（细胞生物学专业论文）天然胸腺肽α1的纯化策略研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 tn 。是一种具有多种生物学活性的生物反应调节因子，具有抗病毒、杀伤肿 瘤细胞和增强机体免疫等功能，已在临床治疗慢性病毒性肝炎、癌症等疾病中得 到了广泛应用，临床价值极高。其制备方法主要有三种：组织提取、人工合成与 基因重组。人工合成的ta1 氨基酸序列与天然tol 的完全一致，但其生产成本 昂贵，且会造成环境污染，近年来，国外进口人工合成的t a1 售价高达9 0 0 元 1 6 m g ，目前有所降低，很多患者没有经济能力使用此种to1 。基因重组的方法 尚很难实现直接表达，多采用构建tn l 多串体基因，实现ta 1 与其他蛋白( 如 硫氧还蛋白、核糖体蛋白等) 的融合表达。为了得到t nl 的单体，再使用化学 裂解的方法，如用溴化氢、羟胺裂解，而裂解剂都有较强的毒性，如果大规模生 产，会造成环境污染、操作人员的损伤以及有害化台物残留等的不利影响。基因 重组t al 目前只处于临床试验阶段，还没有进入临床应用。组织提取天然t al 较前两种方法存在一定的优势，如售价低，生产过程无环境污染，更重要的是具 有天然活性，对机体相容性好，临床应用安全。但存在的问题是，目前国内市售 的多是从猪、小牛胸腺中提取的胸腺肽粗品，内含多种混合成分和致敏性蛋白， tal 的含量极低( 一般小于o 6 1 ) ，分离纯化困难。本文旨在研究利用组织 提取的方法获得纯度较高的ta 。本研究分为两个方案，方案一为：使用市售 组织提取的胸腺肽粗品，利用h p l c 检测其中t nl 的含量( 约为0 3 1 ) ，然后 利用阴离子交换层析的方法分离纯化，经h p l c 检测t al 含量为7 左右，提 高了2 3 倍多。方案二为：新生小牛胸腺，用提取小分子量多肽的低p h 制各方 法提取t al ，经h p l c 检测，tnl 纯度达到了约6 7 ，大大高于市售胸腺肽粗 品中t ol 的含量；然后根据ta1 的理化性质( 等电点为4 2 ，分子量为3 1 0 8 k d ) ， 采用等电点沉淀和阴离子交换以及二者相结合的方法分离纯化t ol ，ta1 的纯 度分别达到：1 2 9 6 、9 6 1 和1 4 4 6 。以上两种方案均达到了较大程度提高 组织提取t a l 纯度的目的，方案二较方案一得到的t a1 纯度要高出很多，且操 作工艺简便可行，重复性好，具有大规模工业化运用前景。 关键词：t ni ，制备，组织提取，纯度，分离纯化 塑垩奎兰堡圭兰鱼堡兰 a b s t r a c t t h y m o s i n ol ( to1 ) i sab i o l o g i c a lr e s p o n s em o d i f i e rw i t hp l e n t yo fb i o l o g i c a l f u n c t i o n s ，s u c ha sa n t i v i r a la c t i o n 。a n di tc a nk i l lt u m o re e l la n de n h a n c ei m m u n i t y a n ds oo n i ti so fg r e a tv a l u et ot h ec l i n i c a la p p l i c a t i o na n dh a sb e e na p p l i e do nt h e t h e r a p yo f c h r o n i ch e p a t i t i sa n dc a n c e ra n ds oo n t h e r ea r et h r e ep r e p a r a t i o nm e t h o d s o fi t ：d i s t i l l i n gf r o ma n i m a lt i s s u e s ，s y n t h e s i z ea n dg e n er e c o m b i n a t i o n t h ea m i n o s e q u e n c eo fs y n t h e s i z e da n dc r u d et 。1 i si d e n t i c a l ，b u tt h ep r o d u c t i o nc o s to f s y n t h e s i z e dt o l i sm u c hh i g h e ra n dt h ep r o c e s sw i l lb r i n gg r e a tp o l l u t i o nt ot h e e n v i r o n m e n t n o wt h ep r i c eo fi m p o rs y n t h e s i z e dt o 1 i sa sh i g ha s9 0 0 r m b 1 6 m g ， s oal o to fp a t i e n t sc a l ln o ta f f o r dt h eh i g hm e d i c a lf e e to1i sv e r yd i f