（细胞生物学专业论文）优质红锥遗传多样性分析.pdf

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区的特殊条带，可以将其与其它红锥品系区分开来。 酯酶分析：酯酶谱带的分布据r m 的大小分为a 、b 、c 、d 三个区段。 即，a 区：0 3 8 o 4 4 ；b 区：0 4 9 ：c 区：0 5 7 ：d 区：0 8 1 o 9 2 。a 区靠 近负极，所带负电荷较弱，电泳速度慢，共有2 条谱带，r m 呈现逐渐增大规 律，为红锥的特征谱带。b 区较a 区靠近正极，电泳速度较快，共有1 条谱 带，为广东2 号、凭祥、博自共有。c 区电泳速度较快，共1 条谱带，为 博白、苍梧共有。d 区电泳速率最快，共3 条谱带，其中浦北占有三条谱 带，可以看作是其特有带型，博白占有其中一条。 ( 3 ) 柏以基因序列比对分析： 通过p c r 扩增得到1 0 个红锥品系的r b c l 基因全序列，均为1 5 1 3 k b ，序列比对表明从2 5 6b p 1 4 5 5b p l o 个红锥品系之间1 6 处碱基发生 变异，变异率为1 。其中3 0 6b p 处和6 3 4b p 处1 0 个红锥品系较对照 同属的c a s t a n o p s i s l u c i d a 发生相同的变异，可以看作属内进化信息碱 基。i s s r 聚类的第一类群中的广东1 号、容县、凭祥、东兰较c a s t a n o p s i s l u c i d ar b c l 序列均发生碱基变异，并且容县和凭祥在4 2 6b p 处发生相 同变异，第四类群浦北在3 处碱基位置较其它9 个品系发生变异，其它 第二、第三的3 个品系较c a s t a n o p s i sl u c i d a 没有发生变异，可以推论 优质红锥遗传多样性分析 i s s r 分析的第二、三类群与同属的c a s t a n o p s i sl u c i d a 进化上最接近。 进而从翻译成的氨基酸序列比对分析，1 6 处碱基变异共引起8 处氨基 酸序列变异。 ( 4 ) 光合速率及叶绿素含量分析： 1 0 个红锥品系光合速率均呈双峰曲线，于1 0 ：3 0 和1 6 ：3 0 达到最高 峰，其中浦北光合速率最高，东兰光合速率最低。叶绿素含量以浦北最 高，东兰最低。 关键词：红锥；遗传多样性；分析 2 优质红锥遗传多样性分析 a b s tr a c t c a s t a n o p s i sh y s t r i xa c i sak i n do fe v e r g r e e na r b o r sh a v i n g m a n y e x i m i o n sc h a r a c t e r ss u c ha s ： g r o w i n gf a s t ，e x c e l l e n t t e x t u r e ，a b r o a da c c l i m a t i z a t i o n i nt h i ss t u d y ，i n t e r s i m p l es e q u e n c e r e p e a t ( i s s r ) 、p e r o x i d e s ei s o z y m e s 、e s t e r a s ei s o e n z y m e s 、a n a l y s i so f 柏乩g e n es e q u e n c e sw e r ee v a l u a t e df o ri t sp o t e n t i a lu s ei nt h eg e n e t i c v a r i a b i l i t yo fi 0c u l t i v a r so ff a s t a n o p s i sh y s t r j xa d c ，a n dt h e n c o m b i n e dw i t ho t h e rp h y s i 0 1 0 9 i c a la n a l y s i s ，w ec a nd oaa l l s i d e s r e s e a r c ha b o u t t h e s et 0c u l t i v a r so fc a s t a n o p s i sh y s t r i xa d c t h em a i n l yi m p o r t a n te x p e r i m e n tr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 i s s ra n a l y s i s s t a t i s s o f t w a r ew a su s e dt oc a l c u l a t et h en e i sg e n e t i c d i s t a n c ea n dad e n d r o g r a mw