（细胞生物学专业论文）杜氏盐藻cdna文库的构建与kcbp基因的克隆及功能分析.pdf

原创性声明 m i llll lll l li i iiiii iiii 、t18 3 3 7 8 6 本人郑重声明：所星交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本沦文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成采。对本文的研究做出熏要贡献盼个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任出本人承担。 学位论文作者： 铆丽干 日期：冽p 年，月幽 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文赢接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者： 柙确平 一期：知向年r 月，甬 摘要 摘要 近年来，随着对莱茵衣藻等研究的广泛开展，运用藻类基因工程的手段可 以构建高产、优质、抗逆的藻类新品种，还可以生产燃料、降解污染物以及构 建藻类表达系统生产大量廉价的蛋白和药物来研究并治疗人类疾病。作为单细 胞生物的杜氏盐藻具有无细胞壁、培养简单等许多独特优点，使它不但可以作 为一种新型的转基因宿主，而且可以作为模式生物研究基因的表达调控等，因 而亟待克隆杜氏盐藻的相关功能基因的数量不断增加。构建杜氏盐藻e d n a 文 库显得尤为必要。 纤毛和鞭毛二者是可以相互指代的，都是由轴丝微管及外面包被的纤毛膜 组成。已有研究表明疾病的发生与纤毛体突变存在着必然的联系，如多囊肾等。 然而本实验室着力于将杜氏盐藻鞭毛作为模式细胞器来研究纤毛与疾病的关 系。驱动蛋白( k i n e s i n ) 和类驱动蛋白( k l p s ) 蛋白组成了基于微管马达的一个 大的家族，是真核细胞中一类保守的具有a t p a s e 活性的微管马达蛋白。这些马 达在很多基本的细胞发育进程中起着重要的作用。迄今为止，很多驱动蛋白及 类驱动蛋白在包括拟南芥在内的植物中被鉴定。类驱动蛋白钙调素结合蛋白 ( k c b p ) 是在驱动蛋白和类驱动蛋白中唯一的一个在邻近它的马达结构域处有 一个钙调素结合结构域的蛋白，其属于驱动蛋白1 4 家族的一个成员。k c b p 是 一个负指向的c 末端微管马达蛋白，有三个独立的结构域：一个肌球蛋白尾同 系物区域4 ( m y t h 4 ) ；一个类踝蛋白结构域( b 4 1 ) ；一个钙调素结合结构域 ( c b d ) 。m y t h 4 和类踝蛋白结构域( b 4 1 ) 在其它报道过的驱动蛋白中没有 发现。k c b p 定位在维管束上，包括早前期、纺锤体上和成膜体上，这表明k c b p 通过捆绑微管来形成维管束。迄今为止，k c b p 同系物仅仅出现在植物和衣藻等 少数绿藻中。 微管是纺锤丝的成分，破坏微管结构就是抑制纺锤体的形成。秋水仙素能 够阻止微管的形成。驱动蛋白参与微管的组装，c r k c b p 基因是一个负末端指向 的驱动蛋白基因，在“货物 从鞭毛顶端到鞭毛基体的运输中起作用。然而， 在杜氏盐藻中k c b p 基因还没有被克隆，同时，它在鞭毛组装中的作用至今也 没有研究。 本研究首先构建了杜氏盐藻e d n a 文库，然后利用根据各物种间序列的保 a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，t h em e t h o d so f g e n e t i ce n g i n e e r i n gw e r e u s e df o ra l g a et ob u i l d h i g h - y i e l d ，h i g hq u a l i t yn e ws p e c i e sf o rm u l t i p l ep u r p o s e ss u c ha sp r o d u c i n gf u e l ， d e g r a d a t i n gp o l l u t a n t sa n dp r o d u c i n gc h e a po ra b u n d a n tp r o t e i n sa n dd r u g s b e c a u s e d u n a l i e l l as a l i n a ，as i n g l e - c e l lo r g a n i s mw i t h o u tc e l lw a l l ，i sc u l t u r e de a s i l y , r a p i d l y a n di n e x p e n s i v e l y , t h ea l g ai sa b l et ob ed e v e l o p e dn o to n l ya sab i o r e a c t o