（细胞生物学专业论文）拟南芥gasa6基因功能的分析.pdf

so u t hc h i n an o r m a l u n i v e r s i t y t h ed i s s e r t a t i o nf o rm a s t e r d e g r e eo fs c i e n c e f u n c t i o n a la n a l y s i so fa t g a s a 6 ina r a b i d o p s i st h a l i a n a m s c a n d i d a t e ：h a ox u s u p e r v i s o r ：p r o f x i a o - ji n gw a n g s p e c i a l t y ： c e l lb i o l o g y i n s t i t u t e ： s c h o o lo fl i f es c i e n c e s u b m i t t e dd a t e ： m a y2 6 ，2 010 摘要 摘要 ( g as t i m u l a t e dt r a n s c r i p t si na r a b i d o p s i s ) 基 结构特征，本论文主要对a t g a s a 6 在植物生 进行了研究，得到如下主要结果： 技术研究a t g a s a 6 的时空表达模式，结果表 花中表达：伴随种子的萌发，a t g a s a 6 在胚 幼苗阶段，彳，g 强财6 的转录主要发生在细胞 主根和侧根的分生组织，或者下胚轴、子叶、 真叶、茎的维管组织：此外，a t g a s a 6 启动子驱动的g u s 基因在发育的胚珠中 也有很强的表达。 2 、构建好3 5 s ：g a s a 6 ：e g f p 表达载体后，分别通过在洋葱表皮细胞和拟 南芥根细胞中表达a t g a s a 6 ：e g f p 融合蛋白，观察a t g a s a 6 ：e g f p 的亚细胞 定位情况。结果表明，a t g a s a 6 ：e g f p 融合蛋白主要定位在细胞壁以及胞外基 质区域，这与生物信息分析推测的结论相同，a t g a s a 6 蛋白是分泌型的细胞壁 蛋白。 3 、在种子萌发和幼苗生长阶段，a t g a s a 6 的转录活性同时受到g a 、a b a 和糖信号的调控，g a 正调控a t g a s a 6 的表达，a b a 和糖信号负调控a t g a s a 6 的表达。同时，g 剐6 超表达转化植株对6 葡萄糖胁迫、6 蔗糖胁迫和a b a 信号的敏感性显著减弱，而g a s a 6 超表达转化植株对g a 信号则表现得更为敏 感，a t g a s a 6 可能同时影响了g a 、a b a 和糖信号对种子萌发和幼苗生长的调 控。 4 、综合激素和糖对a t g a s a 6 表达的影响，以及通过r t - p c r 技术获得的分 子水平证据来分析，a t g a s a 6 可能分别受到g a 信号转导途径核心组分d e l l a 、 a b a 信号转导途径核心组分a b l 5 和糖信号转导途径核心组分h x k l 的调控， 在调节种子的萌发和幼苗生长的过程中发挥重要作用。 5 、与野生型植株相比，超表达a t g a s a 6 的植株体内可溶性糖含量显著升高 而t - d n a 插入突变植株的可溶性糖含量较低，据实验结果推测a t g a s a 6 可能影 华南师范大学硕士研究生学位论文 响了植株体内的糖代谢过程。 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , w e 旬c u s e do u rr e s e a r c ho nt h ef u n c t i o n a la n a l y s i so fa t g a s a 6 , a m e m b e ro ft h eg a s a ( g a - s t i m u l a t e dt r a n s c r i p ti na r a b i d o p s i s ) g e n ef a m i l yf r o mt h e s i g h to fm o l e c u l a rb i o l o g y t h em a j o rr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h r o u g ht h eu t i l i z a t i o no fr t - p c rt e c h n i ca n dg u sr e p o r t e rg e n e ，w ef o u n dt h a t a t g a s a6c a r