（细胞生物学专业论文）一个拟南芥多效突变体相关基因的克隆及其功能的初步研究.pdf

兰卅f 大学硕士学位论文 一个拟南芥多效突变体相关基因的克隆及其功能的初步研究 摘要 利用t - d n a 介导的启动子诱捕载体( p r o m o t e rt r a pv e c t o r ) 转化拟南芥，我们分离到 了一个多效突变体，称为1 5 5 系。本文在整体水平、组织水平和细胞水平上深入研究了该 突变体的表型和结构的变化、通过突变体与野生型之间的杂交对其遗传背景进行了分析， 并运用分子生物学手段对突变体相关基因进行了克隆和定位，初步探讨了该基因的表达模 式和功能。 1 1 5 5 突变造成了植株形态发育方面的许多变异，包括：子叶圆而肥厚，下胚轴粗短， 根长缩短，成熟植株叶片数目减少，叶柄缩短，叶片远基端叶尖向下卷曲，叶色深绿：从 营养生长到生殖生长的转化延迟7 天左右，整个植株的高度明显低于野生型。 2 突变体茎顶端分生组织( s h o o ta p i c a lm e r i s t e m ，s a m ) 的石蜡切片观察表明：1 ) 1 0 d 苗龄1 5 5 的s a m 扁平，不像野生型形成拱形：2 ) 2 1 d 时，1 5 5 的s a m 和c 2 4 一样呈拱 形，但是s a m 的两侧p z ( p e r i p h e r a lz o n e ) 较野生型平坦。此外，原套第二层( l 2 ) 细胞 呈非垂周分裂；3 ) 第3 0 d 时，突变体的s a m 依然停留在营养型分生组织阶段，而野生型 的s a m 已经分化为生殖型( 花序茎) 分生组织。 3 与野生型相比，1 5 5 的子叶脉序也发生了改变：子叶维管脉络有2 - 6 个小的末端脉 序从中脉或侧脉延伸出来，远基端有额外的闭合或非闭合环，并且子叶脉络中环的形状和 位置不规则排列。 4 组织化学检测表明，g u s 基因在1 5 5s a m 的肋状区和叶原基特异性地表达。 5 遗传分析表明，1 5 5 系是一个由细胞核基因控制的单基因隐性突变体。 6 1 5 5 的生长发育特性与激素关系的研究结果显示，插入突变造成了1 5 5 对激素响应 状态的微弱改变，i a a 和g a 3 对c 2 4 下胚轴伸长的抑制均比1 5 5 更为明显。但是，1 5 5 对 这两种激素响应的总体趋势和c 2 4 是一致的。 7 用1 1 a i l p c r 对突变体的相关基因进行了克隆，通过核苷酸序列比对分析发现， 该基因位于第号染色体上，与热激蛋白1 0 1 ( h s p l 0 1 ) 相关。 8 通过r t - p c r 对正常生长条件下野生型和突变体中h s p1 0 1 相关蛋白基因的表达水 平进行了初步的检测，发现在正常生长条件下两者的表达水平基本一致。但在热激处理后， 突变体中该基因的表达未明显检测到，还有待于进一步验汪。另外还发现，1 5 5 对高温敏 感，在3 0 。c 生长条件下，1 5 5 的生长受到严重抑制，不能进入生殖生长阶段。 以上实验结果表明，t - d n a 插入确实引起了插入位点基因功能的改变，进而导致了突 兰州大学硕士学位论文个拟南芥多效突变体相关基因的克隆及其功能的初步研究 变体一系列形态、结构和发育的改变，说明该基因编码的h s p l 0 1 相关蛋白可能是调节拟 南芥正常生长发育信号通路中极为重要的一员，通过参与细胞问的信号转导及调控而影响 子叶维管发育，茎顶端分生组织的形成与维持以及整体形态的发育。 关键词：拟南芥：t d n a 插入；生长素；维管模式；茎顶端分生组织；热激 蛋白；t a i l p c r 兰州大学顾士学位论文一个拟南芥多效突变体相关基因的克降及其功能的初步研究 a b s t r a c t a p l e i o t y p i cm u t a n tn a m e d1 5 5w a si s o l a t e d ，u t i l i z i n gp r o m o t e rt r a pv e c t o rt ot r a n s f o r m a r a b i d o p s i s i t sa l t e r a t i o n so fp h e n o t y p ea n ds t r u c t u r eh a v eb e e nf u r t h e rs t u d i e da tw h o l e ， o r g a n i ca n dc e l l u l a rl e v e l s b ym e a n so fb a c k c r o s sb e t w e e nw i l d t y p ea n dt h em u t a n t ，i t s g e n e t i cb a c k g r o t m dh a sb e e na n a l y z e d m o r e o v e r ，t h et r a p p e dg e n eh a sb e e nc l o n e da n dl o c a t e d t h r o u g hm o l e c u l a rt e c h n i q u e s b a s e do na l lt h e s er e s u l t s ，t h ee x p r e