能研究提供了有价值的线索，并通过研 究r n a 干扰对细胞表型变化的影响，为n n a t 在神经系统中功能的明确做了有 益的积累，进一步拓宽我们对n n a t 分子在中枢神经系统中功能的认识。 n e u r o n a t i n 基因表达及功能初步研究 t h ep r e l i m i n a r y s t u d yo fn e u r o n a t i ng e n e s e x p r e s s i o nc h a r a c t e r i s t i c sa n d f u n c t i o n p o s t d o c t o r a lf e l l o w ：y ul i h o n g s u p e r v i s o r ：p r o f y ux i n - b i n g ( c e n t e rf o rs t e mc e l la n dt i s s u ee n g i n e e r i n g ，s u ny a t - s e nu n i v e r s i t yo f m e d i c a ls c i e n c e s ，g u a n g z h o u510 0 8 0 ，g u a n g z h o u ) a b s t r a c t n e u r o n a t i n ( n n a t ) i sar e c e n t l yc l o n e db r a i ns p e c i f i cg e n et h a ti ss e l e c t i v e l y e x p r e s s e dd u r i n gb r a i nd e v e l o p m e n t h u m a nn n a tg e n es p a n s3 9 7 3 b a s e sa n d c o n t a i n st h r e ee x o n sa n dt w oi n t r o n s n n a tm r n ah a st w od i f f e r e n ts p l i c ei s o f o r m s ， a a n d l 3 ，t h ef o r m e re n c o d i n gap r o t e i no f81a m i n oa c i d sa n dt h el a t t e r5 4a m i n oa c i d s t h e s et w oi s o f o r m ss h a r et h es a m eo p e nr e a d i n gf r a m e ，b u tt h e a f o r mc o n t a i n e da n a d d i t i o n a l81 b ps e q u e n c ei n s e r t e di nt h em i d d l eo ft h ec o d i n gr e g i o n t h eh u m a n n n a ti sas i n g l ec o p yg e n el o c a t e da tc h r o m o s o m e2 0 q11 2 12 ，w h i l et h er a tg e n ei s l o c a t e do nt h ed i s t a lr e g i o no fc h r o m o s o m e2 ，2 hi n n a ti sa ni m p r i n t e dg e n ea n d e x p r e s s e df r o mt h ep a t e r n a la l l e l e ，w h i l et h e m a t e r n a la l l e l ei s m e t h y l a t e da n d s i l e n c e d a sn n a ti sh i g h l ye x p r e s s e di nt h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e mf r o mm i d g e s t a t i o nt h r o u g he a r l yp o s t n a t a ld e v e l o p m e n ta n dd o w nr e g u l a t e di na d u l t h o o da n d s e n e s c e n c e ，n n a tm a yb ei n v o l v e di nb r a i nd e v e l o p m e n ta n dd i f f e r e n t i a t i o n e x p r e s s i o no fn n a tw a sd e t e c t e di ns o m et u m o r sa n do u to f n e r v o u st i s s u e ，e x c e p tf o r a b n o r m a lb r a i n t h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no fn n a