lb ee x p r e s s e di nr o o t , s t e m , l e a v e sa n df l o w e r s s t r o n gg u sa c t i v i t y d e t e c t e di ns e e d sa f t e ri m b i b i t o ns u g g e s t si t sc r u c i a lr o l e i nt h ep m c e 鹳o fs e e d g e r m i n a t i o n d u r i n gt h ep e r i o do fs e e d l i n gd e v e l o p m e n t ，a t g a s a 6m a i n l ye x p r e s s e d i nm e r i s t e m a t i ct i s s u e so fp r i m a r yr o o ta n dl a t e r a lr o o t , v a s c u l a rb u n d l e so fh y p o c o t y l a n dl e a v e s ，i m p l y i n gt h a ta t g a s a6m a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h e s er e g i o n s i n a d d i t i o n , s t r o n gg u sa c t i v i t yd 慨t e d i ni m m a t u r a t ee m b r y od e m o n s t r a t e si t sr o l ei n e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t 2 t os t u d yt h es u b e e l l u l a rl o c a l i z a t i o no fg a s a 6 ，g a s a 6 ：e g f p ( e n h a n c eg r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ) f u s i o nh a sb e e nc o n s t r u c t e df o rt r a n s f o r m a t i o ni n t ow i l d - t y p e a r a b i d o p s i s w h e ng a s a 6 一g f pw a st r a n s i e n t l ye x p r e s s e di no n i o ne p i d e r m a lc e l l s a n dp e r m a n e n t l ye x p r e s s e di na r a b i d o p s i sr o o tc e l l s ，g f pf l u o r e s c e n c ew a sp r i m a r i l y l o c a t e di nt h ec e uw a l la n dt h ee x t r a c e l l u l a rm a t r i x , w h i c hi sc o n s i s t e n tw i t ht h e s u p p o s i t i o n m a d et h r o u g hb i o i n f o r m a t i ca n a l y s i s 3 a t g a s a 6e x p r e s s i o nc o u l db er e g u l a t e db yg 八a b & a n ds u g a r sa tt h e t r a n s c r i p t i o n a ll e v e ld u r i n gt h ep r o c e s so fs e e dg e r m i n a t i o na n ds e e d l i n gd e v e i o p m e n t g ac o u l dp o s i t i v e l yc o n t r o l et h ee x p r e s s i o no fg a s a 6w h e r e a sa b aa n ds u g a r c o n t r o ln e g a t i v e l y m o r e o v e r , t h eg e r m i n a t i o nr a t i oo f 3 5 s ：a t g a s a 6w a sl l i g h e rt h a n b o t hw i l