f i c u l tt ob e e x p r e s s e dd i r e c t l yb e c a u s et h ep o l y p e p f d eo fi t i sv e r ys h o r t s oi ti so f t e nb e e n e x p r e s s e dt o g e t h e rw i t ho t h e rp r o t e i n s ，s u c ha sr i b o s o m a lp r o t e i na n d s oo n t h e nt 1i si s o l a t e df r o mt h ef u s i o np r o t e i nb yc n b ro rh y d r o x y l a m i n e b u tt h ec h e m i c a l m e d i c a m e n t sa r eo f t e nv i r u l e n t s ot h ep r o d u c t i o nw i l lp r i c ku pt h ep o l l u t i o no ft h e e n v i r o n m e n ta n db r i n gd a m a g et oo p e r a t o r s g e n er e c o m b i n a t i o nto1 i si n e x p e r i m e n t a t i o nn o w t h ec r u d et a 1 h a v ea d v a n t a g e so v e rt h et w oo t h e r s t h ep r i c e i sv e r yl o wa n dt h ep r o d u c t i o np r o c e s si ss a f et ot h ee n v i r o n m e n t m o s to fa l l ，i th a s c r u d ea c t i v a t i o nm a di ss e c u r et ot h ep a t i e n t s b u tt h ep r o b l e mi st h ec o n t e n to f t o li s v e r yl o w ( o f t e nb e l o wo 6 - 1 ) i no r d e rt oo b t a i nh i g hp e r c e n to ft 。1 w em a k e t h i s s t u d y t h er e s e a r c hi n c l u d e st w os c h e m e s t h ef i r s to n ei s ，w ep u r c h a s et h ec r u d et q l a n dt h eh p l ca n a l y s i ss h o w st h ec o n t e n to f to 1 i sa b o u to 31 t h e ni ti sp u r i f i e d b ya n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dt h ec o n t e n th a si n c r e a s e dt oa b o u t7 t h e s e c o n do n ei s ，w ep u r c h a s en e wb o mc a l ft h y m u sa n dd i s t i l lt a 1b yl o wp h p r e p a r a t i o nm e t h o d t h ep u r i t yo ft o 1r e a c h e sa s1 l i g ha s6 7 b yh p l c t h e ni ti s p u r i f i e db yi s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o na n da n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yr e s p e c t i v e l y , a n dt h ep u r i t yi s1 2 9 6 a n d9 6 1 t h er e s u l ti s1 4 4 6 b yt h em e t h o do f i s o e l e c t r i c p r e c i p i t a t i o ni n t e g r a t ew i t ha n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y i nc o n c l u s i o n ，b o t ht h e t w os c h e m e sa c h i e v et h ep u r p o s eo fh e i g h t e n i n gt h ec o n t e n to ft ol ，a n dt h es e c o n d o n ei sm u c hb e t t e rt h a nt h ef i r s to n e t h eo p e r a t i o nt e c h n i c so ft h es e c o n do n ei s 2 浙江大学硕士学位论文 s i m p l ea n df e a s i b l e ，a n di tp o s s e s s e st h ef o r e g r o u n dt ob ea p p l i e dt oi n d u s t r i a l i z a t i o n i nl a r g es c a l e k e yw o r d s ：t h y m o s i n 。