（细胞生物学专业论文）斑马鱼striatin基因的分子克隆及发育表达分析.pdf

摘要 在许多种不同的细胞进程中，如细胞分裂分化、生长繁殖、信号 转导、d n a 复制、基因调控和细胞衰老凋亡等生命进程中蛋白质 s e r t h r 磷酸酶2 a ( p p 2 a ) 起着重要的调节作用。结构亚基a ，调节亚 基b 和催化亚基c 组装构成一个p p 2 a 的异源三聚体。其中各有两种 异构体存在在结构亚基a 和催化亚基c 中，而调节亚基b 则有十多 种异构体按其特异性分为至少四个不同的家族，分别为b ，b ，b 和 b 。多种不同的基因分别编码这些不同的调节亚基，而调节亚基b 的功能除了能介导催化特异性的底物外还能介导p p 2 a 全酶的在细胞 内的亚定位。 调节亚基b 中的s t r i a t i n 的在低等脊椎动物中的功能和作用及其 独特的表达定位引起了我们的研究兴趣，为此在本实验中我们采用 r a c e 克隆方法克隆了斑马鱼p p 2 a 调节亚基b s t r i a t i n 基因的全长 序列。所得序列结果为斑马鱼s t r i a t i n 基因包含2 3 4 9 b p 的c d s 其编 码的氨基酸序列长7 8 2 个a a 。较高的同源性存在于斑马鱼s t r i a t i n 氨 基酸序列与其他物种的s t r i a t i n 氨基酸序列之间。关于斑马鱼s t r i a t i n 基因的表达模式分析，r t - p c r 分析显示在9 个组织中s t r i a t i nm r n a 有不同程度的表达，而在斑马鱼胚胎发育各时期中在两细胞期、多细 胞期、囊胚期和原肠期中表达量很高，而在其他发育时期表达量较低。 w e s t e r nb l o t 结果分析，在脑组织中检测到s t r i a t i n 有最高的表达。 然而在心脏、鳃和鳍中s t r i a t i n 蛋白没有被检测到。在发育过程中， s t r i a t i n 蛋白在原肠、神经胚和视原基期有非常强烈的表达，随后表达 量在多细胞和心跳期下调。这些结果揭示出s t r i a t i n 在成体组织中和 斑马鱼发育过程中有很重要的作用。 关键词：s t r i a t i n ，斑马鱼，分子克隆，表达分析 i i a b s t r a c t i ti sw e l le s t a b l i s h e dt h a tt h ep r o t e i ns e r i n e t h r e o n i n ep h o s p h a t a s e 2 a ( p p 2 a ) p l a y sv e r yi m p o r t a n t r o l e si nm a n yd i f f e r e n tc e l l u l a rp r o c e s s e s ， i n c l u d i n g c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n ，g e n ee x p r e s s i o n ， n e u r o t r a n s m i s s i o n ，a p o p t o s i s ，a g i n g ，a n ds oo n p p 2 ac o n s i s t so ft h r e e h e t e r o g e n i cs u b u n i t s ：t h es c a f f o l ds u b u n i ta ，t h ec a t a l y t i cs u b u n i tc ，a n d t h er e g u l a t o r ys u b u n i tb w h i l eb o t ht h es c a f f o l da n dt h ec a t a l y t i c s u b u n i t s c o n t a i no n l yt w oi s o f o r m s ，a tl e a s tf o u rs u b f a m i l i e so ft h e r e g u l a t o r ys u b u n i t s ，b ，b ，b ，a n d b ”h a v eb e e ni d e n t i f i e d t h e s e r e g u l a t o r ys u b u n i t sf r o md i f f e r e n tf a m i l i e sa r ee n c o d e db yd i f f e r e n tg e n e s a n db e a ro t h e rf u n c t i o n sb e s i d e sd i r e c t i n gt h es p e c i f i c i t yo fp p 2 a t oe x p l o r et h ep o s s i b l ef u n c t i o n so ft h er e g u l a t o r ys u b u n i t so fp p 2 a i nl o w