s s i o np a r e ma n df u n c t i o n so f t h ey a p p e dg e n eh a sb e e nd i s c u s s e d 1 n o t i c e a b l ep l e i o t r o p i cp h e n o t y p e sw e r ea s s o c i a t e dw i t ht h em u t a n t ，i n c l u d i n gr o u n d e d c o t y l e d o n s ，s h o r t e n e dh y p o c o t y l sa n dt o t a ll e n g t h ，s m a l l e rr o s e t t el e a v e sw i t hs h o r t e n e dp e t i o l e s a n dd o w n w a r dl e a f t i p ，s h o r t e ra n dt h i c k e rs i l i q u e s ，l e s si n t e m o d e sa n dd e l a y e d f l o w e r i n gt i m e 2 h i s t o l o g i c a la n a l y s e si n1 5 5p l a n t sd e m o n s t r a t et h a t1 ) c zo f1 0 d a y o l ds e e d l i n g si n1 5 5 w a sa l m o s tf l a t ，w h i c hw a sn o ta sv a u l t e da sc 2 4 2 ) a td a y2 1 ，t h ec zw a sv a u l t e d ，b u tt h ep z ( p e r i p h e r a lz o n e ) l o s ti t so r i g i n a lu p h i l lh o g b a c k b e s i d e s ，n o n a n t i c l i n a lc e l ld i v i s i o n sw e r e o b s e r v e di nm u t a n tt u n i c al 2l a y e r 3 ) o b s e r v a t i o n sa t d a y3 0r e v e a l e dt h et r a n s i t i o nf r o m v e g e t a t i v et or e p r o d u c t i v eg r o w t hw a sd e l a y e d ( f o ra b o u t7d a y s ) i nt h em u t a n t 3 c o t y l e d o n so ft h em u t a n th a dad i s o r d e r e dv a s c u l a rn e t w o r kw i t ha d d i t i o n a lu n c l o s e dt o p l o o pa n d2 - 6f r e ev e i ne n d i n g s ，w h i c he m a n a t e df r o mm i d d l ea n dl a t e r a lv e i n s 4 g u sa s s a yo fs a ms h o w sb l u es t a i n i n g s p e c i f i c a l l ye x p r e s s e di n r i bz o n ea n dl e a f p r i m o r d i u mi nt h em u t a n t 5 g e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e st h a tt h em u t a n tp h e n o t y p ei n15 5w a sc a u s e db yas i n g l e r e c e s s i v e ，n u c l e a rm u t a t i o n 6 t h ep h y s i o l o g i c a lr e s u l t sr e v e a lt h a t1 5 5w a sl e s ss e n s i t i v et o e x o g e n o u sa u x i na n d g i b b e r e l l i nt h a nc 2 4 ，b u tt h eg r o s st r e n dw a ss i m i l a ri nb o t h15 5a n dc 2 4 7 b yu s i n g1 a l l - p c r ，t h et r a p p e dg e n eh a sb e e nc l o n e da n dt h el o c a t e do nc h r o m o s o m ei v a n di t sp r o p e r t yw a sr e l a t e dt oh s p l 0 1 8 ，r