a sc o n s t r u c t e db a s e do r lu p g m ac l u s t e r a n a l y s i s t h e s e1 0c u l t i v a r ss u r v e y e dw e r ec l a s s i f i e di n t o4m a j o r g r o u p s a f t e rm a n yt r i e s ，w ef i n d t h eo p t i m u mp r o g r a m m i n g o f i s s r p c r ，a n di ti s ：t e m p l a t e6 0n g ，1ut a q ，1 5m m o l l m 9 2 + ，dn t p o 2 5m m o l l ，p r i m e r s0 5um o l l ，2 d i m e t h y lf o r m a m i d ed i m e t h y l a c e t a li n2 0ulr e a c t i o ns y s t e m t h ep r o c e e d i n go fi s s r p c ri s ：9 4 5m i n ，9 4 3 0s ，5 2 - 5 5 4 5s ，7 2 2m i n ，4 0c y c l e s ，7 2 7 m i n 2 i s o z y m e sa n a l y s i s t w o i s o z y m e s ( p e r o x i d e s ei s o z y m e ，e s t e r a s ei s o e n z y m e ) o f i 0 c u l t i v a r sw e r es t u d i e d b y m e a n so f p o l y a c r y l a m i dg e l e l e c t h o p h o r e s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts e v e r a l b a s i ci s o z y m e b a n d sw e r eo b s e r v e di na 1 1c u l t i v a r sa n dt h e yh a v e t h e i ro w n c h a r a c t e r i s t i cb a n d sw h i c ha r ed i f f e r e n tf r o m e a c ho t h e r a n a l y s i so fp e r o x i d e s ei s o e n z y m es h o w e st h a tt h e s e t h r e e b a n d s d i s t r i b u t ei nt w oz o n e s ( a ，b ) ，p u b e ih a so n es p e c i a lb a n di nc - z o n e a n a l y s i so fe s t e r a s ei s o e n z y m es h o w e st h a t t h e s es e v e nb a n d s 3 优质红锥遗传多样性分析 3 4 d i s t r i b u t e i n t h r e ez o n e s ( a ，b ，c ，d ) ，a n d i t i s ：az o n e ：0 3 8 0 4 4 ：b z o n e ：0 4 9 ，c z o n e ：0 5 7 ：d z o n e ：0 8 1 0 9 2 b o b a ia n dc a n g w uh a v eo n e s p e c i a lb a n di nb - z o n e ，b o b a i 、c a n g w ua n dn o 2o fg u a n g d o n gs h a r e o n es p e c i a lb a n di nc z o n e p u b e ih a s t h r e es p e c i a lb a n d si nc - z o n e r b c lg e n e s e q u e n e sa n a l y s i s t r o u g ha n a l y s i n go fr b c lg e n es e q u e n e sa c q u i r e df r o mp c r ，w e f i n ds i x t e e nm u t a t i o n si n2 5 6b p 1 4 5 5b p ，s ot h em u t a t i o nr a t i o is1 c o m p a r e dt oc a s t a n o p s i sl u c i d a , b e t w e