（细胞生物学专业论文）微管正端跟踪蛋白tip150的鉴定与功能研究.pdf

摘要 摘要 微管骨架在细胞的有丝分裂、细胞迁移、神经分化和细胞内物质运输等生 命重要过程起到不可或缺的作用。在细胞内，有效地对它的动态性进行调节对 于完成这些功能至关重要。微管正端跟踪蛋白是一类特异定位到聚合微管正端 的微管结合蛋白。它们能够凋控微管的动态性，影响微管与细胞器和信号分子 的作用，以及调节微管骨架网络所受到的力。它们对细胞形态和功能的多个方 面都产生重要影响。为了更加深入的了解微管正端跟踪蛋白作用网络及其作用 微管的机制，我利用信息学的方法鉴定了新的微管正端跟踪蛋白t i p l 5 0 。它能 够与微管末端蛋白e b l 相互作用和共定位到聚合微管的末端。并且t i p l 5 0 能与 微管解聚酶m c a k 作用，且相互作用受到a u r o r ab 激酶的抑制。进一步的r n a 干扰实验显示t i p l 5 0 和m c a k 的微管末端定位均依赖于e b l ，且t i p l 5 0 通过增 强m c a k e b l 之间的相互作用发挥协助m c a k 聚集到微管末端的功能。这些结果 有助于我们进一步了解整个微管正端跟踪作用的动态性与可塑性。 同时，我的初步结果表明t i p l 5 0 可能以四聚体的形式存在起到不同骨架间 桥梁的作用。这暗示着t i p l 5 0 在细胞迁移、纺锤体星状微管定位等细胞活动中 潜在的生物学功能。 关键字：细胞骨架，微管，微管结合蛋白，微管正端跟踪蛋白，m c a k ，e b l ，t i p l 5 0 ， a u r o r ab a b s 仃a c t a b s t r a c t t h em i c r o t u b u l e ( m t )c y t o s k e l e t o n o r c h e s t r a t e sc e l l u l a r p l a s t i c i t y a n d d y n a m i c su n d e r l y i n gm o 印h o g e n e s i sa n dc e l ld i v i s i o n g r o w i n gm tp l u s e n d sh a v e e m e r g e da sd y n a m i cr e g u l a t o 叫m a c h i n e 叫i nw h i c hs p e c i a l j z e dp r o t e i n s ，c a l l e d p l u s - e n d t r a c k i n gp r o t e i n s ( + t i p s ) ，b i n da n dg o v e m t h ep l u s e n dd y n a m i c se s s e n t i a l f o rc e l ld i v i s i o na n dm i g r a t i o n h o w e v e r ，t h em o l e c u l a rm e c h a n i s m su n d e r l y i n gt h e p l u s e n dr e g u l a t i o nb y + t i p s a ts p i n d l ea n da s t r a lm th a v er e m a i n e de l u s i v e h e r e w es h o wt h a tt i p15 0i san o v e l + t i p t i p15 0b i n d st oe b1 锄v 豇r da n dc o 1 0 c a l i z e s w i t he b1 a tt h em tp l u s e n d s 砌v f l ，d s u p p r e s s i o no fe b le l i m i n a t e st h e p l u s e n d 一1 0 c a l i z a t i o n o ft i p15 0 i n t e r e s t i n 9 1 y ， t i p15 0a l s ob i n d sm c a k ，a m t - d e p o l y m e r a s e1 0 c a l i z i n gt ot h ep l u s e n do fm t s u p p r e s s i o no ft i p 15 0 d i m i n i s h e st h ep l u s e n dl o c a l i z a t i o no fm c a k i m p o i r t a n t l y ，a u r o r ab m e d i a t e d p h o s p h o r y l a t i o nd i s r u p t st i p l5 0 一m c a ka s s o c i a t i o n 伽v f 护d ir e a s o nt h a tt i p15 0 f a c i l i t a t e st h ee b 1 一d e p e n