rf o r p r o d u c i n gr e c o m b i n a n tp r o t e i n so rv a c c i n e sb u ta l s oa sa m o d e lo r g a n i s mf o r s t u d y i n gt h eg e n ee x p r e s s i o n sa n dr e g u l a t i o n so f o t h e rs p e c i e s t h e r e f o r e ，i ti su r g e n t t oc l o n em o r ef u n c t i o n a lg e n e sr e l a t e dt od s a l i n a t h ec o n s t r u c t i o no ft h ee d n a l i b r a r yo f d s a l i n aw i l lc o n t r i b u t et ot h es t u d i e so f d s a l i n aa sa b i o r e a c t o ra n da ，r m o d e lo r g a n i s m c i l i aa n df l a g e l l aa r e e c o l u t i o n a r i l yc o n s e r v e do r g a n e l l e s ，w h i c h a r e c o m p o s e db ya x o n a n a lm i c r o t u b u l e sa n dc i l i am e m b r a n e s t u d i e sh a v es h o w n t h a t t h eo t 文2 u r l e n c oo fd i s e a s e si sn e c e s s a r i l yr e l a t e dt ot h em u t a t i o n so fc i l i a , s u c ha s p o l y c y s t i ck i d i l c yd i s e a s ea n ds oo n t h ee x p e r i m e n t so fo u rl a b o r a t o r yf o c u so nt h e f l a g e l l u mo fd s a l i n aa sam o d e lo r g a n e l l et os t u d yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc i l i aa n d d i s e a s e s k i n e s i na n dk i n e s i n l i k e ( k l p s ) p r o t e i n sa l ec o n s e r v a t i v em i c r o t u b u l em o t o r p r o t e i n sw i t ht h ea t p a s ea c t i v i t yi ne u k a r y o t i cc e l l s t h e s em o t o r sp l a yi m p o r t a n t r o l e si nm a n yb a s i cd e v e l o p m e n t a lp r o c e s s e so fc e l l t od a t e ，m a n yk i n e s i n so rk l p s w e r ei d e n t i f i e df r o m a r a b i d o p s i s t h a l i a n aa n do t h e r h i g h e rp l a n t s k i n e s i n c a l m o d u l i n - b i n d i n gp r o t e i n ( k c b p ) w a so b t a i n e df r o mp l a n t sa san e wk l p s ，w h i c h h a sae a l m o d u l i n - b i n d i n gd o m a i ni nt h en e i g h b o r i n go fi t sm o t o rd o m a i n k c b p , a m e m b e ro ft h ek i n e s i n - 14f a m i l y , i san e g a t i v ep o i n to ft h ec t e r m i n a lm i e r o t u b u l e m o t o rp r o t e i n sw i t ht h r e es e p a r a t ed o m a