（动物遗传育种与繁殖专业论文）人胚胎干细胞体内向肌细胞分化的研究.pdf

扬州大学硕士学位论文 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究 成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研 究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声 明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：一t 彗 j b 签字日期：多口扩年多月塔日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本 人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信 息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。 学位论文作者签名：1 彗 化 签字日期：2 嘲年月侈日 导师签名： 签字日期：巴勺月骰年 丁慧人胚胎干细胞体内向肌细胞分化的研究 人胚胎干细胞体内向肌细胞分化的研究 研究生：丁慧 导师：李碧春教授、盛慧珍教授、陈学进副教授 专业方向：胚胎工程与生物技术 中文摘要 人胚胎干细胞( h u m 趾e i i l _ b 巧o m cs t e mc e l l s ，h e s 细胞) 是能向多种细胞类型分 化的全( 多) 能性干细胞，如何将这类细胞诱导分化成骨骼肌细胞，为治疗肌肉退 行性疾病，如杜氏肌营养不良症( d u c h e i l i l sm u s c u l a rd y s 仃o p h y ，d m d ) ，提供足 够数量的细胞来源，一直是干细胞分化研究领域的热点。本研究针对这一问题进行 探讨，以人e s 细胞系s h e s3 9 作为实验材料，成功的将s h e s3 9 细胞在体外诱导 成骨骼肌细胞的前体细胞。建立合适的小鼠肌肉损伤模型后，将这些前体细胞移植 入小鼠肌肉中，能进一步整合分化为骨骼肌细胞和肌肉组织干细胞卫星细胞。 实验结果如下： 1 为了建立合适的肌肉损伤模型，对2 0u g 心肌毒素( c 砌i o t o x i n ) 单独处理 以及处理2 4 小时后辅以x 射线局部照射小鼠胫骨前肌这两种方案进行比较，并对 1 8 ，2 5 和5 0 g y 的照射剂量进行比较。病理检查的结果证实：心肌毒素能在注射部 位对肌肉造成严重破坏，大部分骨骼肌细胞变性坏死；辅以2 5 g 亨的x 射线局部照 射能明显抑制肌细胞损伤后内源性细胞的修复增生，大大提高人源性细胞的整合率 ( 2 8 6 5 1 3 6 9 ，p o 0 1 ) 。另外，1 8 g y 的照射剂量也可达到相似效果，但5 0 g y 的照射剂量效果相对较差。 2 利用经典遗传学的杂交一互交方法，将8 周龄的非糖尿病一严重联合免疫 缺陷( n o d 居c i d ) 雄鼠( s c i d 乒) 与m d x 纯合雌鼠( 1 n d x 4 ) 相杂交，再用其所生 的8 周龄f l 代雄鼠( s c i d + 厶m d x - ) 和雌鼠( s c i d + m d x + _ ) 互交，提取4 6 只f 2 代 杂合子小鼠的基因组d n a ，对d y s t r o p h i n 以及s c i d 基因进行p c r 检测，共获得1 3 只 双基因缺陷的纯合小鼠( s c i d - m d x ) ，作为研究杜氏肌营养不良症的免疫缺陷型 2 扬州大学硕士学位论文 动物模型。 3 人胚胎干细胞悬浮培养，诱导分化成类胚体，在合适培养液中贴壁后继续分 化生长，多次传代，直至形成类似于成纤维细胞样的骨骼肌前体细胞后，将这些前 体细胞植入经心肌毒素+ 2 5 g yx _ 射线局部照射联合处理的n o d s c i d 小鼠胫骨前 肌。为了确定最佳的细胞移植时间，分别在照射后o 小时、2 4 小时、4 8 小时三个 时点进行细胞移植的实验。免疫组化结果表明：照射后2 4 小时或4 8 小时进行移植 的外源细胞整合率相对较高，分别为2 4 3 2 和2 3 4 8 。 4 心肌毒素+ 2 5 g yx 射线局部照射联合处理n o d s c i d 小鼠2 4 小时后，将 1 1 e s 来源的前体细胞移植到n o d s c i d 小鼠的胫骨前肌中，2 1 6 周后取材做冰冻切 片，随后的免疫组化和原位杂交结果证实，约1 0 一2 0 的细胞能整合分化成骨骼 肌细胞，并表达人特异性的d y s 拓o p h i n 基因，部分细胞能分化成为卫星细胞，并表 达卫星细胞的相关标志，如p a ) 【7 等。将这些细胞以同样方式移植入免疫缺陷的杜 氏肌营养不良症的动物模型一s c i d x 小鼠肌肉后，也能整合分化成骨骼肌细胞并 表达d y t r o p h i n 基因。 5 在h e s 细胞来源的前体细胞移植后1 4 1 2 8 天的共1 2 只小鼠( 2 6 处移植位 点) 中，都有人源性的细胞整合，而未见畸胎瘤的形成。说明1 1 e s 细胞有潜力成为 临床治疗杜氏肌营养不良症的细胞来源。 