t - p c rw a sp e r f o r m e di nn o r m a lg r o w t hc o n d i t i o n s ，d i s p l a y i n gt h ee x p r e s s i o nl e v e lo ft h e t r a p p e dg e n ew a si d e n t i c a li nb o t hc 2 4a n d1 5 5 h o w e v e r , t h ee x p r e s s i o nl e v e lo f t h es a m eg e n e w a s n td e t e c t e da p p a r e n t l yi n1 5 5a f t e rh e a ts h o c ka t3 7 | 。c p r i m a r yh e a ts h o c kt r e a t m e n t 兰州大学硕士学位论文 一个拟南芥多漱突变体相关基因的克隆及其功能的初步研究 d e m o n s t r a t e st h em u t a n tw a sn o t i c e a b l ys e n s i t i v et oc o m p a r a t i v e l yh i g ht e m p e r a t u r eb e c a u s et h e g r o w t ho ft h em u t a n tw a ss e r i o u s l yi n h i b i t e dw h i c hc o u l d n o tt r a n s i tt or e p r o d u c t i v ep h a s ef r o m v e g e t a t i v e i nc o n c l u s i o n ，t h et - d n ai n s e r t i o ni n d e e dc a u s e dt h ef u n c t i o n a la l t e r a t i o n so ft h et r a p p e d g e n e ，a n df u r t h e r a f f e c t e das e r i e so fc h a n g e si n v o l v i n gi nm o r p h o l o g y ，s t r u c t u r ea n d d e v e l o p m e n t ，w h i c hr e v e a l st h ep r o t e i nr e l a t e dt oh s p l 0 1e n c o d e db yt h et r a p p e dg e n em a yp l a y a ni m p o r t a n tr o l ei nt h es i g n a lp a t h w a yw h i c hi sn e c e s s a r yf o rr e g u l a t i n gn o r m a lg r o w t ha n d d e v e l o p m e n to fa r a b i d o p s i s ，t h r o u g hw h i c hs a md e v e l o p m e n ta n dv a s c u l a rp a t t e m i n g f o r m a t i o na sw e l la st h em o r p h o g e n e s i so f p l a n t sa r ea f f e c t e d k e y w o r d s ： a r a b i d o p s i s t - d n ai n s e r t i o na u x i nv a s c u l a rp a t t e r n i n gs a m h e a ts h o c kp r o t e i n t a i l p c r 三竺型皇塑翌圭兰些丝苎一 二尘垫堕至兰整窒錾竺塑茎茔里竺塞堕丝茎垫堡塑塑生塑塑 c z e d t a g a g f p g u s h s p i a a m s n p t i i o c o d p c r p z r a m r p m r ，r _ p c r r z s a m s d s 1 1 a i l p c r 1 二d n a t i b a t r i s 缩略语 c e n t r a lz o n e d i s o d i u me t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t a t e g i b b e r e l l i n g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n b e t a - g l u c u r o n i d a s e h e a ts h o c kp r o t e i n 3 - i n d o l e a c e t i ca c i d m u r a s h i g ea n ds k o o g n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e1 