（蔬菜学专业论文）外源一氧化氮NO缓解小白菜铜胁迫的生理效应.pdf

山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 小白菜( b r a s s i c ac a m p e s t r i sl 夕为十字花科芸薹属蔬菜，一二年生 草本植物。近年来，随着农业生产上含c u 杀菌剂的频繁使用及工业生产 中含c u 污染物的大量排放，流入环境中的c u 越来越多，导致菜地土壤 受到污染，进而污染蔬菜。n o 是生物体中一种重要的氧化还原信号分子， 也是一种活性氮( r e a c t i v en i t r o g e ns p e c i e s ，r n s ) 。研究表明，n o 广泛 存在于植物组织中，并参与植物呼吸作用、光形态建成、种子萌发、衰老、 对胁迫的响应、细胞程序性死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，p c d ) 以及抗病 防御反应等过程。但到目前为止，人们对n o 在铜胁迫生理过程中的作用 机理还了解不多，特别在园艺作物上的研究报道甚少。 本文以小白菜为材料，采用水培法，通过在营养液中添加外源n o 供 体硝普钠( s o d i u mn i t r o p r u s s i d e ，s n p ) ，结合添加n o 抑制剂 n i t r o l a r g i n i n e ，研究了外源n o 对铜胁迫下小白菜幼苗植株生长、光合 特性、叶绿素荧光参数、抗氧化系统间的关系，探讨了铜胁迫下外源n o 在小白菜幼苗植株中的生理调节功能。主要结果如下： 1 3 0 0 肛m o l l 以n o 供体s n p 能缓解10 0 10 0 0 9 m o l l 1 铜胁迫对小白菜 植株造成的伤害，显著提高了幼苗的生长量，叶片保护酶活性和氧化损伤 的影响，表明外源n o 能缓解铜胁迫对小白菜幼苗生长的抑制作用。以 3 0 0 9 m o l l 1s n p 处理缓解3 0 0 9 r n o l l - 1 铜胁迫伤害的效果最好，显著提高 了小白菜幼苗生长、叶片叶绿素含量、保护酶活性，显著降低了m d a 含 量，从而增强植株的抗性。 2 外源n o 不同程度地提高了铜胁迫下小白菜幼苗叶片的p s i i 光化 学效率( f v f m ) 、p si i 潜在活性( f 们o ) ，显著降低了初始荧光( f o ) 。 添加n o 的抑制剂n i t r o l a r g i n i n e 增大了初始荧光( f o ) ，降低f v f m 、 f v 腰o ，说明抑制了n o 的缓解效应。表明外源n o 能有效缓解铜胁迫对 小白菜幼苗p si i 系统的伤害，对提高小白菜耐性起着重要的作用。 3 。铜胁迫下添加外源n o 提高了幼苗光合色素含量、光合速率，增加 了渗透调节物质脯氨酸和可溶性蛋白的含量，而胞间二氧化碳浓度下降， 添加n o 抑制剂n i t r o l a r g i n i n e 抑制了n o 对铜胁迫下幼苗植株的这些作 用。 外源一氧化氮( n o ) 缓解小白菜铜胁迫的生理效应 4 外源n o 提高了3 0 0 9 m o l - l 以铜胁迫下小白菜幼苗抗氧化保护酶超 氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 的活 性；n i t r o l a r g i n i n e 抑制了n o 对抗氧化物质代谢的调节作用。同时， 外源n o 降低了铜胁迫下小白菜幼苗丙二醛( m d a ) 和过氧化氢( h 2 0 2 ) 的含量。表明外源n o 处理可通过促进铜胁迫下保护酶活性、抗氧化剂 和渗透调节物质含量，降低铜胁迫下植株体内r o s 含量，提高小白菜 幼苗对铜胁迫逆境的适应能力，降低铜胁迫对小白菜幼苗的抑制作用， 从而提高植物的耐性。 关键词：一氧化氮；铜胁迫：小白菜幼苗；生理特性 2 a b s t r a c t a sam e m b e ro fc r u e i f e r a eb r a s s i c a , c h i n e s ec a b b a g e 俾r a s s i c ac a p e s t r i s l ) i sao n eo rt w oy e a r sh e r b a g ep l a n t a l o n gw i t ht h ef r e q u e n t l yu s eo f b a e t e r i e i d ea n dag r e a td e a lo fe o n t a m i n a t i o n ，m o r ea n dm o r ec o p p e rw a si n d o u r e di n t ot h ee n t i r o n m e n t i ti sr e s u l t e di nt h ep o l l u t i o no fs o i l a n dw o r s e v e g e t a b l e s t u d i e s s h o w e dt h a tn i t r i