d e n t1 0 a d i n go fm c a k o n t om t p l u s e n d sa n do r c h e s t r a t e s t h ed y n a m i c sa tt h ep l u s e n do fm t s m yp r e l i m i n a 巧r e s u l t sa l s om d i c a t et h a tt i p 15 0i sat e t r a m e ra n dm a yp l a ya n i m p o r t a n tr o l e i n c r o s s l i n l ( i n gd i f f e r e n tt ) ，p e so fc y t o s k e l e t o n ，w h i c hs u g g e s ta p o s s i b l e 向n c t i o no ft i p 15 oi nt h ep r o c e s so fc e l lm i g r a t i o n ，a s t r a lm i c r o t l j b u l e p o s i t i o n 酣口， k e yw o r d s ：c ) ，t o s k e l e t o n ，m i c r o t u b u l e ，m i c r o t u b u l ea s s o c i a t e dp r o t e i n s ，m i c r o t u _ b u l e p l u s e n dt r a c k i n gp r o t e i n s ，e b1 ，m c a k ，t i p 15 0 ，a u r o r ab i i 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所旱交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或 撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作 了明确的说明。 作者签名： 一薹：兰一签字日期：型罕：皇：! 兰 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学 拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构 送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 日公开口保密( 年) 作者签名：差t 卜岂作者签名：蔓! 鱼 签字日期：型灶 导师签名： 签字日期：匦 怍p 雪l7 6 ，2 第l 章绪论 1 1 概述 第1 章绪论微管正端跟踪蛋白研究进展 微管正端跟踪蛋白( m i c r o t u b u l ep l u s e n dt r a c k i n gp r o t e i n s ) 是大类 在进化上保守的蛋白质( a k h m a n o v a & s t e i n m e t z ，2 0 0 8 ) 。其成员的氨基酸序列， 分子结构以及功能不尽相同，但它们都有一个共同的特点：特异地在聚合微管的 正端聚集。它们之间通过一些蛋白质结构域相互作用，这些蛋白质结构域之间适 当的相互作用强度保证了其能适应细胞内实时变化的环境。微管正端跟踪蛋白的 作用广泛，它们能够调控微管的动态性，影响微管与细胞器和信号分子的作用， 以及调节微管骨架网络所受到的力。它们对细胞形态和功能的多个方面都产生重 要影响。 细胞骨架如何动态地与其他细胞内结构作用与连接，如何调节有丝分裂，胞 内运输，细胞运动等一系列重要的过程，直到现在我们对于这些问题仍然没有很 好的答案，依旧是我们研究的重点。此外，细胞骨架蛋白质与人类很多的疾病相 关，比如癌症，细菌感染，心血管疾病，炎症以及神经退行性疾病等。而微管， 微丝及中间纤维，这细胞骨架的三大成员中，人们对微管的研究尤其关注。很多 细胞骨架的活动都与微管有着密切的关系。在细胞内，又存在大量能与微管结合 的蛋白质，它们或是使微管稳定，或是让微管变得不稳定，从而在时空上调节微 管的动态性。微管结合蛋白对微管动态性调节的作用方式也存在多样性。有的微 管结合蛋白与游离的微管蛋白异二聚体结合，比如0 p 1 8 ；有的直接结合在微管 的外壁上，比如经典的t a u 蛋白和m a p 4 ；有的特异地与微管末端结合，也就是 我们将介绍的微管正端跟踪蛋白质。 第1 章绪论 1 2 微管 在介绍微管正端跟踪蛋白质之前，我们有必要对微管发现的历史和微管的基 本结构做一个简单的回顾。 1 2 1 微管研究简史 在二十世纪五、六十年代，由于电镜样品固定方法的改进，在样品中常常能 看到细长的杆状结构。这个时期的研究者要么没有注意到这个现象，要么认为这 些细长的结构不重要，不值得考虑，或者有的人称它们为普通的传送小管 ( c a n a l i c u l i ) ，内质网，纤维结构。直到s 1 a u t t e r b a c k 和l e d b e t t e r 及p o r t e r 对它们的结构进行详细的研究，指出其存在的广泛性( w e l l s ，2 0 0 5 ) 。 