关键词：胚胎干细胞，骨骼肌细胞，分化 丁慧 人胚胎干细胞体内向肌细胞分化的研究 s t u d yo n t h ei nv i v od ir e n t i a t i o nt os k e l e t a l m y o g e n e s i sb yh u m a ne m b r y o n i cs t e mc e l l s m s c a n d i d a t e ：d i n gh u i a d v i s o r ：p r o l ib i c h u n ，p r o s h e n gi u i z h e n ，p r o c h e nx u e - j i n s p e c i a l 够：e m b 巧oe n g i n e e r i n ga 1 1 db i o t e c l u l o l o g y a b s 瞰c t h 啪a l le m b r ) ，0 1 1 i cs t e m ( h e s ) c e l l sa r ep 1 嘶p o t e n c y ( m u l t i p o t e n c ”s t e mc e l l s w h i c hh a v e 龇p o t e n t i a lt od i 腩r e n t i a t ei n t oa l lc e l lt ) ，p e so ft 1 1 eb o d y i t sah o tf i e l dt o i 1 1 d u c et h j ss t e mc e l l st om y o g e m cl i n e a g et op r o v i d ee n o u g hc e l l sf o rm et r e a 恤e n t so f l em u s c l ed e g e n e r a t i v ed i s o r d e r s ，s u c ha l sd u c h e m sm u s c u l a rd y s 们p h y ( d m d ) i i l t 1 1 i ss t u d y ，w ef 0 c u s e do nt h i si s s u ea i l di n d u c e dm eh e sc e l l st oa p p r o p r i a t er n y o g e n i c p r e c 璐o rc e l l si nv i t r o f o rt e s t i n gt h e s ec e l l s ，w ee s t a b l i s h e da m o u s em o d e l u s i n gt h i s m o d e l ，w es h o wt h a tp r e c u r s o rc e l l sd e r i v e d 筋mh e sc e l l sc a n 硫o r p o r a t ee 舵c t i v e l y i n t o 也em o u s es k e l e t a lm u s c l e 心e rt r a n s p l a l l t a t i o i l ，a i l dd i 疏r e n t i a t et oar a l l g eo fc e h t y p e sm 也em y o g e n i cl i n e a g e ，i n c l u d i n gs a t e l l i t ec e l l s ，m u s c l ea 1 1 ds a t e l l i t e c e l l s t h e r e s u l t ss h o w e da sf o l l o w i n g ： 1 ho r d e rt 0e s ta _ b l i s hao p t i m a lm o u s em o d e lf o rm y o g e n e s i s ，t h et i b i a l l i sa n t e r i o r n l u s c l e so fm i c ew e r ep r e t r e a t e dw i t he i t h e r2 0 u go fc a r d i o t o x i na l o n eo ri nc o m b i n a t i o n w i t hd i f f e r e n td o s e so fi r r i d i a t i o n ( 18 ，2 5 ，o r5 0 g y ) 2 4 hl a t e r 7 n l e r e s u l t so ft h e p a t h o l o g ) rc o i l f i 册e dm a tt 1 1 ec a r d i o t o x i n a g e dm u s l c es e v e r e l ya n dt h e i r r i d i a t i o n s u p r e s s e dp r o l i f e r a t i o no ft h ee n d o g e n o u sc e l l s t 1 1 ec o