tr e m a i n st ob ee l u c i d a t e d t h e t e c h n o l o g yo fb i o i n f o r m a t i o n ，t r a n s f e c t i o n , i m m u n o f l u o r e s c e n c et e c h n i q u e ，f l o w c y t o m e t r y , r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p c ra n dr n ai n t e r f e r e n c ew e r ei n v o l v e di n t h i s s t u d ya n dm a i nr e s u l t sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w s ： 一i v n e u r o n a t i n 基冈表达及功能初步研究 1 w ep e r f o r m e dab l a s ts e a r c ho fn n a tf u l l l e n g t hm o u s em r n aa n dp r o t e i n a g a i n s tt h ed a t a b a s e sp r e s e n t l ya v a i l a b l e n n a te s t sw e r ei d e n t i f i e di nh u m a n ，m o u s e , r a t ，h a m s t e r , c h i m p a n z e e ，c o w ，p i ga n dd o g n on n a te s t sw e r ei d e n t i f i e da g a i n s tt h e o t h e rd a t a b a s e s n op h o s p h o r y l a t i o nw a sf o u n di nn n a tp r o t e i nb yn e t p h o ss e r v e r ； t h ep o s s i b i l i t yo fp r o t e i nl o c a t i o ni nc e l l sp r e d i c t e db yp s o r ts e r v e ri se n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( 4 4 4 ) o rc y t o p l a s m ( 2 2 2 ) t h e r e w e r e s i g n a lp e p t i d ea n d t r a n s m e m b r a n ea tnt e r m i n a la n a l y s i sb ys m a r ts e r v e r ；s a g er e s u l t sh i n t e dt h a t t h e r ew e r e n n a t e x p r e s s i o n a t h i g h l e v e li n m e d u l l o b l a s t o m a , e p e n d y m o m a , m e s o t h e l i o m a , r h a b d o m y o s a r c o m a ；m o d e r a t el e v e li na s t r o c y t o m aa n do p h t h a l m o c a r i n o m a ； l o wl e v e la tn o r m a lc e r e b r a lc o r t e x ，r e t i n a ，p l a c e n t a , s p i n a lc o r d ，e m b r y o n i cs t e mc e l l a n d p e r i t o n e u m 2 w ec o n s t r u c t e dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r so fn n a ta n dt r a n s f e c t e dt h e v e c t o r si n t ot h eh e p g 2c e l l s n n a t e g f pf u s i o np r o t e i nd i s t r i b u t e da tc y t o p l a s m n o o b v i o u si m p a c tt oc e l lc y c l ea n da p o p t o s i sw a sf o u n di nt h en n a to v e r e x p r e s s e dc 6 c e l l sb yf l o wc y t o m e t e r 3 n n a tm r n a e x p r e s s i o nw e r ed e t e c t e db yr t p c rd u r i n