其实早在二十世纪初人们在分别对有丝分裂时期细胞和细菌鞭毛进行观察 的时候( b r i n k l e y ，1 9 9 7 ) 就发现明显的纤维状长线结构，那个时侯被称为小纤维 ( f i b r i l l a e ) 。但是当时的研究者对于这些结构是真实存在的还是固定引起的假 象一直争论不休。直到电镜的出现使人们第一次能在高分辨率下研究细胞内的亚 结构，人们才广泛而明确的认识到纤维状结构的存在。当时的一项研究这样描述 微管：“内质网的长管结构，它的直径大概有1 8 纳米( 和我们现在观察的2 5 纳 米非常接近) ，结构非常直”。后来的人们发现如果样品在用锇酸固定后，再用戊 二醛这样的交联剂固定，管状结构的分辨率能得到很大的提高。技术上的进步最 终使人们认识到这些管状结构的广泛存在，并用微管来称呼它们。 我们对于微管组成的分析得益于自然界中存在一些能作用于微管的药物，其 中最早用于科学研究的是秋水仙素。上个世纪六十年代，t a y l o r 和他的学生 b o r i s y 等利用秋水仙素作为工具，研究微管蛋白的组成( b o r i s y t a y l o r ，1 9 6 7 a ： b o r is y t a y l o r ，1 9 6 7 b ) 。他们鉴定出组成微管的最小单元分子量为1 1 0 k d 左 右的蛋白质。后来发现1 1 0 k d 的蛋白质在变性条件下其实是分子量为5 5 k d 的0 【， p 异二聚体( b r y a n & w i l s o n ，1 9 7 1 ) 。到了七十年代，w e i s e n b e r g 在体外成功纯 化和重组微管( w e i s e n b e r g ，1 9 7 2 ) 。有了纯化的蛋白质就能够分析微管聚合的特 性，就做特异性的抗体，分析微管在细胞内的定位特点。到了八十年代，m i t c h i s o n 提出微管的动态不稳定模型以及发现一系列起重要调节作用的微管结合蛋白 ( m i t c h i s o n k i r s c h n e r ，1 9 8 4 a ) 。这一时期，v a l e 还在神经细胞中发现马达 蛋白( v a l ee ta 1 ，】9 8 5 ) 。到现在，与微管有关的蛋白质数以百计，其在细胞内 的广泛功能也越来越多被揭示出来。 第1 章绪论 1 2 2 微管的基本结构 微管为管状中空结构，外径大约为2 5 纳米，内径约为1 5 纳米，厚度约为5 纳米。组成微管的最小单元为a ，p 微管蛋白头尾相连形成的异二聚体。若干个 异二聚体再头尾相连形成原纤维。细胞内的微管大部分由1 3 根原纤维通过侧向 作用形成。两个原纤维之间的作用并不与轴向垂直，而是绕着轴向以大约1 0 度 左右沿左手螺旋上升。在体外，组成微管的原纤维数目从1 1 1 5 不等，其中以 1 4 居多。 在早期鞭毛的电镜图片中人们就能清楚地看到微管有1 3 根原纤维。沿着相 互作用的亚基绕微管一周则上升三个位置，所谓的3 一1 3 螺旋( 图1 1 ) 。由于微 管蛋白有a ，p 之分，微管蛋白亚基的侧向作用也有两种方式( d e s a i m i t c h i s o n ， 1 9 9 7 ) 。如果微管蛋白以仅，p 亚基交替的方式排列，那么1 3 根原纤维的微管每 一处的侧向作用都一致，均为0 【一p ，称为a 型( 图1 1 中的1 3 p f _ a ) 。如果微管 蛋白是a 与q 结合，p 与p 结合，绕过一圈以后上升三个位置的亚基将是不一样 的。也就是说某两根原纤维之间的侧向作用和其他地方不一致，为0 【一p ，此处称 为接缝( s e a m ) 。这种结构的微管称为b 型( 图1 1 中的1 3 p f - b ) 。后来的电镜 研究发现细胞内绝大部分都以1 3 一b 型存在。这是因为o 【一o 【或者p p 结合在能量 上比o 【一b 结合要稳定。由于这个原因，体外组装条件下3 一1 4 螺旋和4 一1 5 螺旋的 微管也采取相同亚基侧向结合的方式( a m o s h i r o s e ，2 0 0 7 ：m 0 0 r e s ，2 0 0 8 ) 。 不同的是3 1 4 微管有接缝，而4 一1 5 微管没有。为了顾及亚基之间侧向作用，两 者原纤维的走向与中心轴成一定角度。而1 3 一a ，和1 3 一b 中原纤维与中心轴完全 平行。细胞里面3 1 4 或者4 1 5 的微管很少，可能是因为这对于细胞来说不太经 济，它们比起3 1 3 来到达相同的距离需要更多的微管蛋白。 1 2 3 微管的动态不稳定性 为了更好地理解微管的动态不稳定性这一特性，我们有必要对描述微管动态 性的假说进行简单地回顾。在w e i s e n b e r g 体外成功重组微管以后( w e i s e n b e r g ， 1 9 7 2 ) ，研究者很快就发现微管聚合到达一定的阶段会达到一个平台期，整个聚 合微管的吸光度达到平衡。最初是认为达到平衡态时，微管蛋白在两个微管末端 发生缓慢的结合和解离的过程，这样微管的中间部分完全没有变化，长度也没有 改变。