c o x i d ew a s i n v o l v e d1 1 1v a r i o u s p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e so fp l a n t s ，s u c ha s r e s p i r a t i o n ，p h o t o m o r p h o g e m c ， r e s p o n s e s ，s e e dg e r m i n a t i o n ，s e n e s c e n c e ，s t r e s sr e s p o n s e s ，p r o g r a m m e d c e l l d e a m d i s e a l s er e s i s t a n c ei np l a n t s t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nn i t r i c o x i d ea n d r e s i s t a n c e e s p e c i a l l y t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nn i t r i co x i d ea n dc o p p e r t o l e r a n c eo fp l a n t s i sar e s e a r c hf o c u si nr e c e n ty e a r s t ot h ep r e s e n t , i n f o n n a t i o na b o u tt h ee f f e c t so fn i t r i co x i d ei np h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e so f d l a n t si sv e r yl i m i t e d t h e r ea r eh a r d l yr e p o r t sa b o u tt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n c o p p e rt o l e r a n c eo f h o r t i c u l t u r ep l a n t sa n dn i t r i co x i d e i nt h ep r e s e n te x p e r i m e n t ，b yu s i n ge x o g e n o u ss o d i u mn i t r o p r u s s i d e ( s n p ) ，an i t r i co x i d ed o n o r , a n dn i t r o l - a r g i n i n e ，an i t r i cs e a v e n g e r t h ee f f e c t s o fn i t r i co x i d eo nc o p p e rt o l e r a n c eo fc h i n e s ec a b b a g e c u l t i v a rs e e d l i n g sw e r e i n v e s t i g a t e d u n d e r c o p p e r s t r e s s c h i n e s ec a b b a g ew a sc h o s e n 铺a n e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l t h er e l a t i o ns h i pb e t w e e nn i t r i c o x i d ea n ds e e d l i n g g r o w t h ，p h o t o s y n t h e t i cc h a r a c t e r i s t i c s ，n i t r o g e nm e t a b o l i s m ，a n t i o x i d a t i v e s v s t e mi na d a p t a t i o nt oc o p p e rs t r e s sw a sd i s c u s s e d m a i nr e s e a r c hr e s u l t s w e r ea sf o l l o w s ： 1 3 0 0u m 0 1 l e x o g e n o u ss o d i u mn i t r o p r u s s i d e ，w e r ei n v e s t i g a t e do n t h e g r o w t h , l e a fp r o t e c t i v ee n z y m a t i c a c t i v i t i e s s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ， p e r o x i d a s e ( p o d ) ，c a