m b i n e dt r e a t i l l e n t si m p r o v e dt h e i n c o r p o r a t i o n 、析t hh u m a nc e l l se 船c t i v e l y i r r a d i a t i o na t2 5 g ys e v e r e l yi n h i b i t e dm u s c l e r e g e n e r a t i o n ( 2 8 6 5 13 6 9 ，p o 01 ) i 盯a d i a t i o na tl8 g ym i l d l yi i l l l i b i t e d ，t h ed o s eo f 5 0 g y 、糯n o ts og o o d 4 扬州大学硕士学位论文 2 f o l l o w i n gt h ec r o s s - b a c k c r o s sm e t l l o d ，8 - 、e e k o l dn o d - s c i dm a l em o u s e ( s c i d - ) w a sm a t e dw i t h8 - w e e k - o l dm d xf e m a l em o u s e ( m d x 一0 ，a n dt 1 1 e nm e i r 8 1 w e e k o l ds o n ( s c i d + m d x 一) m a t e d 、i md 硼g h t e r ( s c i d 十妇1 d x 吖- ) 1 1 1 eg e n o m e d n aw a se x t r a c t e d mt h ef 2g e n e r a t i o n sa n dp c rm e t h o dw a se m p l o y e dt o 锄p l 毋 t h en o m l a la n da b e r r a l l tf h g m e n t so fd y s t r o p m na 1 1 ds c i d g e n e a m o n gm e4 6 i n d i v i d u a l so ff 2g e n e r a t i o n ，t 1 1 e r ew e r e13h o m o z y g o t e sd e f i c i e n ti nd o u b l eg e n eo fs c i d a n d d y s t r o p h i n ( s c i d - m d x 一一) ，h i c h 、v a su s e df o rd m di 删 1 1 u n o d e f i c i e n tm o u s e m o d e l 3 h e sc e l l sw e r ec u l t u r e di ns u s p e n t i o nt oi n d u c et h ef b r m a t i o no fe m b 巧o i db o d i e s a r e re b sa t t a c h m e n t ，c h a i l g e dt ot h em e d i 啪s u t i a b l ef o rm y o g e i l i cp r e c u r s o rc e l l s g r o 训h a & rt h em o 印h o l o g yo fd i f f e r e n t i a t e dc e l l s 嘲l i k e 肋r o b l a s t ，t h ec e l l s 默鹣 嘲e c t e dm oa i l i m a lm o d e l st ot e s tt h e i ra b i l 时i nv i v 0 t oa n a l y s i st h eo p t i m a lt i m e c o u r s e ，8 一w e e k 0 1 dn o d s c i dm i c ew e r e 仃e a t e dw i t h2 0 u go fc 莉i o t o x i nf o l l o w e db y i r r a d i a t i o n ( 2 5 g y ) 2 4 hl a t e r ，c e u sw e r et r a n s p l a n t e d0 ，2 4 ，o r4 8 ha 矗e ri r r a d j a t i o n t h e r e s u l t so ft h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t 叮c o n f i m e dt 1 1 a tt r a n s p l 删i o na tb o t h2 4a n d4 8h 1 e dt oa 铲e a t e ri n c o 印o r a t i o no fh e sc e l l d e r i v e d c e l l si m ot h et am u s c l e s ，t h e y w e r e 2 4 3 2 a 1 1 d2 3 4 8 r e s p e c t i v e l y 4 。