e rv e r t e b r a t e s ，w eh a v ec l o n e dt h ef u l l - l e n g t he d n as e q u e n c eo f t h eg e n ee n c o d i n gt h er e g u l a t o r ys u b u n i ts t r i a t i no fp p 2 af r o mz e b r a f i s h ， d a n i or e r i ou s i n gr a c ec l o n i n gm e t h o d t h er e s u l to fs e q u e n c es h o w e d t h a tt h es t i a t i ne d n ao fz e b r a f i s hc o n t a i n sa no r fo f2 3 4 9b pe n c o d i n ga p r o t e i no f7 8 2a m i n oa c i d s t h es t r i a t i np r o t e i nd i s p l a y sav e r yh i g hl e v e l o fs e q u e n c ei d e n t i t yw i t ht h es t r i a t i n r e g u l a t o r y s u b u n i tf r o mo t h e r s p e c i e so fv e r t e b r a t e s r e g a r d i n gi t se x p r e s s i o np a t t e m ，r t - p c ra n a l y s i s r e v e a l st h a tt h es t r i a t i n g e n ei sd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di n9t i s s u e s e x a m i n e d d u r i n gt w e l v ed i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e so ft h ez e b r a f i s h ， i i i t h eh i g h e s tl e v e lo fm r n ae x p r e s s i o nw a sd e t e c t e da tt h es t a g e so f t w o - c e l l ，m u l t i p l e c e l l ，b l a s t u l aa n dg a s t r u l a , a n dad e c r e a s e dl e v e lo ft h e s t r i a t i nm r n aw a sd e t e c t e di no t h e rd e v e l o p m e n t a ls t a g e s a tt h ep r o t e i nl e v e l ，t h eh i g h e s te x p r e s s i o nl e v e lo ft h es t r i a t i n p r o t e i nw a sf o u n di nb r a i n i nc o n t r a s t ，t h es t r i a t i np r o t e i nw a sh a r d l y d e t e c t a b l ei nk i d n e y , h e a r t , g i l la n df m d e v e l o p m e n t a l l y , t h es t r i a t i n p r o t e i nw a si n i t i a l l ye x p r e s s e da tl o wl e v e li nt w o c e l l ，m u l t i p l e c e l la n d b l a s t u l as t a g e ，t h e ns i g n i f i c a n t l yu p r e g u l a t e da tt h es t a g e so fg a s t r u l a , n e u r u l a ，a n do p t i cv e s i c l e ，a n dt h e nd e c r e a s e da th e a r tb e a t i n ga n dl a t e r s t a g e s t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a ts t r i a t i na p p e a r st op l a yav e r yi m p o r t a n t r o l ed u r i n gz e b m f i s hd e v e l o p m e n ta n da l s oi na d