dt y p ea n dl o s s - o f - f u n c t i o nm u t a mw h e ng e r m i n a t e do nm sa g a rm e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t h6 g l u c o s eo r6 s u c o r s e a tt h es a m et i m e ，3 5 s ：a t g a s a 6 s h o w e dh y p e r s e n s i t i v i t yt oe x o g e n o u so a 3 t h o s ep h e n o m e n o md e m o n s t r a t et h a t a t g a s a 6 m i g h tb ei n v o l v e di ng 八a b a a n ds u g a rs i g n a l i n gp a t h w a y sc o n c u r r e n t l y 4 b a s e do nt h er e s u l t sf r o mc o n t r o l l e de x p r e s s i o nm a n n e r so f a t g a s a6a n de v i d e n c e i l l 华南师范大学硕士研究生学位论文 f r o mt h em o l e c u l a rl e v e l s ，d e l l a , a b l 5a n dh x k l m i g h tw o r ka su p s t r e a m r e g u l a t o r so fg a s a 6i ng a , a b aa n ds u g a rs i g n a l i n gp a t h w a y , r e s p e c t i v e l y 5 c o m p a r e dw i t hw i l dt y p ep l a n t s ，h i g hl e v e l so fs o l u a b l es u g a r sw a sp r e s e n t e di n 3 5 s ：a t g a s a 6w h e r e a sl o wl e v e l ss h o w e di nl o s s o f - f u n c t i o nm u t a n t ，i n d i c a t i n gt h e v i t a lr o l e so f a t g a s a6i nt h ep h y s i o l o g i c a lp r o c e s so f s u g a rm e t a b o l i s m k e yw o r d s ：a t g a s a 6 , g a s a g e n ef a m i l y , g e n ee x p r e s s i o n , s u g a rs i g n a l i n g i v 缩略词表 缩略词表 a b aa b s c i s i ca c i d a m pa m p i c i l l i n b p b a s e p a i r c t a b c e t y t r i e t h y la m m o n i u m b r o m i d e e d n a c o m p l e m e n t a r yd n a d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d d n 2 0 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d n t p d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e d t ae t h l e n e d i a m i n et c t r a c e t i ca c i d g f p g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g a g i b b e r e l l i n g l ug l u c o s e g u s p - g l u c u t r o n i d a s e hh o u r h a ca c e t i ca c ：i d k a n k a n a m y c i n n a a c s o d i u ma c e t a t e n a c l s o d i u mc h l o r i d e n a c i os o d i u mh y p o c h