（细胞生物学专业论文）小鼠人工杂合四倍体孤雌胚胎生成途径及其体外发育效果观察.pdf

两南大学硕十学付论文摘要 小鼠人工杂 摘要 成途径及其 小鼠体外发育胚胎无论是体外受精胚、体细胞克隆胚或者是孤雌激活发育的胚均存在比 较明显的2 细胞阻滞现象。早期胚胎发育过程中不同动物在不同时期所表现出来的这种发育 阻滞现象正好位于母体一胚胎核基因支撑其发育的过渡期，被认为是胚眙基因组核基因重新 程序化和基因活化启动转录及表达促细胞生长因子异常所致。不同倍性染色体核型的孤雌胚 胎表现二细胞发育阻滞现象尤为明显，据报道【1 1 单倍体、纯合二倍体和杂合二倍体孤雌胚胎发 育至4 细胞胚胎的比率分别是1 8 5 、2 3 7 和3 5 3 。说明早期胚胎卵裂球单细胞核内染色 体数目愈多、染色质杂合性愈大，支撑小鼠孤雌胚胎过阻滞期发育的能力就愈强。 已知小鼠孤雌胚胎染色质倍性和同质异质性与激活小鼠卵母细胞的方法有很大关系。为 此，本实验通过人工选择不同的小鼠成熟卵母细胞激活方式，探索获取高比率杂合二倍体孤雌 胚胎的有效途径，再通过选择能够使二细胞胚胎发生有效融合的适宜电融合条件，在本实验室 建立体外电融合双卵裂球杂合二倍体孤雌胚胎，人工生成四倍体孤雌胚胎的方法，体外培养这 种四倍体孤雌胚胎，旨在研究小鼠早期孤雌胚胎卵裂球单个细胞染色质物质在质量加倍、性质 异质化的基础上观察克服2 细胞阻滞现象、提高囊胚生成效率的情况，为进一步研究胚胎早期 发育初始机制、提高体细胞核移植的成功比率和孤雌囊胚生成效率奠定基础。试验结果如下： 试验一：获取高比率杂合二倍体孤雌胚胎的孤雌激活方式研究。试验通过不同化学激活 剂对小鼠成熟卵母细胞进行孤雌激活，显微操作仪下观察第二极体是否排出并结合核型分析， 旨在研究不同激活方式所得到的激活卵的染色质倍性，并对不同染色质倍性的激活卵体外培 养发育至囊胚，比较其发育率，选择生成二倍体孤雌胚胎效率最佳的孤雌激活方法制作小鼠 人工杂合四倍体孤雌胚胎。结果显示：( 1 ) 7 乙醇激活7 m i n ，主要形成单倍体激活卵，激 活率和囊胚发育率分别为9 4 2 8 和3 0 0 0 ； ( 2 ) 1 0m m o l l 的s r c l 2 激活6 h ，多排出第二 极体形成单倍体激活卵，激活率和囊胚发育率分别为7 0 3 4 和2 7 9 7 ； ( 3 ) 7 乙醇激活 5 m i n 后移入2m m o l l6 - d m a p + 5 , u g m lc b 的c z b 中激活3 h 及靴g n d a 2 3 1 8 7 + 2 m m o l l 6 d m a p + c b 作用3 h 均能有效激活小鼠卵母细胞，激活后抑制第二极体排 出而出现2 个原核杂合二倍体的比率较高，其激活率、囊胚发育率分别为9 7 7 3 、3 8 6 4 v s 9 4 7 0 、3 6 9 2 。结果表明：7 乙醇联合2 m m o l l6 - d m a p + 5 , t g m lc b 作用3 h 的激活方式 能有效抑制第二极体排出，获得较多杂合二倍体孤雌胚胎，与单倍体孤雌胚胎相比，其孤雌 两南大学硕十学位论文摘要 囊胚发育率明显提高。 试验- - ：昆白小鼠2 细胞胚胎卵裂球电融合制作四倍体胚胎的最适宜电融合条件探索。 本试验将见栓雌鼠2 1 2 4 h 后处死，取2 细胞胚胎，置于电融合液中，设计四组电融合参数 ( a 组：脉冲电压为6 0 0 v c m 、脉冲宽度为5 0 【s 、间隔1 s ：b 组为1 2 0 0 v c m 、3 叩、间隔1 s ； c 组为6 0 0 v e r a 、1 0 【l s 、间隔1 s ；d 组为1 2 0 0 v c m 、5 0 比s 、间隔l s ) 对昆白小鼠2 细胞胚 胎进行融合，融合后转入r a m l 6 培养液中，3 7 ，5 c 0 2 培养，7 2h 后检查囊胚率，旨在 探索胚胎电融合后获得较高囊胚发育率的最适宜电融合参数，为下一步体外电融合双卵裂球 杂合二倍体孤雌胚人工生成四倍体孤雌胚胎建立最适宜的电融合条件。试验结果：a 组和b 组融合率最高，分别可达到6 8 1 8 、6 6 3 0 ，差异不显著( p 0 0 5 ) ；而c 组和d 组的融合 率显著低于其他两组，融合率分别为4 7 5 7 、4 9 4 7 ：a 组和b 组电融合后囊胚发育率分 别为4 5 4 5 、4 4 5 7 。两者差异不显著( p o 0 5 ) 。以上结果表明：脉冲电压为6 0 0 v c m 、 脉冲宽度为5 吮s 、间隔l s 为2 细胞胚胎电融合形成四倍体胚胎的最适宜电融合条件。 试验三：小鼠人工杂合四倍体孤雌胚胎的制作及其与杂合二倍体孤雌胚胎体外发育情况 的比较。本试验采用试验一的最佳激活方法获得杂合二倍体孤雌胚，再采用试验二得出的最 佳电融合参数将获得的杂合二倍体2 细胞胚体外电融合人工生成四倍体孤雌胚胎，体外培养 使其发育至囊胚，与杂合二倍体孤雌胚比较其囊胚发育率，旨在研究小鼠早期孤雌胚胎卵裂 球单个细胞染色质物质在质量加倍、性质异质化的基础上观察克服2 一细胞阻滞现象、提高囊 胚生成效率的情况，为进一步研究胚胎早期发育初始机制、提高体细胞核移植的成功比率和孤 雌囊胚生成效率奠定基础。