u l tt i s s u eh o m e o s t a s i s k e yw o r d s ：s t r i a t i n , z e b r a f i s h ，m o l e c u l a rc l o n i n g ，e x p r e s s i o na n a l y s i s i v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果除文中已经注明引用的内容外， 本论文不合任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方武标 明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名： 净断罢 矽，。年，月弘日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期问论文工作的知识产权单位属湖南师范大 学同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子版，允许论文被查阅和借阅本人授权湖南师范大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 本学位论文属于 l ，保密口，在年解密后适用本授权书 2 、不保密酗。 ( 请在以上相应方框内打“ ”) 作者签名： 埠断孥 导师签名：多渺 日期：年f 月多d 日 日期：w 口年j 、月多。日 斑马鱼s t r i a t i n 基冈的分子克隆及发育表达分析 第一章前言弟一早日i ji 可逆的蛋白质磷酸化和去磷酸化反应，是一种在细胞内普遍存在 的共价修饰的生化反应，生物体内几乎所有的生理病理过程都与此有 关【1 1 。有两种蛋白酶调控这种作用，一种是蛋白激酶催化蛋白质磷酸 化，一种是蛋白磷酸酶催化蛋白质去磷酸化【2 1 ，在a t p 的能量驱动下 这两种酶催化蛋白底物加磷酸基团或去磷酸基团。可逆磷酸化的功能 由蛋白磷酸酶和蛋白激酶共同协调行使。这两种反应的平衡进行对细 胞的新陈代谢具有非常重要的意义【3 1 。磷酸化反应中，蛋白激酶催化 磷酸基团的结合在底物蛋白质的特定位点上，使底物蛋白该位点本来 非极性的疏水氨基酸残基转化成极性的亲水氨基酸残基，而使底物蛋 白某位点极性的发生变化导致其空间构象发生改变3 1 ，从而引起其蛋 白质相互作用的改变，进一步调控生物体的生理生化反应。而在去磷 酸化反应中蛋白磷酸酶去掉底物某位点的磷酸基团，同样会引起蛋白 质空间作用位点的特性改变 4 , 5 1 ，从而带动细胞内精密的调控网络发 生作用，引起一系列生理生化反应变化。蛋白激酶和蛋白磷酸酶二者 调控的蛋白质的可逆磷酸化修饰作用对原核以及真核生物中受广泛 存在的信号转导机制调控的细胞内生理生化反应有着重要的作用。通 过磷酸化和去磷酸化，胞外信号能高速有效地传导至细胞内的各个部 分，进行生命活动的调节。这些生命活动包括d n a 复制、r n a 转录、 蛋白质翻译、细胞的分裂、生长、分化、衰老、细胞对于离子通道活 性调控、免疫反应等【5 1 。 硕士学位论文 蛋白磷酸酶与蛋白激酶 蛋白激酶用于催化蛋白质的磷酸化反应，而蛋白磷酸酶则用于催 化蛋白质的去磷酸化反应，这两类反应共同组成细胞内的可逆磷酸化 系统，充分说明了二者在功能上相辅相成，互为依托，共同行使在细 胞内的调控作用鸭9 】。随着基因组计划的进行，越来越多的物种基因 组序列被测定完成，而分析得知在已知的生物体的基因组序列中大概 有2 3 的基因在蛋白质合成中参与蛋白激酶和蛋白磷酸酶的编码 【5 1 。在这之中，就基因数目来说编码蛋白磷酸酶的基因要远少于蛋白 激酶的。据统计基因组中参与编码蛋白激酶的真核基因就大约有2 ， 仅在哺乳动物的基因组序列中就有五百个以上的基因编码蛋白激酶 忉，基因水平上的多样性导致了蛋白水平上的多样性，由此一个功能 多样的蛋白激酶超级家族就形成了。根据蛋白激酶的功能它们可被分 为九个主要的类型，每个类型又由多个家族以及其亚家族组成。与数 量庞大的蛋白激酶不同的是蛋白磷酸酶的数量和种类都比较少，蛋白 磷酸酶之所以在数量和种类上有如此大的差距，主要是因为蛋白磷酸 酶很多是复合蛋白质，它们的构成比蛋白磷酸酶更复杂8 1 。根据蛋白 磷酸酶的不同底物催化特性，蛋白磷酸酶大致被分为三个家族：以 s e r t h r 残基为催化底物的s e r t h r 蛋白磷酸酶( p p ) ，以t y r 残基为 催化底物的t y r 蛋白磷酸酶( p t p ) ，另外还存在一类能同时使磷酸化 的t y r 和s e r m 残基脱磷酸的蛋白磷酸酶，被称为双重特异性蛋 白磷酸酶( d s p ) t 8 , 9 1 。蛋白磷酸酶( p p ) 2 a 属于s e r t h r 蛋白磷酸酶 家族。 2 斑马鱼s w m t m 基因的分子克隆及发育表达分析 2 蛋白磷酸酶2 a 2 1p p 2 a 概述 一直以来由于p p 2 a 的全酶结构相对于其家族其他蛋白磷酸酶来 说更为复杂多变，对p p 2 a 的研究不如p p l 、p p 2 b 等深入，且进展 缓慢，而p p 2 a 在细胞生命活动中的重要作用引起研究者越来越多的 兴趣【9 】。