l o r i t e o d o p t i c a ld e n s i t y p a c p a c l o b u t r a z o l p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r t r e v e r s et r a n s c r i p t i o n s d s s o d i u md o d c c y ls u l f a t e s t r s t r e p t o m y c i ns u l f a t e v 脱落酸 氨卞青霉素 碱基对 十六烷基三乙酸溴化铵 互补d n a 焦碳酸二乙脂 脱氧核糖核酸 双蒸水 脱氧核糖核苷酸 乙二胺四乙酸 绿色荧光蛋白 赤霉素 葡萄糖 p 葡糖苷酸酶 小时 醋酸 卡那霉素 醋酸钠 氯化钠。 次氯酸钠 光密度 多效唑 聚合酶链式反应 逆转录 十二烷基磺酸钠 链霉素 华南师范大学硕士研究生学位论文 t a q t d n a 确s t r i s h c l p g l b l d m s m g t h e r m u s aq u a t i c u sd n a p o l y m e r a s e t r a n s f e rd n a t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e t r i s h y d r o c h l o r i d e m i c r o g r a m l u r i ab e r t a n im e d i u m l o n gd a y s m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m m i l l i g r a m 嗜热水生菌d n a 聚合酶 转移d n a 三羟甲基氨基甲烷 h s 盐酸 微克 l b 培养基 长日照 m s 基本培养基 毫克 i i i i 、f 1 1 1 l ：i 1 1 3 糖信号与植物激素的互作7 1 1 4 糖信号的调控9 1 1 5 复杂的信号网络9 1 2 植物g a 信号途径的研究进展1 0 1 2 1g a 信号通路1 0 1 2 2g a 信号通路的下游基因1 1 1 3g a s t 基因家族的研究进展一1 2 1 3 1g a s t 产物的结构特征及亚细胞定位1 2 1 3 2g a s t 产物的表达1 3 1 3 3g a s t 产物的功能1 4 1 4 研究目的与意义1 5 第二章实验材料与方法1 7 2 1 实验材料17 2 2 材料培养1 7 2 2 1m s 培养基17 2 2 2 播种及幼苗移栽1 7 2 2 3 土壤培养18 2 2 4 培养条件18 2 3 目的基因的克隆与载体构建1 8 2 3 1 主要试剂及培养基18 2 3 2 载体与菌株1 9 2 3 3 引物设计1 9 华南师范大学硕士研究生学位论文 2 3 4 目的片段的扩增与回收2 0 2 3 5 目的片段与p m d1 9 t 载体连接2 l 2 3 6 大肠杆菌感受态的制备2 l 2 3 7 目的片段与t 载体连接产物转化大肠杆菌2 l 2 3 8 目的片段与t 载体连接转化子鉴定2 2 2 3 9 测序2 3 2 3 1 0 目的片段的回收一2 4 2 3 1 1 表达载体片段的回收2 4 2 3 1 2 目的片段与表达载体连接2 4 2 3 1 3 目的片段与表达载体的连接产物转化大肠杆菌。2 4 2 3 1 4 重组转化子鉴定2 4 2 3 15 重组转化子转化农杆菌2 5 2 3 1 6 农杆菌阳性菌落的鉴定2 5 2 4 花序轴浸泡法转化拟南芥2 6 2 4 1 主要试剂及菌株2 6 2 4 2 花序轴浸泡法转化拟南芥2 6 2 5 转基因植株的鉴定2 6 2 5 1 拟南芥基因组e l n a 提取一2 6 2 5 2 卡那霉素基因p c r 鉴定2 7 2 5 3 转基因植株纯合子的筛选2 8 2 6 拟南芥杂交2 8 2 7t - d n a 插入突变体纯合株系鉴定2 9 2 7 1 主要原理2 9 2 7 2 引物设计3 0 2 7 3 三引物p c r 鉴定3 0 2 8a z g a s a 6 的r n a 表达水平分析3l 2 8 1 总r n a 的提取31 2 8 2 总r n a 浓度及纯度测定31 2 8 3e d n a 第一链合成3 2 2 8 4p c r 反应3 3 2 8 5p c r 结果的相对定量3 4 2 目录 2 9g u s 组织化学染色一3 4 2 9 1 主要试剂及配制3 4 2 9 2 组织化学染色3 4 2 1 0 洋葱表皮细胞中的瞬时表达3 4 2 1o 1g a s a 6 与e g f p 的融合表达质粒提取3 4 2 1 0 2 