（细胞生物学专业论文）紫荆花红色素的提取、纯化及其生物活性的研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 紫荆花红色素的提取、纯化及其生物活性的研究 摘要 紫荆( c e r c i sc h i n e n s i sb g e ) 是豆科紫荆属植物，在全国各地均有栽培，花量资源丰 富，花期长，花色艳丽，色素含量较高，是一种较理想的天然红色素资源。但有关紫荆 花红色素的开发情况鲜见报道。本论文包括文献综述、超声法萃取紫荆花红色素的工艺 研究、大孔树脂纯化紫荆花红色素的研究、紫荆花红色素理化性质及稳定性的研究、紫 荆花红色素体外抗氧化活性的研究和结论等六部分。课题研究内容系首次进行，具有创 新性，目的是为其进一步开发利用提供实验数据，为提高其应用价值提供理论依据。 首先，对当前国、内外有关植物色素开发应用的研究情况进行了综述，并在此基础 上提出了本论文的课题。 采用单因素试验和正交试验对紫荆花红色素的超声法提取条件进行了研究。结果表 明，影响因子依次为：料液比 超声功率提取剂浓度 提取时间，提取的最佳条件为： 紫荆干花、粉碎、2 次提取，2 5 - - - 3 5 、料液比1 ：2 0 ( g ：m 1 ) 、超声功率7 0w ( 2 0 k h z ) 、 提取剂8 5 乙醇，提取时间1 5 m i n 。在这一工艺条件下获得的色素产品为具有特殊花香 的紫红色浆状物，在可见光区的最大吸收波长为5 2 6 n m ，产率为1 0 1 2 ，色价e ( 1 ， 5 2 6n m ) 为2 5 6 。 研究了五种大孔吸附树脂对紫荆花红色素的吸附、解吸能力，确定弱极性树脂a b 8 为色素纯化的最佳树脂，1 0 0 丙酮为最佳洗脱剂。进行了a b 8 树脂的静态吸附、脱附 试验，结果表明：在p h = l 2 、2 0 - 4 0 ，6 0 1 2 0 m i n 可达吸附饱和，1 0 2 0 m i n 内可 达最大脱附量。对a b 一8 树脂的动态研究表明：原液浓度( 以吸光度表示) o 7 左右，合 理的吸附流速为2 0m l m i n ，合理的洗脱流速为1 5m l m i n 。紫荆花红色素在上述优化条 件下纯化制备，总收率达到4 3 1 左右，纯化后色素色价高达2 7 1 。 研究了紫荆花红色素的稳定性和理化性质，色素易溶于水、醇、丙酮等极性溶剂， 不溶于石油醚等非极性溶剂。色素水溶液在酸性条件下呈红色，p h = l 2 时颜色最为鲜 红，色素溶液( o 1 h c l ) 可见光区的最大吸收波长为5 2 6 n m 。色素耐光性、耐热性较 好，苯甲酸钠、蔗糖、抗坏血酸、苹果酸、柠檬酸等添加剂对其稳定性影响较小，h 2 0 2 、 n a 2 s 0 3 对色素具有一定的破坏作用。金属离子n a + 、m 9 2 + 、z d + 、a 1 3 + 对色素稳定性无 影响，c u 2 + 、f e 2 + 对色素影响较小，f e 3 + 可使紫荆花红色素变为褐色，因此应避免与f e 3 + 山东师范大学硕士学位论文 接触或共存。紫荆花红色素的显色反应也与花色素苷的显色特征一致。综上表明，紫荆 花红色素属黄酮类花色苷类色素。 研究了紫荆花红色素的抗氧化性，色素具有一定的还原性，还原力高于v c ，色素 液浓度与还原力正相关。色素具有清除o h 和0 2 的作用，清除o h 比清除0 2 的能力 强，样品浓度o 1 0 0g l 时，对o h 的清除率为8 0 6 9 ，对0 2 的清除率为4 4 8 7 ；色 素清除o h 和0 2 。的能力在测试浓度范围内清除率与样品浓度正相关。色素清除o h 和0 2 的能力均高于v c 。 关键词：紫荆紫荆花红色素超声波a b 8 大孔吸附树脂抗氧化性 中图分类号：t s 2 0 1 山东师范大学硕上学位论文 s t u d y o ne x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g ya n db i o l o g i c a l a c t i v i t yo fr e dp i g m e n tf r o mf l o w e r so f c e r c i sc h i n e n s i sb g e a b s t r a c t c e r c i sc h i n e n s i sb g e b e l o n g st oc e r c i so fl e g u m i n o s a e ，i sw i d e l yc u l t i v a t e da l lp a r t s o fo u rc o u n t r y ，h a v i n gal o n gf l o w e rs e a s o n ，b l o o m i n gi nb r i g h tc o l o ra n dg i v i