a 缸rt h ec o 1 b i n e dt r e a t m e n t sw i t h2 0 u go fc a r d i o t o x i na n di 玎a d i a t i o n ( 2 5 g y ) 2 4 hl a t e r ，h e sc e l l - d e r i v e dc e l i s 、v e r et r a n s p l a n t e di n t ot h et i b i a l i sa n t e r i o r ( ，r a ) m u s c l e s o fn o d s c i dm i c e 2 - 16w e e k sa r e rt h et r a n s p l a n t a t i o n ，t am u s c l e sw e r ec o l l e c t e da 1 1 d f r o z e ns e c t i o n e d 1 1 1 er e s u h so ft h ei m m u n o h i s t o c h e m i s 时a i l di i ls i t uh y b r i d i z a t i o n ( i s h ) c o n f i 姗e dt h a ta b o u t10 一2 0 p r e c u r s o r sd i 疵r e n t i a t e df r o mh e sc e l l sc a n 眦d e r g o m y o g e n e s i si nn o d - s c i dm o u s ea i l dg i v er i s et 0a 砌g eo fc e l lt y p e si n 恤m y o g e l l i c l i n e a g ei n c l u d i n gs a t e l l i t ec e l l se x p r e s s i n gt h er e l a t e dm 破e r s ，s u c ha sp a x7 m sc e l l s a l s oc a l li n c o i p o r a t ei n t os c i d 而d xm o u s e ( t h ea 1 1 i m a lm o d e lf o rt 1 1 ed u c h e 皿sm u s c u l a r d y s t r o p h y ) a n de x p r e s st h ed y s t r o p h i ng e n e 5 a m o n gt h e12m i c e ( 2 6t r a n s p l a n t a t i o ns “e s ) ，w h i c hw e r et r 锄s p l a n t e dw i t hl 也s 丁慧人胚胎干细胞体内向肌细胞分化的研究 5 c e l l d e r i v e dc e l l s14 12 8d a y s1 a t e r ，、ec a nf i n da l lo ft h ec e l l si n c o 印o r a t i o n ，b u tn o t e r o t o m af 0 n n a t i o n t h er e s u l t ss k l w e dt h a ti tw a sf e a s i b l et ou s eh e sc e l l sf o rm e 骶a t m e n t so fd m d k e y w o r d s ：s k e l e t a lr n y o g e n e s i s ，e n l b r ) r o i l i cs t e mc e l l ，d i 虢r e n t i a t i o n 6 扬州大学硕士学位论文 第一章文献综述 胚胎干细胞来源于植入前囊胚的内细胞团，是在体外培养获得的一种原始多能 ( p l u r i p o t e n t ) 干细胞，具有向三胚层来源的所有组织细胞类型分化的潜能一全 能性( p l 研p o t e n c y ) ；以及在维持其未分化状态和核型稳定的前提下无限增殖 的特性【l 】。这两个显著的基本特性，使得胚胎干细胞成为临床干细胞治疗的理想 细胞来源【2 1 。利用干细胞替代缺损细胞、修复损伤组织，将成为一种新颖而有 效的临床治疗方法【3 ，4 】 自从1 9 9 8 年美国t h o m s o n 实验室建成第一株人e s ( h 啪a i le m l 珊o n i cs t e mc e l l s ， 1 1 e s ) 细胞系以来【5 1 ，对1 1 e s 细胞的研究一直是科研领域的焦点，理论上h e s 细胞具 有分化成个体任何一种细胞类型的能力，包括骨骼肌细胞。目前，国内外暂无有效 的方法将h e s 细胞向骨骼肌细胞进行诱导和分化，但如果使用适当优化的诱导方案， 可将h e s 细胞分化为肌肉前体细胞。将这些前体细胞移植入体内后，由于h e s 的无限 增殖能力，为机体获得足够数量的细胞提供了可能，进而为治疗肌肉退行性疾病， 如杜氏肌营养不良症( d u c h e 皿sm u s c u l a rd y s t r o p h y ，d m d ) ，开辟了一条新的途 径。 