试验结果：( 1 ) 卵母细胞采用7 乙醇联合2 m m o l l 6 - d m a p + 5 p g m lc b 的激活方式，激活后培养2 4 h 选取7 9 枚杂合二倍体2 细胞胚胎微滴培 养，有3 0 枚发育至囊胚，其囊胚发育率为3 7 9 ( 3 0 7 9 ) ：( 2 ) 采用同样的激活方式，选 取同样数目的7 9 枚杂合二倍体2 细胞胚胎，采用6 0 0 v c m 、5 0 必s 、间隔1 s 的电融合条件对 2 细胞胚胎体外融合生成杂合四倍体胚胎，融合胚胎数为5 8 ，在m m l 6 培养基中经过7 2 h 体 外培养最后有4 4 枚发育至囊胚，其囊胚形成率为5 5 7 ( 3 0 7 9 ) 。 结论：昆白小鼠经过超排处理在注射h c g l 6 h 收集排出第一极体的成熟卵母细胞，采用 7 乙醇联合2 m m o l l6 - d m a p + 5 , u g m lc b 作用3 h 的人工激活方式进行激活，激活卵在m m l 6 培养基中培养2 4 h 后获得杂合二倍体2 细胞胚胎，采用6 0 0 v c m 的脉冲电压、5 0 m s 的脉冲宽 度、间隔1 s 对这种胚胎在体外电融合人工生成四倍体孤雌胚胎，在m m l 6 培养基中经过7 2 h 体外培养使其发育至囊胚，这种人工制作的四倍体孤雌胚胎的囊胚发育率显著高于二倍体孤 雌胚的囊胚发育率( 5 5 7 v s 3 7 9 ，p 0 0 5 ) 6 m m o l ls r c l 2a c t i v a t eg r o u p4 8 c e l le m b r y or a t e sa n dr a t e so fm o r u l aa n d b l a s t o c y s ti ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a no t h e ra c t i v a t i o ng r o u p ，r e s p e c t i v e l ya c h i e v e s 3 2 0 0 、2 3 2 0 ( 3 ) u n i o nc h e m i c a la c t i v a t i o no fm o u s eo o c y t e s ：7 e t h a n o l a c t i v a t i o n5 m i n ，a f t e ra c t i v a t i o ni n t o2m m o ln 6 - d m a p 七5 , t g m l c ba c t i v a t i o no f c z bm e d i u m3 ha n d5 t g m la 2 318 7 + 2m m o l l 6 一d m a p + c b ( 3 h ) s h o wb e t t e r ， p r o d u c i n gh i g h e rr a t eo f2 p nh e t e r o z y g o u sd i p l o i da n dt h e i r4 - 8 c e l le m b r y or a t e sa n d r a t e so fm o r u l aa n db l a s t o c y s tr e s p e c t i v e l ya c h i e v e s5 0 0 0 、3 8 6 4 v s4 8 4 6 、 3 6 9 2 t h er e s u l ti n d i c a t e d ：t h eb e t t e ra c t i v a t i o nw a yi st h a t7 e t h a n o l + 2m m o l i 6 - d m a p 七5 t g | m l c b ，t h ee f f e c ti sb e t t e rb e c a u s ei tc a ns u p p r e s st h ed i o d et o d i s c h a r g ee f f e c t i v e l y , t h u sm a yo b t a i nm a n yh e t e r o z y g o u sd i p l o i dp a n h e n o g e n e t i c e m b r y o s ，c o m p a r e dw i t ht h eh a p l o i dp a n h e n o g e n e t i ce m b r y o s ，i t sr a t eo fb l a s t o c y s t g r o w t hd i s t i n c te n h a n c e m e n t e x p e r i m e n t st w o ：n ee x p l o r a t i o no nt h em o s ts u i t a b l ee l e c t r i c i t y f u s i o n c o n d i t i o n ，w h e np r o d u c et e t r a p l o i de m b r y ow i t hh e t e r o z y g o u sd i p l o i dk a r y o t y p e t h