gt h ed e v e l o p m e n to f b r a i n i tc o u l db ed e t e c t e df r o me 9a n di n c r e a s ew i t ht h ed e v e l o p m e n tt i m ea n dr e a c h t h ep e a ka tb i r t h a f t e rb i r t h , n n a tm r n a e x p r e s s i o ng r a d u a l l yd e c l i n e sn om a t t e ri n b r a i no rc e r e b e l l u m 4 i m m u n o f l u o r e s c e n c ea n a l y s i sr e v e a l e dn n a tp r o t e i np r i m a r i l ye x p r e s s e d a b u n d a n t l ya tt h er e g i o no fe c ，c c ，d e w , d h ca n dc go fb r a i n n n a tp r o t e i ni sl o c a t e d a tm y e l i no fn e r v ef i b e r , w h i c hf o r mt h ef a s c i c u l a rs h a p e n n a tm a yb eam y e l i n a s s o c i a t e dp r o t e i n 5 t h er n ai n t e r f e r e n c er e s u l t e di nt h ec h a n g eo fp c12c e l ls h a p e w i l dp c12 c e l l sa r et o r o i d ，s h o r tf u s i f o r ma n dt r i a n g l e ，t h e r ea r es h o r tn e u r i t i sa m o n gs o m e p c12c e l l s a f t e ri n t e r f e r e n c e d ，t h ec e l l sa r ep o l y g o nr e g u l a rw i t hs h o r tp r o c e s s e s ； c o l o n yd i s a p p e a r e d a n d c e l l g r o w t h w a s s c a t t e r e d t h o u g h t h e i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yt e c h n i q u et od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fd i f f e r e n tn e r v o u sl i n e d i f f e r e n t i a t i o nm a r k e ri nt w og r o u pp ci2c e l l s ，w ec o n s i d e rt h e r ew e r en oo b v i o u s d i f f e r e n c e s 一v 一 n e u r o n a t i n 基冈表达及功能初步研究 6 t h er n ai n t e r f e r e n c ew o u l dp r o m o t et h en e u r i t e se x t e n s i o no fn g ft r e a t e d p c12c e l l s n e u r i t e sh a v ee x s e r t e da f t e rp ci2c e l l sc u l t u r e de x p o s e dt on g ff o r6 h ， t h e s en e u r i t e sa l ea b o u th a l fo fm a xd i a m e t e ro fc e l l sf o r4 8 h t h el e n g t ha n dn u m b e r o ft o t a lp r i m a r yn e u r i t ei nk o n c k d o w ng r o u pa r eo b v i o u s l yl o n g e ra n db i g g e rt h a nt h a t i nc o n t r o lg r o u pw h e np c12c e l l sw e r ec u l t u r e df o r4 8 he x p o s e dt on g e i nc o n c l u s i o n ，t h r o u g hd e t e c t i n gt h en n a te c t o p i ce x p r e s s i o ni ne u k a r y o t i cc e l l a n d o b s e r