t a l a s e ( c a t ) ，a n do x i d a t i v ed a m a g e i nc h i n e s ec a b b a g e s e e d l i n g su n d e r1 0 0 1 0 0 0 9 m o l l 1c o p p e r s t r e s sc o n d i t i o n t h er e s u l t s s h o w e d l a tt h eb e s te f f e c to nt h ea l l e v i a t i o no f3 0 0g m o l l q c o p p e rs t r e s s d 锄a g e 嗍o b s e r v e di n t h et r e a t m e n to f3 0 0 1 a m o l l - 1 s n ra tt h i s c o n c e i l 仃a t i o 玑t h es e e d l i n gg r o w t h ，c h l o r o p h y l lc o n t e n t ，a c t i v i t i e so fp r o t e c t i v e e n z y m e si nl e a v e sw e r es i 嘶f i c a n t l yi n c r e a s e d , w h i l em a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) 3 外源一氧化氮( n o ) 缓解小白菜铜胁迫的生理效应 c o n t e n ti nl e a v e sw e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d t h ea b o v er e s u l t si n d i c a t e dt h a t d o s a g ee f f e c to fe x o g e n o u sn i t r i co x i d ed o n o r ( s n p ) e x i s t e do nt h ea l l e v i a t i o n o fc o p p e rs t r e s si nc h i n e s ec a b b a g es e e d l i n g s ，a n dt h eb e s ta l l e v i a t i n ge f f e c t w a sf o u n da t3 0 0g m o l l - i c o p p e rs t r e s s ，w h i c he l e v a t e dt h et o l e r a n c eo f p l a n t s 2 b yt h et r e a t m e n to fe x o g e n o u sn i t r i co x i d e ，p h o t o c h e m i c a le f f i c i e n c yo f p s i i ( f v f m ) ，p o t e n t i a lp h o t o c h e m i c a le f f i c i e n c y ( f v f o ) ，w e r e i n c r e a s e d ， m i n i m a lf l u o r e s c e n c e ( f o ) ，w a so b v i o u s l yi nt h el e a v e so fc h i n e s ec a b b a g e s e e d l i n g sd e c r e a s e du n d e r3 0 0g m o l l 1c o p p e r s t r e s sc o n d i t i o n c o p p e r t r e a t m e n ta l o n eh a ds i g n i f i c a n te f f e c t so nu p p e ri n d e x e s 1 1 1 er e s u l t ss h o w e d t h a tn oc o u l da l l e v i a t et h ed a m a g eo fp s i ic a u s e db yc o p p e rs t r e s sa n dp l a y a ni m p o r t a n tr o l ei ne n h a n c i n gc o p p e rr e s i s t a n c ei nc h i n e s ec a b b a g es e e d l i n g s 3 e x o g e n o u ss o d i u mn i t r o p r u s s i d ei n c r e a s e dn e tp h o t o s y n t h e t i cr a t e ( v n ) ， t h ec o n t e n to fp h o t o s y n t h e t i cp i g m e n ti nl e a v e sa n dt h ec o n t e n t so fs o l u b l e p r o t e i ni nl e a v e so fc h i n e s ec a b b a g es e e d l i n g su n d e r3 0 0g m o l l 。