i s e x p e r i m e n t a ld e s i g nf o u rg r o u po fe l e c t r i c i t yf u s i o np a r a m e t e r ( ag r o u p ：t h ep u l s e v o l t a g ei s6 0 0 v c m ，t h ep u l s ew i d t hf o r5 0 m s ，i ss e p a r a t e dl s ；bg r o u pi s1 2 0 0 v 屉m ， 3 毗，i ss e p a r a t e dl s ；cg r o u pi s 6 0 0w c m ，1 毗s ，i ss e p a r a t e dl s ；dg r o u pw a s 1 2 0 0 v c m ，5 毗s ，i ss e p a r a t e dl s ) t op e r f o r mt h ef u s i o ne x p e r i m e n tw i t h 2 - c e l l e m b r y o s ，i no r d e rt oo b t a i nt h em o s ts u i t a b l ee l e c t r i c i t yf u s i o np a r a m e t e rt op r o d u c e t e t r a p l o i de m b r y oa f t e re l e c t r i c i t yf u s i o n ，t h e ne s t a b l i s ht h em o s ts u i t a b l ee l e c t r i c i t y f u s i o nc o n d i t i o nt o p r o d u c e a r t i f i c i a l t e t r a p l o i dp a r t h e n o g e n e t i ce m b r y ow i t h 旦堕大学硕+ 学位论文 a b s t r a c t h e t e r o z y g o u sd i p l o i dk a r y o t y p e r e s u l t s ：( 1 ) t h ee l e c t r i cr a t eo fag r o u pa n db g r o u p i sh i g h e s t ，w a sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t ( 6 8 1 8 v s6 6 3 0 ，p 0 0 5 ) ( 2 ) t h ee l e c t r i c r a t eo fc g r o u pa n ddg r o u pi sl o w e rt h a no t h e rt w og r o u p s ，a c h i e v e s4 7 5 7 ，4 9 4 7 ， r e s p e c t i v e l y ( 3 ) t h er a t eo fb l a s t u l ao fag r o u pa n dbw a sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t ( 4 5 4 5 v s4 4 5 7 ，p o 0 5 ) t h ea b o v er e s u l ti n d i c a t e dt h em o s ts u i t a b l ee l e c t r i c i t v f u s i o nc o n d i t i o n i st h a tp u l s ev o l t a g ei s6 0 0 v c m ，t h ep u l s ew i d t hf o r 5 0 比s ，i ss e p a r a t e d i s ，w h e np r o d u c et e t r a p l o i de m b r y ow i t hh e t e r o z y g o u sd i p l o i dk a r y o t y p e e x p e r i m e n t st h r e e ：t h ep r o d u c t i o no fa r t i f i c i a l h e t e r o z y g o u st e t r a p l o i d p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o a n dc o m p a r e dw i t h h e t e r o z y g o u sd i p l o i dk a r y o t y p e p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y oi nv i t r og r o w t h t h i se x p e r i m e n tp r o d u c e sa r t i f i c i a lt e t r a p l o i d