1 o r g a n i z i n gc e n t e r o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p e r i p h e r a lz o n e r o o ta p i c a lm e r i s t e m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r r i bz o n e s h o o ta p i c a lm e r i s t e m s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r t r a n s f e r r e dd n a 2 , 3 ，5 一t r i i o d o b e n z o i ca c i d t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 中心区 乙二胺四乙酸 赤霉素 绿色荧光蛋白 d 一葡萄糖苷酸酶 热激蛋白 吲哚乙酸 m s 培养基 新霉素磷酸转移酶i i 组织中心 光密度 聚合酶链式反应 边缘区 根顶端分生组织 每分钟转速 反转录p c r 肋状区 茎顶端分生组织 十二烷基硫酸钠 热不对称交错p c r 转移d n a 2 ，3 ，5 一三碘苯甲酸 三羟甲基氨基甲烷 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究 所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、 观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：金蕴日期：丝巫：i ：箩 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰州大 学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保存或 向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅； 本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用 学位论文或与该论文盲接相关的学术论文或成果时，第署名单位仍然为兰州 大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：二奎率导师签名：壤日 期：乡嘭；丝f 兰州大学硕士学位论文一个拟南芥多效突变体相关基因的克隆及其功能的 | ：j j 步硎究 第一章文献综述 植物功能基因组学是植物后基因时代研究的核心内容，它强调和应用整体的( 基因组水 平或系统水平) 实验方法分析基因组序列信息、阐明基因功能。其特点是采用高通量的实 验方法结合大规模的数据统计计算方法进行研究，基本策略是从研究单一基因或蛋白质上 升到从系统角度研究所有基因或蛋白质。在植物功能基因组学的研究中，拟南芥和水稻是 两种最常用的模式植物。植物功能基因组学是一个崭新的研究领域，其研究方法正在不断 发展和完善，主要包括利用t - d n a 插入( t - d n ai n s e r t i o n ) 、转座子技术( t r a n s p o s o n ) 、基 因表达系列分析技术( s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) 、表达序列标签技术( e x p r e s s e d s e q u e n c et a g ，e s t ) 、生物芯片( b i o l o g i c a lc h i p s ) 等。 1 t - d n a 介导的基因诱捕技术 功能基因组学研究的内容是将基因的功能与序列联系起来，经典的遗传学方法是对基 因序列进行原位修饰，然后观察该修饰对宿主组织产生的影响。然而，将突变引起的表型 变化与基因修饰的分子机制联系起来很难，主要基于以下两个原因：首先，许多基因在功 能上是冗余的，与其它在序列水平相关或不相关的基冈分担着相互重叠的功能；其次，许 多基因能在多个发育阶段产生作用，这些基因的突变可以导致早期致死或者是高度的多效 性表型，这种多效性表型会掩盖一个基因在特定途径中扮演的角色( p a t e i a ，2 0 0 0 ) 。 近年来，利用报告基因整合t - d n a 鉴定基因的技术已经得到了相当程度的发展。这一 技术在果蝇中称为增强子检测( b e l l e n ，1 9 9 9 ) ，并且在小鼠的发育生物学中也被证实是非常 有力的工具。不同类型的诱捕系统也得到了发展，其主要不同点在于使用的报告基因结构 有差异，因而可以分为启动子诱捕，基因诱捕和增强子诱捕。 1 1 启动子诱捕的原理 报告基因可用于构建三种基本类型的基因诱捕：增强子诱捕，启动子诱捕，以及基因 诱捕。在增强子诱捕体系中，报告基因融合了一个弱的启动子，通常包含了一个t a t a 盒 以及转录起始点，它不能单独使报告基因表达。当恰好插在某个增强子附近时，在该增强 子的作用下，报告基因表达( p a t i c i a ，2 0 0 0 ) 。