（细胞生物学专业论文）动点hsmis12复合物分子构架解析及相互作用调控网络研究.pdf

中国科学技术大学博士学位论文摘要 摘要 细胞周期是细胞最基本的生命活动之一，它通过一系列有序的反应进行分裂， 产生两个包含相同遗传物质的子细胞。细胞周期中最核心的事件就是进行遗传物 质的复制和分离，即在s 期进行d n a 的复制，然后在有丝分裂时期将复制的染色 体平均分配到子细胞中去。有丝分裂过程中染色体的运动和分离又是通过纺锤体 微管和位于染色体着丝粒上的动点之间的协同作用来完成的。 m i s l 2 复合物是一个进化上较为保守的蛋白复合物，人源m i s l 2 复合物由 m i s l 3 、m i s l 4 、m i s l 2 和p m f l 四个蛋白组成，功能性研究表明它们在动点的组 装和染色体的分离中发挥重要作用，但是它们动点定位机制仍不清楚。在我们进 行的f a rw e s t e m 筛选中，我们发现m i s l 3 是有丝分裂过程中重要激酶a l 】r o r a b 的 一个潜在的结合蛋白。在有丝分裂的前期、前中期和中期阶段，m i s l 3 和a u r o m - b 激酶具有相同的着丝粒定位。进一步的实验表明m i s l 3 不仅可以在体内外同 a u r o r a b 激酶发生相互作用，而且还可以被a u r 0 胁b 激酶磷酸化，觚o m - b 激酶 可以磷酸化m i s l 3 第1 0 0 位和第1 0 9 位丝氨酸残基。在细胞内，无论是用干扰r n a 抑制a u r o m - b 蛋白的表达还是用小分子抑制剂来抑制a u r 0 胁b 的激酶活性，都 会使m i s l 3 的动点定位明显减少，但是却不会影响m i s l 2 的动点定位，表明 a u r o r a b 激酶特异性的决定m i s l 3 的动点定位。此外，外源性表达m i s l 3 不可被 磷酸化突变体也不能定位到动点上，相反，模拟磷酸化的突变体却可以定位到动 点。说明a u r o m - b 激酶介导的磷酸化作用直接决定了m i s l 3 的动点定位。此外， m i s l 3 的动点定位还受到a u r o m - b 激酶的时空调节，在有丝分裂的晚期阶段， a u r o r a b 激酶活性下降，m i s l 3 会从动点上解离下来。先前的研究表明下调 a l 鹏m - b 蛋白的表达或是抑制m 哟m - b 激酶活性会破坏外层动点蛋白n d c 8 0 复 合物和马达蛋白c e n p e 的动点定位，但是这一机制仍不清楚。我们的r n a 沉默 实验表明敲除掉m i s l 3 蛋白会减少n d c 8 0 复合物和c d 一e 的动点定位，因此， a u r o 胁b 激酶对m i s l 3 的磷酸化调节可能在这一通路中发挥作用。有意思的是， 在抑制掉a u r 0 胁b 激酶活性的细胞中，外源性转入m i s l 3 的模拟磷酸化突变体可 以在很大程度上恢复n u 亿和c e n p e 的动点定位，进而修复动点一微管之间的连 接，这些结果表明a u r 0 豫b 激酶对m i s l 3 的磷酸化修饰在外层动点蛋白的装配和 动点一微管之间的连接中发挥作用。 m i s l 2 复合物在动点上的功能已经较为清楚，但是它们分子间结合方式仍是 未知的，为了解析m i s l 2 复合物的分子构架，我们引入了共表达系统在体外表达 和重组该复合物。共纯化结果显示m i s l 3 能和m i s l 4 结合形成一个相对紧密的异 i 中国科学技术大学博士学位论文摘要 二聚体，p m f l 与m i s l 2 之间通过微弱的作用相结合。此外，这两个异二聚体之 间也是依靠微弱的作用而结合，但是，一旦这两个异二聚体结合在一起，它们又能 协同作用最终形成一个分子比近乎1 ：1 ：1 ：1 的四蛋白复合物，我们的酵母双杂交 实验进一步证实了这一结论。此外，m i s l 2 复合物也能够和n d c 8 0 复合物中的 s p c 2 4 s p c 2 5 异二聚体以及k n l 1 蛋白的c 端发生直接结合，因此我们推论人中 的m i s l 2 复合物也具有同n d c 8 0 复合物、k n l 1 蛋白结合形成王m 烈复合物的 能力。除了能形成k m n 复合物之外，m i s l 2 复合物还通过m i s l 3 和m i s l 2 蛋白 同外层动点蛋白z 、) r i n t 1 相结合，除此之外，m i s l 3 蛋白还能特异的与 c e n p h c d 咿i 复合物中的c e n p h 相结合，但是却不会同该复合物中的另外一 个组份c e n p 5 0 相结合，说明m i s l 3 和m i s l 2 蛋白主要介导m i s l 2 复合物同其他 动点蛋白之间的结合。 综上所述，我们认为a u r o r a b 激酶对m i s l 3 的磷酸化作用促使m i s l 3 在动点上 聚集，从而形成一个完整的m i s l 2 复合物。而一旦m i s l 2 复合物形成，它又会同 n d c 8 0 复合物、k n l 1 蛋白结合形成k m n 复合物，组装出有效的动点一微管结合 表面：此外，它们还会募集马达蛋白c 曰口e 等到动点上，实现染色体的运动和分 离。 