p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o ，u s i n gab e s ta c t i v a t i o nm e t h o dt oo b t a i nh e t e r o z y g o u sd i p l o i d k a r y o t y p e p a r t h e n o g e n e t i c e m b r y o a n d h e t e r o z y g o u sd i p l o i d k a r y o t y p e p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y op r o d u c e db ye l e c t r i c i t yf u s i o n ，t h e ni nv i t r og r o w t ht ob l a s t u l a ， c o m p a r e dw i t ht h er a t eo fh e t e r o z y g o u sd i p l o i dk a r y o t y p ep a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o f o rt h ep u r p o s eo ff u r t h e rs t u d y , s u c ha st h ee a r l ye m b r y og r o w t hi n i t i a lm e c h a n i s m ， e n h a n c i n gs u c c e s s f u lr a t i oo fs o m a t i ce e l ln u c l e u st r a n s p l a n ta n de n h a n c i n gt h er a t eo f p a r t h e n o g e n e t i cb l a s t o c y s t ，a n ds oo n r e s u l t s ：( 1 ) t h eo o c y t ea c t i v a t e db y7 e t h y l a l c o h o lu n i t e2 m m o l i6 - d m a p + 5 9 m l c b ，a f t e rt h ea c t i v a t i o n ，i nv i t r og r o w t h ，a n d a f t e r2 4 ht os e l e c t7 9h e t e r o z y g o u sd i p l o i dp a r t h e n o g e n e t i ce m b r y ot og r o w , t h e nw e f o u n d3 0g r o w t ht ot h ep o u c he m b r y o ，i t se m b r y og r o w t hr a t ea r e3 7 9 ( 3 0 7 9 ) ( 2 ) a r t i f i c i a l h e t e r o z y g o u st e t r a p l o i d p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o aa r e m a d ew i t h h e t e r o z y g o u sd i p l o i dk a r y o t y p ep a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o s ，w h i c hw e r ea c t i v a t e db yt h e s a m em e t h o da n d7 9h e t e r o z y g o u sd i p l o i dw e r es e l e c t e d ，i nt h ec o n d i t i o no f e l e c t r i c i t y f u s i o np a r a m e t e r ：6 0 0 w c m ，5 0 比s ，t ob es e p a r a t e dt h el s ，a t l a s t ，4 4 h e t e r o z y g o u s d i p l o i dg r o wt ob l a s t o c y s t ，t h er a t eo fm o r u l aa n db l a s t o c y s ta r e5 5 7 ( 3 0 7 9 ) c o n c l u s i o n s ：t h ep r o d u c t i o no fa r t i f i c i a lh e t e r o z y g o u st e t r a p l o i dp a r t h e n o g e n e t i c e m b r y ow i t hh e t e r o z y g o u sd i p l o i dk a r y o t y p ep a r t h e n o