（细胞生物学专业论文）动物肠道中嗜酸乳杆菌粘附作用研究.pdf

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n h s ) 标记进行蛋白印迹试验，d a b 显色得到以 下结果：在w e s t e r n b l o t 鉴定嗜酸乳杆菌表面蛋白中与鲤鱼、草鸡、新西兰兔、 昆明鼠的肠粘液相互作用的蛋白，表明s 层蛋白对菌体粘附在肠道内起着重要的 作用。嗜酸乳杆菌中的s 层蛋白分子量4 3 6 k d a ，即s 蛋白，可以与多种动物( 鲤 鱼，草鸡，新西兰兔，昆明鼠) 肠粘液蛋自形成作用关系。相似地，用w e s t e r n - b l o t 法可以鉴定出可能与s 层蛋白作用的鲤鱼、革鸡、新西兰兔、昆明鼠的肠粘液蛋 白，即新西兰兔肠粘液中分子量为3 5 k d a 的蛋白和昆明鼠肠粘液中分子量为 5 5 k d a 的蛋白。它们是s 层蛋白的受体，在菌体粘附过程中起重要作用。然而， 实验结果表明，在鲤鱼与草鸡肠粘液蛋白在嗜酸乳杆菌的粘附中显示条带较多， 特异性较差，表明嗜酸乳杆菌与鲤鱼和草鸡肠道粘液蛋白不存在特异的相互作 用。 总之，在嗜酸乳杆菌表面蛋白与动物肠道粘液蛋白相互作用过程中，菌体表 山东师范大学硕士学位论文 面起主要作用的是蛋白s ，而肠道粘液中起主要作用的蛋白则是依物种的变化而 变化的，动物的进化程度越高，蛋白条带越来越单一，即特异性增强。 关键词：嗜酸乳杆菌，表面蛋白，粘附，鲤鱼，草鸡，新西兰兔，昆明鼠，肠粘 液 山东师范大学硕士学位论文 a d h e s i o no f l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sa t c c 4 3 5 6i nt h e g a s t r o i n t e s t i n a lt r a c to fd i f f e r e n ta n i m a l s a b s t r a c t l a c t o b a e i l l u sa c i d o p h i l u s ，a l li m p o r t a n tp r o b i o t i c ，i sam a j o rm e m b e ro ft h e e o m m e n s a lf l o r ai nt h eg a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t so f h u m a a sa n da l i n l a l $ a d h e s i o ni st h e f i r s t s t 印o fb a c t e r i a lc o l o n i z a t i o ni nt h eg a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t t h es u r f a c e l a y e r p r o t e i no fl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sw a st h o u g ht om e d i a 德t h eb a c t e r i a la d h e s i o nt o t h ei n t e s t i n a l e p i t h e l i a a n d p m m o t e t h e t h eb a c t e r i a lc o l o n i z a t i o ni n t h e g a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t i tr e s u l t si nas e r i e so fp r o b i 0 6 ce f f e c t se x e r t e dt ot h e i rh o s t s i ti sh e l p f u lf o re l u c i d a t i o no fa d h e s i o nm e c h a n i s ma n da p p l i c a t i o no fp r o b i o t i c st o i n v e s t i g a t et h ei n t - t i n no fs u r f a c ep r o t e i n sf r o ml a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sw i t h i n t e s t i n a lm u c u s t h e s - l a y e r sp r o t e i nw a se x t r a c t e d 丘d ml a c t o b a c i l l u