1 ，p r e p a r a t i o n ，d i s t i l l ，p u r i t y , i s o l a t i o na n d p u f f f i c a t i o n 3 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 tal 的制备方法及其临床研究进展 ta1 是一种具有多种生物学功能的生物反应调节因子( b i o l o g i c a lr e s p o n s e m o d i f i e r , b r m ) ，近年来已越来越多的用在各种传染性疾病和癌症等的治疗上。 本文对t al 的生物学功能、ta - 的制备方法及其优缺点、tnl 在慢性病毒性肝 炎和癌症等各种疾病治疗中的功能与机理研究进展进行了概述。 天然t nl 是由2 8 个氨基酸组成的酸性多肽，分子量3 1 0 8 k d ，等电点4 2 ， 唯一的修饰是n 端乙酰化，无二硫键与糖基化，其氨基酸序列为：n a c s e r - a s p a l a - a l a - v a l - a s p t h r - s e r - s e r - g l u i l e t h r - t h r - l y s a s p - l e u l y s g l u - l y s - l y s g l u v a l v a l g l u g l u a l a - g l u a s n c o o h ，这一序列在哺乳动物中相当保守，人、 鼠、牛的t a 1 序列完全相同。 1 t f i t 的生物学功能概述 t 。l 是一种具有多种生物学功能的b r m 。它主要作用于t 淋巴细胞( t l y m p h o c y t e ，简称t 细胞) 分化发育的早期和晚期，诱导其成熟，促进其分化【1 2 1 3 1 。 它能通过t 辅助细胞( h e l p e r t c e l l ，t h 细胞) 介导增强同种或自身混合淋巴细胞 反应的功能，能增强t 细胞对抗原和其他刺激的反应并能增加其在各种抗原或致 有丝分裂原激活后产生1 f n 、i l 2 、i l 3 等淋巴因子的分泌和其表面淋巴因子受 体的水平，还具有增强巨噬细胞杀伤肿瘤的能力，6 】；可以促进自然杀伤细胞 ( n a t u r a lk i l l e rc e l l ，n k 细胞) 的增殖和成熟，促进n k 细胞功能的修复，增强其 细胞杀伤作用并促使其分泌各种淋巴因子如i l 2 和1 f n y 7 , g l ；增强细胞因子的 作用，减少药物治疗中细胞毒素的毒一陛1 9 , 1 0 ；增强免疫调制剂在治疗免疫缺陷、 自身免疫疾病和恶性肿瘤中的作用，t o i 配伍其他细胞因子具有抗肿瘤作用“】， 等。 最近的研究还发现，t a1 可以通过调节海马神经元内兴奋性突触的传递进 而影响中枢神经系统的神经生理功能f 1 2 j ；它还可以在没有l p s 的情况下直接激 活肿瘤相关巨噬细胞( t u m o r - a s s o c i a t e dm a c r o p h a g e t a m ) ，把它活化成杀伤肿瘤 的状态 1 3 , 1 4 j ；tdl 配合g m c s f 、i l 一4 和肿瘤坏死因子( t u m o rr l e c r o s i s f a c t o r ，t n f ) 可以促使t a m 分化成树突细胞( d e n d r i t i cc e l l d c ) ，并促进d c 成熟及其功能的 4 浙江大学硕士学位论文 发挥，经研究发现d c 在体外表现出很强的抗肿瘤能力，在过继免疫治疗中可在 很大程度上阻碍肿瘤的生长并延长患者生存期 1 5 , 1 6 , 1 7 1 ；tnl 还具有调节机体的免 疫平衡功能，等。 人体内t al 的含量在十岁以前较高，随后逐年降低，四十岁以后，在胸腺 内区已不能检测到t a1 ，到了老年，tn1 分泌量及其活性都处于很低的水平。 这是因为胸腺有明显的年龄性变化，幼儿期的胸腺较大，此后缓慢退化，而ta l 主要由胸腺上皮细胞分泌。 人体内主要有两套免疫细胞：t 细胞和b 淋巴细胞( 简称b 细胞) 。t 细胞 产生的免疫应答是细胞免疫，其效应形式主要有两种：一是与靶细胞特异性结合， 破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；二是释放淋巴因子，不同的淋巴因子作用不同， 最终使免疫效应扩大和增强。