n gah i g h - y i e l d o u t p u to fp i g m e n t h e n c ei ti sac o m p a r a t i v e l yi d e a ln a t u r a ls o u r c eo fr e dp i g m e n t h o w e v e r , s o f a rt h e r eh a sb e e nn os y s t e m i cr e p o r to nt h ed e v e l o p m e n to ft h i sn a t u r a ls o u r c e t h i st h e s i si s c o m p o s e do fs i xp a r t s ：a ni n t r o d u c t i o nt ot h es t u d yo nn a t u r a lp l a n tp i g m e n t s ，t h es t u d yo n u l t r a s o n i ce x t r a c t i o no ft h er e dp i g m e n tf r o mc e r c i sc h i n e n s i sb g e ，t h es t u d yo np u r i f i c a t i o n b ym a c r o p o r o u sa d s o r p t i v er e s i n ，t h es t u d yo ns t a b i l i t ya n dp h y s i c - c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ， t h es t u d yo na n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ft h i sr e dp i g m e n ta n dac o n c l u s i o n t h ep u r p o s eo ft h i s t h e s i si st h a tp r o v i d i n gs o m ee x p e r i m e n t a ld a t ef o rf u r t h e rd e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o n ， p r o v i d i n gs o m et h e o r e t i c a lb a s i sf o ri n c r e a s i n gt h ev a l u eo f t h i sp i g m e n t i n t r o d u c t o r yc h a p t e rp r o v i d e sa ni n t r o d u c t i o nt ot h es t u d yo nt h ed e v e l o p m e n to fs o m e p l a n tp i g m e n t sb o t ha th o m ea n da b r o a d ，b r i n g i n gu pt h et o p i co f t h i st h e s i s a san e wm e t h o do fe x t r a c t i o n ，u l t r a s o n i cw a su s e dt oe x t r a c tr e dp i g m e n tf r o mf l o w e r so f c e r c i sc h i n e n s i sb g e o r t h o g o n a lt e s ta n dm o n o f a c t o rt e s te x p l o r e st h eu l t r a s o n i ce x t r a c t i o n c o n d i t i o n s ，t h ef a c t o r st h a ta f f e c t i n gu l t r a s o n i ce x t r a c t i o n ：r a t i oo fr a wm a t e r i a lt os o l v e n t u l t r a s o n i cp o w e r a l c o h o lc o n c e n t r a t i o n e x t r a c t i o nt i m e ；s p e c i f i c a l l ya sf o l l o w s ：d r yf l o w e r 2 0 0 0ga n dt w i c eo fe x t r a c t i o n ，2 5 - 3 5 c ，s o l i d ：l i q u i