xa d d o p h i l u sb y8m g u a n i d i n eh y d r o e h l o r i d e , 5mn e u w d ll i c ia n d5m a c i d i cl i c lw i t hd i f f e r e n t t r e a t m e n tt i m ea n dt e m p e r a t u r e ，r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m i z e de x t r a c t i o nm e t h o da s w e l la st h eo p t i m i z e dt e m p e r a t u r ea n dt i m eo fe x t r a c t i o nw e r eo b t a i n e db yu s i n gt h e g e l - p r os o f t w a r e i tw a ss h o w e dt h a tt h em a x i m u m a lc o n c e n t r a t i o na n dp 匆o f s - l a y e rp r o t e i nw a s o b t a i n e db ye x 拄a e t i n gw i t h5ma c i d i cl i c ia t2 5 cf o r1 5m i n t h ei n t e s t i n e so f c o m m o nc a r p ，n a t i v ec h i c k e n ，z e l a n i a nr a b b i t k u n m i n gm i c e w e r e c u ta n dr i n s e dw i t hs t e r i l ep b sb u f f e r ( p h 9 5 1a s e p t i c a l l y t h ei n t e s t i a n lm u c u sw a s o b t a i n e db ys c r a p i n gt h ei n t e s t i a n ls u 由c ea n dc e n u i f u g a t i o - t h eb a c t e r i a ls l n f a c o p r o t e i n sw e r eo b t a i n e db yt r e a t m e n tw i t h5m a c i d i cl i c lt h ew e s t e r n - b l o t sw e r e e o n d a c t c dr e s p e c t i v e l yb yu s i n gb i o t i n - n i - - i s l a b l e di n t e s t i n a lm u c u sa n ds u r f a c o p r o t e i n s i tw e f 。r e v e a l e db yd a bt h a tt h es - l a y e rp r o t e i nf r o ml a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u sw f l sp l a y e di m p o r t a n tr o l e si na d h e s i o no fb a c t e r i a ls u r f a c ep r o t e i n st o 5 当查墅要查堂堡主壁垡望苎 证t 鳅i a m u c 璐a f 。o l r t n l o i lc a r p ，u a t i v ec h i c k e ，z e l 血i 丑nr a b b i t , k u n m i n gm i c e t h es - l a y e rp r o t e i ni nl a e t o b a c i l t u aa c l d o p h i l u si sa4 3 6k d ap r o t e i n 。