关键词：m i s l 2 复合物，m i s l 3 ，6 岫r a b ，共表达，k 稍复合物，c e n p e ，n d c 8 0 复合物，动点 i v 中国科学技术大学博士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t n l ec e uc y c l ei s 也eo r d e r e ds e t so fp r o c e s s 廿l r o u 曲w h i c hc e l l sd i v i d e ，p r o d u c i n g t 、) l ，od a u 啦e rc e u sp o s s e s s i n gm es a i ：n e to fg e n e t i ci i l 】b 肌a t i o n t m sp r o c e s si s 劬妇n e n t a lf o rc e l lg r o w t i la i l dd i 腩r e n t i a t i o n t h er n 0 s ti n l p o n a n te v e n t so ft h ec e l l c y c l ea r et l l o s ec o n c e m e dw i t ht h ed u p l i c a t i n g 觚dp a r t i t i o i l i n go ft 1 1 eh e r e d i t a ：r y m a t e r i a l s m o r es p e c i f i c 砒l y ，t i l cc e l lr e p i i c a t e si t sg e n o m i cd n a d u r i n gsp h a s e 觚d s 印a r a t e st h er e p l i c a t e dg e n o m e si i i t 0t 、7 旧d a u g h t e rc e l l sd u r i n gm i t o s i s a n dm e c h r o m d s o m em o v e m e n t si ni i l i t o s i sa r eo r c h e s t m t e db yd y n 锄i ci m e r a c t i o n sb e t 、；v e e n s p i n d l em i c r o t u b u l e s 砒l dt l l ek i n e t o c h o r e ，am u l t i - p r o t e i nc o n l p l e xa s s e m b l e do n t o c e n t r o m e r i ce i n ao f l ec h r o m o s o m e h s m i s12c o m p l e xi sac o r i s e e df 0 * p r o t e i nc o m p l e xc o l l s i s t i n go fh s m i s12 ， h s m i s l 3 ，h s m i s l 4a n dh s p m f l ，w l l i c ha r ce s s e n t i a lf o rk i n e t o c h o r ea s s e m b l ya i l d c l l r o i n o s o m es e g r e g a t i o n ，b u tm e i rl o a d i n gm a m l e rt 0t l l ek i n e t o c h o r er e m a i n se l u s i v e o u rp r e v i o u sf 打、e s t e m 蹈s a yo fa u r o r a bi l l t e r a c t i n g 眦i i li r l l p l i e dt 1 1 a tm e h s m i sl3p r d t e 主ni sap o t e i l t i a lb i n d i n gp a m l e ro fa 啪r a bk 幻弱e i n d e e d ，h s m i sl3 c 0 一l o c a l i z e d 、7 l ，i t l la u r o r a bl ( i r l 嬲ea tt 1 1 ec e n t r o m e r ef - r o mp r o p h 嬲et 0l n e t a p h i 塔ei n h e l ac e l l s a u l o mbi n t e r a c t s 、们廿lh s m i s l 3 伽v 加d 龇l d 加v f v d h s m i s l 3i sa c o 伊a t es u b 蛐瞰eo fa u r o mb a i l d 也ep h o s p h o 巧l a t i o ns i t e s 、v e r