但接下来研究马上就宣告这个假说是错误的( m a r 9 0 1i s & w i l s o n ，1 9 7 8 ) 。 同位素实验发现即使在平衡态，还是有源源不断加入到微管。因此为了保证整体 上的平衡，最直观的解释是在一端聚合而另一端解聚，所谓踏车( t r e a d m i l l i n g ) 。 第1 章绪论 这个假说比较好的解释了一些宏观的现象。直到后来m i t c h i s o n 利用纯化的中心 体作为微管组织中心研究发现( m i t c h i s o n k i r s c h n e r ，1 9 8 4 b ) ，如果把在低浓 度微管蛋白条件下组装的微管放到高浓度下，并不是所有的微管都变长。因为微 管的另一端被中心体封闭，按原来的解释如果浓度增加所有微管的长度都将增 大。所以只能是原来的假说不对。宏观的平衡态并不代表每根微管处于平衡态， 微管无时无刻不在动态变化着，要么解聚，要么聚合，两者偶尔相互转换。 m i t c h i s o n 称之为动态不稳定性( d y n a m i ci n s t a b i l i t y ) ( m i t c h i s o n & k i r s c h n e r ， 1 9 8 4 a ) 。微管的这个特性更有益于它与细胞内结构建立联系，这对于微管行使生 物学功能非常有意义。有人称这是细胞生物学上最早用单分子思想来解释宏观现 象的例子( v a l e ，2 0 0 8 ) 。后来人们利用实时成像技术在体内和体外都证实了这个 假说( h o r i o & h o t a n i ，1 9 8 6 ：w a l k e r8 ta 五1 9 8 8 ) 。现在己为绝大部分研究者 所接受。 微管的动态不稳定性涉及到相关的四个参数：微管聚合和解聚的速率，崩塌 ( c a t a s t r o p h e ，聚合到解聚的转变) 和重建( r e s c u e ，解聚到聚合的转变) 的 频率( 图1 2 ) 。当微管处于聚合状态，g t p 一微管蛋白添加到微管末端的片层结 构，添加的速率与微管蛋白浓度相关。在这之后，g t p 很快就会水解成g d p 。g t p 微管蛋白转变为g d p 微管蛋白会使原纤维的曲率变大，有向外弯曲的趋势，但是 这种趋势被g t p 帽的存在所限制。如果在某一时刻聚合的速率小于水解的速率， 那么稳定微管的g t p 帽就会消失，微管将会处于解聚状态。此时g d p 一微管的原 纤维因为没有外因的约束将弯曲成所“羊角 结构( r 锄s 7 h o r n s ) ，最终将从 微管末端解离下来。微管解离的速率非常快，而且与微管蛋白浓度没有关系。 4 第l 章绪论 1 3 p f a1 3 p f b1 4 p f1 5 p f 图11 徽管的结构。微管的摹本结构单元是d b 异二壤体。n ，b 异二聚体首尾 相连形成原纤维。原纤维再通过侧向作片j 形成中空的微管。微管的外径和内径分别 约为2 5 和1 5 纳米，管壁的厚度约为5 纳米。图示中，蓝色和绿色小球分别代表q 和b 微管蛋白单体。微管外围的黄线和红线则表示微管蛋白沿侧向周以后达到的 位置。在1 3 根原纤维的微管中蛋白亚基2 间以相同弧基或者不同弧基的方式进行 侧向结合，所以存在1 3 p f - 和1 3 p f b 的结构。1 3 p 卜 。1 3 p f b 和p f 均是绕一 周以后上一三十亚基，1 5 p f 绕一周足上升4 个亚基。】3 p 卜b 和1 4 p f 结构都有接缝 的存在。1 3 p 卜 年ub 的原纤维与中心轴完全平行。为了顾及亚基侧向的作j j t1 4 p f 和1 5 p f 的原纤维走向和中心轴不平行( l n o s h l r ，2 0 0 7 m 0 0 r e s 。2 0 0 8 ) 。 第l 章绪论 图12 微管的动态不稳定性。动态不稳定性的重要特点是在整个反应体系中的任 何时刻间时存在聚合和解聚的微管。6 t p 微管蛋白添加到微管末端的片层结构t 在 遮之后很快g t p 就会水解成6 d p 。g 1 p 微管蛋白转变为g d p 微管蛋白会使原纤维的 曲举变大，有向外弯曲的趋势，但是这种趋势被g t p 帽的存在所限制。如果由于某 一时刻聚合的速率小于水解的速率，那么稳定微管的6 t p 帽就会消失微管将会处 于解聚状态此时g d p _ 微管的原纤维因为没有外因的约束将弯曲成所谓“羊角” 结构( r 衄s h o r n s ) ，虽终将从微管丰端解离_ 卜来。 心 m 幽 胁 研 时 y 第1 章绪论 1 3 微管正端跟踪蛋白 微管的动态性受到大量微管结合蛋白的调控。微管正端跟踪蛋白是一类特异 定位到聚合微管正端的微管结合蛋白。它们大部分在真核细胞内都比较保守。最 近的研究着重在解析微管正端跟踪蛋白怎样与微管作用及微管正端跟踪蛋白之 间的结合方式，进而深入了解它们调节微管动态性的方式。现在越来越多的证据 表明，微管正端跟踪蛋白作用网络在协调细胞内结构的组织方面起到举足轻重的 作用。 下面将重点介绍已知几个主要微管正端跟踪蛋白家族的结构与功能关系。首 先我们将对微管正端跟踪蛋白的结构特点进行总结，概述微管正端跟踪蛋白与微 管正端结合的机制。