g e n e t i ce m b r y oi nm o s ts u i t a b l e e l e c t r i c i t yf u s i o nc o n d i t i o no f6 0 0 v c mt h ep u l s ev o l t a g e ，5 毗st h ep u l s ew i d t h ，i s s e p a r a t e dl s ，c o u l dg r o wt ob l a s t o c y s t ，w h o s er a t ei sh i g h e ro b v i o u s l yt h a nt h ed i p l o i d p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o ( 5 5 7 v s3 7 9 ，p 0 0 5 ) t h i se x p l a i n ss i n g l eo o c y t ec o u l d b ea b l et oo v e r c o m e2 - c e l l sh i n d e ra n d i m p r o v et h er a t eo fb l a s t o c y s t ，w i t hs i t u a t i o no f c h r o m a t i nm a t e r i a li nt h eq u a l i t yd o u b l e sa n dt h ec h r o m a t i n h e t e r o z y g o s i t y k e yw o r d s ：m o u s e ，o o c y t e , p a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o n ，e l e c t r i cf u s i o n ，t e t r a p l o i d e m b r y o s i i i 独创性声明 学位论文版权使用授权书 年月止) 。 学位论文作者签名：导师签名 签字日期：年月日签字日期： 欠附 年月 i t 丝 蚣 盟 必 蚴 日 经 巡l 月 成一 盈竖 生一 噬虹 年 迪 盖年 避 避擅 型 篓珊 盥 醴监锢 剑 龃趱婵 一 差 一 篓 型 惹 一一一一一 一一一一一 一一一 一一一一一 一一一一一 两南大学硕十学位论文文献综述 第一部分文献综述 第一章卯母细胞孤雌激活研究进展 1 小鼠卯母细胞孤雌激活与孤雌胚发育 孤雌生殖一词最早是由o w e n 于1 8 4 9 年提出，指在没有精子参与的情况下，卵细胞能发 育为一个胚胎的过程。孤雌生殖现象在无脊椎动物和低等脊椎动物中较为常见，但哺乳动物 自然状态下则未见有孤雌生殖现象。因此，在哺乳动物中主要应用孤雌生殖技术使其哺乳动 物的卵母细胞在体外激活并发育至囊胚。孤雌生殖技术通过人工刺激模拟受精过程，提高胞 质内钙离子浓度，从而使卵母细胞在无需精子条件下被激活。可用于间接评估卵母细胞的质 量、分析早期胚胎发育中父系母系配子相互作用、研究胚胎发育初始机制。同时成熟卵母细 胞的体外激活也是通过核移植进行动物克隆的必要条件【2 l o 1 1 孤雌激活在核移植中的重要作用 卵母细胞激活是哺乳动物生殖过程中的重要生理现象，这是因为卵母细胞只有激活后才 能完成成熟分裂，并由此向有丝分裂过渡，开始新的个体发生。对哺乳动物卵母细胞孤雌激 活的研究将加深对胚胎发生、核移植等许多重大理论问题的认识。当前，动物克隆的总效率 很低，仅为1 一6 ，很可能与受体卵母细胞朱被充分激活有关【3 1 。因而，卵母细胞孤雌激活 和孤雌发育的研究对于提高细胞核移植率、胚胎体外生产率均具有重要的意义和价值。 1 2 卯母细胞激活的概念及机制 孤雌激活是动物克隆技术中的一个重要环节，其成功与否在某种程度上决定了动物克隆 能否获得成功。成熟的卵母细胞已经储备了充足的蛋白质、细胞器、r n a 、d n a 和能量， 并且其中期纺锤体始终处于聚合解聚的动态平衡之中，其他许多代谢过程也都十分旺盛，随 时为进一步的发育做好准备。受精时，精子使休眠的卵母细胞复活，启动一系列的生化事件 的发生、代谢的变化和减数分裂的完成，最终导致细胞分裂。这种过程被称为卵母细胞的激 活。 然而，在没有精子的作用下，体内的卵母细胞也可能由于其他的因素越过m i i 期阻滞， 发生卵裂并继续发育。这种现象称为孤雌发育。如果孤雌发育能产生个体则称为孤雌生殖。 孤雌生殖( p a r t h e n o g e n e s i s ) 是指在没有雄性配子的任何作用，由雌性配子产生的胚胎，不论其 是否发育成个体，均称为孤雌生殖【4 1 。自然界中，孤雌生殖是一种繁殖现象，在爬行类动物、 鱼类动物、鸟类动物也存在着一定的孤雌生殖现象。两栖类动物的卵子能够为实验激活、卵 裂，并且有少数可以发育成个体1 5 l 。卵母细胞激活是哺乳动物生殖过程中的重要生理现象， 1 两南大学硕十学位论文文献综述 ) 因卵母细胞只有激活后才能完成成熟分裂，并由此向有丝分裂过渡，开始新的个体发生。无 论是正常受精还是克隆，卵母细胞均要发生激活。对哺乳动物卵母细胞孤雌激活的研究将加 深对胚胎发生、核移植等许多重大理论问题的认识。 