e n3 0 6 b pa n d 6 3 4 b p ，t h e yh a v et w oc h a r a c t e r i s t i cm u t a t i o n so ft h e i ro w i ，s oi tcan d if f e r e n t f r o m c a s t a n o p s i s t u c i d a c o m p a r e d t o c a s t a n o p s i s l u c i d a , d o n g l a n 、p i n g x i a n g 、r o n g x i a n 、n o 1o fg u a n g d o n gw h i c hb e l o n g t ot h ef i r s tg r o u pi ni s s ra n a l y s i s ，a 1 1o ft h e mh a v em u r a t i o n si n r b c lg e n es e q u e n e s p u b e ih a v et h r e em u t a ti o n sc o m p a r i n gw i t ho t h e r n i n ec a s t a n o p s f sh y s t r i xa d c ，s ow et h i n ki t i sv e r ys p e c i a l t h e s e c o n d a n d t h i r d g r o u p s i ni s s r a n a l y s i sa r es i m i l a r w i t h c a s t a n o p s i sl u c i d a p h y s i 0 1 0 9 i c a la n a l y s i s p h o t o s y n t h e t i ce f f i e n c ya n dc o n t e n to fc h l o r o p h y la r ed i f f e r e n t i nt h e s e1 0c u l t i v a r s o fa l l ，p u b e ih a st h eh i g h e s tl e v e l s ，d o n g l a n h a st h el o w e s t1 e v e 】s k e yw o r d s ：c a s t a n o p s i s h y s t r f x a d c ；g e n e t i cv a r i a b i l i t y ：a n a l y s i s 4 优质红锥遗传多样性分析 略缩词 i s s ri n t e r s i m p l es e q u e n c er e p e a t s微卫星d n a 或短串联重复序列 r a i dr a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a随机扩增多态性d n a p c rp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 d n ad e o x y r i b o n u c l e o t i d e脱氧核糖核酸 a c ra c r y l a m i d e丙烯酰胺 b i s b i s a c r y l a m i d en ，n 甲叉双丙烯酰胺 e d t ae t h y l e n ed i a m i n et e t r aa c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 p a g ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 e be t h i d i u mb r o m i d e溴化乙碇 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠 d n t pd e o x y r i b o n u c l e i c t r i p h o s p h a t e脱氧核糖核苷三磷酸 t b et r i s 一硼酸缓冲液 t r i st r ih y d r o x y m e t h y lm e t h y l a m i n e三羟甲基氨基甲烷 l bl u r i ab e r t a n培养基 c t a bc e t y l t r i e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e十六烷基三甲基溴化铵 r n a a sr i b o n u c l e a s ea核糖核酸酶 b p b a s ep a i r碱基对 k bk il o b a s ep a i r千碱基 u p g m a非加权组平均法 5 优质红锥遗传多样性分析 1 前言 遗传多样性是指种内基因的变化，包括种内显著不同的种群间和同一种 群内的遗传变异，也称为基因多样性。