启动子诱捕以及基因诱捕包含一个无启动子的 兰州大学硕上学位论文 个拟南芥多教突变体相关基因的克隆及上功能的初步研究 报告基因( 如无启动子的g u s 基因) ，当报告基因随机插入到基因组d n a 中的转录单位并 且位置正确时可以产生转录融合。在启动子诱捕中，报告基因须插入到一个外显子中，产 生转录融合。相反，基因诱捕结构中的报告基因前包含一个或多个接合受体序列，这些序 列能够保证报告基因插入在内含子中时也能表达。从接合供体到接合受体位点的接合产生 上游外显子序列与报告基因的融合。除了转录融合，启动子诱捕和基因诱捕还能够产生翻 译融合，从而为蛋白质定位提供相关信息。 启动子诱捕是对特异表达的启动子或基因的鉴定。如p o l a r i s 基因的鉴定就是在包含 了一个启动子诱捕基因p a g u s b i n l 9 的转化系a t e m i o i ( a r a b i d o p s i s 历a b a n ae c o t y p ec 2 4 ) 中得以分离的( t o p p i n ge ta 1 ，1 9 9 1 ，1 9 9 4 ；c a s s o ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。一旦启动子得以鉴定，还可启 动目的基因的异位表达，因而可以此来检验该基因在发育中的表达模式。国外科研工作者 曾在一个增强子诱捕系中分离到了一个根冠特异性的启动子( t s u g e k ia n df e d o r o i f , 1 9 9 9 ) ， 并用该启动子启动白喉毒素基因( d t - a ) 的表达以检测去除根冠细胞后的发育结果。 基因诱捕为基因鉴定提供了强有力的工具，其优点在于并不需要产生可见的突变。这 一优点可以胜任经典遗传学方法不能分析的两类基因：功能冗余基因和多效基因。到目前 为止，通过基因诱捕已经发现了很多新基因，如f r u i t f u l l ( g ue ta 1 ，1 9 9 8 ) ，p r o l i f e r a ( s p r i n g e re ta 1 1 9 9 5 ) ，p o l a r i s ( t o p p i n ga n dl i n d s e y 1 9 9 7 ) 等。 1 2 报告基因的种类 1 2 ，13 - g l u c u r o n i d a s e 细菌剁刚( “f 删) 基因是在植物中普遍使用的报告基因。g u s 蛋白非常稳定，当与其它 蛋白发生融合时仍能保持活一陛( j e f f e r s o n e ta 1 ，1 9 8 7 ) 。g u s 活性可以通过使用很多的底物以 组织化学染色来检测，这些底物购买方便。但缺点是组织化学染色具有破坏性，g u s 检测 不能用于活体。g u s 活性的检验非常灵敏，甚至能在单个细胞中检验出来。对于许多植物 来晚，购买g u s 底物的费用限制了其在大型植物中的使用或是大规模筛选。 1 2 2 g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n g 和慕因编码的绿色荧光蛋白( g f p ) 是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白。绿色荧 光蛋白近年来被用作植物报告基因，因为g 和基因适用各种牛物基因的转化。并且检测方 法简便，无需底物、酶、辅助因子等物质。g f p 是自发荧光，检测时只需提供合适的光照 就能被检测出来。g f p 活性的检测是无破坏性的，能够在活体中进行，并且能够全程监控 ( 王关林，方宏筠，2 0 0 2 ) 。 兰州大学硕士学位论文个拟南芥多效突变体相关基凼的克隆及其功能的初步研究 1 2 3l ct r a n s c r i p t i o nf a c t o r 幻是玉米类m y c 转录因子r 基因家族的一员，调节花青素苷合成。幻在异源植物中 表达可产生花青素苷的累积( g o l d s b r o u g he ta 1 ，i 9 9 6 ) ，这。一特点对于该因子作为报告基凶是 非常有利的，因为该基因表达产物的检测并不需要昂贵的底物并且也无破坏性。这种可见 的报告因子对于农田生长植物的大量筛选具有吸引力，而此时用光照检测g f p 是不实际 的。不过， l c 一编码的转录因子高水平地表达会产生表型效应，例如，l c 在拟南芥中高水 平的表达将增加毛状体形成数目。 1 3 z d n a 作为转化载体的特点 t - d n a 是农杆菌t i 质粒上的特异d n a 片段，它能将外源基因高频转移到高等植物中 并能使之有效表达。已知t - d n a 的两侧是一对2 5 b p 长的同向重复序列，称为t - d n a 的 边界区( b o r d e rs e q u e n c e s ) 。t _ d n a 的左侧边缘区称作l b 序列，右侧边缘区称作r b 序列。 一般认为t i 质粒边缘区序列是相当保守的，并且在t - d n a 转移到植物细胞并整合到核基 因组的过程中是必需的。其r b 序列决定了t - d n a 的毒性和转移能力，该序列可引导 t - d n a 从根瘤土壤杆菌细胞转移到寄主植物细胞，并整合到核基因上。