1 骨骼肌细胞的发生及其调控 骨骼肌细胞起源于轴旁中胚层【7 】( p a r a x i a lm e s o d e m ，图1 ) ，在人胚胎第3 周末， 轴旁中胚层细胞密集并呈分节状，形成体节( s o m i t e ) ( 图l a ) ：体节由生皮肌节 ( d e m o m y o t o m e ) 和生骨节( s c l e r o t o m e ) 组成，生皮肌节细胞分别向背侧或腹侧 迁徙而形成轴上生肌节( e p a x i a lm y o t o n e ) 或轴下生肌节( h y p a x i a ln l y o t o n e ) 。表达 m y f5 的轴上生肌节和表达m y o d 的轴下生肌节分别进入骨骼肌发生过程，轴上生肌 节细胞主要分化成躯干的肌肉，轴下生肌节细胞主要分化成四肢的肌刚8 】；生皮肌 节中间部分细胞向下迁徙后形成的生肌节细胞主要分化为卫星细胞【9 】( 图1 b ) 。卫 星细胞通常是p a x3 和p a ) 【7 双阳性的细胞，并保持继续增殖，但并不表达肌肉的分 化标志如m y o d 等。这与先前的某些观点认为所有的生肌节细胞都退出原有细胞周 期中而进入分化阶段的观点有所不同。 丁慧 人胚胎干细胞体内向肌细胞分化的研究 7 在胚胎骨骼肌发生发育中起重要调控作用的主要是肌肉调节因子( n m s c l e r e g u l a t r o yf a c t o r s ，m r f s ) 【1 0 - 1 4 】，其中包括m y o d 、m y f 5 、m y f 6 和m y o g e i l i n 。它 们的共同结构包括一碱性氨基酸富含区及其随后的螺旋一环一螺旋( b h 2 h ) 结构。 b r a 吼和r u d i n i c k 等【1 5 ，1 6 】的实验证实，单独敲除m y o d 基因的小鼠，出生时有正常 的肌肉形成；单独敲除m y f 5 基因的小鼠尽管死于严重的脊柱和胸廓畸形，但也有 正常的肌肉形成；联合敲除m y 0 d 和m y f 5 基因的小鼠因无肌肉形成，出生即为死 胎。在m y o d 、m y f5 和m y f6 三者缺乏的小鼠胚胎中，骨骼肌细胞的发生完全缺 乏【1 7 】。抑制i n y o g e 血的活性会导致肌肉发生的紊乱和新生胎儿致死率的增加【1 8 ，1 9 1 。 另外，单个或两个m i 江s 基因突变的研究显示：m y o d 的表达决定了生皮肌节细胞 特异地进入骨骼肌细胞分化的方向，m y f 5 和m y f 6 的表达也可直接决定这些细胞 进入骨骼肌细胞分化的方向；m y f5 和m y f6 对肌肉发生过程中的m y o d 起上游调 控作用( 图1 d ) ，而m y o g e l l i n 主要在骨骼肌发生的后期过程中发挥作用。 处于静止状态、通常是p a ) 【3 和p a x7 双阳性的卫星细胞，在成年个体的肌肉损 伤后，重新激活、增殖、分化形成新的骨骼肌细胞以达到修复损伤肌肉的目的。卫 星细胞的重新激活可能是重新上调m y o d 、m y f5 和m y f6 等基因表达的结果。 c 0 0 p e r 等【2 0 】通过实验证实，小鼠骨骼肌再生时，卫星细胞激活早期表达m y o d 和 或m y f5 ，随后所有增生的卫星细胞均表达m y o d ( 因此m y o d 在成体骨骼肌被认为 是激活态卫星细胞的一个很好标志) 。骨骼肌失神经支配后，卫星细胞数量同样发 生明显改变，r o “g u e s 和s c h m a l b m c h 【2 l 】在大鼠实验中观察到，失神经早期的卫星 细胞通过m y o d 和或m y f5 途径激活，数量明显增加，开始成肌分化过程，但在 失神经条件下，卫星细胞再生难以形成成熟的肌纤维，其数量在随后快速下降，长 期骨骼肌失神经支配导致的不可逆肌萎缩，卫星细胞库的耗竭可能是一个重要原因 【2 2 1 。以往的研究表明，p a x3 可以通过激活酪氨酸激酶受体m e t ( c m e t ) 而发挥作用， 由于c m e t 基因与肌肉前体细胞的迁徙功能有关，缺乏p a x3 的小鼠胚胎会导致肌肉 前体细胞的迁徙失败而造成肢体肌肉发生的缺失【2 3 】，因而，p a x3 也是骨骼肌发生 过程中的一个关键调节因子。p a ) 【7 可以替代p a ) ( 3 发挥其大部分的生理作用，但在 肢体肌肉发生过程中，缺乏p a ) 【7 基因的小鼠胚胎的肢体肌肉仍能正常发育，说明p a ) 【 扬州大学硕士学位论文 7 不为胚胎期肌肉形成所必需【2 4 】。研究表明：p a x3 、m y f 5 和m y f 6 的表达都能上调 m v o d 的表达( 图1 d ) 。 在脊索、神经管等轴旁结构分泌的促进或抑制性信号的共同诱导【2 5 ，2 6 】下，骨骼 肌细胞的发生还受到许多相关基因的调控而保持其增生、分化的平衡状态( 图l c ) 。 