1c o p p e r s t r e s ss i g n i f i c a n t l y m e a n w h i l e ，e x o g e n o u sn i t r i co x i d em a r k e d l yd e c r e a s e d i n t e r c e l l u l a rc 0 2c o n c e n t r a t i o n ( c i ) u n d e r3 0 0 p t m o l l 1c o p p e rs t r e s s ，b u t n i t r o - l a r g i n i n eb l o c k e dt h e s ee f f e c t so fs o d i u mn i t r o p r u s s i d ei ns o m ee x t e n t 4 s o d i u mn i t r o p r u s s i d es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da c t i v i t yo fs o d ，p o d ， c a ti nl e a v e so fc h i n e s ec a b b a g es e e d l i n g su n d e r3 0 0g m o l l - 1c o p p e rs t r e s s n i t r o l a r g i n i n eb l o c k e dt h ee f f e c t so fn i t r i co x i d eo i la d j u s t i n ga n t i o x i t a n t s y s t e m h o w e v e r ，e x o g e n o u sn i t r i c o x i d em a r k e d l yd e c r e a s e dm e m b r a n e p e r m e a b i l i t y , t h ec o n t e n to fm d a a n dh 2 0 2u n d e r30 0g m o l l c o p p e rs t r e s s k e yw o r d s ：n o ；c o p p e rs t r e s s ；c h i n e s ec a b b a g es e e d l i n g s ；p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s 4 英文缩写符号及中英文对照表 关于学位论文原创- 性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并向 社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 山东农业大学硕士学位论文 文献综述 n o 是生物体中一种重要的氧化还原信号分子。研究表明，n o 广泛 存在于植物组织中( r u a ne ta l ，2 0 0 4 ) ，并参与植物呼吸作用( m i l l a r & d a y ， 1 9 9 6 ) 、光形态建成( b e l i g n i & l a m a t t l n al ，2 0 0 0 ) 、种子萌发( g i b a e t a l ， 1 9 9 8 ) 、衰老( l e s h e me t a l ，1 9 9 8 ) 、对胁迫的响应( r u a ne t a l ，2 0 0 4 ) 、 细胞程序性死亡( b e l i g n ie ta l ，2 0 0 2 ) 以及抗病防御反应( d u m e re ta l ， 1 9 9 5 ；v a ne ta l ，1 9 9 8 ；c h a n d o ke ta l ，2 0 0 3 ) 等过程。因而，n o 与环境 胁迫条件下植物抗性的关系受到研究者的广泛关注。许多研究者已意识到 n o 在提高植物抗性中起着重要的调节作用，适当浓度的n o 可增强植物 的抗性。 小白菜( b r a s s i c ac a m p e s t r i sk ) 为十字花科芸薹属蔬菜，一二年生 草本植物。它原产于我国，在我国有6 0 0 0 年以上的栽培历史( 徐毅，2 0 0 5 ) 。 小白菜营养丰富，味道鲜美，富含蛋白质、糖类、脂肪、维生素a 等人 体健康不可缺少的物质，而且四季常有，适应性强，南北都可以种植，是 我国人民喜食的大宗蔬菜。 近年来，随着农业生产上含c u 杀菌剂的频繁使用、c u 矿的过度开采 及工业生产中含c u 污染物的大量排放，流入环境中的c u 越来越多，更 加恶化了环境质量，导致菜地土壤受到污染，进而污染蔬菜。