i n s ：ah o m o l o g u eo fm y o s i nt a i lr e g i o n s4 ( m y t h 4 ) ；al i k e - a n k l ep r o t e i nd o m a i n ( b 41 ) ；ac a m - b i n d i n gd o m a i n ( c b d ) m y t h 4a n db 4 1h a v en o tb e e nf o u n di no t h e rr e p o r t e dk i n e s i n s k c b pw a s p o s i t i o n e do nv a s c u l a r , i n c l u d i n gt h e p r e p r o p h a s eb a n d ，s p i n d l ea n di nf i l m - f o r m i n g b o d y , s u g g e s t i n gt h a tk c b pf o r m st h ev a s c u l a rb yb i n d i n gt h em i c r o t u b u l e s t od a t e , i i i a b s t r a c t k e yw o r d s ：d u n a l i e l l as a l i n ae d n al i b r a r yk i n e s i nl i k e c a l m o d u l i n b i n d i n gp r o t e i n v 目录 1 引言1 2 杜氏盐藻c d n a 文库的构建3 2 1 材料与方法3 2 1 1 材料3 2 1 2 方法5 2 2 结果与分析7 2 2 1 总r n a 及m r n a 的质量7 2 2 2e d n a 的合成8 2 2 3 文库滴定度8 2 3 讨论9 2 4 d 、结1 0 参考文献。1 1 3 杜氏盐藻k c b p 基因的克隆及功能分析1 2 3 1 简并引物扩增杜氏盐藻基因k c b p 片段及序列分析1 2 3 i i 材料与方法12 3 1 2 结果与分析2 0 3 25 r a c e 方法扩增杜氏盐藻k c b p 基因5 端e d n a 序列”2 2 3 2 1 材料与方法2 2 3 2 2 结果与分析2 7 3 33 r a c e 方法扩增杜氏盐藻k c b p 基因3 端e d n a 序列”2 9 3 3 1 材料与方法2 9 3 3 2 结果与分析3 2 3 4 杜氏盐藻k c b p 基因e d n a 全长的克隆及序列分析3 4 3 4 1 材料与方法3 4 引言 1引言 杜氏盐藻是一种在海水中生长的高度耐盐而没有细胞壁的低等真核生物， 它富含类胡萝卜素和甘油，并且培养条件简单，所以作为一种新型的生物反应 器，具有很大的潜力。用杜氏盐藻来生产各种药用蛋白或口服疫苗，具有独特 的优点和广阔的应用前景。随着分子生物学和基因工程等学科的发展，藻类基 因工程倍受关注。因此，对杜氏盐藻基因工程表达调控研究已成为基因研究的 热点，亟待克隆的相关基因的数量不断的增加，人们期望克隆杜氏盐藻的功能 基因并通过基因工程与化学的有机结合而形成新的基因药物【1 1 。因此，构建杜氏 盐藻e d n a 文库，可作为筛选相关目的基因的重要资源，在克隆新基因以及基 因功能分析研究等方面具有重要作用，更有利于利用基因工程技术对杜氏盐藻 进行改造来生产所需的外源性蛋白，如抗体、抗生素和疫苗的生产，能够广泛 地应用于人类、 畜禽和其它物种疾病的预防和治疗【2 j ；也可以改造盐藻使其能 够高效地分解或吸收有毒或有害物质，在污水处理和环境保护方面存在着较大 的应用价值p 1 ；又可以改造盐藻作为新型安全无污染的生物燃料、饲料、化肥和 能源等，应用于相关的一些领域。 本实验室着力于将杜氏盐藻鞭毛作为模式细胞器来研究纤毛与疾病的关 系。纤毛和鞭毛是细胞表面的特化细胞器，在不同真核生物中具有高度保守性。 在结构上，均由轴丝微管及其外部包裹纤毛膜组成，二者结构上基本相同，因 此，可互相指代。驱动蛋白和类驱动蛋白( k l p s ) 组成基于微管马达蛋白的一 个大的家族，这些马达蛋白在很多基本的细胞的和发育的进程中起着重要的作 用。k c b p ( k i n e s i nl i k ec a l m o d u l i n b i n d i n gp r o t e i n ) 是从植物中得到的一个新的类 驱动蛋白，它是在驱动蛋白和类驱动蛋白中唯一的一个在邻近它的马达结构域 处有一个钙调素结合结构域的蛋白。k c b p 在拟南芥中首次被克隆并鉴定【4 】并 且将它归类于k i n e s i n 1 4 家族的一个成员。k c b p 在基于微管分裂的细胞中起着 重要的作用，包括藻丝的形态发生、有丝分裂和细胞分裂。