em 印p e dt os e r lo o a n ds e r l0 9 s u p p r e s s i o no fa u r o l 甚bk i n a s eb ye i t l l e rs m a l l i n t e 彘r i n gr n ao r c l l e i i l i c a li i l l l i b i t o r sa b r o g a t e st l 圮l o c a l i z a t i o no fh s m i sl3b u tn o th s m i sl2t 0m e c h o r e i l l a d d i t i o i l n o n - p h o s p h o 巧l a t 2 l b l e b u tn o t诵l d t y p e a n d p h o s p h 0 - m i i l l i c k i n gh s m i s l3 ，翻l e dt 0l o c a l i z et 0t h el 【i n e t o c h o r e ，d e m o n s 觎t i n gm e r e q u i 他m e mo fp h o s p h o 巧l a t i o nb y a u r o r abf o r t h e 髂s e m b l yo fh s m i s l 3t o l 【i n 咖c h o r c i n 角c t ，l o c a l i z a t i o no fh s m i s 13t 0t l l e 玉【i n e t o c h o r ei ss p a t i o t e 珈i p o r a l l y r e g u l a t e db ya u r o mbh n a s e ，w i l i c hi se s s e n t i a lf o rr e c m i t i n go u t c rl 【i n e t o c h o r e c o n l p o n e n t ss u c h 嬲n d c 8 0c o m p o n e n t sa n dc e n p ef o r 如n c t i o n a lk i n e t o c h o r e 嬲s e m b l y i n l p o r t a n t l y ，p h o s p h o m i m i c k i n gm u 觚h s m i s l3r e s t o r e st 量l e 嬲s e m b l yo f c e n p et 0t l i ek i n e t o c h o r e 锄d 协啮i o nd e v e l o p e da c r o s st l l es i s t e rk i n e t o c l l o r e si i l a u r o mb i 1 1 l l i b i t e dc e l l s t h 吣，w er e a s o n 哦h s m i s13p h o s p h o 巧l a t i o nb ya u r o r ab i sr e q u i r e df o ro 唱a 1 1 i z i i 培as t a _ b l eb i 帕r i e n t e dm i c r o t u b u l el 【i n 酏o c h o r ea t t a c h m e mt l l a t i se s n t i a lf o rf a i t h 向lc h r o m o s o m es e g r e g a t i o ni nm i t o s i s f u n c t i o n a ls t u d i e sh a v es u g g e s t e dm a tn l eh s m i sl2c o m p l e xm a ya c t 弱t h ec o r e c o m p o n e n to fk i n e t o c h o r e ，b u ti t sm o l e c u l a ra r c m t e c t u r ei sl e s sk n o 帅t od e l i n e a t c v 中国科学技术大学博士学位论文 a b s t r a c t 廿l e i i l t e r a c t i n gn e t 、v o r k 、析“nt l l eh s m i s l 2c o m p l e x ，w ea d o p tt h ec o - e x p r e s s i o n s y s t e mt 0p u r i 匆锄dr e c o r l s t i m t e “sc o m p l e xi nv i t r 0 o u rc o - p 嘶f i c a t i o nr e s u l t s s h o wt 1 1 a th s m i s l 3a i l dh s m i s l 4c a nf 0 衄at i g h th e t e r o d i m c r ，w h e r e 嬲n