在物种内部因生境的不同也会产生遗传 上的多样化，各种生物不同亚种或地方品种中都存在着丰富的遗传多样性， 是物种以上各水平多样性的重要来源。一个种群遗传多样性越高或越丰富， 适应环境的能力就越强。可见，物种或种群进化潜力和适应环境的能力取决于 遗传多样性的大小“1 。植物遗传多样性研究是植物种质资源保护及开发利用 的基础，它是根据遗传标记来进行的。对当前优良品种的遗传多样性进行准确 的评价可以为亲本选配、后代遗传变异程度及杂种优势水平的预测提供预见 性的指导，这是关系到育种目标能否成功实现的关键。1 。 检测遗传多样性的方法是随着生物学研究层次的提高和实验手段的不 断改进而逐步发展起来的。从形态学水平、细胞学( 染色体) 水平、生理生 化水平直至达到目前的分子水平。无论在什么层次上进行研究，其目的都是 为了揭示遗传物质的变异。迄今为止，任何一种检测遗传多样性的方法都存 在各自的优点和局限性，还找不到一种可以完全取代其它方法的技术。因此， 包括经典的形态学、细胞学、以及同工酶和d n a 技术在内，各种方法都能从 各自的角度提供有价值的信息，都有助于我们认识遗传多样性及其生物学意 义”。 1 ，1 植物遗传多样性研究的发展 1 8 6 0 年以来，以孟德尔为代表的经典遗传学采用的是最直接的表现型性 状作为了解遗传差异的标记。由于表现型和基因型之间存在着基因表达、调 控、个体发育等复杂的中间环节，如何根据表现型差异来反映基因型差异，就 成为用表现型性状检测遗传多样性的关键。在形态学层次上，利用表现型来研 究遗传多样性具有简便、易行、快速的特点。但以后的研究表明，表现型性状 大多不是单基因控制的，并且大部分根本不是可遗传性状，而是环境饰变等作 用的结果。用表现型性状差异来研究植物遗传多样性有很大的不确定性和局 限性。因此，仅仅依赖表现型性状是远远不够的，还必须进行更深层次的研究， 并加以比较验证。染色体水平的遗传多样性研究又称细胞学标记，主要体现 在染色体结构变异( 缺失、易位、倒位、重复) 、数目变异( 整倍体、非整倍 6 优质红锥遗传多样性分析 体) 及染色体形态、缢痕和随体等核型特征，这些特征的变异使种内出现丰富 的多样性。用同功酶标记研究遗传多样性始于1 9 6 6 年，女h h u b b y 等“1 对果蝇种 群遗传变异的定量研究，是近几十年来应用最普遍的方法。根据中心法则，组 成酶蛋白质多肽链的氨基酸种类和顺序是由d n a 核苷酸链的碱基编码所决 定。所以，当d n a 链上的酶结构基因发生点突变时，一个或多个核苷酸发生了 替换，就会导致由它编码的氨基酸改变，从而直接影响酶蛋白质的构型和静电 荷。通过电泳能够分离和鉴别这种酶蛋白质变体，推断假定酶基因位点的所有 等位基因的存在“3 。然而，以蛋白质变异来推定基因变异存在着理论上的缺 陷。蛋白质仅反映了基因可编码序列的状况，而实际上此部分序列比许多非编 码序列的变异水平低得多；同义密码子的第3 位碱基的置换无法反映在氨基 酸序列上。而且，酶很容易失活，野外取样后需立即分析。因此，等位酶分析法 有一定局限性，一般只用于研究种间差异和种内遗传多样性分析。2 0 世纪6 0 年代，用分子分析手段研究遗传多样性的全新方法应运而生，主要包括对d n a 、 r n a 的分子标记和蛋白质标记。该法基本不受环境和发育状态的影响，需要样 品量少，适用于珍稀、濒危物种的研究，从生物的遗传本质入手，便于在较高水 平上进行统一比较。 1 2 分子标记技术在植物遗传多样性研究中的应用 林木群体遗传结构的变异和因此带来的群体遗传多样性是遗传学研究的 重要领域。天然群体的遗传多样性程度和分布受遗传漂变、迁移、突变和选 择等因素的综合影响，其基因频率会在一定的水平上波动，即遗传多样性会反 映在d n a 水平上。分子标记可以有效地揭示林木种群间及种群内的遗传多样 性，进而分析其系统分化规律、研究群体遗传结构、多样性程度，了解基因流 动和渗入的方向和作用，为进行种源区划、估计基因保存时的取样策略、交配 系统和模式以及鉴定具有遗传多样性和生产力最佳搭配的杂交群体提供参考 同时，对了解林木的进化过程、开展林木遗传育种和引种驯化均具有指导意 义。