l b 序列能限定被 转移t - d n a 片段的大小范围( 王自章等，2 0 0 1 ：陆晓春和薛庆中，2 0 0 2 ) 。由于t - d n a 能 随机整合到植物基因组中，转化频率相当高，并产生大量独立插入的后代群体，所以已广 泛应用于植物基因的分离与鉴定中。 1 4 诱捕基因的获得 1 4 1 文库筛选( 1 i b r a r ys c r e e n ) 当t - d n a 插入比较复杂，并用其它方法难以分离时，可以构造突变体基因组文库，用 与t - d n a 左侧或右侧同源的序列从完整的或不完整的基因组文库中获得t - d n a 及其侧翼 的植物d n a 序列。 1 4 2 质粒拯救( p l a s m i dr e s c u e l 质粒拯救是利用t - d n a 基因诱捕标签的ec o l i 中含有的质粒复制起点和选择分子标记 分离t - d n a 和植物基因。从植物突变体分离到基因组d n a 后，用一限制性内切酶进行完 全酶切，将酶切所得的d n a 片段与载体连接，获得的植物d n a 克隆转化到大肠杆菌中。 这些大肠杆菌培养于抗性筛选培养基上，以分析质粒d n a 中是否存在t o d n a 标签 ( w a l d e n ，2 0 0 2 ；杨奇志等，2 0 0 4 ) 。 1 兰州大学硕士学位论文一个拟南芥多效突变体相关基因的克隆及其功能的初步研究 1 4 3 t a i l - p c r 法( t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r ) 该技术是通过插入的t - d n a 序列设计3 个嵌套的特异性引物，分别和简并引物组合， 进行连续的p c r 循环，利用不同的退火温度选择性地扩增，使t - d n a 及其侧翼植物d n a 成为主要扩增对象，所获得的片段可以直接用作探针标记和测序。t a i l p c r 技术简单易 行，反应高效灵敏，产物的特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得植物侧翼d n a 序列( l i ua n d r o b e r t 1 9 9 5 ) 。 1 4 4 基因步行法( g e n ew a l k e r ) 可以从一特定d n a 序列开始扫描该基因组上游和下游的序列，并且可用来识别基因。 从突变体中分离到的基因组d n a 经限制性内切酶酶切后产生平末端，在平末端连接一具 有3 粘性末端的接头，该接头与p c r 的2 个锚定引物( “内”引物和“外”引物) 碱基互 补。同时根据t - d n a 设计其它锚定引物。第一轮p c r 时，在“外”引物和t _ d n a 之间进 行扩增。反应混合物稀释后进行第二轮p c r ( 接头的“内”引物和t - d n a 之间) ，得到的 p c r 产物分离并测序后，可用来识别t - d n a 序列及其侧翼的植物基因组序列。 除t - d n a 介导的诱捕技术外，第二种基因鉴定的常用方法即差异显示筛选法，是基于 表达模式的，在一定时空或特定条件限制f 表达的基因可以通过该法得以分离。近来，差 异m r n a 显示技术( r e u b e ra n d a u s u b e l ，1 9 9 5 ) 的灵敏性已经得到提高，加之微阵列及基 因芯片技术也得以发展，使得许多基因的表达模式得以分析( r i c h m o n da n ds o m e r v i l l e ， 2 0 0 0 ) 。然而，这些技术的使用被分离r n a 探针的组织材料所限制，因为瞬时表达的基因 通常是低水平的，或者只在很小数量的细胞里表达，所以鉴定难度很大。 基因诱捕技术已经被证明是植物发育生物学研究中非常有力的工具，其最大贡献是产 生了组织或细胞特异性标记。拟南芥基因组的测序工作已经完成，因此基因诱捕技术在拟 南芥基因组基因功能的研究中逐渐扮演重要角色。 2 茎顶端分生组织的研究概况 2 1 顶端分生组织的结构特点 植物体是分生组织的产物。在胚胎发生时期，被子植物产生两种不同的顶端分生组织， 根顶端分生组织和茎顶端分生组织( s h o o ta p i c a lm e r i s t e m ，s a m ) ，它们作为器官发生中新 细胞的持续来源在植物的整个生命周期中起作用。这两种分生组织分别是由位于根和茎顶 端的一小群形态上未分化的、具有多能性的细胞组成的。根分生组织产生初级根和侧根细 胞，茎顶端分生组织产生叶、茎以及花，它们构成了植物体的地e 结构。因此，根和茎顶 4 兰州大学硕士学位论文 一个拟南芥多效突变体相关基因的克隆及其功能的初步研究 端分生组织的正确功能对于植物正常的生长和发育非常关键。 在营养生长阶段，从s a m 的侧翼产生了叶原基。在营养生长末期，在环境和内部因素 的诱导下，植物体开始经历向开花和生殖生长的转化。在这个阶段，茎伸长，二级s a m 在叶片的叶腋形成，花分生组织在初级和二级s a m 的侧翼产生。初级的生殖性s a m 也被 称为花序茎分生组织。花分生组织可产生四类侧向的同中心环器官，称为轮生体。萼片是 最早从轮生体的最外层生成的，接着是花瓣在第二轮生体产生，雄蕊在第三轮生体产生。 花分生组织在中心雌蕊形成后消耗殆尽，花分生组织最后终止。 