研究表明：神经管和侧板中胚层分泌的骨形成蛋白4 ( b m p 4 ) 具有抑制m y f 5 和m y o d 表达的作用，相反，脊索、神经管或外胚层分泌的s o n i ch e d g e h o g 或w n t s ( w n t l 、 w m 3 、w n t 7 a 、w n t l l ) 则具有激活m y f5 和m y o d 表达的作用。 c 图1 骨骼肌细胞的发生【o j 。a ：轴旁中胚层细胞所形成体节结构示意图。b ：轴上生肌节、轴下 生肌节以及卫星细胞。c ：轴旁结构分泌的信号对生肌节细胞的诱导作用。 d ：基因干扰的研 究。n t ：神经管；s c ：生骨节；n c ：脊索；m t 生肌节；d t ：生皮肌节。 f i 2 1d e v e l o p m e n t a lm e c h a n i s m so fm y o g e n e s i sl ( a ) s c h e m a t i co u t l i n i n gt h ed e v e l o p m e n to ft h e s o m i t ef o mt h ep a r a x i a lm e s o d e r m ( b ) t h ee x p a x i a lm y o t o m e ，t h eh y p a x i a lm y o t o m ea n dt h e s a t e l l i t ec e l l s ( c )s i g n a l so rc u e sf r o ma d i a c e n tl i n e a g e sc a u s et h ed e v e l o p m e n to ft h e d e m o m y o t o m a l c e l l s ( d ) t h es t u d i e so f g e n ed i s r u p t i o n ( n t ) n e u r o t u b e ；( s c ) s c l e r o t o m e ；( n c ) n o t o c h o r d ；( m t ) m y o t o m e ；( d t ) d e n l l o m y o t o m e ； 生肌节细胞从原始的间充质细胞分化为成熟的肌纤维，一般要经过4 个时期： 前成肌细胞、成肌、肌管细胞和肌纤维。前成肌细胞( p r e m y o b l a s t ) 为稍长的不规 则形状细胞，细胞质少、核大而圆，染色质深，核仁明显。前成肌细胞增大并生长 鬣黼岁 丁慧人胚胎干细胞体内向肌细胞分化的研究 9 为梭形，胞质增加，同时出现散在的肌丝，核变为椭圆形，染色质浅，核仁明显， 此为成肌细胞( m y o b l a s t ) 。成肌细胞继续分裂增殖，胞质中的许多肌丝组成肌原纤 维，同时部分成肌细胞数个融合在一起，形成共质体样细胞，呈管状，即为肌管 ( m y o t u b e ) 。肌管失去了分裂能力，细胞质中的肌原纤维不断增加，按一定规律排 列后出现明暗交错的横纹，细胞核向边缘排列，此时即为肌纤维。部分胚胎期成肌 前体细胞，胎儿期成肌细胞可转化为卫星细胞，成为卫星细胞的早期来源而一直存 在于个体中。关于卫星细胞的起源，科学家们提出了几种假说。早期研究通过移植 胚胎中胚层生肌节到另一受体胚胎中，观察到移植的中胚层生肌节细胞发生迁移并 组成受体胚胎中的骨骼肌前体细胞，从而提出卫星细胞来自中胚层生肌节间充质细 胞的假说。但近年来的研究对这种论断提出质疑，1 9 9 9 年d ea n g e l i sd 等研究发现 从胎鼠背侧主动脉中获得的卫星细胞样细胞同时具有肌细胞和内皮细胞标志，将其 移植到新生小鼠后，这些细胞参与出生后肌肉的生长和再生，并可与中胚层生肌节 来源的肌纤维融合：d ea n g e l i sd 同时以c m e t - - p a x 。的变性鼠晚期胚胎做为实验 对象，发现这种突变小鼠无法从中胚层生肌节中迁移出肌细胞，但在其肢体中发现 类似的肌源祖细胞，这些肌源祖细胞可能起源于发育肢体中的血管，由此提出卫星 细胞起源于胚胎血管祖细胞的假说。这一假说提示了出生后的骨骼肌中至少有部分 肌卫星细胞的发育是完全独立于胚胎成肌细胞和肌肉的发育，而来源于血管组织 中。 2 骨骼肌细胞的退化、病变 骨骼肌细胞再生能力很弱，已发育成熟的成体肌纤维一般无分裂再生能力，损 伤后，可由存在肌纤维周围肌卫星细胞分化后得以补充。卫星细胞的数量随着个体 年龄的增长，数量不断减少，有研究认为可能是由于调亡速度加快所致【2 。卫星细 胞的数量和或功能上的减少容易造成骨骼肌的退化甚至变性而导致疾病【2 引，例如 杜氏肌营养不良症( d u c h e l l i l sm u s c u l a rd y s t r o p h y ，d m d ) 。d m d 是由于抗肌萎缩 蛋白基因( d y s 仃o p h i n ) 的突变导致骨骼肌细胞膜上的骨架蛋白抗肌萎缩蛋白丧 失功能所致。杜氏肌营养不良症是一种x 一连锁隐性遗传病，以男性患者居多，占活 l o 扬州大学硕士学位论文 产男婴1 3 0 0 0 一1 4 0 0 0 ( 欧美) 和1 2 2 0 0 ( 日本) ，国内的发病率约为1 3 6 0 0 ，此病 的高发率是由于抗肌萎缩蛋白基因的高突变率所致( 以基因缺失为主) ，受损的肌 纤维承受外界运动、张力的能力明显减弱【2 9 ，3 0 1 。