c a l l e ds a p r o t e i n m o r e o v e r ，s e v e r a lp r o t e i n s i ni n t e s t i n a lm u u u $ o f0 0 1 1 1 2 1 1 0 1 1c a r p ，n a t i v e d d c k z e l a n i a nr a b b i t ，k u n m i n gm i c ew a sf o u n da sm u c u sa d h e s i o n - p r o m o t i n g p r o t e i ni nd i f f e r e n ta n i m a l s t h e yw e r e3 5k d a p r o t e i nf o rr a b b i ta n d5 5 k d ap r o t e i n f o rk l m m i n gm i c ee h a m e t e a s z e db yw e s t e r n - b l o t t i n g w h i c hw 盱ec o n s i d e r e d t h e x e e e p o l o r $ f o rs - l g y e rp r o t e i n b u t , i tx i g t s e e m e dt h e r ew e r en os p e e i l i em u c l l s a d h e s i o n - p r o m o t i n gp r o t e i n sf o u n d i nt h ei m e s t i r i a lm t l c u $ o f c o m m o nc a r pa n dn a t i v e d d c k f o rt o om a n yp r o t e i nb e n d s v i s u a l i z e do nt h en i t r o c e l l u l o s em e m b r a n e i nc o n c l u s i o n , t h es - l a y e rp r o t e mi nl a c t o b a c i u u sa c i d o p h i l u sw a s t h em a i nm u g q l s a d h e s i o n - p r o m o t i n gp r o t e i nc h a r a c t e r i z e dt b ei n t e r a c t i o no f b a c t e r i a lm l l - f a c ep r o t e i n 锄da n i m a li n t e s t i n a lm u c l l s t h en d h e s i o n - a s s o e i a t e x tp r o t e i n s 缸缸t e s d a i l im u c n s w 唧d i f f e r e n l ：w i t ha n i m a l s ，t h es i m p l ea n ds p e c i f i cp r o t e i nb e n d sw e l ef o u n di nt h e i a t e 吐m a ii n u c u so f h i g h l ye v o l v e da n i m a l s k e y o m s ：l a c t o b a c i l i u aa e i d o p h i l u s ，s u r f a c ep r o t e i n , a d h e s i o n , c o i l i o n lc a r p ，c h i c k e n ， m b b 也m o l i s e ，i n t e s t i n a li ：n u c r s 6 山东师筢大学硕士学位论文 综述 动物肠道中乳杆菌粘附作用的研究进展 1 乳杆菌及其益生作用 1 1 乳杆菌的生物学特性 嗜酸乳杆菌是一类g + 杆菌，杆状，末端呈圆形，大小为0 6 0 9 x i 5 x 1 6 pm ， 以单个、成对或短链形式存在，不运动，无鞭毛，无芽孢，过氧化氢酶阴 性，不产生细胞色素。嗜酸乳杆菌是微需氧菌，无氧或较低的氧分压环境下在固 态基质表面生长，5 肛1 0 的二氧化碳可促进嗜酸乳杆菌的增殖“1 。 对于嗜酸乳杆菌来说，其生理、生化具以下特性：肽聚糖的类型为l y s - da s p ； 磷壁酸的特异性是甘油型；乳酸构型为d l 型；不存在异染颗粒；d 一乳酸脱氢酶 值为1 5 0 ；l - - 乳酸脱氢酶值为1 3 0 ；g + c ( ) 为3 4 3 7 。 嗜酸乳杆菌有复杂的营养要求，需要较低的氧分压、可发酵糖类、蛋白质及 其降解产物、核酸的衍生物、脂肪酸、微量元素m g 和等，需要大量的b 族维生 素满足它们的生长。嗜酸乳杆菌可以发酵大量的糖类，这是嗜酸乳杆菌应用于食 品工业的主要特性。在生长中，9 0 的菌株代谢的糖类中存在苦杏仁苷、纤维二 糖、七叶苷、果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、麦芽耱、甘露糖与蔗糖；9 0 的菌 株代谢的糖类中不存在阿拉伯糖、葡萄糖酸盐、甘露糖醇、松三糖、鼠李糖、核 糖、山梨醇与木糖。1 1 8 9 的菌株代谢的糖类中存在蜜二糖、棉子糖与海藻糖。 