t 细胞还可以调节b 细胞的活性，当b 细胞受到 抗原刺激后，增殖分化为大量浆细胞，浆细胞可合成和分泌抗体( 免疫球蛋白) ， 抗体在血液中循环，通过与抗原结合可中和毒素，抑制细菌或靶细胞代谢，溶解 靶细胞，从而清除相应抗原并促进巨噬细胞吞噬抗原，由b 细胞产生的免疫应 答为体液免疫。胸腺是培育t 细胞并使其分化成熟的重要器官，胸腺不仅会随着 年龄的增长而退化和萎缩，它还是一个易受损害的器官，急性疾病、肿瘤、大剂 量辐照和激素等均可导致其急剧退化，胸腺细胞大量死亡，其分泌t n1 的量减 少并影响t 细胞的分化成熟，进而导致中老年人或患者自身免疫功能低下，致使 机体对各种疾病、肿瘤发生等抵抗力和抗感染能力下降，这就需要及时补充外源 性的tn 。，以提高细胞免疫功能，增进健康和提高人类的平均寿命1 8 】。 2 t 。的制各方法 日前，t al 的制备方法主要有三种。 2 1 组织提取天然t 1 t 。1 最早是g o l d s t e i n 从小牛胸腺素第五组分( t h y m o s i nf r a c t i o n5 ，t f 5 ) 中 分离纯化出来的。t n1 是一种高度保守的活性肽，在各种哺乳动物中结构一致， 分布广泛，存在于哺乳动物各组织器官中，尤其以胸腺中含量最高。 目f i i j 尚未见有国内外利用组织提取方法获得高纯度tnl 的报道。国内市售 的多是从猪、小牛胸腺中提取的胸腺素混合物，名称各异( 胸腺肽、胸腺素、胸 浙江大学硕士学位论文 腺因子等) ，质量、剂型、售价均不一，内含多种混合成分，t nl 的含量极低( 一 般小于l ) ，因此用量大。 胸腺肽粗品即t f 5 中的部分已知成分如下( 个别成分信息不全) ： t f 5 中已知成分分子量( d a )等电点氨基酸数目 to1 3 ，1 0 8 4 22 8 t 。53 ，0 0 0 to7 2 ，2 0 0 t o1 1 to1 2 3 5 p m t 1 2 ，5 0 0 左右 3 5 5 1 0 9 1 1 2 左右 t b4 4 ，9 8 2 5 1 4 3 t b83 9 胸腺五肽6 8 05 多肽1 3l + 泛素8 ，4 5 16 77 4 t p a ( 胸腺多肽a ) 3 ，6 1 0 4 ，0 0 0 3 92 7 t h f ( 胸腺体液因子)3 2 2 05 7 5 93 1 t h y m o p o i e t i n ( 胸腺增生素) 5 5 6 25 5 4 9 t f x ( 胸腺因子x ) 4 ，2 0 0 目前制备天然t nl 的最大困难是它在t f 5 中的含量很低( 约占o 6 一1 ) ， 再加上繁杂的提取工艺，混合成分复杂，性质相近，难以分离和纯化，得率低， 成本高，材料来源也受到很大的限制。ta1 提取工艺有多种，这里介绍g o l d s t e i n 的两种方法，一种方法为：将小牛胸腺匀浆、离- i i , ，上清经丙酮沉淀，2 5 5 0 硫酸铵沉淀，沉淀溶解后用超滤截留分子量1 5 k d 以下的成分，s e p h a d e xg 2 5 脱盐，低压冻干得到t f 5 。再经c m 一纤维素离子交换层柝，s e p h a d e xg 一2 5 脱盐， d e a e - 纤维素离子交换层析，过s e p h a d e xg 7 5 柱，最后用s e p h a d e xg 一1 0 脱盐 即得到t al 。以上过程中tnl 的鉴定通过等电聚焦电泳来完成【1 9 1 。另一种方法 为高压液相色谱法：利用制备型的d e l t a p a kc 1 8 反相柱，由小牛胸腺得到t f 5 浙江大学硕士学位论文 的方法同上，洗脱液a 为0 0 2 m p h 6 8 的乙酸铵，洗脱液b 为乙腈，检测波长 2 8 0 n m ，将冷冻干燥的t f 5 溶于洗脱液a 中上样，每分钟收集一管，用放射免 疫测定法( r a d i o i m m u n o a s s a y , r i a ) 鉴定得到t 。i 2 0 l ，目前应用比较广泛，鉴 于不同的色谱系统，洗脱条件等有所不同。 2 2 人工合成t 1 早在8 0 年代初m e r r i f i e l d 等实验室就己经人工合成了tnl ，目前国外合成的 t 1 已上三期临床试验，用于乙型肝炎病毒( h e p a t i t i sbv i r u s ，h b v ) 和丙型肝 炎病毒( h e p a t i t i scv i r u s ，i - i c v ) 疾病的治疗【9 】。对t al 这样较短的肽类采用固 相合成是目前新兴的研究方向之一，具有较高的应用价值，其基本的工艺路线为： 采用对碱敏感的n4 芴甲氧羰基( f m o c ) 作为a 一氨基的保护基，以 f m o c a s n ( t r t ) w a n gr e s i n 为起点由c 端逐个向n 端延伸得到t a1 的氨基酸树 脂，去除f m o c ，用1 0 m l 醋酸一吡啶( v ：v = i ：1 ) 处理氨基酸树脂使n 端乙酰化， 切割树脂纯化得到tnl 。