v i n gp r o t e i ne x p r e s s i o n c h a r a c t e r i s t i c si nr a tb r a i nu n d e rn o r m a l p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n ，w eo b t a i nv a l u a b l ec l e wf o rf u n c t i o ns t u d yo fn n a tg e n e t h e r e s e a r c ho fn n a tk n o c k d o w ni su s e f u lt oc l e a rt h eg e n ef u n c t i o ni nn e r v o u ss y s t e m a l lo ft h e s ec o u l db r o a d e nt h eh o r i z o na b o u tt h ef u n c t i o n so fn n a ti nc n s 一v i n n a t f b s d m s o p c r i m p c r c d n a r n a i 英文缩写词表 n e u r o n a t i n f e t a lb o v i n es e r u m d m i e t h y ls u lf o x i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e v e r s e dt r a n s c r i p tp c r c o m p l e m e n td n a r n ai n t e r f e r e n c e d s r n ad o u b l e s t r a n d e dr n a s h r n a n g f g f a p c c d c w c g d h c p l p m b p m o g m a g s h o r th a i r p i nr n a n e r v eg r o w t hf a c t o r g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n e x t e r n a lc a p s u l e c o r p u sc a l l o s u m d e e pc e r e b r a lw h i t em a t t e r c i n g u l u m d o r s a lh i p p o c a m p a lc o m m i s s u r e p r o t e o l i p i dp r o t e i n m y e l i nb a s i cp r o t e i n m y e l i no l i g o d e n d r o g l i ag l y c o p r o t e i n m y e l i na s s o c i a t e dg l y c o p r o t e i n n e u r o n a t i n 基冈表达及功能初步研究 n e u r o n a t i n 基因表达及功能初步研究 博士后：余利红 合作导师：余新炳教授 中山大学干细胞与组织工程研究中心，广州51 0 0 8 0 n n a t 基因研究进展 i 上j l 一 刖吾 大脑发育是一个连续不断的过程，通过基因的选择性表达而得以精确控制。 n n a t 是近年来发现并被克隆的脑特异的新基因，早期研究显示它仅在胚胎期和 出牛后脑发育最旺盛时高表达，在成年和衰老脑中表达下调，提示该基因的表达 对大脑发育过程具有指导作用。n n a t 表达和结构特点暗示其产物可能是重要信 号因子，对脑的发育具有调节作用。克隆和分析n n a t 基因对研究大脑早期发育 的过程和机理具有重要意义。对小鼠、大鼠和人的基因研究已经比较深入，但对 其它物种基因的研究报道很少。本部分内容综述了最近几年对n n a t 基因的研究 结果和进展，主要包括n n a t 基因的克隆和分析、n n a t 基因产物结构和功能的预 测、n n a t 基因的研究现状等，并进一步对n n a t 基因的研究前景进行了展望。 1 n n a t 基因的克隆及其组织表达谱 1 1 基因的克隆 n n a t 是一个脑特异的，具有高度保守性的哺乳动物发育相关新基因。它的 首次分离是在新生大鼠脑中，j o s e p hr 和d o ud 于1 9 9 4 年在对大鼠出生后脑发 育过程中基因的选择性表达研究时，通过差异展示技术得到了一个在新生鼠脑中 选择性表达的c d n a 片段，此片段在g e n b a n k 中没有同源序列。以此为探针， 从相同m r n a 样品制备的文库中筛选到阳性克隆并测序。n n a tc d n a 全长为 1 1 9 5 b p ，编码8 1 个氨基酸的新蛋白，有强的转录起始位点，编码区从第4 l 到 n e u r o n a t i n 基因表达及功能初步研究 2 8 3 个核苷酸，之后是转录终止序列【i 】。