目前已经开发了几十种基于d n a 多态性的分子标记，在方法上大体可分 为三类0 1 ：非p c r 类( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应) ，如 r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，限制性酶切片段长度 多态性) 、v n t r s ( v a r i a b l en u m b e ro ft a n d e mr e p e a t a s ，可变数目串联重 7 优质红锥遗传多样性分析 复位点) 等；以p c r 为核心的引物技术类，如r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i cd n a ，随机扩增的多态性d n a ) 、a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，扩增片段长度多态性分析) 等：位点标定p c r 类( s i t e t a r g e t e dp c r ) ，女f l s c a r ( s e q u e n c ec h a r a c t e r i s t i ea m p l i f i e dr e g i o n ， 序列特异扩增区域) 、s s r ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p s ) 等。 1 2 1r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h is 面分析 r f l p 是一种理想的遗传标记，共显性且不受环境和发育阶段的影响，直 接反映d n a 水平的变异，具有揭示基因组各部分多种类型变异的潜力。但对 d n a 样品的量( 2 i 0u g ) 和纯度要求都比r a p d ( 0 5 5 0n g ) 高得多，得到 的带谱也更为复杂且难于解释，放射性物质的使用安全也是限制r f l p 应用于 实践的一个因素。r f l p 是一项复杂的技术，是否能成功的说明问题与分析对 象d n a 以及限制性内切酶和探针的选择关系很大。m o n t e 等利用2 1 个r f l p 探 针，对小麦族的1 6 个属5 4 份材料进行了分析，研究了不同基因组的亲缘关 系。贾继增等。1 对小麦2 l 条染色体r f l p 作图位点遗传多样性分析表明：普通 小麦遗传多样性非常贫乏，不同国家来源的品种相似系数达0 8 以上：四倍体 小麦( a a b b ) 和山羊草( d d ) 为亲本的品种系中，对应的染色体上有较高的遗 传多样性，说明小麦的原始供体种是丰富现代栽培小麦遗传多样性的重要资 源；在小麦的a ，b ，d3 个基因组中，b 基因组的遗传多样性最高，d 基因组最差 ( 以l d 最甚) ，a 居中。 1 2 2r a p d ( r a n d o m 椰| _ f i e dp o i y m r p h is md n ) 分析 r a p d 是p c r 的一种变形。r a p d 图谱间的差异可因4 种方式产生：核 苷酸置换造成引物与结合位点无法匹配；某个引物结合位点缺失 ( d e l e t i o n ) ；两引物结合位点间的大片段插入导致间距过大而扩增中断： 插入或删除改变了扩增产物的大小。r a p d 方法简便、快速、灵敏，但与r f l p 及等位酶之类共显性标记相比有一个大的缺陷，即r a p d 是显性标记，无法直 接用于基因型分析。r a p d 结果虽不太精确，但确实提供了足够的多态性以分 辨种以下类型”1 。n g u y e n 等”1 利用4 0 个r a p d 引物对1 5 个小麦品种的遗传多 样性进行了分析。c o r b e l l i n i 利用r a p d 标记进行了杂交小麦亲本的遗传多样 性研究，海林等”1 利用r a p d 标记分析了小麦耐盐种质的遗传多样性，结果表 8 优质红锥遗传多样性分析 明，共产生2 0 0 条扩增片段，多态性片段数为1 7 2 条，扩增片段的多态性百分 率为8 6 ，供试的2 4 份材料相似系数在0 2 l o 9 7 之间。 1 2 3a f l p ( i i p l f i e df r a g m e n ti e n g t hp o i y m o r p h i s m ) 分析 a f l p 即扩增片段长度多态性，是1 9 9 3 年由荷兰科学家z a b f a u 矛o v o s 发 展起来的一种检测d n a 多态性的新方法。这种方法的原理是基于对植物基因 组总d n a 双酶切经p c r 扩增后的限制片段进行选择，具体是植物基因组d n a 经 限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，将特定双链 接头( a d a p t e r ) 连接在这些d n a 片段的两端，形成一个带接头的特异片段，作 为d n a 扩增的模板。接头序列以及与其相连的限制位点作为随后进行的限制片 段扩增的引物结合位点。p c r 引物3 末端含有选择核苷酸，选择核苷酸延伸 到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择核苷酸配对的限制性酶切 片段被扩增，扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。与其他分子标 记相比，它结合了r f l p 和r a p d 各自的优点，方便快速。