该过程所需的仪器与设备为手动固相多肽合成仪、 l a b o r o t a 4 0 0 2 w b 旋转蒸发仪、h p l l o o 分析型高效液相色谱仪、g r a d i f r a c 色谱 仪、w a t e r sp r e pl c4 0 0 0s y s t e m 制备型高效液相色谱仪和h i t a c h il 8 5 0 0 型氨基 酸分析仪等【2 ”。人工合成tn 。的氨基酸序列与天然t n1 的完全一致，但其生 产成本昂贵，且会对环境造成很大污染。目前国外进口的人工合成t nl 售价为 9 0 0 元1 6 m g ，很多患者没有经济能力使用此种t a 1 。 2 3 基因重组t l 目前与天然tn1 氨基酸序列完全一致的ta ，单体己在重组大肠杆菌中获得表 达并纯化出来，其基本方法为：先合成设计好酶切位点的四条基因片段，连接各 片段得到含有t o 1 单拷贝的基因并连接到质粒p g e m 一3 z f 中，转化感受态大肠 杆菌d i q 5n 中扩增ta 基因，将t a 1 单拷贝基因依次连接到p g e m 3 z f 质粒中 构建t nl 基因的四串体，克隆入p t h i o h i s a 表达载体中，转化大肠杆菌t o p l 0 株进行表达，收集目的菌体，得到tn 。四串体一融合蛋白，经纯化后用羟胺裂解 ( 裂解位点- a s n g l y 一) 得到t a 】的单体 2 2 t 。 利用基因重组方法获得t a1 存在的问题是：ta l 肽链较短，很难利用基因 7 浙江大学硕十学位论文 工程方法实现直接表达，多采用构建tnl 多串体基因，实现t nl 与其他蛋白( 如 硫氧还蛋白、核糖体蛋白) 的融合表达。为了得到t n1 的单体，再使用化学裂 解的方法，如用溴化氢，羟胺裂解，而裂解剂都有较强的毒性，如果大规模生产， 会造成环境污染、操作人员的损伤以及有害化台物残留等的不利影响。苗红等瞵j 报道的利用基因工程方法制备t al 没有使用化学裂解而是应用凝血酶进行裂解 虽避免了环境污染，但所得到的t a l 与天然t a1 在结构上有一定的差别，n 端 未乙酰化。也有报道在毕赤酵母2 3 3 邮和钝顶螺旋藻【2 5 1 中进行t d1 的基因表达， 但均是与外源蛋白进行的融合表达，没有得到t al 的单体。 2 4 不同方法制备的t q1 比较 不同制备方法得到的tn t 是有一些差别的，人工合成t n l 与天然t n l 的氨 基酸序列完全相同，基因重组t t 2 1 有的在n 端未乙酰化或c 端多了一个同型丝 氨酸内酯或二者兼而有之。天然tn 】c 端的1 4 个氨基酸呈现高度的n 螺旋结构 【2 6 1 ，人工合成t al 的空间结构与天然的有一些差别，详见图1 ，基因重组t nl 的空间结构还未见报道。在临床应用中的毒副作用上，市售天然t f 5 因含有 很多杂蛋白或致敏性蛋白，ta 含量低，在使用中会出现一些不良反应，但整体 耐受性良好。个别可见恶心、发热、头晕、胸闷、无力等症状，少数有荨麻疹、 皮疹等，也有患者服用后偶有嗜睡感，有出现过敏性休克的报道。人工合成ta l 在使用中耐受性良好，超过2 0 0 0 例不同年龄各种疾病的患者得到的临床经验发 现所有适应症的副反应发生率少于1 ，而且副反应都很轻微，主要是注射部位 疼痛，极少情况下有红肿、短暂性肌肉萎缩，多关节痛并伴有水肿和皮疹。二者 在治疗慢性乙肝病人时均可能会出现丙氨酸转移酶( a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s e ， a l t ) 水平有一过性上升到基础值的两倍以上( a l t 波动) 的情况，如无肝衰竭 预兆出现，仍可继续使用，对t a1 有过敏历史或有胸腺肿瘤的患者或器官移植 者均不可使用。基因重组t o1 目前只处于临床试验阶段，还没有进入临床应用 阶段，有关其毒副作用还未见报道。 浙江大学硕士学位论文 f i g1 ：t h es e c o n d a r y c o n f o r m a t i o no fs y n t h e t i c t ol 图l ：人t 台成t 口l 的二级结构1 1 1 ( a ) ：t a l n 端第5 到第8 氨基酸残基之间的t 3 转角结构 ( b ) ：t 。i n 端第1 7 到第2 4 氪基酸残基之问的c t 螺旋结构( a ) 图与( b ) 图之间为人t 合成t n l 整体的二级结构 t 。的临床研究与应用进展 3 1t - 在病毒性肝炎治疗中的作用机制与临床应用研究新 进展 慢性肝炎病毒感染仍是威胁着人类健康的全球性问题。目前，世界范围内受 h b v 感染者接近2 0 亿，约有3 5 亿c h b 患者。我国是h b v 感染的高发地区， 病毒携带者约有1 3 亿，人群中h b s a g 阳性率为1 0 左右，随感染时间的延长， 有些患者会发展成c h b 甚至是肝硬化或h c c 。c h c 患者约有1 7 亿，尽管发病 率相对较低，但其发病率与h c c 的发病率成正相关2 甜。抗病毒治疗的目的是 清除或持续抑制体内的h b v 或h c v ，以改善或减轻肝损害，阻止进展为肝硬化、 肝衰竭或h c c ，并提高患者的生活质量。