卵母细胞激活过程中会出现一系列的生理生化变化。其中c a 2 + 的变化在卵母细胞激活中 起着至关重要的作用。哺乳动物受精时，精子激活卵子引起卵子细胞内发生持续数小时的反 复性的短暂的c a 2 + 升高，这就是c a 2 + 振荡( c a “o s c i l l a t i o n ) 。卵子胞质c a 2 + 升高可使m p f 和c f s 失活或消失，从而启动成熟分裂器，促使m 期卵继续第二次成熟分裂 6 1 。通常c a 2 + 振荡是在精卵相互作用后的几分钟到十几分钟之内发生的。第一次c a 2 + 升高一般可持续2 m i n 多的时间，第二次和第三次c a 2 + 升高也会持续较长时间，而以后的每次c a 2 + 升高持续时间大 约为l m i n 左右。第一次c a 2 + 升高的幅度明显高于后米的c a 2 + 升高的幅度。这些多次重复的 c a 2 + 升高的间隔在每个卵子基本衡定，但不同动物的间隔不同，最短的为l m i n ，最长的可达 1 h 。卵母细胞受精或人工激活后，细胞内c a 2 + 浓度迅速增加，使c s f 的活性消失，c y c l i n b 被降解，从而引起m p f 的活性降低或消失，细胞离开m 期，完成减数分裂并进行卵裂。邓 满齐等【7 j 发现，抑制卵内游离c a 2 + 浓度的升高则抑制了卵母细胞激活的一系列反应，c a 2 + 浓 度的升高是卵母细胞激活的重要诱导信号，但并非诱导卵母细胞激活一定需要c a 2 + 浓度的脉 冲升高。因此，受精过程的第一次c 2 + 升高始于精卵结合处，经过3 5 次再次升高后，转变 为整个卵子同步发生的c a 2 + 升高变化。这是哺乳动物卵子受精c a 2 + 振荡的特点。 在卵母细胞激活过程中，p l c 水解二磷酸磷脂酰肌醇( p i p 2 ) ，生成三磷酸肌醇( i p 3 ) 和二 酰基甘油( d a g ) 。i p 3 作为细胞内第二信使，作用于钙库中对i p 3 敏感的特异受体，结合量达 到一定阀值时开放钙通道使钙库内的c a 2 + 释放至胞质中。钙库释放的c a 2 + 量与i p 3 受体饱和 度成正比，这一反应称为三磷酸肌醇诱导钙释放( i i c r ) 。同时，c a 2 + 义作用于钙库中另一类对 l p 3 不敏感的受体，达到一定阐值时开放其管辖的钙通道，使钙库中c a 2 + 释放至胞质中，这一 反应称为钙诱导钙释放( c i c r ) 。此外，细胞外c a 2 + 与胞质c a 2 + 以及钙库c a 2 + 可进行交换，钙 库和质膜上的钙泵不断维持细胞内外c a 2 + 的平衡【m 。两种钙释放机制协调作用导致胞质c a ：+ 在受到刺激时出现脉冲升高。c a 2 + 脉冲升高的频率与刺激的性质和强度相关，精子与卵子结 合越多，c a 2 + 脉冲升高的频率越高。再者，卵母细胞成熟和受精均涉及到多种蛋白质磷酸化 状态的改变。6 - d m a p 对卵母细胞的激活作用主要是维持p 3 4 c d c 2 的磷酸化和抑制c y c l i n b 的 磷酸化使m p f 活性下降。同时还可以抑制纺锤体形成时微管蛋白的磷酸化进一步抑制极体的 排出。但6 - d m a p 单独使用对卵母细胞的激活作用较弱，一般要与适度的可以引起c a 2 + 波动 的其他激活因子协同作用才能使卵母细胞达到充分激活。 模拟精子受精的人工刺激同样能够激活卵母细胞。受精导致c a 2 + 浓度出现脉冲式变化， 而人工激活常是诱导一次性c a 2 + 浓度升高的刺激，其对卵母细胞激活的作用是类似的，即仍 然是使胞质内c a 2 + 浓度水平升高1 9 1 。 2 两南大学硕+ 学位论文文献综述 2 卯母细胞孤雌激活的方法 卵母细胞孤雌激活方法可以分为物理激活、化学激活。物理激活包括机械刺激、温度刺 激以及电刺激处理；化学激活包括乙醇激活、酶刺激、渗透压处理、离子载体处理、麻醉剂 处理、蛋白质合成抑制剂以及蛋白磷酸化抑制剂处理等。 2 1 物理激活 物理激活方法中，机械刺激和温度刺激，因其操作繁琐，稳定性和重复性差，且孤雌激 活率偏低，较少被人们采用。相对而言，电刺激激活方法因简便易行、稳定性、重复性较好， 且集激活和融合为一体，而被广泛应用。电刺激的原理是卵母细胞在短暂高压直流电脉冲的 作用下，膜的磷酸二酯双分子结构的稳定性发生改变，细胞膜上形成很多瞬时的小孔，使细 胞内外介质中c e + 进入细胞，并使胞质内c a 2 + 浓度升高，从而弓懒卵母细胞的激活。邹贤刚 等【1 0 】用电脉冲活化兔卵，使8 9 5 的卵发育到8 。1 6 细胞期，2 6 6 达到囊胚阶段。卵母细胞 受电刺激时，细胞膜形成许多恢复的微孔，c a 2 + 可通过微孔进入胞质中，使胞内c a 2 + 脉冲升 高，激活卵母细胞，电脉冲诱导的c a 2 + 浓度升高主要是外源c a 2 + 造成的，c a 2 + 升高可使卵母 细胞激活。研究表明，随着电激活次数的增加，卵母细胞活化率亦增加，但激活次数过多， 囊胚率反而下降【1 1 1 。 2 2 乙醇激活 乙醇是发现较早的一种化学激活剂，对卵母细胞的激活主要是通过水解细胞膜上4 ，5 - 二磷酸磷醋酞肌醇产生1 ，4 ，5 一三磷酸肌醇，从而诱发细胞内源钙释放到细胞质，提高了 胞内的钙离子浓度，进而胞内c a 2 + 浓度升高引起卵子激活。