在拟南芥和烟草的 分裂细胞中，k c b p 定位在微管、有丝分裂的纺锤体微管和成膜体的早前期，进 一步支持了k c b p 在有丝分裂和细胞分裂中起着重要作用【5 l 。 c r k c b p ( c h l a m y d o m o n a sk c b p ) 是在衣藻中发现的与鞭毛相关的驱动蛋 白，目前在衣藻中通过对c r k c b p 在鞭毛中的定位以及免疫印迹实验已经为该 l 杜氏盐藻e d n a 文库的构建 2 杜氏盐藻c d n a 文库的构建 随着基因工程和分子生物学的发展，藻类基因工程越来越受到关注。杜氏 盐藻作为一种海水中生长的高度的耐盐且无细胞壁的真核生物，它含有很高的 类胡萝卜素及甘油，而且它的培养条件非常简单，因此作为新型生物反应器， 应该有着很大的发展潜力。所以对杜氏盐藻基因工程表达调控方面的研究已成 为研究热点，亟待克隆的相关基因的数量也不断扩大，人们期待克隆出一些杜 氏盐藻的功能基因通过化学与基因工程的结合来生产新的基因药物。构建杜氏 盐藻e d n a 文库，可作为筛选相关目的基因的重要资源，它在克隆新的基因和 基因功能的分析研究等方面具有重要作用，也利于通过基因工程的手段对杜氏 盐藻进行改造生产所需外源蛋白，如疫苗、抗生素和抗体等。 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 1 1 1 1 主要仪器设备 s i m f 1 2 4 雪花制冰机： 微波炉： s y n t h e s i s 超纯水系统： 全自动灭菌锅 空气摇床： 普通冰箱： s d c 6 数控低温恒温槽： s k 1 型快速混匀器： t g l - 1 6 g 高速台式离心机： z d 8 5 恒温振荡器： 快速恒温数显水箱： g n p 型隔水式恒温培养箱： 凝胶成像系统： 3 日本三洋 顺德市格兰仕电器实业有限公司 美国s g 公司 日本t o m y 美国b a m s t e a dl a b l i n e 河南新飞电器有限公司 上海新芝生物技术研究所 江苏省金堰市医疗仪器厂 上海安亭科学仪器厂 常州国华电器有限公司 常州国华电器有限公司 上海精密实验设备有限公司 s y n o p t i c sl t d 杜氏盐藻c d n a 文库的构建 2 1 2 方法 2 1 2 1 杜氏盐藻m r n a 的提取与纯化 a 杜氏盐藻m r n a 的提取( 弛l 裂解法) ( 1 ) 取处于对数生长期的盐藻细胞1 0 0m l ，用u t e x 培养基洗涤两遍后，平 均分配转移至4 个5 0m l 无r n a s e 的离心管中，弃去上清，每管加入t r i z o l2 5m l ， 用无r n a s e 的吸头反复吹打或剧烈振荡以裂解细胞( 勿涡旋) ，室温静置5m i r a ( 2 ) 在上述离心管中，按照每lm lt r i z o l 加入o 2m l 氯仿( 新开瓶) 的标 准加入氯仿，盖上离心管盖子，在手中用力震荡1 5s ，在室温下( 1 5 3 0 ) 放置2 - - - ，3m i n 后，1 2 0 0 0 9 ( 2 8 ) ，离心15 r a i n ： ( 3 ) 取上层水相置于新离心管中，按照每lm lt r i z o l 加0 5m l 异丙醇( 新 开瓶) 的标准加入异丙醇，在室温下( 1 5 3 0 ) 放置1 0m i n , 1 2 0 0 0 9 ( 2 8 ) 离心1 0 m i r a ( 4 ) 弃上清，按照每1m lt r i z o l 加l m l7 5 乙醇( 用d e p c 水配制的) 的标准加入7 5 乙醇进行洗涤，涡旋混合，7 5 0 0 9 ( 2 - 8 ) 离心5m i n ，弃 上清： ( 5 ) 让沉淀的r n a 在室温下自然干燥；用2 0 0m 左右r n a s e - f r e ew a t e r 溶 解r n a 沉淀； 希 ( 6 ) 取lm 进行l 琼脂糖凝胶电泳，检查r n a 完整性，同时在2 6 0 n m 、 2 8 0 r i m 测量光吸收值。 b 杜氏盐藻m r n a 的纯化 ( 1 ) 将2 0 0t t l 含有r n a 的溶液在5 5 ( 2 孵化1 0m i n 以完全溶解r n a 沉淀。 ( 2 ) 涡旋或者振荡o l i g o ( d t ) 磁珠的管型瓶直到颗粒均一悬浮。 ( 3 ) 1 j h5 0t t lo l i g o ( d t ) 磁珠到含有r n a 样品的微量离心管中，通过轻轻振荡 混合均匀。 ( 4 ) 加入15 0t t l2 x m a g - b i n dm r n ab i n d i n gb u f f e r , 用移液管混合7 0 c 孵化3 m i n 。之后放在室温下1 0r a i n 。 ( 5 ) 离心收集磁性颗粒8 0 0 0 9 ，l m i n 5 杜氏盐藻c d n a 文席的构建 p a p 3 n e op r e d i g e s t e dv e c t o r ( 图1 1 ) 1 肛l 、t 4d n al i g a s e ( 3 5 0u g l ) 2p l 混 匀后，1 2 过夜反应； ( 2 ) 经苯酚氯仿异戊醇抽提后用2 0u l 的t eb u f f e r 溶解沉淀： ( 3 ) 取l i g a t i o n 溶液的一部分1 0g l 加入到5 0 “l 的d h l 0 be l e c t r o c e l l s 中 进行了电转化。转化条件是1 5k v , 2 0 0q ，2 5p f 。 ( 4 ) 将菌液稀释1 0 、1 0 2 、1 0 3 倍涂板。 d 文库质量鉴定 坚脚d o n i n 口- m c 8 i 毫t 体的皇ti 位点的上墨鼻育t 7 翩予町用于体升转量丘应 图1 1p a p 3 n e op r e d i g e s t e dv e c t o r 图谱 计算平板上单菌落数，测定文库的滴定度。随机挑取1 3 个单克隆，用t 3 和t 7 引物做菌落p c r ，检测插入片段的大小。p c r 扩增程序为9 5 预变性l m i n , 9 4 变性3 0s ，5 5 退火3 0s ，7 2 延伸3m i n , 3 0 个循环，7 2 延伸1 0 m i n 。用l 的琼脂糖凝胶电泳检测结果。 引物序列为 t 3： 5 ，- a t t 从c c c t c a c t a a a g g g c g 一3 ，t 7 ： 5 ，一t a a t a c g a c t c a c t a t a g g g 一3 ，。 2 2 结果与分析 2 2 1 总r n a 及m r n a 的质量 琼脂糖凝胶电泳检测总r n a ：得到2 8s 和1 8s 两条清晰的条带，亮度大约 是2 ：l ( 图1 2 ) 。紫外分管光度计测定a 2 6 0 a 2 8 0 为1 9 8 ，说明r n a 的纯度 7 杜氏盐藻e d n a 文库的构建 高，没有蛋白和其它物质的污染。上述结果表明r n a 纯度及完整性非常好。 卜一2 8 s 卜一1 8 s 图1 2 总r n a 电泳检测 2 2 2e d n a 的合成 双链c d n a 经1 琼脂糖凝胶检测，形成弥散条带，长度主要约为0 1 k b 3 k b 。 表明合成的c d n a 质量较好( 图1 3 ) 。 图1 3 双链c d n a 电泳检测 m ：d l l o k bd n a 分子量标准1 ：d se d n a 2 2 3 文库滴定度 经过涂板发现稀释倍数在1 0 3 倍比较合适，符合每个平板菌落在3 0 - - - 3 0 0 个 的标准。通过数平板上的菌落数，平均每个平板的菌落数在2 4 1 个菌落，通过 公式：文库滴度( p f u m l ) = ( 菌落数x 稀释倍数) 受体菌的体积计算文库滴定度， 通过计算得到文库滴定度为5 6 x1 0 6 p f u m l 。对随机挑取的克隆进行p c r 扩增， 经l 琼脂糖凝胶电泳检测插入片段的大小，结果得到o 4 6 0k b 不等的片段( 图 1 4 ) ，平均插入片段长度为1 9k b 。 8 杜氏盐藻c d n a 文库的构建 图1 4 从左到右：随机挑取1 3 个克隆的p c r 产物，d l l o k bd n a 分子量标准 2 3 讨论 文库滴度、插入片段和重组率的大小是鉴定某种物种e d n a 文库质量重要 的标准【6 】。本实验的文库滴定度为5 6 x1 0 6 p f u m l ，重组率为9 0 左右，插入片 段的平均长度为1 9k b 。这些数据完全满足了构建完整文库的要求。构建高质量 的e d n a 文库的前体和基础就是提取到高质量的m r n a 。本文采用t r i z o l 法提 取到了较为完整的m r n a 。由于杜氏盐藻中富含多糖和酚类物质，它们易于r n a 结合，影响r n a 的质量【_ 7 1 ，使常规的r n a 提取均不是很理想，所以本实验中 用乙醇沉淀r n a 的同时，用高浓度冰冷的n a c l 再沉淀得到较好的纯化效果之 后才进行e d n a 双链的合成。同时，层析柱分级分离e d n a 也很关键，短片段 过多会导致连接转化效果和文库质量。层析柱的制备易产生气泡，本实验采用 的t a k a r a 公司的c d n al i b r a r yc o n s t r u c t i o nk i t 中认为制备柱子时用t eb u f f e r 洗涤柱子之后将无盖1 5m l 的e p 管插到柱子下方进行离心，这种方法易产生 气泡，使得之后层析得到的c d n a 效果不好，本文在制备柱子的过程中完全没 有使用1 5m l 的e p 管，直接用t eb u f f e r 洗涤柱子之后离心，之后才放入无盖 1 5m l 的e p 管来收集层析得到的e d n a , 实验效果良好。转化体系中所加入的目 的片段不能超过4 0g l ，过多也会导致转化效率的降低。 杜氏盐藻作为一种新型的生物反应器，用以口服疫苗或生产药用蛋白，具 有独特的优点和广阔的应用前景。