i f n 和拉米夫定( 1 a m i v u d i n e ) 是目前 公认的治疗c h b 有效的主要抗病毒药物，但二者在治疗中均存在一定的缺点， 浙江大学硕士学位论文 如1 f n a 治疗后复发率较高，有明显的不良反应，在失代偿性肝病患者中应用 有一定的风险，且对许多患者无疗效；拉米夫定则需要长期治疗，耐药性病毒变 异的发生率较高，停药后容易发生a u 反跳甚至发生重症肝炎。而且这些药物 在治疗围生期感染、a l t 水平较低及h b s a g 阴性的c h b 患者时效果不是太好。 i f n 和病毒唑是目前世界认同的c h c 抗病毒疗法的常用药物，但仍有不少问题， 如疗程长、远期治疗效果不是太理想等。 tn 。商品名为日达仙、迈普新、注射用胸腺肽al 等，它作为一种新型的免疫 增强剂，是一种具有多种生物学功能的b r m ，它具有直接的抗病毒作用，同时 可以恢复在抗病毒过程中发挥重要作用的细胞毒t 细胞( c y t o t o x i c t l y m p h o c y t e s ， c t l 细胞) 、t h 细胞和n k 细胞等的功能，既具有明显的免疫促进作用又对机体 无明显的损害作用，一直被视为治疗c h b 和c h c 的首选药物。 3 1 1tal 抗病毒的主要作用机制 tnt 主要作用于t 细胞分化发育的早期和晚期，诱导其成熟，促进其分化。 它可以刺激c d 4 + c d 8 + 双阳性细胞分化为c d 4 + 或c d 8 + 单阳性细胞( 成熟的t 细胞) ，上调i l 2 受体的表达，通过活化c d 4 + 、c d 8 + t 细胞和n k 细胞促进内 源i l 2 、i f n 一和i f n y 的产生。它可以活化病毒特异性t h 细胞并增强针对病 毒蛋白的体液免疫应答，增加能直接抗病毒的2 5 寡腺苷酸合成酶的产生：还 可以刺激t h l 类细胞因子的产生，抑制t h 2 类细胞因子如i l 4 和i l 1 0 的产生， 无论体内还是体外研究都证明在h c v 侵染的早期t h l 类细胞因子有助于清除病 毒并可延迟疾病进展，而t h 2 类细胞因子却降低病毒清除率并可加速疾病恶化 2 9 , 3 0 , 3 1 。t q1 可以促进于细胞分化成c d 4 细胞，经t 1 治疗的患者体内外周 血淋巴细胞( p e r i p h e r a lb l o o dl y m p h o c y t e ，p b l ) h bc d 4 + t 细胞数量增多，t h l t h 2 比例增高，进一步说明t n1 可诱导具有免疫活性c d 4 + t 细胞的产生，c d 4 + t 细胞进而可以增强所有和自身抗原的增殖反应，说明抗h b e c d 4 + t 细胞在效应 子功能的发挥中必不可少。另外，t ni 治疗后肝脏中c d 4 + c d 8 + 比例下降最明 显，这一现象表明：t 1 首先活化c d 4 + t 细胞，然后活化效应细胞如n k 细胞、 自然杀伤t 细胞( n a t u r a lk i l l e rl y m p h o c y t e ，n k t 细胞) 和c t l 细胞，并通过分泌 i f n y 、i l 一2 和t n f 来增强免疫反应1 3 2 , 3 3 。 n k t 细胞在清除病毒过程中发挥着非常重要的作用。在肝脏中，c d 5 6 + 和 浙江大学硕上学位论文 c d 5 7 + n k t 细胞数量随t nl 的治疗呈增加的趋势，t i 治疗结束后这种效应仍 然存在。y o n e k u r ak 剐等曾报道了c d 5 6 + t 细胞在治疗c h c 中的作用机制，研 究表明c d 5 6 + n k t 细胞主要渗入到肝小叶周围，在修复受损的肝细胞和排除病 毒中发挥着重要作用，可以减少病毒载量。 tnl 与其它抗病毒药物联合用药可以在抑制病毒复制中表现出附加或协同效 应，如法昔洛韦( f a m c i c l o v i r ) 通过减少病毒载量可以增强t 细胞抗病毒的反应 性进而增强t al 的抗病毒功能。 3 1 2tol 在病毒性肝炎治疗中的临床应用 3 1 2 1t l 治疗c f i b 的临床应用 s a t o s h i l 3 2 1 等对tnl 单独应用治疗a l t 高于正常水平一倍的c h b 患者做了研 究，给予7 例患者剂量为1 2 o 4 m g ，前2 周每周六次，接下来2 2 周每周两次 共2 4 周的t nl 皮下注射治疗，在治疗结束后4 8 周观察期间，有4 2 9 的患者 a l t 水平恢复正常，2 8 6 的患者产生了完全应答，治疗效果明显。 a r a s ey 1 3 5 1 等对单独应用t l 治疗c h b 进行了研究，结果显示，前2 周每周 六次服用t q1 ( 分高剂量1 6 m g 次与低剂量o 8 r a g 次) 接下来2 2 周改为每周两 次用药共2 4 周的疗程对c h b 的治疗非常有效，治疗后完全应答率为3 7 5 ，检 测血清中h b v - d n a 的水平低于1 0 0 m e q m l ，2 4 个月后a l t 水平升高并恢复到 正常，还发现高低剂量治疗组间的差别并不显著( p = 0 6 0 8 ) 。 