继n n a t 首次在大鼠中克隆之后，d o ud 和j o s e p hr 于1 9 9 6 年以鼠n n a t 0 c 为探针，筛查了人胎脑c d n a 文库，分离并测 序了人n n a tc d n a 【g e n b a n ka c c e s s i o nn o u 2 5 0 3 3 f o r m ) a n du 2 5 0 3 4 ( 1 3 - f o r m ) 】，之后又以人的n n a t pc d n a 为探针，筛查人的基因组文库，通过 s o u t h e r n 杂交，限制性酶切分析，引物步行测序得到了人n n a t 基因的全长序列1 2 j 。 该基因共跨越3 9 7 3 个碱基，包含3 个外显子和2 个内含子。引物延伸分析 结果表明，该基因的单一加帽位点定位于起始密码子上游第1 2 4 个碱基，肩动子 包含有修饰了的t a t a 框c a t 丸a ( 2 7 ) 和修饰的c a a t 框g g c g a a t ( 5 9 ) 。 这种结构的启动子也存在于其它几个脑特异基因中。5 侧翼区有潜在的转录因子 结合位点。另外。肩动子包含一2 l b p 的序列，它与控制神经元特异的基因表达 的神经限制沉默元件具有很高的同源性，位于基因的4 2 l 。s p 1 、a p 一3 结合位 点位于内含子l 内部。所有拼接供体和受体位点都遵守g t a g 规则。外显子1 编码2 4 个氨基酸，外显子2 编码2 7 个氨基酸，外显子3 编码3 0 个氨基酸。在 基因的3 端，有加尾信号一a a t a a a ，p o l y a 位点和g t 簇。除了苏氨酸外，其 余所有的n n a t 用到三联体密码子与人类所使用的密码子一致。 1 2n n a t 基因的组织表达谱研究 n n a tm r n a 在哺乳动物神经发生过程中被选择性的表达，j o s e p h r 掣3 j 的 研究表明n n a tm r n a 有0 c 、d 两种拼接形式，两者具有相同的开放阅读框，0 c 形 式包含3 个外显子，编码8 1 个氨基酸的蛋白，d 形式包含两个外显子，编码5 4 个氨基酸的蛋白，两者的差别是0 【形式有一个额外的8 l b p 片段插入到编码区中。 除此之外，k a g i t a n if 等【4 l 报道其m r n a 有另外一种拼接形式，但通过r t p c r 不能检测到表达。j o s e p h r 等【3 】利用n o r t h e r n 杂交，分析了大鼠n n a t ( n n a t ) 在大 脑及其它组织中的表达分布。研究发现n n a t 在新生鼠胎脑选择性表达，而在心、 肾、肝等三种组织没有表达。同时还做了不同时相点的n o r t h e r n 杂交分析，结果 表明n n a tm r n a 对于大脑具有相对的选择性。它最初出现在胚胎1 1 1 4 天，这 时神经管闭合，神经上皮细胞开始增值，在胚胎1 6 一1 9 天的神经发育高峰期时， m r n a 的表达变得很显著。随着神经发育的完成，下降到成年大脑的表达水平。 d 形式最早出现在胚胎11 1 4 天，而仅形式甚至于更早，在胚胎7 1 0 天就能检测 到。以上结果表明n n a tm r n a 的两种形式在大脑发育期间被差异调节，不同拼 接形式的出现与大脑发育相关。u s u ih 等【5 】在研究哺乳动物大脑发育过程的分子 一2 一 n e u r o n a t i n 基冈表达及功能初步研究 机制，利用修饰的差异筛选和n o r t h e r n 印迹分析，同样证实n n a t 在胎脑中的表 达高于成年大脑至少五倍，且在大脑发育过程中表达下调。根据原位杂交的结果， 在胚胎后脑发育过程中，n n a t 最初在胚胎后期和出生后早期高表达，在成年和 衰老脑中表达下调。但是，在检测的大量的成年脑组织中，垂体前腺是n n a t m r n a 唯一强表达的地方1 6 】。有趣的是，组织培养研究表明，在成年小鼠的胰p 细胞中也有表达【7 j 。 w i j n h o l d sj 等【8 j 通过消减杂交证实小鼠n n a t 在p 1 9 胚胎癌细胞中表达下调。 他们通过n o r t h e r n 印迹分析、切片原位杂交和全样载片( w h o l e - m o u n th y b r i d i z a t i o n ) 杂交组织化学分析，确定基因在后脑发育早期的菱脑节3 和5 及前肠口袋的底部 瞬时表达。另外，在甲期拉特克囊，垂体前叶，发育中的内耳也能检测到表达。 在胚胎发牛后期，n n a t 基因在中枢和周围神经系统的主要部分强表达。这些结 果表明，n n a t 参与了后脑和垂体的发育过程中片段一致化( s e g m e n ti d e n t i t y ) 的维 持，及神经系统所有结构的成熟或维持。而在k i k y on 等【9 】的研究中，通过原位 杂交分析表明在新牛鼠的嗅球、海马和小脑n n a tm r n a 也有表达。而y o s h i o k a n 等【i o 】在研究转化抑制基因时，证明n n a t 在鼠胚胎成纤维细胞中比在正常成纤 维细胞高表达。y a m a s h i t am 掣2 2 】分离大鼠的催产素能神经元和血管升压素能神 经元后，采用单细胞差显杂交技术发现n n a t 仪在血管升压素能神经元表达，而 在催产素能神经元中不表达，进一步采用原位杂交方法证实2 l 天的大鼠胚胎中 枢神经系统中n n a t 广泛表达，成年大鼠脑中则主要在视丘下部的腹面强表达。 