乙醇对卵母细胞的激活主要是引 起细胞膜i p 3 的形成，通过i p 3 受体介导c a 2 + 库释放c a 2 + 。谭景和掣1 2 1 发现，用酒精活化的 卵母细胞时，于培养液中添加5 0 i u 青霉素，可使排卵6 h 的小鼠卵母细胞激活率达9 7 0 。 哺乳动物m i i 期卵母细胞在含有7 8 乙醇的培养液中，处理5 7 m i n 可激活卵母细胞使其 形成原核，甚至可以发育到囊胚。但是乙醇激活经固定染色后观察，大多数形成一个原核， 大部分已排出第二极体( p b 2 ) ，形成单倍体胚胎，且激活率有限，所以通常与其它方法联合 使用，以期获得较高的激活率和二倍体胚胎。 2 3 钙离子载体激活 钙离子载体a 2 3 1 8 7 ( c a l c i u mi o n o p h o r ea 2 3 1 8 7 ，c a a ) 可以有效的促进小鼠激活【1 3 1 ，如 果预先用钙离子鳌合剂处理，就不能引起卵母细胞激活，说明卵母细胞的激活是由钙离子介 导的。研究还表明直接注射c a 2 + 或应用钙离子载体a 2 3 1 8 7 刺激均能诱发哺乳动物卵母细胞 孤雌激活、第二极体的排出和原核形成【1 4 】。s u s k o p a l l r i s h 等认为钙离子载体能诱发起始的c a 2 + 峰，但没有发生受精时出现的c a 2 + 振荡，这瞬间的c a 2 + 升高可引起m p f 暂时的失活，且单 3 两南大学硕十学何论文文献综述 一使用c a a 进行激活处理会导致卵母细胞绝大部分阻止在中期，同时有两个极体，所以它通 常配合蛋白质磷酸化抑制剂( 6 d m a p ) 或蛋白质合成抑制剂( 如c h x ) 才可以取得理想的 激活效果【1 5 1 。 2 4 二价阳离子 用氯化锶( s r c l 2 ) 处理卵母细胞，s r 2 + 可以进入钙库置换c a 2 + ，释放出c a 2 + 使胞质c a 2 + 升高。从而引发一系列依赖c a 2 + 的生物反应，对卵起激活作用。李光鹏等【1 8 】用s r c l 2 对小鼠 卵母细胞进行化学激活激活率为8 2 ；杨红等【”1 用l o m m o l m l s r c l 2 ：处理卵母细胞9 h 获得 9 1 o 的激活率，而囊胚的发育率高达5 3 2 2 。 2 5 蛋白质合成 i ：p s u 齐l j 蛋白质合成抑制剂如嘌呤霉素和放线菌酮( c y c l o h e x i m i d e ，c h x ) 等引起的卵母细胞激活不 是通过c a 2 + 浓度波动起作用，而是直接抑制m p f 和c s f 等有关的新蛋白的合成，使卵母细 胞从m i i 期休止状态解脱出来。c i - i x 主要抑制c y c l i n b 的合成，从而抑制了卵母细胞维持在 m i i 期所需的m p f 合成。c h x 不抑制蛋白质的磷酸化，故不影响构成纺锤体的微管蛋白的 活性，不影响第二极体的排出【1 6 1 7 1 。 2 6 蛋白质磷酸化抑制剂 6 - d m a p 是蛋白质磷酸化抑制剂，它能阻止蛋白质磷酸化，抑制m p f 和c s f 的活性， 同时抑制第二极体排放，保证孤雌激活偶数目细胞的染色体为二倍体。6 - d m a p 还诱发第二 次成熟分裂纺锤体分解，使卵母细胞只有双倍的原核而诱导其直接进入分裂间期。6 - d m a p 单独使用对卵母细胞的激活作用较弱，一般要与可以引起c a 2 + 波动的其他激活因子( 如乙醇， c a a ，i o n 或电刺激等) 协同作用才可以使卵母细胞达到充分激活【1 8 1 。舒益民等用6 - d m a p 激活人卵母细胞时，只获得了1 1 5 ，当与钙离子载体联合使用时，激活率明显升高至 5 8 7 【1 9 1 。 3 孤雌胚的核型 受精时由于雄性基因组的参与，与雌性基因组共同组成正常的二倍体合子。人工激活后 的继续减数分裂则形成多种核型。根据试验结果，孤雌胚形成的核型有如下五种类型删。一 是激活卵排出第二极体，发育成一个单倍体原核，称为均质单倍体( u n i f o r mh a p l o i d ) 。二是激 活卵速即分裂( i i i l m e d i a t ec l e a v a g e ) 成两个均等的卵裂球，一含雌原核，一含第二极体核，构 成嵌合单倍体( m o s a i ch a p l o i d ) 。三是在完成第二次成熟分裂时第二极体未排出，出现异常的 延迟分裂( d e l a y e dc l e a v a g e ) ，同样构成嵌合单倍体。四是激活卵的第二极体未排出，由两个 混合的单倍体原核组成一个二倍体核，称为杂合二倍体( h e t e r o z y g o u sd i p l o i d ) 。五是激活卵的 第二极体排出，其雌原核加倍形成纯合二倍体( h o m o z y g o u sd i p l o i d ) 。 4 两南大学硕十学位论文 文献综述 不同激活方法所形成的核型有差异。激活处理后3 4 小时观察，乙醇激活的卵大部分排 出第二极体，形成单倍体胚。电激活卵则很少排出第二极体，因此以形成二倍体胚为主。 4 孤雌胚的发育 孤雌活化卵在一定的培养条件下可以开始卵裂并发育。