嗜酸乳杆菌的鉴定特性：对于在1 5 c 下的生长状况为负增长；4 5 c 下的生长 为正增长；生长中牛乳中的酸度为0 8 。 d 一半乳糖苷酶催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖。嗜酸乳杆菌属同型发酵， 葡萄糖通过e m p 途径代谢，产生乳酸。乳酸的产量是1 8 m o l m o l 葡萄糖，同时产 生少量的其它化合物。乳杆菌通过l e l o i r 途径催化半乳糖。h i c k e y 发现嗜酸乳杆 菌利用乳糖降解产生葡萄糖，而半乳糖则释放到培养基中。嗜酸乳杆菌对其它糖 类的利用先后顺序为：葡萄糖果糖 蔗糖 半乳糖“。 1 2 乳杆菌的益生作用 1 2 1 生物屏障作用 乳杆菌于肠粘膜上皮细胞相互作用、密切结合构成了生物学屏障；同时，通 ， 山东师范大学硕士学位论文 过其自身及其代谢物与其它细菌之间的相互作用，调整菌群之间的关系，维持和 保证菌群最佳优势组合以及这种组合的稳定，阻止了致病菌的定殖和入侵，拮抗 致病菌和有害微生物的生长及其毒素的产生。 1 2 2 营养作用 乳酸菌发酵后产生的乳酸，可提高胃内食物的预消化，提高钙、磷、铁的利 用率和维生素d 的吸收；乳糖分解产生的半乳糖，是构成脑神经系统中脑苷脂的 成分，与婴幼儿出生后的生长有密切的关系；同时产生的大量维生素b 群能促进 人体神经细胞的发育；提高人体肠内的b 一半乳糖苷酶的活性，促进奶质中乳糖 的吸收，从而缓解乳糖不耐症；能分泌蛋白酶，促进蛋白质的消化吸收。 t 2 3 抗癌作用 腐败性细菌作用于食物成分和胆汁酸盐类，能生成亚硝基化合物、胆固醇及 胆汁酸的代谢物、氨基酸代谢物( 酚类、吲哚、硫化氢) 等有机致癌物质。与这 些致癌物质有关的肠内细菌酶有b 一葡萄糖醛酸酶、巯基还原酶、偶氮还原酶等。 乳杆菌能改善肠道菌群，抑制致癌物质的产生；同时，乳杆菌及其代谢物激活了 免疫功能，抑制癌细胞的形成和增殖。 1 2 4 增强机体免疫力 乳杆菌在肠道内定殖，相当于自然免疫，能激活机体巨噬活性，诱发特异性 和非特异性免疫反应，提高机体的抗感染能力。 1 2 5 延缓机体衰老 人的衰老与肠内有害细菌产生的氨、胺、硫化氢、吲哚、酚、粪臭素等有害 腐败产物有很大关系。嗜酸乳杆菌代谢产生的乳酸抑制了这些腐败物，使机体衰 老的过程变得缓慢。保加利亚人的长寿和长期服用酸奶有关“。 2 乳杆菌的粘附作用 乳杆菌通过粘附于肠上皮细胞表面，定植形成稳定的菌群。才能对宿主发挥 营养、代谢、免疫及抗衰老等一系列生理作甩，粘附是其发挥生物屏障功能的基 础。乳杆菌与宿主细胞的粘附是其发挥生理作用的首要条件，而有关粘附的特点 和机制，正成为益生菌研究的热点粘附的底物是粘液时称为粘液粘附 ( m u c o a d h e s i o n ) ( 又称为粘膜粘附) ，底物是细胞膜时称为细胞粘附 8 山东师范大学颓士学位论文 ( c y t o a d h e s i o n ) 2 1 乳杆菌与肠上皮细胞粘附的一般特性 目前，乳杆菌与肠上皮细胞粘附的研究极为广泛。有学者相继用t 1 t 2 2 9 细胞 和c a c 0 2 2 细胞作为体外细胞模型来研究乳杆菌的粘附，c a c 0 2 2 细胞和h t 2 2 9 细胞 系是由f o g h 等从人结肠腺癌中分离而建立的细胞系，这两株细胞被广泛地应用于 人小肠上皮细胞的功能研究中。这些细胞在体外培养时可以形成两种明显的功能 区域：由紧密连接分开的顶端膜区和基底膜区，在功能上具有成熟肠上皮细胞的 特性，因此为研究乳杆菌粘附小肠黏膜上皮细胞提供了一个很好的模型。e l i n a 等”采用革兰染色和放射性同位素标记的方法检测了1 2 株乳杆菌对c a c 0 2 2 细胞 的粘附，结果发现千酪乳秆菌鼠李糖亚种( l a c t o b a c i l l u sc a s e is u b s p 砌 s u s ) 的粘附率可高达1 4 4 c h a u v i e r e 等以c a c 0 2 2 细胞为模型，采用细胞培养 和革兰染色的方法对2 5 株乳杆菌进行了粘附性能的检测，发现有7 株乳杆菌对 c a c 0 2 2 细胞的粘附力较强。其中1 株从人粪便中分离出的高粘附力菌株嗜酸乳杆 菌( l a c t o b a c i l u sa c i d p h i l u s ) l s 的粘附性不依赖于钙离子，在粘附过程中， 一般共孵育1 5 h 后达到最大粘附量，并且具有浓度依赖性，酸性环境有利于其粘 跗。扫描电镜观察，乳杆菌与细胞表面的刷状缘紧密相连，而且细胞接触的区域结 构完整。一般乳杆菌的粘附存在种属特异性和菌株特异性，不同的种或亚种其粘 附力不同，同种不同的分离株其粘附性能也相差很大。 2 2 胞外提取液与肠上皮细胞粘附的特性： 范小兵等发现昂立植物乳杆菌的1 2 h 培养上清液和耗尽培养上清液能抑制大 肠埃希菌和伤寒沙门菌等粘附于l o v o 细胞周围，同时还发现发酵上清液对一些病 原菌有抑菌作用“。