n i s h i d a y 等【2 7 1 运用一系列基因表达分析的方法，分别鉴别了成年雄性小鼠皮层， 视丘下部和垂体中的最丰富转录本，发现垂体腺特征表达的前l o 个转录本包括 n n a t 基因。紧接着，他们又在不同性别小鼠的皮层，视丘下部和垂体的基因转 录比较中发现n n a t 在雄性小鼠垂体中的表达比在雌性小鼠垂体中的表达的两倍 还要多，可能受到循环系统中男性荷尔蒙的调节使他的表达呈现出性别上的差异 1 2 8 o n n a t 的表达除了与部位和时间有关外，也受到一些外界因素的调节。1 9 9 6 年，j o s e p hr 等研究发现n n a tm r n a 在未分化的p c i 2 细胞中大量表达。用 神经牛长因子( n g f ) 处理后，n n a tm r n a 的表达下调，细胞增殖停止并转化成神 经元表形，包括已分化的成熟神经元的神经突起。除去n g f 后n n a tm r n a 的表 达恢复。n g f 的这种作用是特异性的，因为转化生长因子，表皮生长因子，醋 一3 一 n e u r o n a t i n 基冈表达及功能仞步研究 酸十四烷佛波醇( t e t r a d e c a n o y l p h o r b 0 1 a c e t a t e ) ，地塞米松处理后并没有观察到相 同的现象。而碱性成纤维细胞牛长因子也能减少n n a tm r n a 的表达，但是效果 没有n g f 明显。当蛋白和r n a 合成抑制剂存在时，n g f 诱导的n n a tm r n a 的 表达下降同样发牛，表明n g f 的作用并不依赖于蛋白和r n a 的合成。两种拼 接形式中仪仅形式在p c i 2 细胞中表达。另外，w o o dw m 等【眩】在用甲状腺激素 处理的促甲状腺肿瘤( t h y r o t r o p i ct u m o r ) 时，观察到n n a tm r n a 的表达上调。 s u r e n d r a ns 等【2 9 】在苯丙酮酸尿症( p k u ) 小鼠大脑检测发现n n a t 表达比在正常小 鼠脑中的表达高，蛋白的高表达可能与模型鼠的认知障碍有关。而b e c k e rm 等 f 3 0 】的研究则发现，他莫西林抗性的乳癌模型中n n a tm r n a 的表达显著上调。p a r k s 等【3 l 】采用体外分离背根神经节模型来研究a r t e m i n 对成年大鼠神经系统影响时 发现，当用a r t e m i n 处理3 个小时后，a r t e m i n 下调包括n n a t 在内的一些与细胞 黏附和基质装配相关的基因的表达。 2 n n a t 基因的结构特点及其染色体定位 d o ud 等【b 】通过第2 0 号染色体的缺失体构建和荧光原位杂交将n n a t 基因 定位在人的2 0 号染色体长臂2 0 q 1 1 2 一1 2 ，此基因为单拷贝，而在小鼠中定位于 第2 号染色体末端8 8 c m 处。 1 9 9 7 年，k a g i t a n if 等【4 】通过用受精8 5 天的单性牛殖小鼠胚胎作消减杂交 确定了三个新的候选印记基因p e 9 5 7 ，其中p e 9 5 的c d n a 序列与n e u r o a n t i n 同 源，且与大鼠和人的有很高的同源性。所有的剪接形式都仅在父本等位基因表达。 通过连锁分析将p e 9 5 n n a t 作图定位到2 号染色体末端，在这个部位包括一个与 形态异常和早期新生儿死亡相关的印记区【l 引。进一步的详细绘图分析表明，n n a t 定位在t 2 6 h 和t 2 w a 的易位断点之间，令人惊讶的是，他与已报道的t 2 8 h 和 t 2 w a 的易位断点之间的印记区很接近，表明在小鼠的2 号染色体末端有两个不 同的印记区，为了研究n n a t 的作用，k i k y on 等【9 】通过荧光原位杂交比较了正常 胚胎，正常胚胎的2 号染色体远端t 2 6 h 易位断点父本重复和母木重复的胚胎。 n n a t 的表达在正常和具有来自父本n n a t 的两个拷贝的胚胎中被检测到，而在具 有来自母本的两个拷贝的胚胎中不能检测到基因的表达。基因的差异表达通过 d n a 甲基化分析得到支持，来自父本的等位基因没有被甲基化，来自母本的等 位基因完全被甲基化。尽管实验胚胎的表现型大体上与检测到的n n a t 表达的胚 胎在结构上表现相似，但是观察到的新生鼠小脑的折叠确实存在差异，这种差异 一4 一 n e u r o n a t i n 基冈表达及功能初步研究 可能是由于n n a t 的获得或缺失而导致的更精确的发育或行为方面的后果。 在鼠的6 条常染色体上有9 个印记区，其中的任一区域的单亲遗传都会导 致鼠的表现型异常。w i l l i a m s o nc m 等【1 4 】将n n a t 作图在带2 h i ，它与以前描述 的印记区接近且有1 8 m b 的距离。他的作图与豚鼠很接近，其等位基因根据亲本 来源不同而差异表达。n n a t 定位到带h 1 使小鼠2 号染色体第二个印记区的作图 定位得到证实和明确。