只需要极少量d n a 材 料，不需要s o u t h e r n 杂交，不需要预先知道d n a 的顺序信息，试验结果稳定可 靠，可以快速获得大量的信息，而且再现性高，重复性好。因而，非常适合于品 种指纹图谱的绘制，遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究。b a r r e t tba 等 嘲利用a f l p 技术评价适应于西北太平洋旱地生产的春、冬小麦代表品种的遗 传多样性，结果表明a f l p 对于小麦遗传多样性的研究来说是一种非常有效的 技术。美国康耐尔大学的b l a i r 利用a f l p 技术评价5 4 份水稻品种的遗传多 样性，研究其系统发育和分类，并与同功酶生化标记及r f l p 标记比较，发现不 仅其结论一致，而且认为a f l p 对于研究水稻品种的遗传变异和构建基因组图 谱更为理想。 1 2 4s s r ( s i 呷l es e q u e n c er e p e a t s 简单序列重复) 分析 s s r 亦称微卫星( m i c r o s a t e l l i t e ) 技术，是指由2 6 个碱基组成的基本 序列串联重复组成的短片段，为共显性标记。由于该技术具有简便、快速、稳 定性高和等位基因多样性高等特点，在基因组研究中作为一种主要的分子标 记技术，已广泛应用于遗传图谱的构建“、比较基因组研究“、遗传多样性分 析“”和系统学研究“3 1 之中。它利用基因组中二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸进 行简单串联重复，从而设计p c r 引物通过p c r 扩增来检测多样性。一般认为微 9 优质红锥遗传多样性分析 卫星d n a 的多态性是由于减数分裂时的错配和不平等交换造成的，其最大的 优点在于s s r 产物进行测序胶电泳分离具有单碱基的高分辨率。因此，能检测 很高的多态性，遗传信息量较大。一个s s r 座位最多可检i 贝! l 至1 j 2 6 个等位基因。 s 5 【i t h 等“”利用s s r 标记对5 8 个玉米自交系进行遗传多样性研究，其结果与 r f l p 标记和系谱分析基本一致。p o w e l lw 等“”、p e ji ci 等“、袁力行等“7 1 研究均认为s s r 标记与其他标记相比，具有最高的多态性信息量( p i c ) ，s s r 标记的等位基因变异来源于基因组d n a 复制时的滑动引起的重复序列数目的 变化，而不是单碱基突变或插入缺失造成的。因而，表现出高度的多态性。 r o n g w e n 等“”用7 个s s r 标记对9 6 个大豆品种进行种质鉴定，绝大多数( 9 4 个) 材料各自都有独特的s s r 指纹图谱。刘峰等“”选用5 7 个多态性最高 的微卫星标记作为核心引物，可以大大提高在大豆种质鉴定中的效率，并认为 s s r 等位基因差异分析有可能用于确定不同起源大豆品种之间的关系。 1 2 51 8 s r ( i n t e r s i m p i es e q u e n o or e p e a t ，i n t e r 一简单重复序列) 分析 i s s r 是利用包含重复序列并在3 或5 锚定的单寡聚核苷酸引物对基 因组进行p c r 扩增的标记系统。相对于组织蛋白和等位酶分析而言，它具有多 态性高、无需活材料，能实现全基因组无编码取样和无组织器官特异性等优点 与s s r 相比，不要求预知基因组序列信息，大大减少了多态性分析的预备工作 对比扩增片段长度多态( a f l p “) 则在模板d n a 的用量，实验繁琐程度和费用上 占优。缺点是都为显性遗传标记，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型。在 缺乏分子遗传学研究背景的濒危植物遗传多样性水平评价中显示出极大的优 势。钱韦等”应用r a p d 和i s s r 标记对源于中国海南和云南2 0 个居群的疣粒 野生稻的遗传多样性进行了检测，结果表明，中国疣粒野生稻在物种水平的遗 传多样性较低，其遗传变异主要存在于海南和云南两地之间，而在居群内的遗 传多样性水平很低。g i l b e r t 等。“和y a n g 等“”的研究表明，i s s r 对p c r 反应的 敏感性低于r a p d ，稳定性优于r a p d 。j o n s s o n 等0 3 1 研究认为在进行克隆植物 遗传多样性的研究时可优先考虑使用i s s r 。g a o 等。”研究认为r a p d 和i s s r 检测疣粒野生稻遗传变异的能力都高于等位酶分析，根据多态条带比率和 s h a n n o n 多样性指数分析，i s s r 能l l r a p d 检测到更多的遗传多态性。由于 i s s r 与r a p d 对基因组进行扩增时各自引物结合的位置不同，二者在居群内， 1 0 优质红锥遗传多样性分析 对个体问遗传关系检测结果的相关性极低。 