d l ：2 0 ( g ：m 1 ) ，1 5 m i n ，7 0w j8 5 a l c o h 0 1 t h r o u g ht h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ep r o d u c t sw e r es p e c i a lp u r p l ef l o w e rp a s t e o b j e c t s ，t h el m a x w a s5 2 6n l n ，c o l o rv a l u ee ( 1 ，5 2 6n n l ) w a s2 5 6 t h ec o n d i t i o n sw e r es t u d i e dt or e f i n er e dp i g m e n t sf r o mf l o w e r so fc e r c i sc h i n e n s i s b g e u s i n g t h em a c r o p o r o u s a d s o r p t i v e r e s i n a n d t h ep e r f o r m a n c eo fa d s o r p t i o na n d d e s o r p t i o nf o rr e dp i g m e n tw i t hf i v em a c r o p o r o u sr e s i n sx - 5 ，a b 一8 ，s 一8 ，d 4 0 2 0a n dn k a 9 w a sc o m p a r e d b ya b - 8s t a t i ca n dd y n a m a t i ce x p e r i m e n t s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h ea b 一8 w a sb e t t e rt h a nt h eo t h e r s ，a n dt h e l 0 0 a c e t o n ew a sg o o de l u a n t a st h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ： c o n c e n t r a t i o no ff l o w e ro r i g i n a ls o l u t i o n ( t or e p r e s e n tw i t ha b s o r b a n c e ) w a so 7m o r eo r 山东师范大学硕士学位论文 l e s s ，2 0 - 4 0 ，p h = l 2 ，a c e t o n ed e s o r p t i o n ，a d s o r p t i o nv e l o c i t i e so ff l o w 2 0m l m i n ， d e s o r p t i o nv e l o c i t i e so ff l o w l 5m l m i n ，t h ep r o d u c ty i e l do ft h ep i g m e n tw a s4 31 ，a n dt h e c o l o rs c a l ee ( 1 ，5 2 6n l n ) o f p u r i f i c a t o r yp i g m e n tw a s2 7 1 t h es t a b i l i t ya n dp h y s i c c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fr e dp i g m e n th a v eo b v i o u s l y e n h a n c e da f t e rp u r i f i e a t i o n i tm e l t si nw a t e r , a l c o h o l ，a c e t o n ea n do t h e rp o l a rs o l v e n t sf r e e l y , n o td i s s o l u b l ei n p e t r o l e u m e t h e ra n do t h e rn o n p o l a rs o l v e n t s i tw a sr e di na c i d i c s o l u t i o n s ，a n dm o r eb r i g h t e ri np h = 1 2 i tw a ss e n s i t i v et oh 2 0 2 ，n a 2 s 0 3 a n dw a ss t a b l et o l i g h t ，h e a t ， s o d i u mb e n z o i e a c i d ，m