研究表明，p p 2 a 在从酵母菌y e a s t 到高等哺乳动物m a m m a l 的进化过程中其氨基酸序列高度保守并且在各种组织及细胞中普遍 表达。p p 2 a 能逆转许多底物蛋白的磷酸化状态脱掉磷酸基团，参与 生物的多项生命活动【1 0 1 ，例如：调控d n a 复制、基因转录翻译、细 胞信号转导、细胞周期、细胞代谢、细胞分裂生长分化及细胞凋亡等， 并和免疫性疾病、癌症等多种疾病的发生发展有关。 2 2p p 2 a 的结构 p p 2 a 结构较为复杂，在哺乳动物m a m m a l 细胞中通常以全酶三 聚体的形式存在，偶尔也可以以核心酶二聚体的形式存在，但三聚体 形式跟为稳定和常见f 引。由分子质量约为6 5k d 的结构亚基a 和分子 质量约为3 6k d 的催化亚基c 二者结合组成核心酶二聚体；之后形成 的a c 核心酶二聚体可与分子质量约在5 0 k d - - 一1 3 0k d 之间的各种不 同的调节亚基b 结合构成p p 2 a 的全酶三聚体模式，只有在p p 2 a 组 成全酶三聚体后才能正确行使蛋白磷酸酶的功能【1 0 】。蛋白磷酸酶 p p 2 a 的结构亚基a 存在着两种异构体为a a 、a p ，另外催化亚基c 硕十学位论文 也有c a 、c b 两种异构体。而其调节亚基b 种类繁多，至少有1 6 个 成员，与p p 2 a 结构亚基a 和催化亚基c 的各种异构体组成了多种 多样的p p 2 a 全酶。至今己发现的调节b 亚基可分为四种亚类，分别 为b 、b 、b ”、b ”，并且在核心酶和刁i 同类型的b 亚基结合构成 全酶形式时具有排他性和特异性，如图所示： b a b b b y b 6 b 。：= ：n d s u m e 酬r o 。u ：。i s o f 。o r m t s s c 旺 ， c b a c ( a 1 3 调节亚基b 家族成员众多，具有多样性，虽然在识别c 业基和a 亚基结合成的核心酶的功能上相似，但这个家族各成员的基因同源性 较低，其基因编码的蛋白结构也互不相同i ”l 。b 亚基的功能主要是调 控p p 2 a 全酶对底物的特异性、调节全酶活性和决定全酶的哑细胞定 位。s g 2 n a ( p r 9 3 ) 蛋白和s t r i a t i n ( p r l l 0 ) 蛋白是在近年的研究中才被 归于p p 2 a 调节基b 家族中的，其氨基酸序列的特征是均含有四个 盆萎 。，：如 陬豫 斑马鱼s t r i a t i n 基因的分子克隆及发育表达分析 蛋白蛋白结构域【1 2 】，其中的w d 重复序列可和a c 核心酶结合从而 构成p p 2 a 全酶，s g 2 n a 和s t r i a t i n 作为p p 2 a 的调节亚基介导p p 2 a 全酶的功能1 3 ，1 4 1 。 2 3p p 2 a 调节亚基b - s t ri a t i n 蛋白家族概述 s t r i a t i n 蛋白家族的重要成员s t r i a t i l l ( 又因其高表达在脑纹状 体中而被称为隆纹菌素) 被克隆鉴定分离出来【1 8 。2 0 】。在哺乳动物中， s t r i a t i n 主要表达于中枢神经系统以及周边神经系统的神经元细胞树 突的突触后致密区中。s t r i a t i n 蛋白家族的另两个成员s g 2 n a 和 z i n e d i n ，继此之后也陆续发现于高等真核生物中。s g 2 n a 最初在细 胞周期中的s 期至g 期具有很高的蛋白表达量，而被视作调控细胞 周期的核蛋白。但随着研究的深入，发现经过亚细胞分离和免疫组化 实验的研究，证实s g 2 n a 只在细胞质中表达并且在细胞质中具有其 特异的亚细胞定位2 2 1 。而z i n e d i n 也被作为s t r i a t i n 蛋白家族的一员， 是因为其蛋白的氨基酸序列结构也存在四个相互作用的区域与 s t r i a t i n 和s g 2 n a 的序列结构相似，并且它们的氨基酸序列比较相似 【3 。对系统发育的分析支持了这样一种假设：它们组成了起源于同一 祖先基因的多基因家族。另外有文献显示，小鼠s g 2 n a 至少有5 种 新的剪接体，其中两种剪接体缺乏在羧基末端的w d 4 0 重复序列。 而s g 2 n a 多种剪接变体形式是由在7 - 9 外显子处的可变剪接形成的， 并且检测这些剪接变体形式在不同组织中的表达谱是不同的【2 3 1 。8 3 、 7 8 、3 8 和3 5 k d a 的s g 2 n a 剪接形式主要在大脑和心脏中存在，而 硕+ 学位论文 8 7 k d a 的剪接形式特异地存在在大脑中。同时3 5 k d a 变体形式更多的 在新生组织中存在而不是成体组织中。w e s t e r nb l o t 的分析结果显示 s g 2 n a 的变体形式对应于不同的生长刺激 2 4 , 2 5 。如受到血清刺激时， 当3 5 k d a 剪接形式的s g 2 n a 蛋白增长时7 8 k d a 的变体形式则减少。 在后生动物的演化中，s g 2 n a 的剪接变体是保守的。