l e r a c t i o nb e t 、e e nh s m i sl2a n dh s p m f1 i sq u i t ew e a k i ns p i t eo fm el o wb i n d i n g 瓶1 1 i 够b e t w r c e nt h em i s l 3 m i s l 4d i m e ra n dt l l em i s l 2 p m f ld i m e r ，n l ef o u r p r o t e i l l sf o r mah e t e 的t e 位瑚e r 谢t has t o i c h i o m e t 巧o fl ：1 ：1 ：l w h e n 也e s ef o u r p r o t e i n se x p r e s s e ds y n c h r o n o u s l y ，i i l l p l y i n gm a t l ef o u rs u b u n i t sc 觚a c ts y n e r g i c a l l y t 0f o m 趾i n t a c tm i s12c o m p l e xi nv i v o o u ry e a s t 帆oh y b r i de x p e r i m e n t se c h ot 1 1 i s h y p o t l l e s i s f u n h e 肌o r e ，b o t l lt l l es p c 2 4 - s p c 2 5 h e t e r 0 - d i m e ro fh s n d c 8 0c o m p l e x a n dt h ect e m i r l a lo fk n l lp r o t e i nc a i lb i n dw i mt h eh s m i sl2c o m p l e xi nv i 们， 跚g g e s t 证gt l l a th s m i s l 2c o m p l e xl 粥t h ep o t e n c yt 0f o mah u g el a 厦nc o m p l e xj 蜮 缌i t sh o m o l o g u ei nc e 翟弦脚e x c e p tf o rn l ek m nc o m p l e x ，m eh s m i s l2c o m p l e x l i n kt l l eo u t e rk i n e t o c h o r ep r o 钯i nz 丽n t 1t h r o u 曲t h ed i f e c tb i n d i n g 谢t hh s m i s12 a 1 1 dh s m i s13s u b 吼i t s i na d d i t i o n ，h s m i sl3s u b u i l i t si n t e r a c tw i mh s c e n p - h p r o t e i n ，as u b u l l i to fc e n p h ic o m p l e x ，b u tn o tt h eh s c e n p 一5 0 t h e s er e s u l t s s u g g e s tt 胁廿l eh s m i s l 2a n dh s m i s l 3s u b u i l bm a ya c t 弱am d g et 0l i l l km e h s m i s l2c o m p l e xw i t l lo t l l e rl ( i n e t o c h o r ep r o t e i n s f i n a l l y ，w ep r o p o s et h a tt h ep h o s p h o r y l a t i o no fh s m i s 13b ya u r o mbk i n 弱el e a d t 0t h ea c c 啪u l a t i o no fh s m i sl3o nk i n e t o c h o r ea tt 1 1 eo n s e to fm i t o s i s ，a s s e m b l i n g 锄 i l 她c th s m i s12c o m p l e x s u b s e q u e n t l y ，m eh s m i s12c o m p l e xb i n d 、析t h 廿l en d c 8 0 c o i i l p l e xa l l dk n l - 1p r o t e i nt of o 肌as t a _ b l ek i n e t o c h o r e m i c r o t u b u l ei m e r a c t i n g 鲫m c e i i la d d i t i o l l ，廿1 eh s m i s12c o m p l e xr e c r u i tm em o t o rp r o t e i i lc d 町p - et 0 k i n e t o c h o r ei n d i r e c t l