a l i ca c i d ，c i t i ea c i d ，s u c r o s e ， v c ，n a + ，m 9 2 + , z n 2 + , a 13 + f e 2 + a n dc u 2 + c a np r o t e c tt h ee x t r a c t e dc o l o r a n t ，f e 3 + m a k ei tb r o w n c h e m i s t r yc o l o rr e a c t i o ns h o w e dt h a t ：p h e n o m e n ao fc o l o u rr e a c t i o no fr e dp i g m e n ti st h e s a m ew i t hc o l o rc h a r a c t e r i s t i c so fa n t h o c y a n i n t os u mu pt h a ti ti sak i n do fa n t h o c y a n i n p i g m e n to ff l a v o n o i dc l a s s a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ft h ep u r i f i c a t o r yp i g m e n tw a ss t u d i e d b ye s t a b l i s h e d m o d e l s y s t e m si nv i t r o i t sr e d u c i n gp o w e rw a sm e n s u r a t e d ，a n di t sp e r f o r m a n c eo fs c a v e n g i n g s u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l ( o2 。) b yo x i d a t i o no fp y r o g a l l a lm e t h o da n ds c a v e n g i n gh y d r o x y l r a d i c a l ( o h ) b yf e n t o nm e t h o dw a sm e n s u r a t e dt o o t h er e s u l ts h o w st h a t ：t h ea n t i o x i d a n t a c t i v i t yh a st od ow i t hi t sc o n c e n t r a t i o n ，a n di t sr e d u c i n gp o w e rh i g h e rt h a nv c ，i t si n h i b i t i n g e f f e c t so 2 - m o r et h a n o h w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fp i g m e n ts o l u t i o ni so 10 0 班，t h er a t i o o fs c a v e n g i n g o hi s8 0 6 9 ，s c a v e n g i n g o2 4 4 8 7 ，a n dt h e yb o t hm o r et h a nv c k e y w o r d s ：c e r c i sc h i n e n s i sb g e ； r e dp i g m e n tf o r mf l o w e r so fc e r c i sc h i n e n s i sb g e ，r p f c ； u l t r a s o n i ce x t r a c t i o n ；a b 8m a c r o p o r o u sr e s i n ； a n t i o x i d a t i o na c t i v i t y c a t e g o r yn u m b e r ：t s2 01 4 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：砂金舀 导师签字： 一， 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权兰 拉可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：孑釜亏 导师签字： 签字日期：2 0 0 歹年门月7 口日 签字日期：2 0 。7 年，f 月；。同 山东师范大学硕i j 学位论义 1综述 1 1 食用色素 食用色素据其来源不同可分为人工合成色素和天然色素两类。 