然后我们将论述微管正端跟踪蛋白作用网络的分子机制，以 及它的生物学意义。最后我们将介绍现在有关微管正端跟踪蛋白如何在调节微管 动态性方面的机制，以及微管骨架与细胞内其他结构复杂的相互作用。 从第一个微管正端跟踪蛋白c l i p l 7 0 发现到现在( p e r e zp a - ，1 9 9 9 ) ，已经鉴 定出大量微管正端跟踪蛋白家族，它们彼此在结构上的相关性并不大( a k h i n a n o v a s t e i n m e t z ，2 0 0 8 ) 。现有的微管正端跟踪蛋白家族成员包括马达蛋白，微管结 合蛋白和跨膜蛋白等等。这些蛋白质的长度短到一两百个氨基酸，长达数千个氨 基酸。它们一般都存在多个结构域或者多个亚基。与蛋白质大小上的干差万别相 反，它们在功能和定位上却很相似，因此很难通过其功能来对它们进行严格分类。 但是微管正端跟踪蛋白有一个很明显的特点：它们在序列上存在有限的几个进化 上保守的结构域，重复序列或是线性特征序列。根据其微管正端结合域，我们可 以把微管正端跟踪蛋白分为以下几类。下面将简要介绍它们的分子结构与重要的 结构特征。这些知识将有助于我们理解微管正端跟踪蛋白如何利用结构域之间的 作用聚集到微管末端和组建蛋白质作用网络。 1 3 1 末端结合蛋白家族( e n d - b i n d i n gf a m i yp r o t e j n s ) 末端结合蛋白( e n d - b i n d i n gp r o t e i n s ，髓) ( s u ，1 9 9 5 ) 结构上包括保守的 氨基端和羧基端，两者之间有一段不太保守的连接序列。e b 蛋白氨基端的c h 结 构域( c a l p o n i nh o m 0 1 0 9 y ) 介导其与微管的结合。c h 在三维结构上为球形 ( h a y a s h i i k u r a ，2 0 0 3 ) 。c h 结构域一般在微丝结合蛋白与信号分子中存在 ( g i m o n ae ta 1 ，2 0 0 2 ) ，也在一些信号分子中介导蛋白质与蛋白质相互作用。同 时c h 结构域也在其他微管结合蛋白中存在，比如c l a m p ( d o u g h e r t y ，2 0 0 5 ) 。通 7 第1 章绪论 过晶体结构的比较，人们发现在h e c l 和n u f 2 蛋白质的氨基端实际上也是c h 结 构域，尽管在序列上相关性比较低。h e c l 和n u f 2 在微管与染色体动点连接中起 决定性作用( c i f e r r ie ta l ，2 0 0 8 ：w e ie ta l ，2 0 0 7 ) 。 e b 蛋白的羧基端包含一端卷曲螺旋( c o i l e d c o i l ) ，由它来负责e b 蛋白的 二聚化( h o n n a p p ae 右a j ，2 0 0 5 ) 。由a 螺旋组成的卷曲螺旋是一个常见的蛋白质 寡聚化结构域，在微管正端跟踪蛋白中常常能看到它们的身影。e b 蛋白质的卷 曲螺旋结构域与保守的髓同源结构域( e n d - b i n d i n gh o m o l o g yd o m a i n ， e b h ) 有部分重叠( h o n n a p p a 日舌a - ，2 0 0 5 ：s l e p ，2 0 0 5 ) ( 图1 3 ) 。高度保守的e b h 结构域的表面有一个疏水沟和极性环状结构。e b 蛋白羧基端的尾巴是段柔性结 构，大约包括2 0 3 0 个氨基酸。其羧基最末端是高度保守的e e y f 序列。c 【一微管 蛋白亚基和c l i p l 7 0 也存在同样的序列( h o n n a p p ap 芒a - ，2 0 0 5 ：k o m a r o v a ，2 0 0 5 ： w e i s b r i c h ，2 0 0 7 ) ，后面会重点叙述它在微管正端跟踪蛋白复合物组装中起的作 用。 1 3 2 细胞骨架结合、甘氨酸富集蛋白质( c y t o s k e l e t o n a s s o c i a t e dp r o t e i n giy ric hp r o t ein s ， c a p giyp r o t e ；n s ) c l i p s 和d y n a c t i n 复合物最大的亚基p 1 5 0 n ”。在分子结构上存在一定的相似 性。它们的羧基端都包含c a p g l y 结构域( g a l j a r t ，2 0 0 5 ：s c h r o e r ，2 0 0 4 ) 。其 中c l i p s 有两个c a p g l y 结构域，p 1 5 0 8 h 鲥只有一个。通过c a p g l y 结构域，c l i p s 和p 1 5 0 8 州可以与微管和e b 蛋白作用。c a p g l y 三维结构也为球状，包括一个特 别的疏水沟。这个疏水沟里面包含高度保守的g k n d g 氨基酸序列和一些典型的甘 氨酸是皂基( h a y a s h ip 方a ，2 0 0 5 ：h o n n a p p a ，2 0 0 6 ：l i ，2 0 0 2 ：s a i t o ，2 0 0 4 ：s l e p v a l e ，2 0 0 7 ：w e is b “c h ，2 0 0 7 ) 。