关于茎顶端分生组织的形态和结构，目前主要有两种描述方式：一种是“原套一原体” 学说( t u n i c a - c o r p u st h e o r y ) ；另一种是细胞组织学的分区学浣( c y t o h i s t o l o y i c a lz o n a t i o n t h e o r y ) 。 “原套一原体”学说的基本证据是，对很多植物茎顶端分生组织的切片观察表明，大 部分植物的茎顶端分生组织的外层细胞呈十分有规律的排列。这些外层细胞形状规则，大 小均一，主要进行垂周分裂，被称为“原套”( t u n i c a ) 。根据植物种类的不同，原套一般分 为两层，分别被标记为l 1 ，l 2 。而这两层或三层细胞之下的细胞被称为“原体”( c o r p u s ) ， 被标记为l 3 。由于“原体”细胞再向下，就出现了明显的细胞分化，因此，根据这种学说， 茎顶端分生组织是由“原套”和“原体”两个部分构成的。 细胞组织学的分区学说对茎顶端分生组织的描述主要依据对茎顶端分生组织区域内细 胞衍生关系的分析。这一学说认为，茎顶端分生组织区域内有一些始终保持分裂能力的细 胞，称为中心区( c e n t r a lz o n e ，c z ) 。由这些细胞衍生出的其他分生细胞，则根据其出现的 位置分为边缘区( p e r i p h e r a lz o n e ，p z ) 和肋状区( r i bz o n e ，r z ) 两类。 虽然高等植物都具有“顶端生长”的特点，但从过去对不同植物茎顶端分生组织的形态 学观察结果来看，上述两种描述方式在适用的植物种类上是有所不同的。如，裸子植物的 茎顶端分生组织并不显示出“原套一原体”的构成方式，而有的植物则由于茎顶端分生组织 的细胞特征比较均一，不显示出分区特点。尽管如此，这两种方式还是为我们认识茎顶端 分生组织提供了基本的框架。 2 2 茎顶端分生组织的研究现状 影响茎顶端分生组织的基因众多，大多只是对其功能有所了解。茎顶端分生组织的功 能可分为三类：( 1 ) 自身干细胞的维持；( 2 ) 干细胞的扩增；( 3 ) 器官原基的发生。近来， 在拟南芥中分子与遗传学的研究丌始阐释其潜在的分子机制。 兰卅f 大学硕士学位论文一个拟南芥多效突变体相关基因的克隆及其功能的初步研究 2 2 1 干细胞的维持 在w u s c h e l ( w l t s ) 突变体中，没有形成维持自身的干细胞( l a u xe ta 1 ，1 9 9 6 ) 。w u s 基 因编码一个同型域转录因子并且在s a m 中心区的o c ( o r g a n i z i n gc e n t e r , 是s a m 中心区 的一个小区域) 表达( m a y e r e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。w u s 在器官原基中的异位表达抑制了器官形成， 并且诱导了干细胞标志基因c l v 3 ( s c h o o f e ta 1 ，2 0 0 0 ) 的表达。干细胞维持和分化发生在 s a m 的邻近区域，因此需要准确地平衡以保持整个植株生命过程中干细胞库的大小。 c l c l a v a t a ) ( c l v l 、c l v 2 、c z v 3 ) 基因的突变打破了这个平衡并导致干细胞积累使 c z 增大( c l a r ke ta 1 ，1 9 9 3 ；c l a r ke ta 1 ，1 9 9 5 ；l a u f se ta 1 ，1 9 9 8 ；k a y e sa n d c l a r k ，1 9 9 8 ) 。遗传 和生化分析表明三类c l v 基因通过同一种信号途径起作用( c l a r ke ta 1 ，1 9 9 5 ；k a y e sa n d c l a r k ，1 9 9 8 ) 。c l v l 编码一个l r r 一受体激酶，c l v 2 是一个与之类似的蛋白，但缺少细胞内 激酶域，c l v 3 编码一个小肽( c l a r ke ta 1 ，1 9 9 7 ；j e o n ge ta 1 ，1 9 9 9 ) 。推测c 是从干细胞分 泌的，并且作为配体结合到c l v l 一c l v 2 受体复合物，激活下游信号活动( c l a r k ，2 0 0 1 ；f l e t c h ， 2 0 0 2 ；r o j oe ta 1 ，2 0 0 2 ；l e n h a r da n dl a u x ，2 0 0 3 ；t r o t o c h a u de ta 1 ，1 9 9 9 ) 。w u s 表达域在c l v 突变体中增大，除此之外，c l v 3 的异位表达抑制了w u s 从其自身启动子转录( l e n h a r dm a d l a u x ，2 0 0 3 ) 。这些发现表明，c l v 信号通过抑制w u s 在相邻细胞的转录限制了 o c ( o r g a n i z a t i o nc e n t e r ) 的大小。通过w u s 诱导c 的表达，w u s c l v 3 相互作用有效 地调节着干细胞群的大小，从而在干细胞与o c 之间建立了一个负反馈循环( s c h o o fe t a 1 ，2 0 0 0 ) 。