另外，i i n os 0 6 1 等还对t q1 治疗c h b 进行了长期疗效与剂量依赖关系的研 究。3 1 6 名h b v - d n a 阳性及a u 水平高于正常值的患者随机接受了o 8 m g 与 1 6 m g 剂量的治疗，疗程2 4 周，7 2 周( 治疗结束后约1 2 个月) 后，1 6 m g 剂量 组中有3 6 4 的患者a l t 水平复常，3 0 的患者可清除h b v - d n a ，2 2 8 的患 者可清除h b e a g 。0 8 m g 剂量组中也得到了类似的效果，且两组副反应发生都非 常轻微。 由此可见，t ql 单用剂量0 8 m g 或1 6 m g ，共2 4 周的疗程可得到较好的抗 h b v 功效。 j i n g i ”1 等对t q1 治疗抗h b e 阳性和h b v - d n a 阳性的c h b 患者与i f n 一 治疗进行了随机对照研究。实验分为三组：a 组2 6 例患者接受t a1 皮下注射， 1 6 m g 次，每周两次；b 组2 6 例患者给予i f n 一5 m u 天，1 5 天后改为每周三次 浙江大学硕士学位论文 共6 个月，随访6 个月；c 组为对照组，3 0 例患者从未接受过t n1 和i f n a 的 治疗，随访1 2 个月。治疗结束后，a 组完全应答率为3 0 8 ，b 组为4 6 7 ( p = o 2 2 4 ) ，随访6 个月后，a 组为4 2 3 ，b 组为2 3 3 ( p = 0 1 2 9 ) ，c 组为 3 3 。1 2 例产生t i 治疗应答的患者中有1 0 例( 8 3 3 ) 治疗结束后h b v - d n a 降至检测下限以下，1 4 例未产生应答的患者中有6 例( 4 2 9 ) 在随访中表现出 延迟应答反应，其h b v - d n a 也降至检测下限以下。b 组中对应百分率分别为 9 ，1 8 ( 5 0 ) 和0 1 2 ( 0 ) 。这说明tol 除了在治疗中，治疗后也能产生很高 的延迟应答率，i f n a 却不能。而且与i f n n 不同的是，t a1 治疗的耐受性良 好，治疗过程中无不良反应产生。 以上结果表明利用t a 1 进行为期6 个月的疗程治疗抗h b e 阳性的c h b 患 者是有效且安全的，它可以抑制h b v 的复制从而清除病毒。 g k k l a u 3 8 1 等对t l 联合法昔洛韦治疗免疫耐受期的9 6 例c h b 患者进行 了研究。第一组的3 2 例患者治疗方案为：法昔洛韦5 0 0 m g 次，每天三次，联合 t al 皮下注射1 6 m g 次，每周两次共2 6 周；第二组的3 2 例患者只用法昔洛韦， 剂量疗程与第一组相同：第三组为对照组，3 2 例患者不接受任何治疗。治疗结 束后随访5 2 周。第4 周，第一组和第二组h b v - d n a 载量从基线水平减少分别 为o 5 0 1 0 9 l o 拷贝m l 和0 5 5 1 0 9 l o 拷9 j m l ( p = 0 1 3 7 ) ，第三组为0 0 3 1 0 9 l o 拷贝m 1 ， 明显低于前两组( p o 0 0 1 ) 。第1 3 周，第一组为0 6 9 1 0 9 1 0 拷贝m l ，显著高于第 二组的o 6 4 1 0 9 l o 拷贝m l ( p = 0 0 4 7 ) 。第2 6 周，第一组为o 9 4 1 0 9 1 0 拷9 q m l ，第 二组为o 7 0 1 0 9 l o 拷贝m l ( p o 0 0 1 ) 。第5 2 周，第一组中有5 例( 占1 5 6 ) 患 者h b e a g 血清转换产生完全应答( 3 例为持续应答，2 例为暂时应答) ，第二组 和第三组中没有患者产生完全应答。在整个治疗过程中有关毒副作用的研究表明 除了三组中均有3 的患者出现头痛，无其他副作用出现。这说明tal 与核苷类 似物联合治疗c h b 可提高免疫耐受期患者的血清转换率，是一种安全而有效的 药物。 另外，t a1 联合i f n d2 b 治疗h b e a g 阴性的c h b 患者，其产生的持续应 答率远远高于拉米夫定联用i f n 一2 b 及单用i f n q2 b 组。治疗7 8 周后t ql 联 用i f n 一2 b 持续应答率为7 4 ，其他两组分别为5 3 3 和4 0 ，治疗结束后的 1 2 个月后三组分别为7 0 - 3 、2 6 6 和2 0 ，1 8 个月后为7 1 4 、2 0 o 和1 0 。 浙江大学硕士学位论文 由此可见，t 1 联合i f n a2 b 治疗c h b 疗效也十分显著 3 9 1 。 总之，tnl 与其它药物联合用药比单用存在明显的优势，且毒副作用发生轻 微，适合临床治疗。 3 1 2 2 t l 治疗c i t c 的临床应用 i f n t 单用或与病毒唑联合使用是目前治疗c h c 常用的方法，但持续应答 率低于4 0 ，对无应答或复发者进行再治疗则无效果。 a n d r e o n e p l 4 0 】等对ta 1 联合i f n 2 b 与单用i f n a2 b 治疗c h c 进行了对 照研究，2 2 例患者皮下注射t 。