1 8 5 6 年，英国的w h p e r k i n s 教授首次人工合成了苯胺紫，揭开了合成色素应用的 新纪元【1 1 。合成色素着色力强、稳定性好、色泽鲜艳、成本低廉、可规模化生产，发展 非常迅速，至2 0 世纪6 0 年代已普遍用于食品、化妆品行业。合成色素多为焦油类物质， 含有苯环和萘环，随着医学、毒理学、食品化学的发展，人们逐渐认识到合成色素不仅 本身无任何营养价值，有的甚至形成b 萘酚和0 【氨基一1 萘酚等致癌物质，严重危害人 体健康【2 1 。于是，世界各国开始重新审视合成色素的应用价值，进行毒理学和遗传学研 究，限制非安全性合成色素的应用。目前，各国允许使用的合成色素，英国2 2 种、日 本1 2 种、捷克1 0 种、中国8 种、美国仅为7 种，法国、瑞典、芬兰、印度、丹麦等禁 用重氮类色素，挪威等一些国家则完全禁用任何化学合成色素。 天然色素是指从自然界生物体中提取并经过精制而获得的产品，不仅绿色环保、安 全无害、着色适宜，又具有重要的食用和药用价值，越来越受到重视。近年来，随着科 学技术的不断进步，天然色素的资源不断被发掘，新品种不断涌现，色素稳定性得到提 高，产品使用更加安全方便，已逐渐成为色素市场的主流。天然色素包括植物色素、动 物色素、微生物色素，植物色素最为缤纷多彩，是天然食品色素的主要来源。 1 2 天然植物色素 植物色素是天然色素家族中最大、最重要的一支。按其化学结构分为四类，即以叶 绿素为代表的吡咯类色素，以胡萝卜素、番茄红素等为代表的多烯类色素，以花青素、 类黄酮等为代表的酚类色素，以甜菜素、紫草红素等为代表的酮醌类色素，其中尤以多 烯类色素和酚类色素的应用最为普遍。 天然酚类色素【3 】包括花青素、花黄素和鞣质3 类，广泛存在子植物细胞液泡的细胞 液中。酚类色素多以6 c 3 c 6 c 为基本骨架，由2 个苯环( a 、b ) 通过三碳链相互联结， 常有羟基、甲基、甲氧基、异戊烯基等取代基，基本结构为2 苯基苯并吡喃，同时在苯 环上至少含有2 个羟基，为多酚衍生物。花青素( a n t h o c y a n i d i n ) 的基本结构为2 苯基苯 并吡喃盐，在3 、5 、7 一碳位上有取代羟基，b 环各碳位上有羟基或甲氧基，形成了多种 花青素。自然状态下，3 、5 碳位上常和糖结合成糖配体，以糖苷形式存在称花色苷 ( a n t h o c y a n i n ) 。已知的花青素有2 0 多种，重要的有天竺葵色素( p e l a r g o n i d i n ) 、矢车菊素 5 山东师范大学硕士学位论文 ( c y a n i d i n ) 、飞燕草色素( d e l p h i n d i n ) 、芍药色素( p e o n i d i n ) 、矮牵牛色素( p e t u n i d i n ) 和锦葵色素( m a l v i d i n ) 等6 种【4 】；成苷的糖主要有：葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿 拉伯糖5 种；植物中花色苷少的仅1 种( 如黑莓) ，多的达2 0 多种。 1 3 花色苷类色素 最初使用花色苷名称的人是m a r g u a r t ( 1 8 3 5 ) ，最早获得花色苷结晶的是 m o l i s h ( 1 9 0 5 ) ，后来的研究者中贡献最大的是h a r b o n e 等人 5 1 。花色苷广泛存在开花植 物中，据初步统计，约有2 7 个科、7 3 个属植物中含花色苷【6 】，而见诸于报道的被研究 和开发的天然色素资源植物只有诸如甜菜、红心萝卜、紫甘蓝等3 0 多种【7 1 。花色苷是花 青素与糖以糖苷键结合而成的一类呈色化合物，广泛分布于植物的花、果实、茎、叶和 根器官的细胞液中，使其呈现出五彩缤纷的颜色，可以说花色苷可带来除绿色之外的所 有颜色。 1 3 1 花色苷类色素的基本结构【8 】 花色苷的基本结构如图1 1 所示，已经发现的花色苷有2 0 0 多种，重要的花色苷有6 种，详见表1 - 1 。 6 伽 图1 1 花色苷的基本结构 f i g 1 1t h ec o n s t u r c t i o no f a n t h o c y a n i n s 表1 1 六种主要的花色苷 l a b l e1 1t h es i xk i n d so fm a i na n t h o e y a n i n s 天竺葵色素p e l a r g o n i d i n hh草莓深红 芍药色素p e o n i d i no c h 3h樱桃 蓝红 矢车菊素 c y a n i d i n o hh 桑葚 蓝红 锦葵色素 m a l v i d i n o c h 3o c h 3葡萄皮紫色 矮牵牛素p e t u n i d i no ho c h 3葡萄皮紫蓝 飞燕草素( 翠雀素) d e l p h i n d i n o ho h 茄皮紫蓝 山东师范大学硕十学位论文 1 3 2 花色苷类色素的提取和纯化 1 3 2 1 溶剂浸提法( s o l v e n te x t r a c t i o n ) 溶剂提取法是根据原料中被提取成分的理化特性，遵循相似相溶原则，使有效成分 向溶剂中转移的过程。