总而言之， s g 2 n a 的剪接变体可能在后生动物细胞的分化和成熟过程中起关键 性作用【2 6 】。 2 4s t ria tin 蛋白家族结构特点 s t r i a t i n 蛋白质家族由三个具有共同的蛋白蛋白作用功能基序的 蛋白质成员s t r i a t i n 、s g 2 n a 和z i n e d i n 组成【2 牝踟。它们的蛋白序列 具有6 6 的相似性。这三个蛋白几乎具有相同数目的氨基酸，并且氨 基酸序列可大致分为四个蛋白质一蛋白质相互作用保守区域【2 9 1 ，从氨 基端到羧基端分别是：小窝蛋白绑定区域、卷曲螺旋绑定区域、钙 离子钙调素连接区域，w d 4 0 重复区域，如下图： 甲跚渺脚 而另一方面氨基末端区域、钙离子钙调素绑定区域与w d 4 0 重复区 斑马鱼s t r i a t i n 基因的分子克隆及发育表达分析 域之间的中间氨基酸区域并没有很高的同源性，由上图中也可以清楚 地看到【3 l 】。 一系列的研究证实小窝蛋白可作为多种多样的信号转导蛋白相 互作用的平台。因为s t r i a t i n 、s g 2 n a 和z i n e d i n 并非跨膜蛋白，而 它们与小窝蛋白的结合成为它们与细胞膜胞质面结合的数种方式中 的一种【3 0 3 1 1 。s t r i a t i n 、s g 2 n a 和z i n e d i n 的卷曲螺旋构成模式尚未 可知，但可以推测此保守区域可以将s t r i a t i n 家族蛋白绑定于膜上， 其方式可能与g 蛋白三聚体的y 亚基定位在附着1 3 亚基膜上的方式 相同【3 2 1 。 w d 重复蛋白被定义为包含四个或者更多的具有将近4 0 个氨基 酸并通常以w d 色氨酸天冬氨酸为结尾的保守核心序列的重复单位 的蛋白，w d 重复蛋白属于一个巨大且迅速扩大的保守蛋白家族 1 3 1 - 3 4 1 。s t r i a t i n 家族蛋白因在其氨基酸序列中包括w d 重复基序，也 被归于w d 重复蛋白家族的亚族。而其中s t r i a t i n 是w d 家族中第一 个已知的以钙离子依赖的方式结合钙调素的蛋白成员瞰1 。最初是在研 究g 蛋白的1 3 亚基时发现了w d 重复基序。g 蛋白异源三聚体的p 亚基以同样顺序存在卷曲螺旋绑定区域、钙离子钙调素连接区域， w d 重复区域。对其蛋白晶体结构分析显示w d 氨基酸重复序列在空 间上形成了一系列高度对称的d 螺旋折叠3 6 1 ，并认为所有的w d 序 列重复蛋白均具有这样的结构。w d 蛋白的串联重复结构创造了一个 稳定的蛋白作用平台，在此数种蛋白可有序相继地或者同时地进行可 逆的相互反应。w d 重复蛋白家族由同源的、结构相关的、功能不同 硕士学位论文 的各种蛋白行使多种同时进行或连续发生的蛋白质蛋白质相互作 用，因数量庞大，结构复杂多变，w d 重复蛋白家族可根据其蛋白功 能的不同被分为三十个以上的功能亚族。数量众多的信号蛋白、细胞 周期蛋白、细胞骨架组装蛋白、囊泡运输蛋白等都属于w d 重复蛋白 这个超级家族【3 7 1 。w d 重复蛋白的重要性不仅显示在其在信号转导、 转录调控、细胞凋亡等许多重要的生命活动所起的关键性的作用，而 且表现在其与许多种人类疾病有关。 2 5s t ri a t i n 蛋白家族的表达定位和功能 s t r i a t i n 家族蛋白虽然有相似的蛋白结构，但其分布有很大差异， 显示了它们在生物体生命活动中有各自不同的作用范围。s t r i a t i n 主要 存在于哺乳动物的基底神经节、颅部和脊髓运动核的神经元细胞中 3 8 , 3 9 。在使用免疫细胞荧光和原位杂交技术检测s t r i a t i n 及其m r n a 在 兔子大脑分布的研究中，s t r i a t i n 的免疫染色和其m r n a 的标签模式结 果基本一致。高密度染色显示的区域主要为背侧纹状体、伏核、嗅结 节、红核、丘脑下核、颅神经运动核等部位3 引。尽管s t r i a t i n 广泛分布 于兔子c n s 中枢神经系统的神经元中，但是其还是在结构上显著地表 达在运动系统中，暗示s t r i a t i n 在运动控制中具有压倒性的重要作用。 此蛋白家族中每种蛋白的d n a 探针和对于特定区域的高量抗体，显示 了z i n e d i n 主要表达在中枢神经系统，而具有更广泛的存在范围的 s g 2 n a 则主要表达在大脑和肌肉中【3 9 】。并且在兔脑q bs g 2 n a 和 s t r i a t i n 通常不是表达在同一神经元中，但是二者同样定位于树突中， 斑马鱼s t r i a t i n 基冈的分子克隆及发育表达分析 表明它们享有相似的定位方式以及相近的功能。这三种蛋白都是胞内 蛋白和膜结合蛋白，大脑细胞的分部分离实验也证实了这点。 s t r i a t i n 蛋白家族在神经系统的表达定位，揭示了其功能与神经系 统密不可分，其结构的多个蛋白质相互作用功能域也说明其具有信号 蛋白和多分子蛋白平台作用【4 0 l 。一项旨在解释s t r i a t i n 蛋白功能的研 究揭示了两组数据，证明了其在胚胎神经元以及成体大脑组织中起着 核心作用。