1 9 0 0 u g m 2 ，2 次周，联合i f n a2 b 3 m u ，3 次 周；对照组的1 9 例患者只服用相同剂量的i f n n2 b ，连续治疗6 个月并随访6 个月。结果显示联合治疗组较对照组表现出明显的治疗功效，其病毒学应答率为 4 1 ，对照组仅为l0 5 ( p = 0 0 3 ) ，研究结果还显示通过增加剂量和或延长疗 程可提高治疗的持续应答率。 a b b a sz 4 1 i 等对to1 联合i f n q 和病毒唑治疗i f n 和病毒唑治疗后无应答 或复发的c h b 患者进行了研究。1 1 例接受过i f n a 和病毒唑治疗的c h c 患者， 其中6 例为无应答，5 例复发，用t l 联合i f n q 和病毒唑再治疗1 2 个月，随 访6 个月。结果显示5 例复发者中有4 例产生了持续应答，6 例无应答者中有1 例在随访中清除了体内的h c v - r n a ，治疗过程中无明显不良反应发生。 以上结果表明tnl 与其他药物联用治疗c h c 有协同作用，对治疗传统疗法 无应答或复发的患者更加有效。这是因为核菅类似物( 如病毒唑) 可通过抑伟4 病 毒复制，而i f n 通过诱导肝细胞表达抗病毒蛋白发挥直接的抗病毒作用，使体内 病毒量明显减少，而t a1 可通过刺激c t l 和n k 细胞活性清除肝细胞内的病毒。 3 2t 1 在治疗h c c 上的作用机制与临床应用 部分c h b 和c h c 患者随感染时间的延长会转变为肝硬化或h c c ，每年约 有小于o 5 的肝炎携带者，7 肝硬化患者转变为h c c ，也就是说每年有超过 5 0 万人口的新增病例。而导致h c c 患者死亡的主要原因是手术后复发，临床研 究发现，h c c 患者手术后免疫功能愈低，恢复愈慢，术后复发时间愈早，复发 率也较高，因此提高或加快免疫功能的恢复有利于降低复发率4 2 1 。 tu1 作为免疫增强剂，除能增强机体的免疫功能外，还具有直接的抗病毒和 浙江大学硕士学位论文 抗肿瘤作用。据s t e f a n i n i 4 3 1 报道tal 联合肝动脉化疗栓塞( t r a n s c a t h e t e rh e p a t i c a r t e r i a lc h e m o e m b o l i z a t i o n ，t a c e ) 治疗h c c ，3 年存活率达5 8 ，而对照组则 为2 0 ，提示t n l 对治疗h c c 有一定疗效。 c h e n gs q 【删等研究了随机对照观察h c c 患者术后t o1 联合t a c e 治疗对预 防h c c 复发的影响。5 7 例h c c 患者随机分为3 组：a 组，手术+ t a c e + t o1 组，1 8 例；b 组，手术+ t a c e 组，2 3 例；c 组，手术切除组不接受其它治疗， 1 6 例。预防性t a c e 治疗方法为s e l d i n g e r 法，术后1 5 个月常规应用，药物和 栓塞剂减半，卡铂1 0 0 m g ，多柔比星4 0 m g ，丝裂霉素1 0 m g ，碘油5 m l ，有复发 患者间隔1 5 个月后重复应用，最多4 次。ta 。治疗方法：术后第一周开始皮下 注射，每周2 次，每次1 6 m g ，连续注射6 个月。a 、b 和c 组一年复发率分别 为8 3 3 、8 7 o 和8 7 5 ( p = o 9 2 6 ) ，中位复发时间分别为7 个月、5 个月和4 个月( p = 0 0 3 9 ) ，中位生存期分别为1 0 个月、7 个月和8 个月( p - o 0 0 2 ) 总之 术后t n1 + t a c e 治疗虽不能显著降低h c c 患者术后复发率，但可延缓复发时 间，提高生存期。 h c c 的治疗与预防需要增强肿瘤抗原和主要组织相容性复合体类别i ( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e xc l a s si ，m h c i ) 分子的表达。t o1 治疗与 预防h c c 的功能是发生在转录水平上的，其作用机制可能为增强p 5 0 f r a - 2 复合 体与p d l 基因中5 。侧翼区增强子a 序列的结合；增强m h c i 表面分子的表达， 进而增强它与i f n a 的协同作用及抗病毒和抗肿瘤能力 4 2 , 4 5 。 3 3 t l 在其它肝病中的应用 非酒精性脂肪肝( n o n a l c o h o l i cs t e a t o h e p a f i t i s ，n a s h ) 是一种无过量饮酒史， 而肝脏组织病理学变化与酒精性脂肪肝相似，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积 为特征的获得性代谢疾病。它作为肝硬化和终末期肝病病因之一同益受到重视， 3 - 2 3 的美国成年人患有n a s h ，通过肝脏显像、尸检或肝活检发现7 0 肥胖病 人有肝细胞脂肪变性，其中2 0 出现脂肪性肝炎，2 0 一2 5 的脂肪性肝炎可进展 为肝硬化。但其确切病因尚不清楚，至今尚无完全有效的药物治疗措施。 tnl 作为免疫增强