1 2 6s n p ( s i n g i en u c l e o t i d ef o i y r n o r p h is n 单核苷酸多态性) 分析 s n p 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的d n a 序列多 态性，在人类基因组中广泛存在。s n p 所表现的多态性只涉及到单个碱基的变 异。通常所说的s n p 都是二等位多态性的，这种变异是由转换( c t 或c a ) 、 颠换( c a ，g t ，c g ，a t ) 所引起的。位于编码区内的s n p ( c o d i n g s n p ，c s n p ) 比较少，但它在遗传性疾病研究中具有重要意义而倍受关注 o c s n p 又分为2 种：同义c s n p ( s y n o n y 2 m o u sc s n p ) 并不影响其所翻泽蛋白 质的氨基酸序列，非同义c s n p ( n o n 2 s y n o n y m o u sc s n p ) 可以改变其为蓝本翻译 的蛋白质序列，从而影响蛋白质功能。d n a 芯片技术是目前检测s n p 最为有效 的方法。s n p 标记具有以下优点：( 1 ) 它在基因组中分布广泛：( 2 ) 与s s r 相 比，s n p 高度稳定：( 3 ) 易于进行自动化分析，缩短了研究时间。 1 2 7 各分子标记技术用于植物遗传多样性时的比较 以上分子标记方法用于研究植物遗传多样性各具优势。r f l p 分析误差最 小，是一种很有效的遗传标记，但操作程序复杂，技术要求高，成本昂贵，有一 定的危险性，使它的应用受到一定限制。r a p d 方法不需克隆制备、同位素标 记、s o u t h e r n 印迹等步骤，所需样品少，快捷、简便、安全，技术操作比较成 熟完善，但结果不太精确，适用于种或亚属水平研究。a f l p 结合了r f l p * 口p c r 的优点，多态性信息量不高，操作较为复杂，费用相对昂贵，但具有最高的多 态性检测效率，非常适合于种质鉴定与保护，如果a f l p 位点能够定位在r f l p 和s s r 连锁图谱上，那它将是最有效的分子标记。s s r 分析具有多态性高，遗 传信息量大等优点，与p c r 的方便性相结合在遗传多样性研究方面具有独特 的优势。i s s r 方法多态性高，无需活材料，无器官特异性，操作简便，费用低廉 缺点是显性标记，不能区分纯合与杂合基因型。s n p 标记优点在于其快速高 效、多态性稳定，缺点是所反映的多态性信息量很有限。因此，在进行植物的 遗传多样性研究时，应根据研究目的和研究对象，以及所拥有的试验条件来选 择行之有效的分子标记手段。 优质红锥遗传多样性分析 跚a j 瑚4 a = 纛卜世r p a f 巩s s r 等 _ j 土一匡卜 1 2 8 分子标记在林木研究中的其它有关用途 1 2 8 1 林木d n a 指纹图谱的构建 尹佟明等用m s ei 和e c o ri 酶切基因组d n a 对4 2 个美洲黑杨无性系的 a f l p 指纹进行了分析。翁尧富等”7 1 利用r a p d 标记对浙江省林木良种审定 委员会审定( 认定) 和通过省级鉴定的8 个板栗品种及无性系进行指纹分析， 鉴别出各板栗品种( 无性系) ，实验过程中对6 8 4 个随机寡核苷酸引物进行了 重复筛选，经筛选共获得9 个稳定的r a p d 标记，构建了板栗的d n a 指纹图谱， 经过大量的实验，确定了鉴别板栗优良品种( 无性系) 的较为理想的实验程序， 从而防止了板栗假冒嫁接苗给林业生产带来的损失。我国目前已经应用d n a 指纹图谱对杨柳科、柳树、尾叶桉和细叶桉。杉木优选树无性系、芒果、杨 梅等林木进行了种质资源鉴定。m a t s u d am 等人“”利用微卫星位点设计新引 物对蓝桉、柠檬桉等五种桉树进行了p c r 指纹图谱研究。l u i 等o ”利用来自 美国3 个不同地区的1 3 0 个欧洲山杨和1 0 5 个大齿杨品种为材料，分析核d n a 的r f l p 和r a p d ，结果表明，d n a 分子标记技术比同功酶标记能更多地揭示遗 传变异，意味着r a p d 是一种有效的山杨( a s p e n ) 指纹工具。分子标记绘制成 的d n a 指纹图谱已成为鉴别品种、品系的有力工具。指纹图谱技术对良种质 量( 真伪、纯度) 的监测，保护名、优、特种质及育成品种的知识产权和育种家 优质红锥遗传多样性分析 们的权益等均有重要意义。目前，我国己建立主要作物品种的标准指纹图谱， 许多树剥p d n a 图谱的绘制也已陆续完成。 1 2 8 2 分子标记与林木育种 长期以来，由于木本植物生长周期长，给常规育种工作带来了一定的困 难。分子标记技术的出现为林木育种研究及应用带来了深刻的变革。