s t r i a t i n 是一个胞内蛋白，主要表达在哺乳动物神经系统的 基础神经节、头部和脊椎的运动细胞核中，主要参与控制生物体的运 动功能。在m a r cb a r t o l i 、j e a n p i e r r et e r n a u x 等人的研究中，通过在 大鼠脑纹状体中注射s t r i a t i n 反义寡核苷酸链，在体内降低s t r i a t i n 的 蛋白表达量，发现在下调s t r i a t i n 的表达后大鼠大量减少了夜间活动， 这证明s t r i a t i n 可作为钙离子感受器，参与脑纹状体树突内处于动态 平衡的钙离子依赖的钙调素调控的活动【4 1 1 。大量的研究证实s t r i a t i n 蛋白家族在真核生物的发育中起到了很重要的作用，特别是在神经系 统的发育过程中。在上述试验中应用s t r i a t i n 反义寡核苷酸技术下调 蛋白表达量，使约8 0 的s t r i a t i n 蛋白在培养的脊髓运动神经元表达 量下降，并且明显损伤神经元树突的生长。此研究可证明s t r i a t i n 蛋 白对于神经元树突的正常生长和发育及其功能的发挥是很重要的【4 0 1 。 推测由于神经元的正常生长发育需要钙离子信号调控的各项活动， s t r i a t i n 蛋白可能通过其特殊的结构域参与钙离子钙调素调控的信号 通路调控生理活动。另外，通过研究s t r i a t i n 蛋白家族的伴侣蛋白 p h o c e i n l 4 2 1 ，可以推测s t r i a t i n 、s g 2 n a 和z i n e d i n 可能参与树突棘的 硕十学位论文 囊泡运输，是通过结合p h o c e i n 蛋白形成复合体行使功能。 类固醇受体( s 瑚r s ) 是一种配体激活的转录因子用于调控基因 表达，s h r s 同样可通过类固醇介导快速的、非基因组的细胞活化4 引。 在q i n gl u 等关于s t r i a t i n 组成膜信号复合体的研究中，发现在血管 内皮细胞中，雌激素类固醇受体q ( e rq ) 通过膜上小窝蛋白定位 的s t r i a t i n 蛋白介导e rq 激活有丝分裂原激活蛋白( m a p k ) 、磷脂 酰肌醇3 - a k t 激酶和内皮型一氧化氮合酶( e n o s ) 4 s l 。在此过程中， s t r i a t i n 直接结合到e rq1 8 3 2 5 3 的氨基酸序列区段，其蛋白结构的 小窝蛋白绑定区域介导e ra 结合在细胞膜上，同时其螺旋卷曲绑定 区域和钙离子钙调素连接区域可作为e rq - - gqi 复合体的支架。雌 激素激活的m a p k ，a k t 和e n o s 在s t r i a t i n 与雌激素类固醇受体q 间的相互作用被阻断时会受到抑制，这些酶所调控细胞生理活动随即 停止；但是对依赖e r 调控雌激素作为驱动因素的报告质粒没有影响。 这些结果确认了激活快速的、非基因组的由雌激素介导的下游信号通 路需要s t r i a t i n 作为分子支架 4 y l 。另外s g 2 n a 也可与发挥与s t r i a t i n 相似的作用，定位e r q 于内皮细胞质膜，可激活e r q e n o s 膜信号 复合物。 在2 0 0 0 年m o r e n o 提出假设：s t r i a t i n 和s g 2 n a 能将p p 2 a 的催 化亚基c 靶定位成钙离子依赖信号通路的成员。这个假设是基于在裂 解的n i h 3 t 3 细胞系复合物中进行的s t r i a t i n 、s g 2 n a 和p p 2 a 的催 化亚基c 之间的免疫共沉降实验【4 7 1 。但目前还没有直接证据证明这 点。s t r i a t i n 和s g 2 n a 能够直接与p p 2 a 催化亚基c 结合并排斥掉其 斑马鱼s t r i a t i n 基因的分子克隆及发育表达分析 它已知的b 调节亚基的结合，并催化s g 2 n a 和s t r i a t i n 去磷酸化【4 8 1 。 装配好的p p 2 a 全酶复合体可调节其他底物的去磷化及磷酸化状态， 因此将s t r i a t i n 和s g 2 n a 作为p p 2 a 调节亚基b 家族的b 亚族【4 2 】。 在对不同步的鼠类成纤维细胞的研究中证实，当s t r i a t i n 和s g 2 n a 作 为调节亚基b 与p p 2 a 结合时，m m o b l 可作为此时p p 2 a 全酶的靶 蛋白，被p p 2 a 特异的去磷酸化岬7 】。m m o b l 类似y e a s t 中m o b l 蛋白，其对于胞质分裂和结束有丝分类后的细胞骨架重建有重要作 用。结果显示虽然在不同步的鼠类成纤维细胞中没有可检测到的磷酸 化，但m m o b l p p 2 a 复合物中的p p 2 a 被奥克酸抑制时， m m o b l p p 2 a 复合物上的丝氨酸位点被磷酸化。同时，p p 2 a 的抑制 也导致s t r i a t i n 、s g 2 n a 和三种未确认的蛋白的高度磷酸化。