这可能是由于d y s t r o p h i n 的基因 缺陷而导致抗肌萎缩蛋白一糖蛋白复合体( d y s 仃0 p h i l l g l y c o p r o t e i n c o m p l e x ) 的结构稳定性下降 3 1 】或热休克蛋白的表达紊乱【3 2 1 而引起肌细胞的变性坏 死。骨骼肌细胞不断损伤后，卫星细胞大量扩增并分化形成新的骨骼肌。但由于本 身的基因缺陷，造成新生的肌细胞持续变性坏死，卫星细胞数量也呈不断减少趋势， 最后导致进行性全身肌无力，呼吸衰竭，患者常2 0 岁左右死于呼吸衰竭，迄今为 止尚无有效的治疗方法。 研究认为，在d m d 等肌肉退行性疾病的治疗方面，较为有效的方法是基因治疗 和细胞移植治疗。关于d m d 的基因治疗，目前主要应用腺病毒、质粒、腺相关病 毒等载体进行构建d m d 基因的重组体，并在动物模型m d x 小鼠( d m d 疾病的动 物模型) 的骨骼肌进行了表达研究【3 3 】，但这些重组体在m d x 小鼠骨骼肌中的表达 效率不高，持续时间不长。研究要取得进展尚有一定的困难。这是因为，d m d 基 因内含子的序列约占基因全长的9 9 ，而且内含子在该基因中的作用相当重要，仅 仅用d m d 的c d n a 进行d m d 基因的表达研究是不完善的，目前又尚无一种载体 能克隆全长的d m d 基因。同时，m d x 小鼠的基因突变为点突变，与人类d m d 基 因的缺失突变有很大的不同，寻找与人类d m d 的基因突变相类似的动物模型目前尚 有困难。有关d m d 的细胞移植治疗研究开展的比较多，并取得了一些进展，但仍 存在一些需要解决的问题。 3 骨骼肌细胞重建的细胞来源 细胞移植就是将自身或外源性的各种具有分化为骨骼肌潜能的细胞移植入受 体中，这种细胞可以在机体内增殖、分化和参与骨骼肌的重建【3 4 】。目前，适合于细 胞移植的细胞类型主要有以下几种： 3 1 成肌细胞 由于成肌细胞可比较容易地从骨骼肌中得到分离和培养，扩增后的细胞经基因 丁慧 人胚胎干细胞体内向肌细胞分化的研究 l l 修饰或直接移植到受损的肌肉中，可与受体的细胞整合形成新的骨骼肌细胞，从而 达到骨骼肌的重建。成肌细胞包含了d m d 基因的全部顺序，所表达的蛋白质功能最 完整，故进行成肌细胞移植治疗d m d 是较为理想的手段，其疗效得到许多有力的支 持【3 5 】，但是这种细胞在移植后的低存活率和融合率【3 6 ，3 7 1 ，限制了其移植效果和应用 的推广。 3 2 卫星细胞 卫星细胞被认为是最为经典的成体骨骼肌的干细胞【3 8 4 1 1 。由m a u r 0 在对青 蛙胫骨前肌的电镜研究中发现，因其与肌细胞位置关系密切而命名。卫星细胞位于 骨骼肌细胞基膜与肌膜之间，属单核细胞，胞核扁圆，紧贴于肌膜下，核内异染色质 较稀疏，细胞质较少。通常处于静止状态，在骨骼肌受损或创伤后，立刻增殖，分 化为成肌细胞，进而融合形成骨骼肌细胞f 4 2 】。卫星细胞在个体刚出生时数量丰富， 但随着个体的年龄增长，人类或其他动物的卫星细胞数量不断减少【4 3 】，在成年小鼠 的所有骨骼肌细胞核中约有l 一5 为卫星细胞的核，而且卫星细胞的增殖分化能 力也随着年龄增大而不断减弱。m o 触l r r a s 【4 5 】等入用流式细胞术的方法( n o w c y t o m e 蚵) 成功从一种表达绿色荧光蛋白( 伊e e nn u o r e s c e n t p r o t e i n ) 的小鼠种系中 分离出肌肉的卫星细胞。将从隔膜( d i 印1 1 r a g m ) 上分离出的卫星细胞移植到m d x 小 鼠的肌肉中( 杜氏肌营养不良症小鼠模型) ，这些细胞能有效的支持肌肉修复。然 而，移植前的体外扩增实验会减弱细胞的再生能力。在m d x 小鼠和d m d 病人肌肉内直 接注射供者的卫星细胞进行治疗后【4 6 1 ，其效果不太理想，只有少数的患者可以在较 长时间里能检测到抗肌萎缩蛋白的表达【4 7 1 ，研究者认为这可能与细胞本身以及机体 的免疫因素有关。 3 3 骨髓来源的干细胞 研究表明，将标记了b 半乳糖苷酶的骨髓来源的干细胞( b m d ) 移植入心肌 毒素预处理过的肌肉中，部分细胞也分化成了骨骼肌细胞【4 8 】；将b m d 细胞移植入 致死量照射的m d x 小鼠中，也能分化为骨骼肌细胞，而且这种细胞在小鼠体内可以同 时表达早期或晚期的肌源性标志，如p a ) 【3 【4 9 锄，m y o d 和m h c 【5 3 】；将g f p 标记的b m d 细胞移植入致死量照射的小鼠后，在肌膜和基底膜之间出现了g f p 标记的细胞【5 4 】， 1 2 扬州大学硕士学位论文 说明这种细胞分化成了卫星细胞，表明卫星细胞可以从骨髓中得到自我更新和补充 并参与骨骼肌的重建。目前认为，b m d 细胞是一个复杂的混合细胞群，从b m d 细胞 中大致可以分离出间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 和造血干细胞 ( h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ，h s c s ) 。