因此认为发酵上清液抑制病原菌粘附的机制可能有两个原 因：一是植物乳杆菌代谢产生抑菌物质，杀死病原菌，使其粘附位点失活，从而不 能粘附在l o v o 细胞上；二是植物乳杆菌的耗尽培养上清液中存在粘附素成分，能 够与l o v o 细驻表面的受体相结合，从而抑制和减少了病原菌在l o v o 细胞上的粘 附。范小兵还发现耗尽培养上清液能明显促进植物乳杆菌粘附于l o v o 细胞上，这 证实耗尽培养上清液中确实存在粘附素成分，能介导该菌的粘附。 2 3 菌体与肠粘液粘附的特性； 肠粘液主要由肠道杯状细胞和粘膜腺细胞分泌的粘稠状物质，覆盖在肠道 9 山东师范大学硕士学位论文 上皮层。粘液的主要组分是大于2 xl o * d a 的高分子量糖蛋白，通过二硫键交联在 一起。粘液中的其它成份包括蛋白，脂类，d n a 和上皮细胞的膜片段“。粘液 对表皮有物理保护作用，同时也是肠道内食物消化时通过肠道的润滑剂。病原 微生物的侵入必须击穿覆盖在肠上皮细胞的粘液层，所以粘液层可以减少通过肠 组织表面的有害的细菌。于机械作用或酶解，肠粘液部分蛋白降解，它们可以结 合到细菌粘附素上，增强了黏膜保护的功能。由于粘液层是肠腔内的第一层，粘 液是乳杆菌到达上皮细胞前最先接触的肠道内组分，所以菌在肠道上的定植过程 中，它起到了重要的作用。 3 粘附成分的研究进展 3 1 乳杆菌s 层蛋白的研究 细菌的细胞外壁一般由细胞壁和细胞膜组成，除此之外，一些乳杆菌中还有 一层表面结构，称为表面层( s u r f a c el a y e r ) 或称为s - 层( s - l a y e r ) ，它们是 由蛋白质组成的晶格状结构，位于细胞壁或细胞膜外层，是生物进化过程中最简 单的一种生物膜”1 。 3 1 1 乳杆菌s 层蛋白的基因 许多乳杆菌茵椿具有s 层蛋白，目前，已有两种短乳杆菌l a c t o b a e i l t u s b ：e v i s “”，一种嗜酸乳杆菌( 厶e c i d o p h i u s ) “”，一种瑞士乳杆菌( 厶 h e l v e t i c u s ) 和脆性乳杆菌( l a c t o b a c i l u $ c r i s p a t u ) ”的s 层蛋白的基因 被测序并克隆。基因库中( n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ， b e t h e s d a ，如，u s a ) 存放了几种编码s 层蛋白的基因序列，五个来自lc r i s p a t u s 的基因序列( g e n b a n k ，a c c e s s i o nn u m b e r sa f 2 5 3 0 4 3 ，a f 2 5 3 0 4 4 ，a b l1 0 0 9 1 ， a b l l 0 0 9 0 ，a j 0 0 7 8 3 9 ) ，十个来自厶h e l v e t i c u s 的基因( g e n b a n k ，a c c e s s i o n n u m b e r s a b 0 6 1 7 7 6 ，a b 0 6 1 7 7 5 ， j 3 8 8 5 6 1 ，a j 3 8 8 5 6 0 ，0 3 8 8 5 5 9 ，a j 3 8 8 5 5 8 ， x 9 2 7 5 2 ，0 3 8 8 5 6 4 ，a j 3 8 8 5 6 3 ，0 3 8 8 5 6 2 ) 和一个来自厶a c i d o p h i l u s 的基因 ( g e n b a n k ，a c c e s s i o nn u m b e r a f 2 5 0 2 2 9 ) 另外，厶鲫y o v o t u s , 厶b u c h n e r i , 厶 g a l l i n a r u 虢, l k e f i ra n dl p a r a k e f i r 菌株也被证明具有s 层蛋白”1 ，但 至今没有得到它们的序列。b o o t 和他的团队认为l g a s s e r i l l l j o h o s o o i l 菌株 缺乏s 层蛋白“”。v e n t u r a 等最近的研究表明，一些乳杆菌品种编码s 层蛋白的基 因有两个1 。乳杆菌常常呈现多个编码s 层蛋白的基因，l a c t o b a c i l u s b r e v i s 1 0 山东师范太学硕士学位论文 a t c c l 4 8 6 9 拥有三个s 层蛋白基因。l a c t o b a c i u sc r e s p a t u j c m 5 8 1 0 “”和厶 a c i d o p m u sa t c c 4 3 5 6 “具有两个s 层蛋白基因。s o u t h e r nb l o t 分析推测出几 种嗜酸乳杆菌含有两个s 层蛋白基因“1 。