这揭示 了这些蛋白都受到p p 2 a 的调节【4 9 】。另* fm m o b l 与s t r i a t i n 和s g 2 n a 间接免疫荧光实验也证实它们之间有相互作用并集中浓缩在细胞核 膜旁【5 2 1 。s t r i a t i n 和s g 2 n a 与p p 2 a 核心酶的相互作用将p p 2 a 全酶 定位于特定的亚细胞部位，而s t r i a t i n 家族蛋白的多蛋白质蛋白质相 互作用域【5 3 1 ，使它们具有多重功能。因此s t r i a t i n p p 2 a 复合物被认为 是多个信号通路的桥梁。 基于以上几点，s t r i a t i n 家族功能可概括如下图： 硕 _ 似论正 。、 一 te l l 幢n a l l n j ： 蜘t h 亡饥m d ii n m i n 州l i l n d n t m小t 川 i i ch 叫n pp a n i di n 雌p a h t f 、i n “n1 帅p t n t c d m 珊f 恤l _ l n j i i hi r n l l yf 犯m h mm 川* _ h n i _ hta 。jj m c n 可 i 匹i 中二aa n d ( 、西i lh a l l lp h l n d 卅d 删啊4 、t n 】t _ “p 1 1 ”3 r o l ei ni h cj kl t h u ma l li h e iin i c n d _ tl i ：n hl m 1 i 、i 1 i “n j l _ nr 蛳i i yh t m 坩四”f n a l 邵 ：r o dc n d 蚩 磷酸酶p p 2 a 参与如信号转导、细胞癌变等各种各样的生命 活动，调控多种生理生化反应，在整个细胞酶系中占有重要地位。而 冈为s t r i a f i n 和s g 2 n a 作为p p 2 a 的调节砸基b 家族成员对p p 2 a 的 亚定位及功能的影响，以及s t r i a t i n 家族蛋白本身所独白具有的特殊 功能，我们克隆了斑马角s t r i a t i n 基因伞长，并在斑马龟组织和胚胎 发育中进一步研究s t r i a t i n 基因的表达水甲变化，这项1 作刘 深入 研究s t r i a t i n 家族和s t r i a t i n 与p p 2 a 组成复合物的功能冉积极的意义 1 ；i 斑马鱼s t r i a t i n 基因的分子克隆及发育表达分析 第二章斑马鱼s t r ia tin 基因的c d n a 克隆 1 实验材料、试剂、仪器和方法 1 1 实验材料、试剂和仪器 1 1 1 选材原因 所选斑马鱼品种：蓝斑马鱼 本研究为什么要选取斑马鱼为实验材料? 由于斑马鱼与人类的基因有8 7 的同源性，这意味着在斑马鱼 身上所做的药物实验得到的结果在大多数情况下也与人体的情况相 符，因此对斑马鱼的研究受到研究者的广泛重视。 1 1 2 斑马鱼大脑组织材料 取饲养或新买来的雌斑马鱼或雄斑马鱼成鱼，冰冻处死，放在用 冰铺好的解剖台上迅速解剖。用镊子取大脑组织放入e p 管中在液氮 中速冻，若沾有血液可以先在预冷好的p b s 中清洗后速冻，在8 0 。c 冰箱中保存备用。 1 1 3 试剂及配制、购买和仪器 用o 1 5 mn a c i 和0 0 1 mt r i s 配制t b s 。用0 5 m lt w e e n 2 0 加入 1 lt b s 配制t b s t 。用lo o m mn a c i 和5 0 m m p h8 0 t r i s 配制a n n e a l b u f f e r 。p r o t e i ne x t r a c tb u f f e r ( p e b ) 本实验室白行配制。 在生工s a n g o n 购买t r y t o n e 胰蛋白胨、a g a r 琼脂粉、y e a s te x t r a c t 酵母提取物、p h y t o m y c i n 链霉素、p e n i c i l i n 青霉素、a m p i c i l l i n 氨苄青 霉素，p c r 胶回收试剂盒，另外本实验所设计的引物其合成及后续的 硕十学位论文 测序也由此公司完成。转化用的e c o l id h 5 a 采用本实验室所保存的 大肠杆菌菌种。在o m e g a 生物公司购买总r n a 提取试剂盒 e z n a t mt o t a lr n ak i ti i ( r 6 9 3 4 0 1 ) ；在天根生物公司处购买 p c rt a q m i x 酶和d n am a r k e r ；在m b i 公司购买r e v e r t a i d t mf i r s t s t r a n dc d n as y n t h e s i sk i t ( # k 1 6 2 1 ) 反转录试剂盒和蛋白质彩虹 m a r k e r ；在t a k a r a 生物公司代理处购买c l o n e t e c h 公司的s m a r t t m r a c ee d n aa m p l i f i c a t i o nk i t ( c a t n o 6 3 4 914 ) 试剂盒，克隆载体 p m d l 8 一t 和h sd n ap o l y m e r a s e p c r 高保真酶；在s i g m a 公司代理 处购买蛋白杂交用的小鼠i b - a c t i n 单克隆抗体，h r p 交联抗鼠多克隆 二抗；在a b c a m 官网上购买鼠抗人的s t r i a t i n 多克隆抗体；在科泰公 司订购p i e r c e 公司的h r p 荧光底物显色液即a b 液。 