分子标 记辅助选择( m a s ) 是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记的基因型来判 断目标基因是否存在的一种植物育种选择方法，这种方法不受其它基因效应 和环境因素的影响，因此结果比较可信：而且可以进行早期选择和对隐性基因 的选择，从而大大加快育种进程，提高选择效果，特别是对生长周期长的林木 来说更具有重要意义。分子标记辅助选择正成为林木育种的有效工具。一旦 分子标记与现有的育种程序相结合，育种学家就能以前所未有的速度和精度 来鉴定、转移、整合基因，育成目标品种，在产生巨大经济、社会效益的同时， 使林木遗传改良学科发生深刻变革。s a r uh k e r m a n 用a f l p 技术研究垂枝桦 树的2 个杂交后代3 0 3 2 个体，产生3 1 2 个有意义的多态性谱带，分子量 范围在2 0 0 7 0 0b p 之间，谱带的分离符合孟德尔的遗传规律。b e i s m a n n 等。“ 用a f l p 技术对两种柳树s a l i xa j b a l ( w h i t ew i l l o w ) 和s ，r a g i l i s l ( c r a c kw i l l o w ) 与它们的后代s ，jr u b e n ss e h r a n k 的分析，支持了先前 用多态型特点所决定的分布。6 e r v e r a 等”利用a f l p 标记对美洲黑杨的抗病 基因进行了研究，他们利用b s a 法与a f l p 分析相结合的方法得出3 个与抗病 基因相连锁的a f l p 标记，提高了与目的基因相连锁的分子标记的筛选效率。 利用分子标记进行林木遗传育种的最终目的是对林木进行遗传品质良，包括 提高丰产性能、改良品质和增强抗性等。随着分子标记技术发展起来的数量 性状位点定位及标记辅助育种，是改良林木遗传品质的有效手段和希望所在。 1 3 厂6 以基因序列 核酮糖一1 ，5 一双磷酸羧化酶加氧酶( r u b i s c o ) 是叶绿体基质中的主要 可溶性蛋白，此酶在光合作用c a l v i n b e n s o n 循环中固定c o 。，而且也在c 3 植物的光呼吸过程中起作用。它由8 个相同的大亚基和8 个相同的小亚基组 成。大亚基由叶绿体d n a 编码并且由叶绿体的核糖休合成：小亚基由核基因编 码，首先由细胞质内的核糖体合成前体蛋白，穿越叶绿体膜后再加工为成熟形 优质红锥遗传多样性分析 式”。编码大亚基的基因简称为r b c l 基因，编码小亚基的基因简称为r b c s 基因。在t 9 8 0 年就首次测定了玉米r b c l 基因的序列，这也是第1 个被克隆 和测序的叶绿体蛋白质的基因。“。紧接着又测定了菠菜和烟草r b c l 基因的序 列，迄今己测得10 0 0 余种种子植物r b c l 基因的序列”“。高等植物r b c l 基 因在结构上和原核生物基因相似，由5 非编码区、编码区和3 非编码区三 部分组成。5 非编码区具有可以和叶绿体1 6 sr r n a3 端附近互补的s d 序 列：3 非编码区具反向重复序列，能形成典型的茎环结构作为转录终止信号 多数r b c l 基因还具有和原核生物基因启动子类似的共通序列。另外，除在纤 细裸藻( f 旧l e n agr a c h i s ) 的r b c l 基因内发现9 个内含子外”“，高等植物 和衣藻的r b c l 基因均不具内含子。 叶绿体基因组中的r b c l 基因序列是分子系统学研究中使用最为广泛的 分子指标之一。它在用于此目的的研究时具有一些独特的优点：以单拷贝形 式存在，不发生基因转变：长达1 4k b ，能提供较多的分子性状：r b c l 基因的 保守性极强，碱基的置换速度非常缓慢，有报道称每百万年只有0 5 o 6 个 碱基发生突变。 1 4 同工酶水平研究优质红锥遗传多样性 t 9 6 6 年，h u b b l y ，l e w o n t i n ，j o h n s o n 和h a r r i s 分别报道了利用凝胶电泳 技术结合酶的特异性染色对果蝇和人类种群遗传变异的的定量研究( 葛颂 等，1 9 9 4 ) 。从此同功酶( i s o z y m e ) 技术被广泛地应用于天然种群变异的研究 中。酶是基因表达的产物。其多肽链中的氨基酸序列由结构基因的核苷酸序 列决定。同功酶的产生是由于构成酶蛋白亚基的氨基酶组成和顺序不同所导 致的。同功酶电泳技术通过对各种同功酶的电泳谱带的分析，可以识别出控 制这些酶的基因位点和等位基因，从而达到在基因水平上研究生物体的目的。 同功酶在生物界普遍存在，并以共显性方式表达，而且采样电泳技术测定等 位基因变异比较灵敏，方法简单、获得结果迅速。更重要的是在选择一定量 的酶系统或位点作为遗传标记时是根据现有成熟的酶电泳技术和染色方法而 定的，并未考虑这些酶或位点在样本中变异情况，对于多态或单肽酶或位点 都是同等对待：所以其变异可以较为客观地代表整个基因组的变异，可以对 任何物种或种群的研究结果进行比较。 1 4 优质红锥遗传多样性分析 过氧化物酶( p o d ) 是一种以过氧化氢( h 2 0 ：) 作为电子受