植物材料的处理3 4 2 1 0 3 金粉母液的制备3 5 2 1 0 4d n a 的包裹3 5 2 1 0 5 基因枪转化3 5 2 1 0 6 样品的处理与观察3 6 2 1 1 表型分析及生理指标测定3 6 2 1 1 1 表型分析3 6 2 1 1 2 糖含量的测定3 7 第三章结果与分析3 9 3 1 转基因植株的获得及鉴定3 9 3 1 1 载体构建3 9 3 1 2 转基因植株的鉴定与纯合一4 0 3 2 a i g a s a 6 的时空表达模式4 l 3 2 1 器官中r n a 水平的表达4 l 3 2 2 组织化学染色4 2 3 3g a s a 6 的亚细胞定位研究4 4 3 3 1g a s a 6 ：e g f p 融合蛋白的瞬时表达4 4 3 3 2g a s a 6 ：e g f p 融合蛋白的稳定表达4 5 3 4 激素与外界因素对g a s a 6 表达的影响4 6 3 4 1g a s a 6 启动子元件的生物信息学分析4 6 3 4 2 外源激素对g a s a 6 表达的影响4 6 3 4 3 外界因素对g a s a 6 表达的影响4 8 3 5 突变体及转化植株的鉴定与纯合5 0 3 5 1 突变体的鉴定与纯合5 0 3 5 2 超表达转化植株的检测5l 3 6g a s a 6 相关突变体的表型分析5 2 华南师范大学硕十研究生学位论文 3 6 1g a s a 6 相关突变体对g a 的反应5 2 3 6 2g a s a 6 相关突变体对a b a 的反应5 4 3 6 3g a s a 6 相关突变体对糖的反应5 5 3 6 4 糖信号和a b a 信号突变体中g a s a 6 的表达。5 9 3 6 5g a s a 6 与糖代谢6 0 第四章讨论6 1 4 1g a s a 6 的时空表达模式6 1 4 2g a s a 6 的亚细胞定位6 2 4 3g a s a 6 在植物生长发育过程中的功能6 3 4 3 1g a s a 6 与外源激素6 3 4 3 2g a s a 6 与外界因素“ 4 3 3g a s a 6 与g a 、a b a 。6 5 4 3 4g a s a 6 与糖信号途径6 6 4 3 5g a s a 6 参与g a 、a b a 和糖信号网络的分子机理初探6 6 4 3 6g a s a 6 参与糖代谢6 7 总结6 9 参考文献7 1 致谢8 1 4 文献综述 第一章文献综述 1 1 植物糖代谢与信号途径的研究进展 植物面对选择压力时需要及时地感知变化并迅速做出应急反应，通过协调 内环境的平衡、调节代谢水平以适应不同的营养状况及外界环境胁迫。同时作 为代谢和信号物质的糖在协调内环境动态变化中具有独特的优势，有利于植物 以最经济的方式对逆境做出迅速的反应，调节相关基因的表达和酶活性，调控 植株的生长发育。从种子萌发、幼苗生长、茎的形态建成、花芽形成、果实成 熟、胚胎发育到植株的衰老，糖对生长发育的调控几乎贯穿植株的整个生活史。 本综述首先概述糖代谢和信号途径的关键组分及其调控，最后重点介绍糖信号 途径及其与植物激素之间的互作与调控。 1 1 1 糖代谢 1 1 1 1 糖代谢与植物的生长发育 胚胎发育阶段，可溶性糖参与调节从细胞分化到细胞扩增及营养物质积累 的全过程，葡萄糖含量的升高促进细胞的分裂活性，而蔗糖与细胞的扩增和淀 粉的合成有关( b o r i s j u ke ta 1 ，2 0 0 4 ) 。海藻糖辱磷酸合成受阻会阻碍胚胎发育， 胚胎不能发育为成熟的种子( e a s t m o n de ta 1 ，2 0 0 2 ) 。此外，己糖与蔗糖的比例 以及碳氮平衡的保持也是胚胎正常发育的重要影响因素，拟南芥w r i n k l e d l 突变 体的种子中己糖与蔗糖的比例发生变化直接影响细胞的大小和数目，最终导致 种子大小和产量的变化( c e r n a ce ta l ，2 0 0 4 ) 。s n r k l 是糖代谢的中心调节酶，大 麦中反义抑锘j s n r k l 的表达，引起子代胚珠发育受阻( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。表达 反义s n r k l 的豌豆种子内，蔗糖含量升高，碳氮平衡的打破引起种子发育异常 ( r a d c h u ke ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 发育早期，种子的萌发、幼苗的生长过程处于从异养向光合自养转变的过 渡阶段，对可溶性糖含量的波动十分敏感，主要依赖体内动员的可溶性糖如蔗 糖、葡萄糖和果糖提供营养并维持胞内的渗透平衡( s a n t o se ta 1 ，2 0 0 4 ) 。