高c u 猪粪 作为有机肥在菜田中的使用，也成为一个不容忽视的c u 污染促进因子。 目前，己有一些关于植物c u 毒害方面的文献报道( 涂俊芳，2 0 0 6 ，薛艳 等，2 0 0 6 ，李淑艳等，2 0 0 6 ) ，特别是关于植物c u 毒害症状等方面的研究 看法比较一致，但对于c u 毒害机理及c u 毒害的治理还处在探讨阶段， 需要进一步的研究与证实，且目前的研究多数集中在大田作物上，蔬菜上 关于c u 胁迫的研究仅有零星的报道。 1 前言 1 1 植物n o 研究进展 1 1 1 n o 的发现 n o 首先是在动物细胞中发现的，作为一种气体小分子参与调控动物 的多种重要生理过程，曾经成为当时国际生物学及医学界的一项令人瞩目 的发现，被美国科学杂志选为1 9 9 2 年度的明星分子。三位美国药理 外源一氧化氮( n o ) 缓解小白菜铜胁迫的生理效应 学家f u r c h g o t t 、i g n a n a r r o 和m u r a d 因为对n o 作为心血管系统的信号分 子的出色研究而共同获得1 9 9 8 年度诺贝尔生理学和医学奖( 梁五生和李 德葆，2 0 0 1 ) 。 在植物方面，早期就曾有人报道n o 可同植物的抗坏血酸( v a ne ta l ， 1 9 7 5 ) 、漆酶( m a r t i n ，e ta l ，1 9 8 1 ) 、脂氧合酶( n e l s o n ，1 9 8 7 ) 等反应。 但有关n o 对植物的作用自1 9 9 6 年才开始引起越来越多人的关注。研究 表明，n o 对植物的呼吸作用( m i l l a r & d a y ，1 9 9 6 ) 、光形态建成 ( b e l i g n i & l a m a t t l n al ，2 0 0 0 ) 、种子萌发( g i b a e t a l ，1 9 9 8 ) 、根和茎叶的 生长发育、果实等植物组织的成熟和衰老( l e s h e m e t a l ，1 9 9 8 ) 、胁迫响应 ( r u a ne ta l ，2 0 0 4 ) 、细胞程序性死亡( b e l i g n ie t a l ，2 0 0 2 ) 以及抗病防 御反应( d u m e re ta l ，1 9 9 5 ；v a ne ta l ，1 9 9 8 ；c h a n d o ke ta l ，2 0 0 3 ) 等生 理过程都有调节作用。最近的许多研究表明n o 在植物细胞中也起很重要 的作用。例如，n o 可作为抗氧化剂和抗凋亡物质抑制细胞的程序性死亡 ( b e l i g n ie ta l ，2 0 0 2 ) ，当用p s e u d o m o n a ss y r i n g a e 感染悬浮培养的豌豆细 胞后，n o 和活性氧( r o s ) 水平升高，从而启动超敏反应和细胞程序性 死亡( d e l l e d o n ee ta l ，1 9 9 8 ) 。最近研究表明，n 0 能有效缓解盐胁迫引 起的小麦根尖细胞的氧化损伤( c h e ne ta l ，2 0 0 4 ) ：外源n o 能通过提高 盐胁迫下芦苇愈伤组织中质膜h + - a t p a s e 的表达和活性，进而提高组织中 k + n a + 而提高抗盐性( z h a oe ta l ，2 0 0 4 ) ：低浓度的n o 预处理能延缓水 稻在盐胁迫和高温胁迫下叶片叶绿素的降解、维持光系统i i 的高活性 ( a k i oe ta l ，2 0 0 2 ) ，外源n o 能提高干旱胁迫下杨树叶片的光合作用、 促进气孔关闭( 王淼等，2 0 0 5 ) 等。但大多数领域的研究还处于起步阶段。 1 1 2 n o 的理化性质 n o 是一种气体自由基分子，在其n 2 轨道上有一个不配对电子，易 溶于水( o 0 4 7 c m 3 c m 3 h 2 0 2 ；2 0 ，l a t i n ) 及脂肪，极易穿过细胞膜，高 度活跃，半衰期短( 大约几秒钟) ，极不稳定。到目前为止，生物体内调 控n o 从其产生细胞到效应细胞精确转运的分子机制还不清楚。n o 的稳 定性主要依赖于其浓度、系统的氧化还原状态、靶位点分子和金属离子的 浓度。由于得失电子的不同，n o 可以以三种相互转化的形式存在：n o 、 n o 、n o + ( s t a m l e re ta l ，1 9 9 2 ) 。中性的n o 分子在2 p n 轨道上具有 6 山东农业大学硕士学位论文 一个单电子，在生物体内，n o 和0 2 、0 2 及过渡金属快速反应。n o 和 0 2 反应形成成氮氧化合物( n o x ) ，包括n 0 2 ，n 2 0 3 和n 2 0 4 ，这些氮氧 化合物能与细胞内胺类、硫醇类物质反应，或将这些物质简单水解形成终 端代谢产物：亚硝酸盐( n 0 2 。) 和硝酸盐( n 0 3 ) 。而n o 和0 2 。反应形成 过氧亚硝基阴离子( o n o o 。) ，o n o o 是一种非常强的氧化剂，对巯基具 有氧化作用( h u i e & p a d m a j a ，1 9 9 3 ) 。同时o n o o 。能引起肽段和蛋白质上 酪氨酸残基上的苯环硝基化，此硝基化作用阻止了其磷酸化作用的发生， 从而引起蛋白质失活。