近来的研究表明，c l v 3 肽离开干细胞( r o j oe ta 1 ，2 0 0 2 ；l e n h a r da n dl a u x ，2 0 0 3 ) 。 这便引出一个问题，即c l v 3 怎么才能不抑制w u s 在o c 中的转录? 异位表达研究表明， w u s 结合到c l v l 能限制c l v 3 移动的范围，意味着o c 周围细胞，卜- 的c l v l 受体能有效 地防止c l v 3 到达o c ，从而防止w u s 转录被抑制。更高水平的c l v 信号控制可能发生在 细胞里面。如遗传研究表明蛋白磷酸化酶k a p p 和p o l t e r g e i s t 抑制c l v 下游信号( s t o n e e ta 1 ，1 9 9 8 ；y ue ta 1 ，2 0 0 0 ；y ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 2 2 2 干细胞的扩增 侧翼器官原基的发生是在距干细胞库一定距离的s a m 侧翼检测到的，表明分生组织顶 端的居中区域能抑制器官形成。这一抑制是怎么发生的呢? 一个重要因子是册0 0 t m e r i s t e m l e s s 岱t m ) 。s t m 编码一个k n o x 蛋白家族的同型域转录因子并且在整个分生 组织表达，但是不在初始的器官原基中表达( l o n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) 。k n o x 基因在很多植物种中 过表达导致细胞分化延迟从而使叶形态发生改变。在其它研究中，异位分生组织的形成表 明k n o x 基因在提高分生组织细胞一致性方面扮演了蕈要的角色( r e i s e re ta 1 2 0 0 0 ) 。s t m 兰、i 1 人学硕上学位论文 一个拟南芥多效突变体相关基困的克降及其功能的初步研究 突变体幼苗出现器官融合，表明其s a m 细胞消耗殆尽( b a r t o na n dp o e t h i g ，1 9 9 3 ；e n d r i z z ie t a 1 ，1 9 9 6 ) 。遗传学研究表明，s t m 通过抑制两个促进器官形成的基因a s y m m e t r i c l e a v e s l 口s 1 ) 和a s 2 将器官发生限定在分生组织侧翼特定的区域( b y r n ee ta 1 ，2 0 0 0 ；o r ie t a 1 ，2 0 0 0 ；s e m i a r t ie ta 1 ，2 0 0 1 ；b y r n ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。因此，s t m 通过允许k n o x 表达阻止了分 生组织分化。与s t m 比较，单个下游k n o x 基因的突变，k n a t l 不能使分生组织终止， 表明f 游组分的冗余( b y r n ee ta 1 ，2 0 0 2 ；d o u g l a se ta 1 ，2 0 0 2 ；v e n g l a te ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 s t m 和w u s 功能的比较表明，虽然其各自的突变体显示相似的缺陷表型，但两个基因 在很大程度上是独立的，并且在对s a m 的调节上功能是互补的( g a l l o i se ta 1 ，2 0 0 2 ；l e n h a r d e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。当w u s 在s a m 中心区特异性地控制干细胞一致性时，s t m 则在整个分生组 织顶端将器官发生控制在s a m 侧翼( g a l l o i se ta 1 ，2 0 0 2 ；l e n h a r de ta 1 ，2 0 0 2 ) 。s t m 的一个可 能的作用是允许干细胞的子细胞在器官形成发生前扩增到足够的数目。 2 2 _ 3 器官原基的发生 器官形成发生在茎顶端分生组织的p z ，在那里来自三个分生组织层的1 5 3 0 个细胞形 成一个j | ：j 始的器官原基( i r i s ha n ds u s s e x ，1 9 9 2 ；f u m e re ta 1 ，1 9 9 2 ) 。器官原基的其中一个标志 是在器官奠基细胞中s t m 表达的负渊控。它将允许a s i 和a s 2 基因在器官原基中起始表 达。a s 编码m y b 域蛋白，a s 2 编码一个具有半胱氨酸重复和亮氨酸拉链的新蛋白。因 此，分生组织细胞和器官细胞命运的决定依赖于两组对抗的抑制剂间的平衡，即s t m 和 a s 基因。 2 2 4 细胞状态的后生调节 如上所述，茎顶端细胞经历了一系列的分化状态。在基因表达过程中相应的变化是怎 样产生的? 有几个例子能说明染色质结构的调节起到了重要作用。 f a s c i a t a ( f a 基因的突变产生了一个增大的s a m ，其l 1 和l 2 层结构被破坏，该 突变使得植株很容易簇生并形成缩短的 艮( k a y ae ta 1 。2 0 0 1 ) 。厨肼和觑舵基因编码两个 c a f 1 复合物