糖对种 子萌发的影响具有多重效应，适量的糖作为营养物质促进种子的萌发，低浓度 的糖吸收后可解除a b a 的抑制效应促进种子的萌发( g a r c i a r r u b i oe ta 1 1 9 9 7 ) ，而 华南师范大学硕士研究生学位论文 高浓度葡萄糖糖延迟种子萌发( p r i c ee ta 1 ，2 0 0 3 ) ，高浓度海藻糖会抑制幼苗根伸 长( m u l l e re ta 1 2 0 0 1 ) 。 进入发育后期，糖含量变化影响成苗器官的建成和育性，如可溶性总糖含 量高导致叶片增厚、叶面积加大、块茎数量增多( p a u le ta 1 ，2 0 0 3 ；f e m i ee ta 1 ， 2 0 0 1 ) ；己糖含量升高导致植株分支增多、种子产量增加( g o e t ze ta 1 ，2 0 0 1 ) ； 海藻糖含量升高抑制植物根的发育( s c h l u e p m a n n e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。而光合速率降低、 黑暗时间过长等引起代谢糖供给不足会延迟茎的形态建成、诱导不定根的产生 ( t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 3 ) 。随着叶片的老化，葡萄糖和果糖的含量逐渐增加而淀 粉的含量逐渐降低，单糖转运蛋白s f p l 的表达增多( q u i r i n oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。通过 反义抑$ 1 j s n r k i i j i 起的糖代谢紊乱常常引起植株的发育异常，如引起大麦花粉粒 形态及育性异常，梨形的花粉粒小且淀粉含量极低，花粉败育( z h a n ge ta 1 2 0 0 1 ) 。 在植物生长发育过程中，除了植株形态和器官的建成，开花时间也受到糖 代谢的严格调控。给黑暗条件下生长的拟南芥外施蔗糖促进成花转变( r o l d a ne t a 1 ，1 9 9 9 ) ，而高浓度的蔗糖又能抑制植株的成花转变、延长植株的营养生长期 ( z h o ue ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 1 1 1 2 糖代谢的调控 植株所具有的反馈调节能力和时空特异表达作用能够及时调节体内糖代谢 水平以适应生长需要。除此之外，糖代谢还受到植物激素和环境因素的严格调 控。 植物激素对糖代谢的影响 植物激素通过对糖代谢的调节影响植株的生长发育。仅一淀粉酶活性是影响 植株体内可利用的可溶性糖含量的关键酶，外源赤霉素可以促进旷淀粉酶的表 达，而a b a 抑制其表达( b e t h k ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 。细胞分裂素能够影响蔗糖在源库 间的运输( r o i t s c he ta l ，2 0 0 0 ) 。在红叶藜中，细胞分裂素可以诱导细胞壁转化 酶( c e l lw a l li n v e r t a s e ，c w - i n v ) 和己糖转运蛋白( h e x o s et r a n s p o r t e r s ，h x t ) 的表达( e h n e f le ta 1 ，1 9 9 7 ) 。尽管有报道称g a 、a b a 、乙烯能促进蔗糖转化酶 ( i n v e r t a s e ，i n v ) 的表达( h e i ne ta 1 ，1 9 8 4 ) ，其具体作用机制却仍不清楚。 外界环境对糖代谢的影响 外界环境对糖代谢的影响主要通过调节代谢相关酶的基因表达和酶活来实 2 文献综述 现( g i l le la 1 ，2 0 0 1 ) 。已有的研究表明，低温、盐胁迫都能使可溶性糖含量升 高( r o s ae ta 1 ，2 0 0 4 ：2 0 0 9 ) 。低温环境下，盐胁迫藜麦后蔗糖磷酸合酶( s u c r o s e p h o s p h a t es y n t h a s e ，s p s ) 、i n v 的活性升高，蔗糖和葡萄糖含量升高( r o s ae ta 1 ， 2 0 0 9 ) 。蔗糖转化酶酶活对低温较为敏感，而蔗糖合酶( s u c r o s es y n t h a s e ，s s ) 和s p s n 对温度不太敏感( r o s ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。在光线强和c 0 2 浓度较高的情况下， 紫蝴蝶兰叶片中s p s 的转录活性特异性升高，这说明光合作用速率影响赃因 的表达( l ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。