0 n o o 经质子化还会形成具有强氧化性的过氧亚硝 酸，破坏生物大分子的结构与功能( k e l me ta l ，1 9 9 7 ) 。在生理p h 条件 下，o n o o 很快与过氧亚硝酸( o n o o h ) 达到平衡，o n o o h 则降解成 n 0 3 或者活性更强的轻自由基( o h ) 。n o 与血红素和铁簇蛋白中的金属 反应形成亚硝酞基一金属复合物，改变n o 靶蛋白的结构和功能，比如激 活鸟苷酸环化酶的活性或抑制顺乌头酸酶的活性，此外，在植物体内存在 大量的含亚铁结合区的酶均能够被n o 激活。n o 失去此电子形成n o + ， n o + 能介导亚硝基化作用。n o 。的生理意义目前还不清楚。一些研究者认 为n o 。是n o 的稳定存在形式，也有人认为n o 。与血红素的三价铁反应而 导致靶蛋白巯基氢化( w e n d e h e n n ee ta l ，2 0 0 1 ) 。 1 1 3 植物体内n o 的来源 研究表明，植物体中n o 主要来源于酶促途径和非酶合成途径。参与 酶促途径的酶有：一氧化氮合酶和硝酸还原酶。 1 1 3 1 一氧化氮合酶途径 在动物中n o 的生物合成主要依赖于n o s ，n o s 是一种血红素蛋白 的同型二聚体，每个亚基需要血红素、f a d 、f m n 、四氢蝶吟( t e t r a h y d r o b i o p t e r i n ，h a b i p ) 。它催化l 精氨酸和0 2 生成n o 和l 瓜氨酸，需要分子 氧、n a d p h 、h 4 b i p 、亚铁血红素、f a d 、f m n 。同时，n o s 还包含钙 调素、l 精氨酸和n a d p h 的结合位点。而且f a d 结合区( 长2 6 0 个氨 基酸) 与铁吡琳n a d p + 还原酶( f n r ) 相同，属于黄素氧化还原酶家族， 此家族还包括细胞色素p - 4 5 0 还原酶，细胞色素b 5 还原酶等。动物体内 n o s 合成n o 的发现，促进了研究者们在植物体内寻找类似的n o 合成机 制。通过将动物n o s 作为抗原，在小麦菌( k u o e ta l ，1 9 9 5 ) 、豌豆胚轴 外源一氧化氦( n 0 ) 缓解小白菜铜胁迫的生理效应 ( s e n & c h e e m a ，1 9 9 5 ) 、向日葵的胚轴( d e lr i oe ta l ，2 0 0 4 ) 等植物体中 发现了n o s 存在，用动物抑制剂处理，检测放射性标记半胱氨酸产物的 合成的方法，可以检测到n o s 的活性。最早是n i n n e m a n n 和m a i l e r ( 1 9 9 6 ) 用此方法在豆科植物m u c n ah a s s j o o 中检测到n o s 活性。研究者们还发现， 大豆细胞提取物的n o s 活性对c a 2 + 有依赖性，且主要位于细胞质中 ( d e l l e d o n ee ta l ，1 9 9 8 ) ，其活性可被动物抑制剂抑制。r i b e i r o 等将抗体 分析和活性分析相结合，证明了玉米中n o s 的存在。用抗体分析从玉米 的根和幼叶中得到了类n o s ，并发现这种酶能够将1 4 c 标记的精氨酸转换 成1 4 c 半胱氨酸。进一步研究发现，n o s 可能定位于玉米的细胞质中，并 且n o s 根据细胞生长状态不同，从细胞质转移到细胞核( r i b e i r oe ta l ， 1 9 9 9 ) 。利用n o s 抗体检测活性测定发现，植物体内n o s 蛋白与细胞色 素p - 4 5 0 还原酶具有很高的同源性，而动物n o s 抑制剂也同样抑制植物 n o 的产生( d u m e re ta l ，1 9 9 8 ) 。但是在植物体内一直未寻找到与动物 n o s 同源性相近的基因、c d n a 或者蛋白质。直到2 0 0 3 年5 月，首次报 道了t m v 诱导烟草i n o s 基因的表达，并确定其分子量为1 2 0 k d 的甘氨 酸脱羧酶复合体( g d c ) p 蛋白的变体形式( c h a n d o ke ta l ，2 0 0 3 ) ，g d c 是定位于线粒体基质的一种分子量为1 3 0 0 k d a 的多酶复合体，除含有需 要磷酸吡哆醛的p 蛋白外，g d c 还分别包含分子量为5 0 6 0 、4 0 4 5 和 1 5 k d a 的l 、t 和h 蛋白。通常，g d c 大约占线粒体蛋白的一半，往往 通过催化两分子的甘氨酸转化为丝氨酸、二氧化碳和氨，来降解光呼吸产 生的甘氨酸。此外，从活性大小、所需的辅助因子、抑制剂敏感性和动力 学参数来看，该i n o s 与动物i n o s 具有明显的相似性，更为重要的是， 动物和烟草i n o s 基因的激活均是病原菌侵染后抗病信号转导所必须的。 1 1 3 2 硝酸还原酶合成途径 除了n o s 催化l a r g 合成n o 外，植物硝酸还原酶( n r ，e c l 6 6 1 ) 可以产生n o ( y a m a s a k i e ta l ，1 9 9 9 ) ，n r 是植物氮代谢中的一个关键酶 和限速酶，它包括两个辅基( f a d 和血红素) 和一个铝一喋吟中心，利 用n a d p h 作为电子供体，催化硝酸盐还原形成亚硝酸盐。