一个菌株中，几个基因编码这些蛋白不 是嗜酸乳杆菌独有的性质，其它菌亦被确定含有几个s 蛋白基因2 。1 。 嗜酸乳杆菌s 层蛋白的多个基因的排布具有种依赖性，它们的基因组成没有 一致性的规律。在厶b r e v i s a t c c1 4 8 6 9 中，表层蛋白基因三个中的两个s i p b 和 s i p c 是相邻的，方向平行，而第三个基因盯够与豇加一s 城因区域不相邻“”。 在厶a c i d o p h j u s a t c c 4 3 5 6 中，两个s 层蛋白基因5 助d 和鲥脚方向相反，中间间 隔有3 k b 的d n a 区域。g a s s e r j 和l j o h n s o n j 瑁自株假定的s 层蛋白基因a p f l 和印彤也被一个短的d n a f 又域隔开，但这些基因是平行方向的1 。厶c r i s p a t u s 的s 层蛋白基因c b s a g c 6 鲫的位置和方向还没有确定“”。 在有亲缘关系物种中表层蛋白的基因序列才具有相似性“。通过d n a - d n a 杂 交可以显示出乳杆菌表层蛋白基因的相似性。厶b r e v i sa t c c 8 2 8 7 的s 蛋白基因 s l p a 与厶b u c h n e r i d s m2 0 0 5 7 的染色体d n a 能够坚固地杂交，这表明b u c h n e r i 中有与s l p a 的序列具有同源性的基因。( p a l v a 等，未发表) 。依照b o o t 等的 s o u 翰e r nb l o t 分析结果，厶c r i s p a t u s , 厶a m y l o v o r u s 和lg a l l i n a r u m 菌 株有两个s 层蛋白编码基因，在某些区域与厶a c i d o p h i i u s 的曲瑾因具有高度 的序列一致性。那些亲缘相差较远的乳杆菌，其s 层蛋白基因的不同在蛋白层面 上表现为缺乏高靡一致性的序列。 在嗜酸乳杆菌的d n a 同源区的a i a 4 区，有两个编码s 蛋白的基因，并且能通 过插入一个6 k b 的染色体片段来调节编码s 蛋白基因的表达。 3 1 2 乳杆菌表层蛋白的性质； 乳杆菌表层蛋白的大小在2 5 7 1 k i ) a 之间，是菌体s 层蛋白中较小的一类。乳 杆菌s 层蛋白的p i 值在9 3 5 1 0 4 之间，其n 端2 5 3 0 个氨基酸是信号肽( t h e s i g n a lp e p t i d e ：s p ) ，通过典型的s e c 途径发挥作用，几乎在原核生物中s 层蛋 白皆有此特点。尽管表层蛋白通常被认为是同多s e c 途径分泌的，但个别的特例 被发现”。 乳杆菌类s 层蛋白的氨基酸的组成与其它种类表层蛋白的组成有相似性，另 外，乳酸菌s 层蛋白氨基酸组成的一些独特之处被发现。乳杆菌s 层蛋白中疏水性 山东师范大学硕士学位论文 氨基酸的组成较高，达到3 1 9 3 7 8 骺，是s 层蛋白的一个典型特征嚣。与其它 的s 层蛋白相比，具有较低的含硫氨基酸组成( 主要来自甲硫氨酸) ，含量最高 只有2 。， 有一个半胱氨酸残基的s 层蛋白，目前只有发现一个：厶g s s s e i v p i1 1 7 5 9 a p f l 蛋白。所有s 层蛋白( 包括来自乳酸菌的菌株) 的一个特性是：具有高含量 的羟基氨基酸( 乳酸菌中其含量在2 3 3 3 ，其它菌中其含量超过1 5 ) 。对于碱 性氨基酸来说，通常s 层蛋白中赖氨酸的含量较高，达到1 0 ，某些乳酸菌的s 层蛋白也具有相同的特点”。乳杆菌s 层蛋白中带正电荷的氨基酸残基一般比带 负电荷的氨基酸残基含量高，可以高达1 2 5 ，结果造成s 层蛋白较高的p i 值。 这是乳杆菌的一个特性，而其它菌种的s 层蛋白相对p i 值较低。 表1 乳杆菌s 层蛋白的性质 种类菌株分子量 ( k d a ) 厶a c i d o a t c c 4 3 5 s 1 p a ： 曲n u s 6 4 3 6 s 1 p b ： 4 4 g l a z y l o v o l b r e v l s 包括倍氨基酸晶格对等电点文献 号肽在信号肽称，包括 内的氢的长度a 和b 在 基酸残内的点 基的数 量 s l p a ：s l p a ：3 0ps l p a ： 1 3 1 。 