m s c s 是骨髓中的非造血性多能干细胞，对骨髓 血系细胞起支持诱导作用，可促进造血细胞克隆的形成。而且，m s c s 是一种多能 间充质干细胞，它可以在不同的诱导条件下分化为成熟的间质细胞，如成骨细胞、 成软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞等。研究表明m s c s 不但可在体外用5 一氮胞苷( 5 a z a c ”i d i n e ) 诱导后，产生含多个核的肌管【5 5 1 ，也能在体内参与骨骼肌细胞的分化 和重建【5 6 5 7 1 。另外，近年的研究发现，h s c s 同样也能参与骨骼肌细胞的重建【5 8 1 。 3 。4 其他肌源性前体细胞 除了卫星细胞和b m d 细胞，现在发现，还有很多其他的肌源性前体细胞也能参 与骨骼肌的重建。从小鼠胚胎的背主动脉( d o r s a la o n a ) 分离出的前体细胞可在体 外形成肌源性克隆f 5 9 】；1 9 9 6 年g o o d e u 等【6 0 】在用c n a 染料h o e c h s t 3 3 3 4 2 对骨髓干细 胞染色并进行流式细胞仪分析时，发现有一群染色偏低，和其它大部分细胞不一样 的细胞群体，遂命名为s i d ep o p u l a t i o nc e l l s ( s p ) ，中文名为侧群细胞。s p 细胞是另一 类主要在骨髓和肌肉中发现的多潜能干细胞，它们的特性尚未完全明了，但具有向 不同于本身起源组织的多种细胞类型分化的能力。目前对s p 细胞的研究己涉及到多 种器官和组织【6 1 1 ，除了造血组织，非造血组织如骨骼肌，心脏、脑、脾、肝、肾、 肺以及小肠、神经、精原细胞中均存在s p 细胞。s p 细胞可以整合入m d x 小鼠的肌肉 中，并部分的恢复d y s t r o p h i n 基因的表达【6 2 1 。将肌肉中分离出的s p 细胞，从尾静脉 移植入m d x 小鼠后，这些细胞可以穿过毛细血管壁，分化为骨骼肌细胞【6 3 ，6 4 1 。研究 表明，b m p 4 在s p 细胞分化成骨骼肌细胞的过程中起着决定性的作用【6 引。最近有人 从肝脏、胸腺或脾脏中分离出的间充质细胞也可分化成骨骼肌细胞【6 6 1 ，提示从骨髓 组织外也能分离出间充质干细胞的可能性。人体的某些成体干细胞，如a c l 3 3 一阳 性的干细胞和从滑膜分离出的间充质干细胞，也可以部分重建d y s t r o p l l i n 的表达并且 减轻m d x 小鼠受损的肌肉功能【6 7 ，6 8 1 。最近，d e l l a v a l l e 等人【6 9 】从人骨骼肌组织的血管 壁分离出的周细胞( p e r i c y t e ) 能高效地在s c i d m d x 小鼠体内整合分化成骨骼肌细胞， 丁慧人胚胎干细胞体内向肌细胞分化的研究 1 3 并表达d y s t 0 印h i n 基因，为细胞治疗肌肉退行性疾提供了新的细胞类型。他们认为 p e r i c y t e 可能是不同卫星细胞的一种胚胎期的m e s o a n g i o b l a s t s 来源的前体细胞。 3 5 胚胎干细胞和原始生殖细胞 干细胞具有不断自我更新和多向分化的特性。利用干细胞替代缺损细胞、 修复损伤组织，将成为一种新颖而有效的临床治疗方法【3 4 1 。胚胎干细胞及胚 胎生殖细胞( e m b 巧o m cg e 肌c e l l ，e g 细胞) 均属于全能干细胞( p l u 邱o t e n ts t e m c e l l s ) ，其中e s 细胞来源于囊胚发育阶段的内细胞团，e g 细胞则由胚胎发育早 期生殖嵴分离出的原始生殖细胞( p r i m o r d i a lg e 眦c e l l ，p g c ) 在体外培养形成。 e s 细胞和e g 细胞具有向三胚层来源的所有组织细胞类型分化的潜能一全能性 ( p l 面p o t e n c y ) ；以及在维持其未分化状态和核型稳定的前提下无限增殖的特 性。这两个特性使其成为临床干细胞治疗中理想的细胞来源【2 】。 4 骨骼肌细胞的重建途径 成年个体中，骨骼肌细胞损伤后的重建或修复主要由卫星细胞来完成。如图2 所示：骨骼肌细胞受损后，静止状态的卫星细胞开始增生、分化为成肌细胞，成肌 细胞相互融合形成肌管( 细胞核位于包质中央) ，肌管进一步成熟为肌纤维，卫星 细胞重新进入静止状态。除卫星细胞外，许多其他来源的前体细胞也能不断参与骨 骼肌细胞的重建，并补充到卫星细胞库中，从而长期维持骨骼肌细胞的正常生理功 能。这类细胞包括：各种间质细胞如肌肉来源的干细胞( m u s c l ed 耐v e ds t e m c e l l m d s c ) 、s p 细胞、c d 4 5 + s c a l + 细胞、s c a l + 细胞、c d 3 4 + 细胞等；骨髓来源 的细胞如m s c s 和h s c s 等；血管前体细胞如周细胞、内皮前体细胞等；其他系统来 源的细胞如神经干细胞等。目前通常将卫星细胞外的各种参与骨骼肌细胞重建的细 胞统称为肌源性前体细胞( m y o g e i l i cp