刘红林等【2 1 1 用乙醇激活小鼠卵， 2 4 h 卵裂率为8 7 1 ，7 2 h 桑堪胚率为3 9 ，9 6 h 囊胚率为3 4 4 ，将1 7 枚孤雌囊胚移入3 只受体，4 d 后从子宫同收到1 5 枚胚胎，其中1 1 枚为孵出囊胚。o z i l 2 2 1 将激活后发育到4 细 胞期的兔孤雌胚移植入受体母兔输卵管，着床率为3 0 3 ，发育到1 l d 有6 6 存活。l o i 2 3 1 等将在中间受体内发育良好的绵羊孤雌囊胚移入受体绵羊中，妊娠2 3 d 孤雌胎儿与正常受精 得到的胎儿没有明显区别，但2 6 d 的孤雌胎儿仍与2 1 d 的大小相似。说明孤雌胎儿可能在妊 娠的第2 5 d 或2 6 d 时死亡。王新庄等【2 4 】研究牛卵母细胞激活及孤雌发育，激活率、卵裂率及 囊胚发育率分别为8 6 0 、8 6 5 和4 8 9 。 不同类型孤雌胚发育能力亦不相同，二倍体孤雌胚的生活力超过均质单倍体和嵌合单倍 体。孤雌胚虽然可完成着床前的早期发育而形成形态正常的囊胚，体外条件下少数二倍体孤 雌胚能发育至前羊膜腔甚至圆筒期，但是孤雌胚附植后发育到一定阶段便发生死亡，未能发 育到期。s u r a n i 等将激活的小鼠卵移入受体小鼠后可以着床并继续发育，但其发育最长未能 超过1 1 天【2 5 1 。 第二章细胞电融合技术国内外研究进展 1 细胞电融合技术国内外研究动态 细胞融合是2 0 世纪6 0 年代发展起米的一项细胞工程技术。细胞融合又称体细胞杂交 ( s o m a t i ch y b r i d i z a t i o n ) ，是指将不同来源的原生质体( 除去细胞壁的细胞) 相融合，并且使 之分化再生，形成新物种或者新品种的技术。细胞融合的研究也是始于对自发的细胞融合现 象的研究。1 9 5 7 年，冈田善雄首次发现仙台病毒h v j ( h e m m a g g l u t i n a t i n gv i r u so f j a p a n ，又 称日本凝血性病毒) 。此病毒可以引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象，开创了以病毒 为诱导物的先河，为细胞融合技术的发展奠定了基础【2 6 1 。 但是，随着研究的深入，病毒对细胞的毒性伤害大等缺点逐渐的显现出来，已经不适合 细胞融合技术的进一步发展。1 9 7 4 年，华裔加拿大籍科学家高国楠利用聚乙二醇( p e g ) 促 使植物原生质体的融合并且产生杂交瘤细胞【2 7 l 。1 9 7 5 年，p o n t e c o r v o 等发表了p e g 能够帮 助哺乳类动物细胞的融合【2 8 1 。1 9 7 6 年，d a v i d s o nr l 证明了这个结论，并且证明了p e g 的浓 度对哺乳动物细胞杂交效率有明显的影响【2 9 1 。因为p e g 具有简单、快速、高效等优点，在 1 9 7 5 年之后，化学助融的细胞融合方法逐渐代替了病毒诱导方法。 化学助融方法也具有较大的局限性，特别是p e g 诱导细胞融合过程不能在显微镜下观 察，很大程度上限制了化学助融方法的使用。1 9 7 9 年，s e n d am 【3 0 】首先应用电脉冲，通过微 5 两南大学硕十学何论文文献综述 电极在显微镜下使植物细胞融合，奠定了电融合技术的基础。1 9 8 2 年，n e u m a n n 3 l 】首次实现 了细胞电穿孔转移基因。经过2 0 多年的改善和发展，电融合技术以其无毒，融合率高，对细 胞损伤小等优点，在各个研究领域中都得到了更加广泛的应用。1 9 8 8 年，张闻迪等p 2 】首次应 用激光诱导细胞融合技术对泥鳅受精卵进行融合实验，融合后的胚胎发育正常，并且植入前 发育和胚胎后期的体内发育情况一致，得到了发育到期的幼鱼。由于当时融合率只有4 0 左 右，且仪器设备比较昂贵、操作复杂，因此没有得到更广泛的应用。电融合实验过程可以在 显微镜下观察，并且可以和核移植( n u c l e a r t r a n s f e r ，n t ) 技术相结合运用，因此在胚胎生 物学，发育生物学等基础学科研究中起到重要的作用。 目前，病毒诱导细胞融合技术只是在某些特定的领域范围内使用；化学物质诱导细胞融 合的技术主要是应用在植物原生质体融合研究中：而在胚胎生物学，发育生物学等基础学科 研究中，在对核质相互作用，克隆动物发育机理等问题的研究中，电融合技术已经得到了广 泛的应用。 2 电融合技术的机制 电融合的主要作用原理是通过电脉冲在细胞膜上产生电穿孔，从而使两个或者多个细胞 融合成为一个更大的细胞。两个细胞在融合前需要紧密接触。因为细胞表面都有一些负电荷 存在，很自然要产生相互排斥的力，必须提供额外的外力使他们相接触。目前相关的报道有 采用p e g ，离心，真空压力等方法。双向电场方法可以诱导细胞膜内部的粒子电荷分开，形 成偶极子。偶极子的形成有两种作用：( 1 ) 细胞向场强高的区域移动；( 2 ) 当细胞紧密接触 的时候，它们会自发的相互排列成“念珠状”。随着偶极子的形成，细胞质膜表面的电荷分布 ； 发生理化变化，质膜瞬间破裂，在相邻的细胞之间，这种瞬间形成的小孔会互相连接形成细 胞质桥，进而开始质膜的连接，直到完