重金属胁迫和营养短缺会导致植物体内可溶性糖浓度 降低。v o d a z z a ( 2 0 0 6 ) 等用重金属胁迫酸橙树根时发现，经镉处理的根中i n v 酶活 下降，糖含量显著降低( p o d a z z ae ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 1 2 糖信号 1 1 2 1 糖信号分子 蠕 各种可溶性糖作为代谢复合物可以参与调控植株的生长发育，而作为信号 分子则可以参与植物对逆境反应的调控。植物体内的己糖和蔗糖是数量最多的 可溶性糖，也是研究得较多的糖信号。j a n g ( 1 9 9 7 ) 等发现，低浓度的葡萄糖、 果糖能特异抑制光合反应基因c a b 2 的转录活性，而代谢中间物磷酸己糖：昏磷 酸葡萄糖，良磷酸果糖却并不能抑制c 口砣基因的表达，这说明己糖信号不依赖 于代谢活性而存在。己糖的非代谢类似物对基因表达的特异调控也表明特异的 糖信号传导机制不需要经过糖的分解作用，如2 脱氧葡萄糖抑制船c 躇因的转 录活性( k l e i ne ta 1 ，1 9 9 8 ) ，甘露糖调节蛋白酶基因的表达和蛋白的降解 ( b r o u q u i s s ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。己糖信号影响植株的整个生长发育过程，它们影响种 子的萌发，幼苗下胚轴的伸长、子叶的转绿和伸展、器官的建成、叶片衰老、 成花转变等过程( m o o r ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 蔗糖很容易降解为葡萄糖和果糖，所以常常将它的信号作用归因于它的水 解产物，然而近年来也发现植物体内存在独立的双糖信号( c h i o ue ta 1 ，1 9 9 8 ) ， 如蔗糖能抑制a t b 2 蛋白的翻译，而葡萄糖、果糖却不能( r o o ke ta 1 ，1 9 9 8 ) ： 编码质子蔗糖同向转移子基因的表达受到蔗糖的特异调节但不受葡萄糖和果糖 的影响( v a u g h ne ta 1 ，2 0 0 2 ) ：蔗糖介导的对转录因子b z i p 翻译的抑制也不能被 己糖所替代( w i e s ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 植物体内还存在许多不同类型的双糖信号，如蔗糖非代谢类似物的帕拉金 华南师范大学硕士研究生学位论文 糖和松二糖对基因表达的调节( l o r e t ie ta 1 ，2 0 0 0 ：f e m i ee ta 1 ，2 0 0 1 ) ，海藻糖对 彳儿3 表达的调节( f r i t z i u se ta 1 2 0 0 1 ) 。糖信号通过对特异基因表达的调控调节 植株的正常发育，蔗糖特异诱导的转录因子a t h b l 3 超表达影响叶片的形态发 育( h a n s o ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 虽然各种糖信号能够独立地传递，但高等植物体内的糖信号转导机制都非 常保守。许多葡萄糖不敏感突变体与蔗糖不敏感突变体是等位基因突变所致 ( g i b s o ne ta 1 。2 0 0 1 ) ，如g m l 是s i s 4 和i s i 4 的等位基因，g m 4 是s i s l 的等位基 因，g i n 6 是s u n 6 ，s i s 5 和捃订的等位基因。 1 1 2 2 糖信号传感蛋白 胞内传感蛋白 h x k l ( h e x o k i n a s e ) 是植物体内第一个被鉴定的糖信号传感蛋白，广泛分 布在细胞质，及线粒体、叶绿体、高尔基体、质体等细胞器的膜上，主要是传 导葡萄糖信号。在葡萄糖类似物的感应实验中，生理水平的啪( 磷酸化底物甘 露糖和非代谢类似物2 脱氧葡萄糖( 2 d e o x y g l u e o s e ，2 - d g ，) 抑制光合作用相 关基因的表达，特异的h x k 竞争抑制剂甘露庚酮糖阻断抑制，而不能作为磷酸 化底物的6 脱氧葡萄糖( 6 - d e o x y g l u c o s e ，6 d g ，) 、三甲基葡萄糖( 3 - t r i m e t h y l g l u c o s e ，3 m g ) 和不能透过细胞膜的左旋葡萄糖( l g ) ，以及葡萄糖的代谢 中间产物均不影响基因的表达( j a n ge ta 1 ，1 9 9 4 ) ，这表明糖信号的传递依赖于 h x k 的参与。虽然胞内磷酸化水平的影响也是一个重要考虑因素，但是注射外 源无机磷( p i ) 和腺苷三磷酸至细胞内并不能解除已糖的特异性抑制效应，说明 抑制信号的传递与能量的消耗无关。