y ，f a c i l i t a t i i l gt l l em o v e m e n ta n ds e g r e g a t i o no fc h r o m o s o m e d u r i n gm i t o s i s k e yw o r d s ：m i s l2c o m p l e x ，m i s l3 ，a u r o m - b ，c o - e x p r e s s i o ns y s t e m ，k m nc o m p l e x ， c e n p e ，n d c 8 0c o m p l e x ，k i n c t o c h o r e v i a c a a p c | c b u b c d c c d e c e n p c l a s p c l i p d a p i g f p h e c i f i p i p l k t m a d m c m m i f m i s m c a k m l 心 m p s m t n u f p b s p m s f 缩略词表 a n t i - c e m r 0 l e i l ea m l s e m a n a p h 嬲ep r o m o t i n gc o m p l e x c y c l o s o r n e b u d d i n gu i l i i l l l i b i t e db yb e i l z i m i ( k o l e c e ud i v i s i o nc y c l e c o i l s e r v e dd n ae l e m e n t o e n t r o m e r e - 嬲s o c i a t e dp r o t e i n c l i p - a s s 0 c i a t e dp r o t e i n c y t o p l 嬲“cl i l 出e rp r o t e 证 4 ，6 埘锄i d i n 0 - 2 - p h e n y l i n d o l e g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n h i 曲e x p r e s s i o ni nc a n c e r i m m u i l o f l u o r ：s c e i l c e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n i n c r e a s e i n p l o i d y k i n e t o c h o r e m i t o t i ca n e s td e f e c t m i i l i c h r o n l o s o m em a i n t e n a 啪【c e m i t o t i cf i d e l i 够o fc h r o m o s o m e 仃锄s m i s s i o n m i l l i c h r o m o s o m ei n 咄l b i l i t ) ， m i t o t i cc e i l 缸o m e r e a s s o c i a t e dh n e s i n m i c r o n i b u l e sa s s o c i a t ep r o t e i n m o n 0 一p o l 盯s p i n d l e m i c r o t l i b u l e n u c l e a rf i l 锄e n t p h o s p h a t eb u 舵r e d 谢i n e p h e n y l m e t h y l s u d p h o n yf l u o r i d e s d s p a g e s p c t b s t t k w b s d sp o l y a c r y l 锄i d eg e le l e c 仃o p h o r e s i s s p i l l d l ep o l ec o m p o n e n t t r i sb u f r e r e ds a l i n e t c e u t ) ，r o s i m l 【i 1 1 a s e w e s t 啪b l 酣i n g i i 论文原创性和授权使用声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 斟 名 年 签者作 中国科学技术大学博士学位论文 文献综述 第一章文献综述 1 1 引言 细胞是生物体的基本单元，细胞的增殖是生物体生长、发育以及机体进行自我 更新的生物学基础。而细胞的增殖是通过细胞周期来实现的，一个典型的细胞周期 包括d n a 合成前期( g l 期) 、d n a 合成期( s 期) 、d n a 合成后期( g 2 期) 和 有丝分裂时期( m 期) 四个时期：g l 期长短因细胞而异，主要合成细胞生长所需 要的各种蛋白质、糖类和脂质等，在g l 的晚期阶段，还存在一个向s 期转变的检验 点；s 期一般需要几个小时，在此过程中，d n a 经过复制而含量增加一倍，与此同 时，细胞还合成组蛋白和复制中心粒；g 2 期比较恒定，一般需要l 1 5 小时，主 要为分裂期做最后的准备，中心粒已复制完毕，此外还合成r n a 和微管蛋白等； 在m 期，染色质发生凝聚形成染色体，在微管的牵引作用下，将复制的d n a 平均 分配到子细胞中去，实现遗传物质的传递。 