通过藻类基因工程可以构建高产、优质、抗 逆的藻类新品种，还可以构建藻类表达系统生产大量廉价的蛋白和药物，以及 生产燃料、降解污染物等。e d n a 文库是包含了生物体表达基因信息的集合体， 9 杜氏盐藻c d n a 文库的构建 是获取未知功能功能基因的有效的技术手段，也是系统研究生物的基因结构和 功能的基础【s 】。因此用g u b l c r - h o f f m a n 法( 一种可以控制克隆基因方向性的 d i r e c t i o n a lc l o n i n g 法) 构建的杜氏盐藻全长c d n a 文库，为下一步重要途径和 信号通路的新基因的发现、序列分析及表达研究打下基础。 本研究构建的杜氏盐藻c d n a 文库通过少量随机测序及p c r 扩增，得到了 一些有生物意义的克隆，如驱动蛋白k i n e s i n 等，文库内是否具有其它相关的基 因或者独立的特异性基因，还需要进一步扩大文库筛选的规模，以得到更多有 生物学意义和应用价值的克隆。 2 4 小结 完整的提取了r n a ，进行双链d n a 的合成，检测了文库的质量。该文库 滴定度为5 6 x1 0 6 p f u m l ，重组率为9 0 左右，插入片段的平均长度为1 9k b 。 这些数据完全满足了构建完整文库的要求。 1 0 杜氏盐藻k c b p 基因的克隆及功能分析 3 杜氏盐藻k c b p 基因的克隆及功能分析 驱动蛋白( k i n e s i n ) 和类驱动蛋白( k l p s ) 组成基于微管马达的一个大的 家族，这些马达在很多细胞的基本发育进程中起着重要的作用。k c b p ( k i n e s i n l i k ec a l m o d u l i n b i n d i n gp r o t e i n ) 是从植物中得到的一个新的类k i n e s i n 蛋白，它 是在驱动蛋白和类驱动蛋白中唯一的一个在邻近它的马达结构域处有一个钙调 素结合结构域的蛋白。k c b p 在拟南芥中首次被鉴定并加以表征【i l ，并且将它归 类于k i n e s i n - 1 4 家族的一个成员。k c b p 在分裂的微管细胞中起着重要的作用， 包括藻丝的形态发生、有丝分裂和细胞分裂。在拟南芥和烟草的分裂细胞中， k c b p 定位在微管、有丝分裂的纺锤体微管和成膜体的早前期，进一步支持了 k c b p 在有丝分裂和细胞分裂中起着重要作用【2 1 。 c r k c b p ( c h l a m y d o m o n a sk c b p ) 是在衣藻中发现的与鞭毛相关的驱动蛋 白。目前在衣藻中通过对c r k c b p 在鞭毛中的定位以及免疫印迹实验已经为该 基因在鞭毛中的作用提供了一部分佐证。 本章节通过搜索n c b i 上g e n e b a n k 中不同物种的k c b p 基因，选择同源性 比较高的氨基酸片段设计简并引物，得到该基因的部分e d n a 序列后，在通过 r a c e p c r 法分别对5 端和3 端进行扩增，最终获得k c b pe d n a 序列全长。 然后通过秋水仙素处理杜氏盐藻细胞，提取处理杜氏盐藻不同时期的r n a ，反 转录成e d n a 后，进行实时荧光定量p c r ，对该基因功能进行分析。 3 1 简并引物扩增杜氏盐藻基因k c b p 片段及序列分析 3 1 1 材料与方法 3 1 1 1 材料 a 主要仪器设备 h p g 光照培养箱：哈尔滨东明医疗仪器厂 b c m 1 0 0 0 a 型生物洁净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 1 2 杜氏盐藻k c b p 基因的克隆及功能分析 用o ( 4 ) l b 固体培养基( a m p + ，以1 0 0 m l 量配置) ：称取胰蛋白胨l g ，n a c i o 5g ，酵母提取物o 5 9 ，琼脂粉1 5g 放入1 5 0 m l 三角瓶后，加入1 0 0 m l 蒸馏水， 高压蒸汽灭菌，待培养基的温度降低到5 0 c 左右，加入氨苄青霉素( 1 0 0i t g m 1 ) 1 0 i i t l ，备用。 ( 5 ) 氨苄青霉素( a m p1 0 0 m g m 1 ) ：在装有氨苄青霉素粉末( i g ) 的容器 内加入高压灭菌水1 0 m l ，用o 2 2p m 一次性滤器过滤除菌，分装后放于2 0 ( 2 保 存。 d 质粒、菌株及藻株 质粒载体p m d l 8 - 1 、p m d l 9 一t 均购买于大连宝生物公司( t a k 搬a ) ；大肠 杆菌d h5 a 是本实验室之前保存的菌种；杜氏盐藻藻株与培养条件( 见第一章) 。 ：j e 引物 a 引物的设计 把g e n b a n k 上登录的莱茵衣藻( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ) 和绿藻 ( o s t r e o c o c c u st a u r i ) 等其他动植物的k c b p 基因进行搜索，然后比对分析其氨 基酸序列，从而筛选出具有高度保守性的序列，该序列在大部分物种中都具有 高度的一致性且翻译成密码子后的简并性尽可能低，根据以上原则，我们发现 比对结果发现中氨基酸序列“d i m q f g ”和“c i f a y g ”存在保守性较高、简并性较 低的特点，该目的片段预计长度约为1 2 0 0 b p 左右，比较符合。 b 引物序列的翻译 将已选择的氨基酸序列“d i m q f g ”和“c i f a y g ”根据密码子表翻译成核苷酸 序列，得到简并引物如下所示： 上游引物f 3 0 ：5 g a ( t c ) a t ( t c a ) a t gc a ( a g ) t t ( t c ) g g 3 下游引物r 3 0 ：5 c c ( a g ) t a ( a c g t ) g c ( a g ) a a ( a g t ) a t ( a g ) c a 3 3 1 1 2 方法 1 4 杜氏盐藻k c b p 基因的克隆及功能分析 3 5 s ； ( 3 ) 接着，加入5 x r e a c t i o nb u f f e r4 p l ，l 必嬲ei n h i b i t o rl p l ，d n t pm 纹2 p 1 ， 用无r n 勰e 的枪头轻轻混匀，快速离心3 5 s ； ( 4 ) 快速放置到3 7 水浴锅中温浴5 m i n ； ( 5 ) 在冰上加入l “l 的a m v ( 2 0 u 弘i ) 至终体积为2 0 9 l ： ( 6 ) 立刻放入到3 7 水浴锅中孵育6 0 r a i n ： ( 7 ) 接着，放到7 0 水浴锅中，1 0 m i n 后结束反应，放到2 0 冰箱中保存， 备用。 cp c r 反应的体系和条件 p c r 反应的体系如下所示： e d n a 模板 10 x l at a q 聚合酶b u f f e r d n l l p ( 各2 5 m m ) f 3 0 r 3 0 l at a q 酶 1p l 1 0 “i 8i i l 1p l 1 l 0 5i l l d h 2 0补充至1 0 0i l l 将1 0 0m 的体系平均分5 管，做梯度p c r 。 p c r 反应的条件： 9 4 ，预变性5 m i n ：9 4 4 5 s ，5 0 5 0 s2 0 个梯度，7 2 9 0 s ，3 0 个循环； 7 2 延伸1 0 m i n ，4 停止。 之后，将p c r 反应的产物进行l 琼脂糖凝胶电泳，观察结果。 d 胶回收目的片段( a z y p r e pd n a 凝胶回收试剂盒) ( 1 ) 用处理过的无污染的刀片在紫外灯下将目的条带割下，放置到一个灭 菌处理过的干净的离心管中； ( 2 ) 称量所割取的胶条的质量，然后加入3 倍体积的试剂d e a ，放置到 7 5 水浴锅中，不时的翻动离心管，使胶条完全溶化在d e a 中； 1 6 杜氏盐藻k c b p 基因的克隆及功能分析 上搁置3 0r a i n 使菌生长停止； ( 3 ) 4 0 0 0r p m 离心1 0 r a i n ，4 c ； ( 4 ) 把上清液移除，使离心管倒扣在无菌滤纸上1 r a i n ，除尽残留液： ( 5 ) 将菌液中加入1 0i l l l 冰上预冷的0 1m o f l 的c a c l 2 后轻轻吹打重悬， 在冰上搁置3 0m i r a ( 6 ) 4 ，4 0 0 0r p m 离心1 0 m i r a ( 7 ) 把上清液移除，使离心管倒扣在无菌滤纸上l m i n ，除尽残留液； ( 8 ) 向离心管中小心加入4 m l0 1m o l lc a c l 2 ，用无菌枪头轻微吹打冲悬 菌液； ( 9 ) 取2 0 0p 1 分装到1 5 m l 离心管中，8 0 c 保存备用。 b 细菌的转化与蓝白斑的筛选 ( 1 ) 在超净工作台中向2 0 0i l l 感受态细菌中加入上述过夜连接的反应体系， 轻轻吹打均匀； ( 2 ) 在冰上放置3 0m i n ( 勿动) ； ( 3 ) 4 2 热休克9 0 s 后立即移到冰上放置3 5m i r a ( 4 ) 加入l b 培养基1 0 0 0 r d ， 3 7 1 2 摇床上轻轻摇动培养4 5 6 0m i r a ( 5 ) 将4 0 1 a l 的x g a l ( 5 0m g m 1 ) 和4 p l 的i p t g ( 2 0 0mg m 1 ) 在一个新的 离心管中充分混合后，均匀涂布到含有氨苄抗性的l b 琼脂平板上，备用； ( 6 ) 将( 4 ) 当中的转化菌在室温下3 0 0 0 r p m 离心4 m i r a ( 7 ) 去除7 0 0 r d 上清液后，将残留液轻轻吹打混合，均匀涂布于准备好的 平板上； ( 8 ) 将平板放到3 7 培养箱内过夜培养； ( 9 ) 次日将过夜培养的平板放到4 1 2 冰箱里约2h ，蓝斑将彻底显现。 