在原生质体瞬时表达系统中，两个催化活 性被抑制的a t h x k i 等位基因仍然能够抑制光合作用相关基因的表达，说明h x k 所介导的信号传递作用与其本身的代谢催化活性是相分离的( m o o r ee ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。在突变e 4 6 9 i n 2 背景下，异源表达两个非催化活性的a t h x k l 等位基因能够 抑制相关基因的表达，恢复对葡萄糖敏感的表型，维持对生长素和细胞分裂素 的反应，进一步说明植物体内存在不偶联代谢途径的糖信号途径。目前关于糖 信号途径中h x k 的下游组分的了解还很少，最近，c h o ( 2 0 0 6 ) 等鉴定了两个 h x k 下游组分v h a bi ( v a c u o l a ri - i + a t p a s eb1 ) 和r p t 5 b ( 1 9 sr e g u l a t o r yp a r t i c l e o f p r o t e a s o m es u b u n i t ) ，它们可以直接结合到葡萄糖信号调节基因c a b 2 的启动子 上，以依赖于葡萄糖的方式调控目的基因的转录活性( c h oe ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 4 文献综述 如同h x k 可以在胞内感知葡萄糖信号，s n r k i ( s n f l r e l a t e dk i n a s e l ) 可 以在胞内感知蔗糖信号( a x e le ta 1 ，2 0 0 3 ) 。s n r k 是植物体内的酵母s n f i ( s u c r o s en o n f e r m e n t i n g1 ) 同源蛋白，包括三个亚族：s n r k l ，s n r k 2 ，s n r k 3 。 s n r k l 与s n f l 的同源性最高，并且与s n f l 在功能上互补，是植物体内的代谢 调节关键酶；后两个亚族成员为植物所特有，与非生物胁迫、激素信号等有关 ( r y o u n ge t 以，2 0 0 7 ) 。b a e n a - g o n z a l e z 等( 2 0 0 7 ；2 0 0 8 ) 通过原生质体瞬时表 达系统和转基因植株的分析，发现s n r k l 在胁迫反应和能量信号整合网络中发 挥重要作用，是植物糖信号转导和代谢途径中的一个关键开关，能够感知蔗糖 信号、及时调控下游基因的表达( b a e n a - g o n z a l e ze ta 1 。2 0 0 7 ；2 0 0 8 ) 。s n r k l 不 仅可以在转录水平上调节代谢相关基因s s 、0 c 淀粉酶( a m y l u m ) 、a g p a s e ( a d p g l u c o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e ) 的表达来控制碳水化合物的代谢；还能通过 磷酸化作用调节重要代谢酶的活性来实现对碳水化合物代谢的调控( p u r c e l le t a 1 ，1 9 9 8 ；l a u r i ee la 1 ，2 0 0 3 ) 。 。甄 s n r k l能够磷酸化植物体内四种重要的代谢酶： h m g r ( 3 一h y d r o x y 一3 - m e t h y l g l u t a r y l - c o e n z y m e ar e d u c t a s e ) ( d a l e 甜a ，1 9 9 5 ) 、催化 蔗糖合成的s p s ( s u g d e n e ta 1 ，1 9 9 9 ) 、硝酸还原酶n r ( n i t r a t er e d u c t a s e ) 以及t p s 5 ( t r e h a l o s ep h o s p h a t es y n t h a s e5 ) ( h a r t h i l le la 1 ，2 0 0 6 ) 。h m g r 是所有类异戊二 烯的前体异戊烯焦磷酸合成的关键限速酶；s p s 和n r 分别是碳、氮代谢过程的 重要代谢酶，影响植物的碳氮代谢水平；t p s 5 是催化合成海藻糖每磷酸 ( t r e h a l o s e 6 p h o s p h a t e ，t 6 p ) 的关键酶，参与调节植物代谢和发育。 细胞膜传感系统 在真核生物中，g 蛋白偶联受体( g p c r ) 介导的信号转导途径是比较保守 的信号转导机制，经典的g 蛋白信号转导途径可能也是植物感知糖信号的一种 方式。编码g 蛋白0 【亚基的基因缺失突变后，g p a l 对a b a 和糖抑制种子萌发的 作用都十分敏感( u l l a h