衔接微管和染色体的是一个称为动点的多蛋白复合体，它一方面介导染色体着 丝粒和纺锤体的连接，同时还具有监控染色体凝聚、排列和分离的功能。当细胞进 入到有丝分裂时期，染色质发生凝聚形成染色体，随后核膜发生破裂；在有丝分裂 的前中期，从两极发出的动点微管开始寻找并捕获染色体，染色体通过特异性结合 在着丝粒上的动点复合物与微管的侧面或者末端结合，在微管一马达蛋白的协同作 用下被逐渐牵引并排列到中期赤道板上；当所有的染色体都排列到赤道板上后，纺 锤体检验点失活，连接姐妹染色单体之间的c o h e s i n 复合物被切开，染色单体分开， 并被纺锤体微管牵引向两极；到了有丝分裂的末期，纺锤体解聚，染色单体去凝聚， 核膜也重新形成，m i d z o n e 区的收缩环也会将胞质中的成份一分为二，从而形成两 个独立的子细胞，每个细胞获得了一份相同的遗传物质( c h e e s e m 锄觚dd e s a i ，2 0 0 8 ) 。 由于动点复合物直接介导遗传物质的分离，因而动点功能的缺失或失活，都可 能导致染色体的分配和分离出现错误( k o p se ta 1 ，2 0 0 5 b ) ，使得遗传物质不能平均分 配到子细胞中去，从而导致非整倍性( 锄e u p l o i d y ) 细胞的出现。几乎所有的实体瘤 在染色体水平的表型就是出现基因组的不稳定性，因而一旦动点功能缺失或异常， 在很大程度上就变成了促使癌症形成的推手。事实上，许多动点组成成份例如 c d 咿- a ( t 0 m o n a g ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 、c e n p h 就在c o l o r e c t a lc 锄c e r 组织中高表达，染 色体旅客蛋白a u r o r a b 和i n c e n p 在许多肿瘤组织中的表达会出现上调，c e n p - f 中国科学技术大学博士学位论文 文献综述 的过表达也被认为和肿瘤的增殖和迁移有关( y u e ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。更为重要的是，动 点是纺锤体检验点蛋白停泊和发挥功能的场所，而这些检验点蛋白直接监控着染色 体排列状态，它们功能的缺失或失活，就会使得染色体在未完全排列到赤道板上就 发生分离，直接导致非整倍性细胞产生。在体外培养的细胞或是在动物体内中，降 低检验点蛋白的表达水平或者引入检验点蛋白功能缺失的突变体都会极大增加非整 倍体细胞的数量，在实体肿瘤中，也发现大量检验点蛋白的突变体( k o p se ta 1 ， 2 0 0 5 b ) ，如图1 1 所示。此外，肿瘤细胞中致癌基因或肿瘤抑制因子也会影响检验 点蛋白的表达，例如在b r a c l 突变的小鼠细胞中，m a d 2 、b u b l 、b u b r l 和z w l 0 的表达水平就会下降，p 5 3 会下调检验点蛋白m a d ll 1 的转录水平而降低m a d l l l 的表达，b c s g l ( b r e a s t c 锄c e r - s p e c i f i cg e n e1 ) 则通过与b u b r l 结合，促使b u b r l 的降 解来下调其蛋白水平( k o p se ta i ，2 0 0 5 b ) 。 因此，对动点结构和功能的研究是一件非常有意义的事情，一方面，它可以揭 示染色体精准分离所需要的生物大分子及其作用机制，从而寻找导致c 刑或者 锄e u p l o i d y 的可能原因和途径：另一方面，动点上的这些关键分子又可以作为癌症 特定的标记物来进行早期的检测和诊断，同时，这些蛋白还可以作为小分子药物作 用的靶点，设计药物来进行癌症的治疗。 2 中国科学技术大学博士学位论文 文献综述 二二二二口一 一一c 二二 ，一； zot ； i 1 一 二二二 工 m 12 3 45e ， 卫一 ， 二二二二 ，m 12 ， 二二二”， 一， 二二 组二二二a * 删 器。 图1 1 ：不问肿痛样晶中发现的检验点蛋白突变体。( 取自k a 睢d 2 0 0 5n m r 肿c 蜘c e r ) l l 豪一湍萤一 憋黪虢 燃 一 一 中国科学技术大学博士学位论文文献综述 1 2 动点的超微结构 在电镜下动点呈现出一种类似盘状的结构。