这些氨基酸对于维持球状结构域起到很重要 的作用。 在c l 工p s 和p 1 5 0 引涮分子上，也存在负责二聚化的卷曲螺旋。c l i p s 分子上 有两个卷曲螺旋结构域，之间有柔性结构分开。这样使得它可以形成对折的分子 内相互作用( l a n s b e r g e n ，2 0 0 4 ) 。在c l i p l 7 0 的羧基端还有一些其他结构域( 图 1 3 ) ，其中包括两个重复的金属离子结合域和一个e e y f 序列( p i e r r ee 芒a ， 1 9 9 2 ) 。c l i p l 7 0 同源物c l i p l l 5 与c l i p l 7 0 相比在氨基端非常相似，都是两个 c a p - g l y 结构域然后紧接着卷曲螺旋，但c l i p l l 5 少了与c l i p l 7 0 相对应的羧基 端( d ez e e u w ，1 9 9 7 ) 。 第1 章绪论 1 3 3 含有碱性氨基酸丝氨酸富集序列的蛋白质 在有些微管正端跟踪蛋白中，存在一些富集碱性氨基酸和丝氨酸的序列。这 些序列的保守性不是很大，但是通过比对也能发现一些关键性残基相对比较保 守。根据预测，这些区域的分子柔性可能比较大，这也许是一直没有相应晶体结 构的原因。这些碱性氨基酸丝氨酸富集序列往往介导了微管正端跟踪蛋白与微 管、e b 蛋白和其他蛋白质的作用。其中最典型的例子包括腺瘤性结肠息肉 ( a d e n o m a t o u sp 0 1 y p o s i sc o l i ，a p c ) 蛋白( n a t h k e ，2 0 0 4 ) ，牙殖酵母的类a p c 基因k a r 9 ( m i l l e r & r o s e ，1 9 9 8 ) ，微管一微丝交联因子( m i c r o t u b u l e a c t i n c r o s s l i n k i n gf a c t o r ，m a c f ) 或者微丝交联家族一7 ( a c t i n c r o s s l i n k i n g f a c t o r 一7 ，a c f 7 ) ( j e f f e r s o ne 芒a ，2 0 0 4 ) ，c l i p 结合蛋白( c l i p a s s o c i a t i n g p r o t e i n s ，c l a s p s ) ( g a l j a r t ，2 0 0 5 ) ，属于膜蛋白的基质结合分子一l ( s t i m 一1 ) ( g r i g o r i e v ，2 0 0 8 ) ，以及我们最新发现鉴定的t i p l 5 0 ( j i a n gp 芒a - ，2 0 0 9 ) 。 上面这些蛋白质都能与微管直接结合。这一大类中还有一些蛋白质不能与微管结 合直接作用但可以与髓蛋白结合，包括m e l a n o p h i l i n ( w up 芒a 厶2 0 0 5 ) ，神经 向导子一1 ( m a r t i n e z l o p e z ，2 0 0 5 ) ，果蝇中的r h o g e f 2 ( r o g e r sp 舌a 五2 0 0 4 ) 。 值得注意的是，c l i p s 和p 1 5 0 订”。蛋白也包含一小段碱性氨基酸丝氨酸富集序列， 它们在与微管结合中也起到一定的作用( c u l v e r h a n l o np ta 五2 0 0 6 ： h o o g e n r a a de 手a ，2 0 0 0 ) 。 1 3 4h e a t 和w d 一4 0 重复序列蛋白 x m a p 2 1 5 d i s l 蛋白家族在序列上有非常显著的特点。它们的氨基端都含有 一个或几个t o g 结构域( g a r d 臼fa ，2 0 0 4 ) 。x m a p 2 1 5 d i s l 蛋白通过这些结构 域与微管和微管蛋白质单体作用。t o g 结构域包括若干个h e a t 重复序列。晶体 结构显示t o g 为多个0 【螺旋组成的片层结构，这点与c h 和c a p g l y 结构域很不 一样。c l a s p s 蛋白也含有类t o g 结构域，但是它们的具体作用现在还不清楚。 l i s l 蛋白包括氨基端的l i s 同源蛋白结构域和羧基端的w d 4 0 重复序列( k im ， 2 0 0 4 ：t a r r i c o n e ，2 0 0 4 ) 。因为l i s l 自己不能结合到微管或者是微管末端，它 必须要通过1 】l r d 4 0 与c l i p l 7 0 ，驱动蛋白d y n e i n 以及d y n a c t i n 作用以后才能定 位到微管末端( c o q u e l l e ，2 0 0 2 ：t a ip 芒a 五2 0 0 2 ) 。 9 第1 章绪论 1 3 5 微管马达蛋白 现在发现能在微管正端定位的马达蛋白既包括微管正向马达t e a 2 ，k i p 2 ，负向 马达n c d ，也包括没有马达活性而具有微管解聚酶活性的k i n e s i n 一1 3 家族马达 蛋白m c a k ，k l p l o a 和k a r 3 ( w u 口舌a - ，2 0 0 6 ) 。