4 4 4 1 0 4 2 6 s l p 8 ： s l p b ：3 0s l p b ； 4 5 6 1 0 3 七株菌 4 1 4 9 一一p 一 【3 8 】 株 m 9 2 4 5 l m g9 4 9 6 4 5 【3 9 】 【2 9 】 a t c c 4 64 6 53 009 8 81 2 4 8 2 8 7 山东师范大学硬士学位论文 a t c c s 1 p b ：4 8s l p b 1 4 8 6 9 4 8 3 s l p c ：4 6s l p c ： 4 6 1 s l p d ：4 2s l p d ： 4 1 3 a t c c 5 5 4 0 0 5 y i t 0 0 4 0 厶c a s e ia t c c 一 7 4 6 9 l j c m5 8 1 0c b s a ： c t i s p a t 4 3 9 c b s b ： 4 5 2 厶ncib 一 f e r m e n t5 9 9 1 埘 n a f c5 1 5 7 2 3 0 llmg9 4 3 5 4 5 g a h i n a j _ 4 0 】 s i p b ：3 0o a =s l p 8 ： 1 2 5 1 8 5 b = 9 9 9 & o b s l p c ：3 0a = 8 4 s l p c ： b = 5 0 1 0 1 2 s 1 p 1 ) ：3 0s 1 p d ： l o 0 8 c b s h ：3 0p c b s b ：2 3 h p h p p 【3 2 】 【3 1 】 4 1 】 1 2 8 1 1 3 1 1 1 3 1 】 1 2 9 1 盯 厶芦 山东师范大学硕士学位论文 l h e l v e t i c s v p i a p f l ： 1 1 7 5 92 9 8 a d f 2 ： 2 9 8 t c c a p f l ： 1 9 9 9 22 6 3 a d f 2 ： 2 6 3 c n r z8 9 2 4 3 1 a t c c 1 0 7 9 7 a t c c 1 2 0 4 6 5 1 5 a p f l ： 3 0 2 a p f 2 ： 2 9 7 a p f l ： 2 8 9 a p f 2 ： 2 8 9 4 3 9 a t c c5 2 1 厶 五株菌a p f l ：2 5a p f l ： j o h n s o n 株 4 -2 5 8 一 订2 8 72 6 5 a p f 2 ：a p f 2 ： 2 9 8 3 1 5 3 2 43 2 6 厶k e f i r2 0 分离6 6 7 1 一 物菌株 c i i e a 6 6 8 3 2 1 p f l ：2 5 一 p f 2 ：2 5 a p f l ：2 5 一 a p f 2 ：2 5 一 p f l ：2 5 一z 8 p a p f l ： 9 9 8 a p f 2 ： 9 9 8 a p f l ： 9 3 5 a p f 2 ： 9 3 5 1 0 1 9 o a =一 4 5 ，b = g ，6 p一 a p f l a p f 2 ：2 5 一 p 9 3 5 9 7 2 a p f 2 ： 9 6 0 一 9 8 0 【3 3 】 【3 3 1 【2 7 】 【3 l 】 【4 2 】 【3 l 】 【3 3 1 【3 0 】 3 0 1 1 4 山东师范大学硕士学位论文 a0 ：倾斜矩阵：h ：六方矩阵：p ，未确定的周期矩阵b 粗糙菌落形态c 光滑 菌落形态 用电子显微镱来初步鉴定细胞壁或表层结构中s 层蛋白的结构。免疫标签被 用于研究厶b r e v i s 菌的s 层蛋白s 1 p a 和l h e v e t i c u s 菌的s 1 p h “”。用电子显 微镜观察到s 层蛋白的倾斜的六角形结构，具有一定的周期性。学者研究了厶 a c f d o p h i l u aa t c c4 3 5 6s 1 p a 和厶c r j s p a t u sj c m5 8 0c b s a 蛋白这些s 层蛋白 亚单位的自组装过程“”。尽管厶a c i d o p h i j u ss 1 p a 和l c r f s p a t u sc b s a 的n 端三分之二的基因序列具有高度的可变性，s 层蛋e t 的这些区域承载着蛋白亚 单位以一种有规律的方式自聚的过程“”。s m i t 等命名厶a c l d o p m l u ss i p a 和 厶c r f s p a t u sc b s a 的这些区域为s a n 。他们认为，通过对比序列，得知，在 h e l v e t i c u s 中的晶状区域也位于s 层蛋白s l p h 的相应区域上，但这种推断还未有 实验证明。通过基因敲除的方法研究l c r i s p a t u s c b s a ，得出从3 2 到2 8 1 的氨基 酸对于自聚过程是必要的“3 。来源于a c i d o p m l u s s l p a 蛋白的s a n 结构被进一 步研究，s a n 区域的n 端和c 端被一个暴露于表面的环所隔开。“。切除c 端的实验不 能影响自聚，表面最外面的c 端没有参加自聚过程”。3 ) 。由于已知s 层蛋白的稳定 的不同，意味者针对厶a c f d o p h i u ss l p a 的端晶状区域的研究结果不能用于其 它的乳秆菌s 层蛋白。 3 1 3 乳杆菌s 层蛋白的系统发生- 我们依照s 层蛋自的序y g ( 包括信号肽) 来分析s 层蛋白的系统发生( 图1 - - b ) 。 