1 2 实验方法 1 2 1 总r n a 提取 使用o m e g a 生物公司的总r n a 提取试剂盒即e z n a t m t o t a lr n ak i ti i ( r 6 9 3 4 0 1 ) ，用其所配套的提取柱、e p 管和试剂提 取z e b r a f i s h 大脑组织中的总r n a 。 1 2 2 根据同源序列设计引物 在n c b i 的g e n b a n k 数据库中搜索已知物种中的s t r i a t i n 基因的 各种同源序列。选取在人类、家鼠、大鼠和金鱼等多个物种中s t r i a t i n 的e d n a 序列，使用j e l l y f i s h 和o l i g o 等软件分析比较在不同物种中 s t r i a t i n 基因序列的差异，并在高保守的同源序列区域内用引物设计 软件p r i m e rp r e m i e r6 0 设计出有效特异的p c r 引物。 斑马鱼s t r i a t i n 基因的分子克隆及发育表达分析 引物序列见如下列表： 表1 用于克隆s t r i a t i ne d n a 的引物 f o r w a r dp r i m e rr e v e r s ep r i m e r s t lc c a g c g g t g a g c a g t g t tt g t t g t c g t a g a a g c g g a t g s t 2a g c g a g t g a c a g a a c a a g a ga c a c t g c t c a c c g c t g g o pg c a a c g g c a g g a c g a g a p u p m s t 3 i pc c g c t t c t a c g a c a a c an u p o pu p mt r c t c g t c c t g c c g t l g c t s t 5 i pn u pg a a a c a c t g c t c a c c g c t g g 表2r a c e 的接头引物序列由c l o n e t e e h 试剂盒提供 l o n g 吣a r a c g a c t c a c t f 蛆a g g g c a a g c a g 咖1 ：c 蛆a a c g c a g a g t p r i m e r u p m s h o n c r a 舶f a c g a c t c a c l ：f 蛆a g g g c p r i m e r n u pa a g c a g t g g t a l c a a c g c a g a g t 1 2 3 合成斑马鱼c d n a 的第一条链 用所提取斑马鱼的脑组织中的总r n a 经定量大约l u g 作为模板 进行反转录反应。用r e v e r t a i d t mf i r s ts t r a n de d n as y n t h e s i sk i t 的反 转录试剂盒所提供的o l i g o ( d t ) 1 8 作为特异引物，严格按照反转录试 剂盒所提供的p r o t o c o l s 进行反应。 1 2 4r a p i da m p li f i c a ti o no fc d n ae n d s 克隆 r a c e 克隆是一种通用的克隆未知基因全长的方法。其克隆策略 为先克隆出基因的中间部位的一段，再根据这段中间序列和按基因的 m r n a 的两末端序列特点所加上的特别的接头序列，设计好特异引物 分别向5 端和3 端扩增片段，最后克隆出未知基因的c d n a 全长序 列。基本原理如下图所示： 硕士学位论文 ( 引自c l o n t e c hu s e rm a n u a l ) ： 弦 + 撇 吣? _ 船- c 黼d s 二 刚。 is 一慨一 r n a k n ah y b r i d 。茹暖c 筌丝磐堂堂堂堂竺竺筌堂嚣 群蛉鲁一 f 觚6 b 聃删y 。o 嗽 l 皇l 琵磐艘笾塑煞擞型塑州”“气翳钟精 f j “蔫舅刊鲥m 尹7镭开 一” ，。l = = = = = = 两r r 丌1 2 广：t i 磊意2 1 茹矛2 。附岬 ，曼三! _ 王_ = = ：= = = = = = 置坳i 1 6 矿m c e 盹r f i r s t m t m d 啊p c r p i n c c h o r l n v e p o r a r t t e i o d n r e 口e o f $ u a p t p 馆s 如n e l a i n e