印记基因通过亲本等位基因甲基化的不同方式而与其他基 因区分。k e l s e yg 等【1 5 】通过甲基化敏感的表现度差异分析用于鼠的2 号染色体 末端印记座位的证实。通过此方法，检测到了n n a t 座位在2 号染色体印记甲基 化位置。 n n a t 专一的在父本来源的等位基因表达，而母本的等位基因沉默且甲基化。 n n a t 座位表现出一些与其它印迹区不同的特性，其它印记基因成簇出现且被等 同调节，而n n a t 与其它的印记基因联系不紧密。更不寻常的是，鼠n n a t 位于双 等位基因表达的b c l 0 基因的8 k b 内含子的内部，且与b c l 0 基因的转录方向相 反。尽管两者之间有这么紧密的排列，但并不共享组织专一表达或等位基因专一 表达的调节元件。用修饰过的b a c 转基因动物表明n n a t 在异位位点的印记表达 需要在基因周围一个至少8 0 k b 的区域。而且，报告转基因小鼠揭示有不同的分 散顺式调节元素指挥组织特异表达，主要是区域的上游部位指导等位基因专一表 达【1 6 】。人的2 0 号染色体的n n a t 位点也有相似的组成。e v a n sh k 等【1 7 】报道人n n a t 在染色体2 0 q 1 1 2 是印记基因，专一的从父本等位基因转录，包含n n a t 的区域 有多个c p g 岛，甲基化分析表明在启动子区域有一个1 8 k bc p g 岛，在所有检 测的组织中都表现出不同程度的甲基化。这个发现与c p g 岛作为n n a t 印记控制 结构域的成分是一致的。n n a t 位于b l c a p ( b l a d d e rc a n c e r - a s s o c i a t e dp r o t e i n ) 基因 8 5 k b 的单一内含子内部，而这个基因不是印记基因。这样的情况，即在人的非 印记基因的基因组结构内部包含有印记基因尚属首例。因此，n n a t 是一个小印 记结构域，这个位点适合于做局部的印记调节机制的研究。e v a n sh k 等【2 6 】针对 多个物种( 人，小鼠和大鼠) 的这个微印记区域的系统发育比较结果显示可能存 在几个不同的侯选基因进行印记控制，包括串联重复序列和参与染色体重排的反 式作用因子假定结合位点。分析结果表明n n a t 是第一个被证明的真哺乳亚纲特 异的印记基因。 一5 一 n e u r o n a t i n 基冈表达及功能初步研究 3 n n a t 蛋白的结构特点及可能的功能 虽然n n a t 的序列己知，但到目前为止对于其编码产物的结构和功能的研究 仍然相对较少，没有确定的结论。从n n a t 的c d n a 序列推断其编码81 个氨基酸 的蛋白，从l 到3 6 位是疏水的，7 4 到8 l 位是亲水的，这种结构暗示蛋白的n 末端可能是与膜结合的，而c 末端定位在细胞质里。推测n n a t 可能参与信号传 导过程【i 】。n n a tm r n a 在哺乳动物大脑发育的胚胎后期和出生后时期表达丰富， 在成年和衰老期表达下调，提示此基因下调参与大脑终末分化，这暗示着它在大 脑分化过程中起一定的作用【l l 。由n n a tq 和p 推断的基因产物大小分别是9 2k d a 和6 1 5k d a ，外显子1 编码的是疏水n 端，外显子3 编码的是亲水c 端，而仪 在d 形式中存在的中间外显子既不是疏水也不是亲水的，氨基酸序列与周质氢化 酶( p e r i p l a s m i ch y d r o g e n a s e ) 有4 0 的同源性【3 l ，它的意义尚不明了。疏水区包含 有2 3 个氨基酸位点，这种大小非常适合形成0 【螺旋结构的跨膜区。有实验结果 支持它是一个跨膜蛋白，当n n a tc d n a 与l a c z 融合后，观察到表达的融合蛋白 被锚定在大肠杆菌的细胞质膜，c 端2 0 由精氨酸组成。人n n a t 推测的氨基酸 序列与两个已知的离子通道蛋白p m p i ，p h o s p h o l a m b a n 有5 0 的同源性，且二 级结构也具有同源性。这两个己知蛋白是作为h + - a t p a s e ，c a z + - a t p a s e 的亚单 位起作用的，属于蛋白脂质。这三个多肽的结构组成是相似的，包括疏水跨膜结 构域和带电荷的亲水结构域。推测n n a t 的蛋白产物也是蛋白脂质，作为大脑发 育过程中离子通道的调节子起作用【1 3 1 。 由人n n a tc d n a 推断出的蛋白与从鼠推断的蛋白具有高度的保守性，除了 c 末端附近两个位置的差异外，其余的序列是一致的。两个物种之间的蛋白的保 守程度表明n n a t 基因功能的重要性【2 1 。n n a t 编码的假定跨膜蛋白可能是作为蛋 白配体，辅因子，小的细胞粘付分子等起作用，参与神经系统成熟过程和后脑和 垂体前叶的发育或分化过程中的信号传导，细胞细胞间通讯或细胞粘附过程【8 j 。 z h e n gs 等研究发现，一种不表达n n a t 基因的p c i 2 细胞亚种对有毒物质的敏感 性增加，当重新转入并表达n n a t 基因后，细胞又具有了对有毒物质的抗性。因 此他们推测，n n a t 在神经发育过程中的功能可能是保护发育中的细胞不受有毒 物质的侵害【1