溶剂浸提后，经过滤、减压浓缩、真空干燥等工艺制得粗品。花 色苷类色素是水溶性色素，基本骨架上存在一个或多个极性基团，可以采用极性溶剂萃 取花色苷。常用的浸提法有无机溶剂提取和有机溶剂提取。 无机溶剂提取：常用水提法，以水作为萃取剂，水是极性较强的溶剂，适合浸提植 物中亲水性的成分，有时为了增加某些成分的溶解度，也有采用酸水或碱水作为提取溶 剂，如高梁红色素的温热碱水提取法【9 】。不过，在花色苷类色素的提取中，水提法往往 提取率较低而极少采用。 有机溶剂提取：常使用乙醇、甲醇、丙酮等，由于乙醇无毒、经济、易溶解、对植 物细胞的穿透能力强，萃取效果好，故乙醇最为常用。花色苷在中性或弱碱性溶液中不 太稳定，提取过程中通常采用酸化乙醇。崔蕊静等【l o 】使用o i h c l 9 5 乙醇2 ：l ( v ) 混合溶液作萃取剂提取了黑豆皮红色素，李和生等【1 1 】提取桑椹红色素，以o i h c l 9 5 乙醇1 ：1 ( v v ) 为提取剂，在料液比1 ：1 0 ( w v ) 、温度7 0 、时间1 2 0 m i n 条件下， 产品得率为5 8 。 溶剂萃取法的缺点是溶剂需回收、产品质量差、纯度低、有异味和溶剂残留【9 1 。 1 3 2 2 微波辅助萃取法( m i e r o w a v ea s s i s t e de x t r a e t i o n ，m a e ) m a e 是利用微波能进行物质萃取的一种新技术。1 9 8 6 年，匈牙利学者g a n z l e rk 首 次报导了应用微波萃取分离各种化合物样品的新方法【1 2 】。不久，g a n z l e rk 又将微波萃 取技术应用于天然产物的提取，p a r e 将此技术进一步细化、完善并申请了专利【1 3 】。 微波萃取的本质是微波对萃取溶剂和物料的均匀加热作用或生物效应( 非热效应) ， 加速溶剂分子对物料的渗透和待提取成分的溶剂化。微波萃取最早应用的装置是家用微 波炉，由于造价低、体积小、适于在实验室内应用，但很难进行回流提取。现在，已有 专门的微波式样制备的商品化设备，可分为两大类，一是密闭式微波辅助萃取装置，二 是开罐式辅助萃取装置【1 4 1 。微波辅助萃取因其快速高效、选择性强、重现性好、节能无 污染等优点，应用范围已从最初的环境样品分析、制各迅速扩展到食品、化工和农业等 领域【1 5 6 】。目前，微波技术用于提取生物活性成分的报道不断出现，已涉及到几大类天 然化合物( 挥发油、苷类、多糖、菇类、生物碱、黄酮、单宁、甾体及有机酸等) ，引起 7 山东师范大学硕士学位论文 人们的极大兴趣【1 7 】。许j 下虹等【1 8 1 以紫甘薯粉为原料，在微波条件下萃取其色素，通过正 交实验确定了萃取紫甘薯色素的最佳工艺参数：微波辐射功率7 0 0 w ( 温度7 0 。c ) 、辐射 时间6 3 7 m i n 、液固比1 5 ：1 、盐酸浓度为o 3 。黎或等【l9 】应用脂肪醇聚氧乙烯醚( a e o ) 协同微波提取虎杖色素，使用0 0 3 a e o 6 0 乙醇水溶液为提取剂、微波功率8 0 0 w ， 提取率高达9 8 9 。g e r g e l yac s i k t u s n a d i k i s s t 2 0 1 、张钟掣2 1 1 均成功应用微波技术提取天 然植物色素，目前微波萃取法在天然色素提取中的应用正在得到推广。 1 3 2 3 超声提取法( u l t r a s o n i ce x t r a c t i o n ) 超声技术是2 0 世纪发展起来的高新技术，是一种新兴的、多学科交叉的边缘科学， 已引起国内外科技工作者的广泛关注，超声技术的发展给化工、食品、生物、医药等学 科的研究开拓了新领域【2 2 1 。超声波是频率超过2 0 k h z 的机械波，目前认为它有3 种基 本作用机制【2 3 1 ，即机械力学机制、热学机制和空化机制。由于超声波作用的独特性，现 已广泛应用于分离领域，如：膜分离技术f 2 4 】、吸附与脱附分离技术【2 5 1 、泡沫浮选分离技 术【2 6 】、提取分离技术【2 7 】等等。 超声波提取技术的原理是利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈的空化效应、 搅拌作用等，破碎细胞、活化待分离物质分子、加速提取成分进入溶剂，提高物质浸出 率，不仅能够缩短提取时间，并且可以避免高温对提取成分的影响【2 8 】。 近年来，超声技术在提取生物活性物质中取得较大的进展。蔡金星等【2 9 】研究了超声 波对草毒色素提取的影响，通过单因素分析和正交试验设计确定了最佳提取工艺条件。 