动力蛋白d y n e i n 也能在一些细 胞中追踪微管正端。这些马达蛋白负责定位的序列通常不在马达结构域，而且它 们的微管末端定位通常依赖于其他正端结合蛋白。此外微丝骨架马达m y o s i nv 也能定位到微管末端，不过也需要借助于其他微管正端跟踪蛋白。 1 0 第l 章绪论 m ”e 勘 p 一，a 卜_ + _ c 旧“卜 二二二二 一量_ 二二二) 二二二卜 p m 伸”c = h i c 一( = ) ( = ) t = j ( = ) 帆e = = j c j 一_ h 一 s t _ c ：j “- 。f _ 口 h _ d - h m ， ( ) ( ) ) ( ) e = 卜一 0 b r d m 一口- m 。h 卜 图l3 撒管正端跟踪蛋白分粪。按照决定微管末端定位的结构域对微管正端跟踪蚩白进行 分类。阁中依次标w i 的蛋白质有即蛋白( e b l 2 邝) ，c p _ g 1 y 蛋向质c l i p s 和p 1 5 0 9 l u e d ， 含有碱性氨基酸丝氨酸富集序列的蚩白质t i p l 5 0 、c l s p s 、 p c 、 c f 7 、s t i m l 和 m e l a n o d h i l i n ，h 醴t 、耶重复序列蛋自质l l s l 和n p 2 1 5 ，马达蛋nm c a i ( 和n 。注意： 幽中只标示山和本综述相关的结构域。 i；。l|一il：8l 口o。一口一o- 第1 章绪论 蛋白家族结构域相互作用分子主要功能 e b l 2 3 ( h ) c h ，c o i l e d c o i l ， 绝大部分微管正端抑制崩塌，促进微管持 m a l 3 ( s p ) ，b i m ( s c ) e b h ，e e y f 跟踪蛋白续生长：招募其他微管 正端跟踪蛋白 c l 工p 1 7 0 ，c l i p l1 5 ( h ) c a p g l y e b s c l a s p s 促进微管重建，招募 t i p l ( s p ) ，b i k ( s c ) c o i1 e d c o il c l i p l 7 0 ，p 1 5 0 8 1 “。6d y n e i n 到微管末端， d c l i p l 9 0 ( d m )b a s i c s e rr i c h s t u 2 ，k a r 9 ，t e a l微管与皮层，动点，囊 z i n cf i n g e r ，e e y f t e a 2 ，k i p 2 ，l i s l泡作用 x k c m l p 1 5 0 山“，s s m 4 ( s p )c a p g l y d y n e i n ，c l i p l 7 0帮助d y n e i n 结合到货 n i p l o o ( s c ) ，n u d m ( a n ) c o il e d c o il 物，调节d y n e i n 连续 b a s i c s e rr i c h 行走的能力 c l a s p l 2 ( h ) ，c 1 s 一2 ( c e )t o g li k ee b s 稳定微管，微管与动 p e 9 1 ( s p ) ，s t u l ( s c ) b a s i c s e rr i c hc l i p l l 5 点、皮层和高尔基的连 0 r b i t m a s t ( d m )c l i p l 7 0 接 a p c ( h )a r m a d i l l o ，s a m p e b s 稳定微管，微管与皮层 d a p c i 2 ( d m ，n oe b lr e p e a t s ，c o i l e d c o i l x k c m l 动点的连接 b i n d i n gd o m a i n ) b a s i c s e rr i c h x m a p 2 1 5 ，c h t o g ，s t u 2 ( s c ) t o g e b s ，b i k l ，k a r 9 稳定微管，提高微管聚 d i s l ，a l p l 4 ( s p ) ，m s p s ( d m ) x k c m l合速度，微管与皮层作 d d c p 2 2 4 ( d d ) ，z y g 一9 ( c e )用 a c f 7 ( m a c f 2 ) c h ，p l a k i n ，s p e c t r i n e b s 稳定微管，微管与微 s h o t k a k a p o ( d m ) g a s 2 ，b a s i c s e rr i c h丝、皮层连接 l i s l ，p a c l ( s c )l i s h w d 4 0c l i p l 7 0 活化d y n e i n ，与皮层作 n u d a ( a n )c o i l e d c o i l d y n e i n ，d y n a c t i n 用 m e l a n o p h i l i