早在1 9 8 1 年， h a r p e r 在分析大豆叶片组织n r 活性时就检测到n o x 的存在( n o + n 0 2 ) 。 通过n r 产生n o 曾一度被认为是豆科植物特有的现象，但后来发现在光 山东农业大学硕士学位论文 照条件下高浓度的硝酸盐培养液可以诱发非豆科植物如向日葵、烟草、玉 米、葡萄、云杉、菠菜和烟草等植物产生大量n o ，暗示n o 可能是所有 植物的氮代谢产物( w i l d te ta l ，1 9 9 7 ) 。y a m a s a k i 等( 2 0 0 0 ) 报道在生理 p h 和n a d ( p ) h 存在的条件下，从玉米幼苗纯化的n r 可催化n 0 2 和n 0 3 。 还原产生n o ，以n 0 2 。为底物的n o 产率高于底物n 0 3 ，此过程可被n a 3 n 、 谷胱甘肽或无氧条件所抑制。但是，n r 中产生的n o 的酶活力只占n r 总活力的1 左右( r o c k e le ta l ，2 0 0 2 ) 。不同植物体不同组织或器官影响 n r 的因子不同。如叶片的n r 主要受光的调控，光下黄瓜叶片中n r 活 性增强，暗处n r 活性下降；而根部n r 活性无光、暗依赖性，但在缺氧、 加耦联剂( c c c p ) 或甘露糖处理下则降低根中a t p 水平可激活根系n r ； 而高氧可促进n r 失活。当用a t p 预处理缺氧的根提取物时，根中n r 活 性即逐渐失去；加入5 - a m p 可使n r 再活化，即黄瓜根细胞内腺苷酸参 与对n r 活性的调控。 n r 既对环境条件如光、c 0 2 、0 2 的快速调节，又受外来物质的影响。 如高c 0 2 下黄瓜叶片中n r 活性高于低c 0 2 的，黄瓜植株同化c 0 2 的速 率可调控n r 基因的表达和酶活性；果糖显著刺激叶片和根中n r 基因的 转录( l a r i o se ta l ，2 0 0 1 ) 。呼吸链抑制剂k r e s o x i m m e t h y l ( k r o m ) 促 进菠菜叶片中n r 活性下降；盐胁迫下n r 活性的日变化规律及其基因的 m r n a 都会发生变化；酚类物质可抑制小麦叶片中n r 活性，此种抑制效 应与酚类物质的结构和浓度有关：此外，c a 净、蛋白激酶( p k ) 、蛋白激 酶激酶( p k k ) 、蛋白磷酸酯酶( p p ) 、1 4 3 3 蛋白和蛋白酶都可调控n r 活性。例如，叶片光合作用暗呼吸和蛋白酶都可调控n r 活性 ( m a c k i n t o s h & m e e k ，2 0 0 1 ) 。例如，叶片光合作用暗呼吸停止时，n r 丝 氨酸残基磷酸化形成一个磷酸肽序列可以与一个或多个1 4 3 3 蛋白 ( 1 4 3 3 5 ) 结合，而抑制n r 活性。蛋白磷酸酯酶可引起丝氨酸的去磷酸 化，使1 4 3 3 s 被解离从而逆转对n r 活性的抑制作用。在体外，一些小 分子化合物包括磷酸盐离子、e d t a 和a m p 也都能够使n r 活化。 1 1 3 3 非酶合成途径 植物也可通过多种非酶途径形成n o ，如经反硝化作用和氮固定形成 n o ；硝化作用和反硝化作用将n 2 0 氧化形成n o ；酸性条件下，由n 0 2 外源一氧化氮( n o ) 缓解小白菜铜胁迫的生理效应 还原形成n o ( b e t h k ee ta l ，2 0 0 4 ) ：由类胡萝1 - 素转化的光介导非酶反应 形成n o ；抗坏血酸或光参与由n 0 2 形成n o ( c o o n e ye ta l ，1 9 9 4 ) 。一 般来说，有氧条件下依赖n r 途径是形成n o 的主要方式；酸化的区域或 组织则多是经过非酶途径产生n o ( y a i n a s a k i & s a k i h a m a ，2 0 0 0 ) 。植物多 途径产生n o 的事实说明植物体中产生n o 的调节机制是非常复杂的。 1 1 4 n o 在植物体内的功能 1 1 4 1 n o 与植物生长发育 有些植物如莴笋、泡桐等种子的萌发需要一定的光照。光介导的萌发 可能是由n o 介导的。使用n o 供体硝普钠( s n p ) 和n 亚硝基乙酰青 霉胺( s n a p ) 使莴笋种子在黑暗条件下也能萌发，并且种子的萌发率与 s n p 和s n a p 的剂量成正比，并能被n o 清除剂p t i o 所逆转，而n 0 2 和n 0 3 。对种子萌发影响不大( b e l i g n i & l a m a t t i n s ，2 0 0 0 ) 。用自旋捕集和 顺磁共振技术可以直接检测到种子萌发时释放n o ；n o 清除剂及鸟苷酸 环化酶抑制剂亚甲基蓝可以抑制光刺激的种子萌发，而s n p 和s n a p 可 促使该植物种子萌发( g i b ae ta l ，1 9 9 8 ) 。张华等( 2 0 0 3 ) 则证实n o 促 进渗透胁迫下小麦种子萌发。