g 小提和鉴定质粒 a 质粒的小提( a z y p r e p 质粒d n a 小提试剂盒) 挑取几个白色菌落从显现有蓝白斑的平板上，接种到4m l 装有l a 液体培 养基的试管中，3 7 1 2 培养过夜，之后根据说明书用质粒d n a 小提试剂盒提取质 1 8 杜氏盐藻k c b p 基冈的克隆及功能分析 h 测序 将鉴定正确的质粒菌液送到北京博尚生物公司测序，确定p c r 产物序列。 将测序结果利用相关的序列分析软件及资料对所测得的序列分析。 3 1 2 结果与分析 3 1 2 1p g r 的产物与酶切鉴定 杜氏盐藻e d n a 作为模板，用简并引物f 3 0 r 3 0 进行梯度p c r 反应，最适 退火温度在5 6 8 c ，得到约1 3 0 0b p 的片段，符合预计目的片段的大小( 图2 1 ) 。 将该片段胶回收后连接到载体p m d l 9 t 上，获得质粒p m d k 1 。用b a m hi 和 h i n di i i 酶切鉴定，酶切后得到载体片段以及一条约1 3 0 0 b p 的片段，与插入的 p c r 片段大小相同( 图2 2 ) 。 1 5 0 0 b p 1 0 0 0 b p 图2 1r t - p c r 扩增杜氏盐藻k c b pe d n a 序列片段电泳结果 m ：d l l o k b 分子量标准；1 ：r t - p c r 产物 2 0 杜氏盐藻k c b p 基冈的克隆及功能分析 l o o o b p 图2 2p m d l 9 t - k 1 酶切鉴定1 ：p m d l 9 t k 1 质粒：2 ：p m d l 9 t - k 1 质粒双酶切( 肌棚i i i ) ：m ：d l 2 0 0 0d n a 分子量标 准 3 1 2 2 序列分析 分别将2 个随机挑选的鉴定正确的克隆测序，纠正比较错误的碱基后 确定p c r 产物序列。经测序得知该e d n a 片段长为1 3 5 0 b p 。把测得的杜氏盐藻 的核苷酸序列翻译成氨基酸序列后与g e n b a n k 已知的氨基酸序列进行b l a s t 比对发现该p c r 所得片段与c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i 、聍出v i n i f e r a 、r i c i n u s c o m m u n i s 、s t i c h o c o c c u sb a c i l l a r i s 、z e am a y s 、g o s s y p i u mh i r s u t u m 、a r a b i d o p s i s t h a l i a n a 、o s t r e o c o c c u st a u r i 、p i c e aa b i e s 及其他物种的k c b p 基因均有较高的同 源性。因此判定该r t - p c r 反应成功得到了杜氏盐藻k c b p 基因e d n a 序列的 部分片段。 2 1 杜氏盐藻k c b p 基因的克隆及功能分析 3 25 r a c e 方法扩增杜氏盐藻k c b p 基因5 端c d n a 序列 经典的r a c e 技术是由f r o h m a n 等( 1 9 8 8 ) 发明的一项技术，r a c e ( r a p i d a m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s ) 是一种通过p c r 进行c d n a 末端克隆的技术。c d n a 完整的序列结构对于研究基因的结构、功能分析以及蛋白的表达是非常重要的。 r a c e 技术从2 0 世纪8 0 年代开始发展起来，r a c e 技术相对于其他方法克隆全 长c d n a 来说具有价廉、简单和快速等特点。r a c e 技术分为5 和3 的 r a c e p c r 扩增。5 r a c e p c r 是通过已知基因的部分片段序列来设计合适的 引物从而获得已知片段上游的末端序列。 本实验应用的是a i b i o n 公司的5 r a c e 试剂盒，通过碱性磷酸酶去磷酸 化反应、烟草焦磷酸去帽子反应以及加接头和反转录反应获得模板后，利用巢 式p c r 获得已知基因片段的上游末端序列。 3 2 1 材料与方法 3 2 1 1 材料 a 主要仪器设备 参看“3 1 ”。 b 主要试剂 a m b i o n 公司的5 - f u l lr a c ek i t ，其他参看“3 1 ”。 c 质粒和菌株 参看“3 1 ”。 d 杜氏盐藻的藻株、培养基以及培养条件 参看“3 1 ”。 e5 r a c e 的引物 杜氏盐藻k c b p 基因的克隆及功能分析 ( 2 ) 充分涡旋。室温1 2 0 0 0 9 高速离心5 m i n 。转移上层水相到一个新的离 心管中； ( 3 ) 加入1 5 0 p l