如果利用传统的化学方法进行固定， 在透射电镜下，可以观察到明显的暗一明一暗的三层结构，加入解聚微管的药物进行 处理还可以看到一个明显的纤维冠状区域；但是，如果采用高压冷冻方法处理细胞， 则看不到这种明显的层状结构，其中，中间的电子不透明区会消失，相对应的，看到 韵是一个直接结合于着丝粒区异染色质上5 0 7 5 衄厚的明亮的区域，该区域包吉 由一些细小的纤维( 直径小于9 衄) 所形成的松散网状结构舯c e w e n 眦划，1 9 9 8 h 依照传统的暗一明暗的结构来理解动点，可以将动点划分为内层、中间层、外层 和纤维冠状层四个不同的区域：内层约4 0 舢厚饵m 彻u e i e d m ，2 5 ) ，结构并不十 分明显，一般直接结合在异染色质表面区域，包含有c e n p 等蛋白，主要构成动 点的结构基础。此外，还具有调节微管生长的功能：中层位于内层和外层之间，一般 约1 5 3 5 啪厚，因其电子密度较低，所以在电镜下看到的是半透明状结构。该区域 包含3 f 3 捌拘瞬酸化表证，可能与感受张力有关：外层约5 0 加n 巾厚，包含有 c e n n e 、c e n p - f 和d y 槲n d ”a c t i n 等成份，形成与纺锤体微管结合的表面：当加 入阻止微管聚合的药物时，还可咀看到由致密的纤维排列井向外延伸约o l o3 岬 而形成的纤维冠状层。动点的作用模式图和电镜结构如图l2 所示( c h 鞴m 船孤d d e s a ，2 0 0 8 ；r i e d 甘锄d s m m o m1 9 9 8 ) 。 动点大小因物种不同而异，在绝太多数生物体中，动点直径在ol o5j | l i l 之间， 结合1 0 4 5 根数量不等的微管( r i e d e r 锄ds a i m o n ，1 9 9 8 ) 。在芽殖酵母中，动点结合在 1 2 5 b p 长的着丝粒上，每个动点只和一根微管结合( i y m 衄蜘ds o o g c l1 9 9 5 ) ：而在人 细胞中，高度重复的着丝粒d n a 有l 4m b ，一个动点将会结合1 s 也o 根微管。 禺l i ：哺乳动物动点超微结构图。a 图是一个结构模式图山匿是电镱结构图。( 取自：c h 啪s 州瑚 d i ) c s a i 瑚8n m r e v m o l c e b i 0 1 ) 中国科学技术大学博士学位论文文献综述 1 3 动点复合物 在过去的几十年里，以质谱技术为基础的蛋白质组学极大地加速了模式生物和哺 乳动物细胞中动点组份的鉴定，通过纯化着丝粒区域染色体、分离有丝分裂时期纺 锤体或是利用已鉴定出的动点蛋白质作为靶点进行t a p 或是l a p 纯化等方法并结合 质谱分析技术已经鉴定出了相当多数量的动点蛋白质，并根据它们的定位关系或功 能进行了初步的分类。 到目前为止，在人中发现和鉴定的动点蛋白已经有8 0 多种( c h e e s e m a n 彻dd e s a i ， 2 0 0 8 ) ，它们的结合和分布情况如图1 3 所示( m u s a c c h i o 锄ds a l m o n ，2 0 0 7 ) 。它们中 的一部份是作为组成型成份一直保留在动点上，如c e n p b 、c e n p c 、c e n p h 、 c d 岬i 等；还有一部份蛋白只是短暂出现在动点上，当有丝分裂进行到下一个阶段 时，它们便会离开动点，如纺锤体检验点蛋白；还有一些蛋白，它们不仅在动点上有 定位，在细胞内的其他部位譬如中心体、纺锤体上有定位，如p l k l 激酶、t t k 激 酶、n e l ( 2 a 激酶和染色体旅客蛋白复合物等。尽管如此，动点蛋白协同作用，确保 染色体在有丝分裂的早期阶段能够排列到中期赤道板上，在晚期的时候能够将染色 单体平均分配到子细胞中去。为了能更有效的进行组装和行使功能，许多动点蛋白 相互结合形成复合物，它们一般具有相同的动点定位和相似时空分布。在此，我将 一些研究得比较深入的蛋白复合物进行一个综述。 中国科学技术大学博士学位论文 圈1 j ：着丝粒一动点结构模式图。( 取自：m m a c d “o 彻d s a 】蚰o n2 7 r 盯m o l c d i b i d ) 中国科学技术大学博士学位论文 文献综述 1 3 1c e n p _ a 及n a c ，c a d 复合物 c e n p a 是h i 咖n em 的一个变异体，特意性瞢代着丝粒区h i 咖雌h 3 。由于 c e n p _ a 只结合在着丝粒区的核小体上，因而往往被看作是着丝粒区的一个表观遗 传标记物，特异性的决定动点在染色体上的定位 相反过表达c e n p a 会使其定 位到着丝粒之外的区域，形成“假着丝粒”位点尽管这个假着丝粒”不具有活性， 但是还会募集h c e n p c 、h s m c l 和h z w i n t l 等动点蛋白到该位置( v 触h 0 0 s e re t a l ， 2 0 0 1 1 。此外，c e n p a 在动点的组装中发挥重要的作用，在d t 4 0 细胞中，抑制 c 呻a 的表达，会使内层蛋白c e n p c 、c e n p - h 、c e n p i 以及外层蛋白n u 伽c c l 、 m a d 2 和c e n p - e 在动点上的量大大减少，并且出现错误定位；同时，染色体也不 能进行有效的凝聚和分离m e 趴i 盯虬甜，2 0 0 5 ) 。 