n o 影响植物根的生长。使用多种释放n o 的化学药剂对玉米离体培养的根进行处理时发现，根尖的生长与试剂的浓 度呈正相关，而亚甲基蓝能阻断这种作用( g o u v ee ta l ，1 9 9 7 ) 。p a g n u a a s a t 等( 2 0 0 2 ) 发现n o 能明显诱导黄瓜根的伸长，并且通过l 认介导的黄 瓜不定根生长和发育能够被n o 清除剂c p t l 0 阻断。植物叶片的生长也 受到n o 的调节，l e s h e ma n dh a r a m a t y ( 1 9 9 6 ) 用k n 0 2 和k h 2 s 0 4 作为 n o 供体处理豌豆叶片，发现低浓度的n o 促进叶片伸展，而高浓度的n o 效果不明显。此外，n o 显著增加豌豆叶片保卫细胞的叶绿素含量( l e s h e m e ta l ，1 9 9 7 ) ，减缓马铃薯叶片叶绿素缺失( l a x a l te ta l ，1 9 9 7 ) 。 n o 在植物光形态建成中具有重要作用。n o 不仅能刺激光依赖性莴 苣种子的萌发，而且参与了黄化茵的脱黄化作用和下胚轴伸长的抑制作用 ( b e l i g n i & l a m a t t i n s ，2 0 0 0 ) 。l e s h e m 等( 2 0 0 1 ) 报道l g m o l l _ 的外源 n o 即可明显促进豌豆叶片的生长，并抑制乙烯的产生。用一些果实、花 卉和蔬菜等材料的研究发现，随着植物组织的成熟和衰老其n o 释放量显 著下降，而施用n o 释放剂可明显延缓植物组织的成熟和衰老进程，植物 1 0 山东农业大学硕士学位论文 组织的成熟与衰老进程中n o 可能是一种可延缓植物衰老的天然植物生 长调节物质，其作用机制与抑制乙烯产生有关。 1 1 4 2 n o 与植物抗逆性 近期研究表明，n o 具有信号分子作用，可以减少非生物胁迫下植物 体内活性氧的积累，缓解各种胁迫造成的氧化伤害，从而增强植物的适应 能力。 2 0 0 1 年g a r i c a - m a t a 和l a m a t t i n a ( 2 0 0 1 ) 研究外源n o 影响植物干旱 胁迫响应的结果表明，与水预处理相比较，外源n o 预处理的植物叶片在 干旱胁迫后保持的相对含水量较高，蒸腾速率和气孔开度下降，离子渗漏 减小；s n p 的这种作用均被能n o 的清除剂c p t i o 所逆转。同时，s n p 处理还能促进后期胚胎发育丰富蛋白的积累，这些结果说明n o 能够提高 植物耐干早胁迫的能力。 另外，l a m a t t i n a 等( 2 0 0 1 ) 报道，施用n o 能提高玉米小麦和番茄 植株和种子抗低温的能力，特别是对那些低温敏感型的幼苗。例如，用 n o 喷洒小麦和玉米幼苗叶片后，二者在低温环境下的植株存活率提高， 低温伤害后植株的恢复能力也提高。马向丽等( 2 0 0 5 ) 研究发现，外源 n o 能促进低温胁迫下黑麦草p r o 的积累，提高抗冷性。 k o p y r a 等( 2 0 0 3 ) 以n o 供体s n p 处理羽扇豆种子，可有效提高盐 胁迫下种子的萌发速度、萌发率、胚根的伸长长度。阮海华等( 2 0 0 1 ) 用 0 1 和lm m o l l 1 的硝普钠s n p 处理，结果根系在受到1 5 0 和3 0 0 m m o l l 。n a c l8 d 后，小麦叶片中的叶绿素含量分别提高5 6 和9 8 ，丙 二醛的积累量下降，离子渗漏减少：同时，s n p 还促进盐胁迫下叶片s o d 和c a t 活性的上升，延缓0 2 。和h 2 0 2 的积累，脯氨酸积累量增加，从而 减轻了盐胁迫下小麦的氧化伤害。u c h i d a 等( 2 0 0 2 ) 的实验结果也表明外 源n o 能够提高水稻幼苗的抗盐能力。最近，z h a o 等( 2 0 0 4 ) 报道，抗 盐性不同的两种芦苇愈伤组织在2 0 0m m o l l d n a c i 胁迫下，耐盐性的沙 丘芦苇愈伤组织中n a + 百分含量低，c a ：+ 和k + 对n a + 的比率提高，这种作 用大小取决于n o 供体的浓度，且可为n o 合成酶抑制剂州a a 和n o 清除剂p t i o 所逆转。 1 2 植物c u 污染的研究现状与植物的抗性作用机制 外源一氧化氮( n o ) 缓解小白菜铜胁迫的生理效应 1 2 1 植物c u 中毒的症状 c u 是植物正常生命活动所必需的微量矿质元素，广泛参与各种生命 活动，它对维持植物正常的新陈代谢及生长发育具有极其重要的意义( 袁 玲，2 0 0 3 ) 。然而，适合植物生长的c u 含量范围很窄，土壤中稍微过量 的c u 便会干扰细胞代谢和离子平衡，对植物产生毒害作用。关于植物c u 中毒的症状，不少文献均有报道，主要是表现在生长受阻，作物减产上。 倪才英等人通过研究表明，当c u 处理浓度在5 0 m g k 9 1 以上时，紫云英 根系开始出现受害症状。表现在根粗短呈淡褐色，根毛少且短，主根弯曲， 并分出较短的叉根：当c u 污染水平达到2 0 0 m g k g 一，时，根腐烂、组织 黑色化，紫云英死亡。植物c u 中毒时往往伴随失绿