n b a s i c s e rr i c he b l 黑色素体的运输 c o i l e d c o i l m y o s i nv n a v i g a t o rl 2 3 b a s i c s e rr i c h神经迁移 r h og e f 2 ( d m )b a s i c s e rr i c he b l 调节r h o 活性 s t i m lt r a n s m e m b r a n e e b l 感知钙的浓度，微管生 b a s i c s e rr i c h长依赖的职管状生长 d y n e i n a a a a t p a s e d y n a c t i n ， 1 i s l 负向马达 m c a k ，x k c m l ( x )m o t o r 。b a sic s e re b s ，x m a p 2 1 5 ，a p c微管解聚 k l p l o a ( d m )r i c h ，c o i1 e d c o i1c l i p l 7 0 ，t i p l 5 0 n c d ( d m ) ，a t k 5 ( a t ) m o t o r ，b a sic s e re b s负向马达，滑动微管 k 1 p ( s p ) r i c h 。c o il e d c o i1 t e a 2 ( s p ) ，k i p ( s c ) m o t o r ，b a s i c s e rm a l 3正向马达，稳定微管， r i c h ，c o il e d c o il t i p l ( b i k l ) 运送其他蛋白质到微 管末端 1 2 第1 章绪论 表格1 1 根据结构域对微管正端跟踪蛋白进行分类。表格中没有列出所有物种中 的同源物，只是列出有代表性且已经报道了功能的同源物。以下是论文中未提及的 彩日种简写：a n ，a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ；a t ，a r a b i d o p s i st h a l i a n a ：c e ， c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ； d d ， d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ；d m ， d r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ；h ，h o m os a p i e n s ；x ， x e n o p u s ； s c ， s a c c h a r o y c e sc e r e v i s i a e ； s p ， s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e 。 1 3 第1 章绪论 1 4 微管正端跟踪的机制 尽管有些蛋白质能与解聚微管的正端结合，比如牙殖酵母里面的d a m l 复合 物( s a l m o n ，2 0 0 5 ) 、微管去解聚酶k l p 5 9 c ( m e n n e l l a ，2 0 0 5 ) 和x m a p 21 5 ( b r o u h a r d ， 2 0 0 8 ) 。还有一些蛋白，如牙殖酵母中x m a p 2 1 5 的同源物s t u 2 ，能与稳定微管的 末端结合( l a n s b e r g e n a k h m a n o v a ，2 0 0 6 ) 。但这些只是少数特例，绝大部分微 管正端跟踪蛋白只与聚合微管的正端结合。这就说明必然存在一些深层次的机制 决定它们特异性的定位。 最直观的解释是聚合微管的正端与微管的其他地方存在差别，而微管正端跟 踪蛋白恰好能识别这一差别。这种差别可能来自g t p 帽( 图1 2 ) 。但是在哺乳 动物细胞中，微管正端跟踪蛋自形成的是彗星状聚集，长度大约是o 5 2 微米， 远远大于g t p 帽的长度。还有一个可能是微管正端跟踪蛋白能识别片状的微管蛋 白，或者是特定曲率的微管原纤维，又或是一些暴露出来的位点。这些位点原来 要么隐藏在微管内管壁，要么因为原纤维之间作用而被掩盖。e b 蛋白是微管正 端跟踪蛋白中最有可能有能力识别其中一个或多个这样的差别的蛋白质。电镜的 结果就显示酵母的e b 蛋白m a l 3 能识别微管的接缝( s a n d b l a d ，2 0 0 6 ) 。这说明 e b 蛋白确实有可能会识别微管蛋白上的某些作用位点，而这些位点正常情况下 是被原纤维之间的作用所屏蔽着的。最近已经成功的在体外重组微管正端追踪体 系。体外的情况下，单独的m a l 3 蛋白就能够特异性的结合到聚合微管的正端和 负端，不需要其他辅助因子的参与。对单个m a l 3 分子的观察表明，蛋白质在微 管末端结合状态和游离状态之间发生快速的周转( b i e l i n g ，2 0 0 7 ) 。微管末端的 结构随着时间推移逐渐转变成正常微管的结构，所以结合的位点也越来越少，发 生周转的微管正端跟踪蛋白也随之减少。这样就在微管末端呈现出