与其他四种核心组蛋白不同的是，新合成的c e n p _ a 只在有丝分裂末期或者在 下一个周期的g l 期早期才掺入到着丝粒棱小体上( j 锄s 啪e ta i ，2 0 0 7 ) ，而不是在s 期在复制叉的后面进入核小体；p e k rh e m m 刊c h 等人的结果显示g f p 也n p a 只 在o l 期发生f r a p ，而在s 期、g 2 期和有丝分裂中期都没有f r a p 发生，说明c e n p - a 只有在g l 期才会发牛l o a d i n g ，这一结果进一步证实了前面的结论( p 胁h 哪m e 五c h 2 0 0 8 1 。因此，c e n p a 在整个细胞周期中的循环和动力学行为可以用图1 4 表示。 。) ， ， 圈14 ：c e n p _ a 在整个细胞周期中的时空分布示意图。( 取自：l 孵e tj 口i 河l d d 0 。0 7 j c b ) 7 芝 笋 谶 司引引引划 3 专 奢守 f 6 o 一= 中国科学技术大学博士学位论文 文献综述 c e n p - a 蛋白自身结构和其他蛋白的协同作用共同决定了c e n p a 在着丝粒上的 定位。一方面，c d 岬a 必须维持在定的水平，过表达会导致错误定位；另外一 方面，c e n p a 蛋白包含有一个由1 0 0 pl 和砣h e l i x 构成的c a t d ( c d 岬- a 嘲r g e t i n g d o m a i n ) 结构域，该结构域能与h i s c o n eh 4 一起形成一个独特的刚性异四聚体，这种 结构可能会在一定程度上决定并维系c e n p a 在着丝粒d n a 上的定位( b l a c ke ta 1 ， 2 0 0 7 ) ；另外，还有一些蛋白能特异性的介导c e n p a 插入到着丝粒d n a 上，m i s l 6 、 m i s l8 和k n l 一2 ( 或称作m 18 b p l ) 就在c d 咿- a 插入到着丝粒区核小体上发挥重要 作用。在裂殖酵母中，m i s l 6 和m i s l 8 形成复合物，维持着丝粒核心区组蛋白的去乙 酰化状态，并且它们处于c d 岬a 动点装配路径的最上游( h a y 嬲h ie ta 1 ，2 0 0 4 ) ；相对 应的，m i s l 8 在人中的同源物m i s l 8 卿m i s l 8 p 具有和c e n p - a 同步的着丝粒定位，即 在有丝分裂末期和g 1 期同时出现在着丝粒上，与此相一致的是，抑制m i s l 8 的表达， 新合成的c d i p - a 就不能定位到着丝粒上，并出现染色体排列异常和间期微核等表 型( f u j 渤e ta 1 ，2 0 0 7 ) ；k n l 2 则首先是在线虫中发现的，值得一提的是，它包含有一 个m y b 结构域，这种结构域广泛存在于d n a 结合蛋白或染色质重构复合物中，因此 k n l 2 可能通过和一些短的、特异性的d n a 结合，从而有助于c e n p - a 进入着丝粒 核小体上。k n l 2 和c e n p a 在着丝粒上的定位是相互依赖的，它们协同作用调节染 色体的凝聚、动点装配和染色体的分离等行为。k n l 2 在人中的同源物是m 1 8 b p l ， 与k n l 2 功能类似的是，m 1 8 b p l 特异性决定c e n p a 插入到着丝粒核小体上，也 会影响动点的组装，并且它也只在有丝分裂退出的时候短暂出现在着丝粒上 ( m a d d o xe ta 1 ，2 0 0 7 ) ( b l a c k 锄db 嬲t t ，2 0 0 8 ) 。 尽管这些蛋白都会影响c d 岬a 的着丝粒定位，但是没有实验结果显示c d 岬- a 能同这些蛋白发生直接的相互作用，一种可能是m i s l 8 和k n l 2 募集一些参与染色质 装配的分子如r b a p 4 6 4 8 来促使c e n p a 的着丝粒定位，另外一种可能是这些蛋白在 着丝粒区形成一种特殊的微环境，这种微环境只允许c e n p a 而不是组蛋白h 3 装配 到着丝粒核小体上。但是在芽殖酵母中，却发现有能同c e n p a 直接结合并介导 c e n p - a 定位到着丝粒上的蛋白s c m 3 ，有报道认为s c m 3 能和n d c l 0 、c s e 4 c 盼心a 相 互作用，其中s c m 3 和n d c l o 形成复合物，并通过n d c l o 特意的与芽殖酵母着丝粒区 的c d e i i c d e i i i 结合，从而能为c s e 4 c e n p a 进入着丝粒区提供一种信号。一旦 c 4 c e n p - a 被募集到着丝粒上后，就能形成包含c s e 4 c e n p - a 的核小体并稳定该 复合物( c 锄a h o r tc ta 1 ，2 0 0 7 ) ；还有研究报道s c m 3 与c s e 4 c e n p a 共定位到着丝粒上， 并影响c s e 4 c d 旧a 的着丝粒定位。e 疗中表达的s c m 3 特异性的与 c s e 4 c e n p a h i s t o n eh 4 异二聚体而不是h i s t o n eh 3 h i s t o n eh 4 结合，此外，它还可 s 中国科学技术大学博士学位论文文献