乳杆菌物种的1 6 sr r n a 编码的基因序列也用来建立系统发生树。当s 层蛋白的序 列分析某类物种的发生产生困难时用1 6 sr 刚瞄自码的基因序列进行分析。依照系 统发生树( 图1 a 和b ) ，由s 层蛋白得到的系统发生树与1 6 sr r n a 编码的基因序 列得到的系统发生树的主枝干是相似的。具有几乎相同的1 6 sr r n a 编码的基因序 列的相近相关的a d d o p h i l u sb 族( 厶g a s s e r f 与l j o h n s o n i l ：) 和l a c i d o p h f l u sa 族( 厶a c i d o p m l u s 与厶c r y s p a t u s ) 与厶h e l v e c i c u s f e 清晰地 山东师范大学硕士掌位论文 形成了分支。依照1 6 sr i l n a 编码的基因序列得到的系统发生树中可以看到，l b r e v l s 种群与其它的乳杆菌分离，这种分离从s 层蛋白基因得到的系统发生树中 也能看出。我们能看到a p f l 和a p f 2 蛋自的两个分支，但其中也有a p f l p f 2 序列 混合存在的分支，也有厶j o h n s o n i ia t c c3 3 2 的a p f l 清晰分离的分支。 6 ( 曩 山东师范大学硬士学位论文 图1 由嗜酸乳杆菌的1 6 sr r n a 编码的基因序列( a ) 和s 层蛋白( b ) 绘制的进 化树 1 6 sr r n a 编码的基因序列为基础的进化取代比s 层蛋白的取代水平要低，而 1 6 s r n a 编码的基因序列为基础的进化树比s 层蛋白基因的进化树更具参考性。明 显地，厶c r i s p a t u s t 搀s 层蛋白是从l a c i d o p h j l u j f c l l h e l v e t i c u s 创, 3 s 层蛋白 上分支出来的，尽管这三个物种的1 6 sr r n a 基因几乎是相同的 图l a 和b 3 。依照 进化分析，两种l b r e v i 螬株的s 层蛋白在品系水平上存在明显的分歧，相同的 厶g a s s e r l lj o h n s o n i 啮株的不同s 层蛋白也能看到这种情况。因此，系统发 生分析表明1 6 sr r n a 编码的基因序列为基础的进化树中物种菌株的水平上的相 同性决定了乳杆菌s 层蛋白的相似性水平。乳杆菌生活境况的选择压力造成了这 些菌s 层蛋白的分化比 6 sr r n a 编码的基因序列为基础的进化更为迅速。这些菌 株包括进化树中不同来源( 入源的，动物来源的，植物来源的和乳制品来源) 品 系。为了证明乳杆菌的生活环境在s 层蛋白进化中的角色更加可信，几种来源于 山东师范大学硬士学位论文 不同生态环境下的一个乳杆菌菌株的几种s 层蛋白被研究。但是至今，没有足够 的数据来分析s 层蛋白的这种情况 3 1 ，4 乳杆菌s 层蛋白的序列比较和二级结构分析 同种菌株的s 层蛋白中我们可以看出，乳杆菌s 层蛋白的一级结构显示出广泛 的变化。在不同豹s 层蛋白中，相同的氩基酸数量的变化从7 2 到1 0 0 之间 表l 】。 厶j o h n s o n i in c c5 3 3 和d s m2 0 5 5 3 之间有最高的同源性，它们拥有两个相同的 s 层蛋白。g a s s e r ia t c c1 9 9 9 2 中的a p f l 和a p f 2 蛋白也相同 表1 。此外，袭1 中l ，g a s s e r i 的两个菌株中的两个s 层蛋白几乎是相同的。然而在a t c c8 2 8 7 和 a t c c1 4 8 6 9 两个菌株中的s 层蛋白几乎不同( 相似性小于4 0 ) 。，b r e v i sa t c c 1 4 8 6 9 s 蛋白三者之间的差异性是令人惊异的巨大( 相似性小于3 6 ) 。厶 8 c d o p h i l u s 与l c r i s p a t u s 名r 自的两个s 层蛋白之间的相似性明显较高，分别为 5 5 3 和4 3 2 。厶g a s s e r i 和l j o h n s o n i i 的s 层蛋白与表l 列出的其它s 层蛋白显 著不同( 相似性小于1 7 ) 。不同种类s 层蛋自之间的相似性的缺乏是其它s 层蛋 白也具有的一种共同的特性。乳杆菌也不例外。 将6 ，p 订& ，a o i d o p h i l u s c r i s p a t u s 和l h e l v e t i a u s 排成一排， 在研究条件下分析，寻找乳杆菌s 层蛋白高度序列相似性的区域。依照早先报道 的序列同源性分析“”，厶a c i d o p h i l u s , 厶c r i s p a t u s 和l l h e j v e t i c u ss 层 蛋白