顾文秀等【3 0 】研究了乌饭树叶色素的提取工艺，在超声波频率3 0k h z 、室温、浸提1 0 m i n 、 溶剂为6 2 ( 体积分数) 乙醇、液固比为3 5 ：l ( m l g ) 、浸提1 次的条件下，提取率为2 3 8 4 ( 常规法为1 1 4 3 ) ，所用溶剂少、提取时间短，所得色素品质高。另外，李桂新 等【3 1 l 、吴瑛等【3 2 】彳艮多人进了相关研究，为超声提取色素技术奠定了坚实的基础。 1 3 2 4 酶法提取( e n z y m a t i ce x t r a c t i o n ) 酶法提取在食品工业应用极为广泛，通过酶工程技术选择特定的酶，使色素“前体” 转化为色素成分提高色素得率，或者除去天然色素粗品中的杂质提高产品纯度，也可以 通过控制酶促反应条件生产不同色调的色素【3 3 1 。s a t os h i n g o 等人【3 4 1 制备红花红色素时， 依次加入不同的氧化还原酶类，在一定的催化反应条件下使红花黄色素b 转变为红花红 色素，产品得率提高2 5 1 0 倍。酶法提取主要是利用纤维素酶( c e l l u l a s e ) 、果胶酶 ( e x o g e n o u sp e c t i ce n z y m e s ) 等分解细胞壁的纤维素、果胶质，促进细胞破壁，从而使 山东师范大学硕上学位论文 花色苷溶出。徐忠等【3 5 】采用酶法提取千日红花色苷，并用吸附层析技术进行纯化，研究 表明适宜的提取条件是：温度3 0 。c 、p h = 6 8 、酶用量6 0 9 9 g 、固液比为1 ：1 0 、提取 时间为6 0m i n ，适宜的纯化条件为径长比1 ：3 0 、层析柱温度为3 5 * ( 2 。酶法提取越来越 普遍。 1 3 2 5 离子交换树脂层析( i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，简称i e c ) 1 9 3 5 年，a d a m s 和h o l m e s 成功研s u t 酚醛型离子交换树脂【8 】。7 0 多年来，m c 由 最初的水处理，逐步延伸到化工、环境、冶金、医疗等领域，成为一个独特的从混合物 中分离相似大分子物质的一种方法。离子交换树脂由高分子的惰性骨架和单分子活性离 子组成，活性离子带有相反电荷，可在树脂骨架中自由进出，发生离子交换现象。根据 交换树脂的性能，分为阳离子与阴离子交换树脂两种类型。 c 的原理是根据物质酸碱性不同，当待纯化溶液通过层析柱时，混合物和树脂不 断进行离子交换，混合物中的离子被吸附在树脂柱上；在冲洗过程中，洗脱剂和树脂再 次发生离子交换作用，把树脂上的离子洗脱下来。赵新淮等【3 6 1 利用乙醇或水从黑加仑果 渣中提取红色素，在料液比为l ：5 ( g m 1 ) 、温度5 0 、时间1 5 m i n ，加入少量浓盐酸( 体 积比1 或3 ) 做稳定剂，提取2 3 次，可得色素9 0 ；选取离子交换树脂除去杂质， 采用1 ：9 的o 1m o l l 盐酸乙醇溶液( v v ) 两步洗脱，可回收8 6 左右的色素。虽然， i e c 最早被引入花色苷类色素的精制，由于大孔吸附树脂的应用，近年来i e c 在花色苷 类色素纯化的研究文献不多。 1 3 2 6 大孑l 树脂分离技术( m a c r o p o r o u sr e s i ni s o l a t i o nt e c h n o l o g y ) 大孔吸附树脂主要是以苯乙烯、二乙烯苯为原料，在0 5 的明胶水混悬液中，加入 一定比例的致孔剂聚合而成，具有良好的网状结构和很高的比表面积，是继离子交换树 脂之后发展起来的新型分离介质，与离子交换树脂的区别是不带离子交换基团。 目前，市售大孔吸附树脂主要分成极性、非极性和弱极性三类树脂。大孔吸附树脂 具有理化性质稳定、不溶于酸、碱和有机溶剂，选择性好，不受无机盐的影响，解析温 和、再生简便、使用周期长等优点。f 1 2 0 世纪7 0 年代发展成一门分离技术以来，被广泛 用于天然产物分离。近年来，大孔树脂主要适合用于极性和弱极性物质的提取分离，国 内应用大孔树脂技术提取纯化花色苷类色素的研究很多。当前，国内对色素分离的研究 分为两个方面【3 7 1 ，第一主要是吸附解吸条件、工艺的研究，第二则对吸附的机制，吸附 过程的动力学进行研究。邹阳等3 8 1 使用a b 8 大孔吸附树脂对蓝莓花色苷精制工艺进行 9 山东师范大学硕士学位论文 了研究，结果表明：树脂吸附流速为l o m l m i n ，解吸流速为5 m l m i n ，饱和吸附量为 3 9 0 9 8 m g m l ，精制色素色价1 7 5 ，是国标的4 0 多倍。张卓等研究了用d 1 0 1 型大孔树脂 纯化玉米紫色植株花色苷色素的工艺参数，当上样液浓度为0 4 9 m l 、流速为0 6 m l m i n 时，吸附率达7 3 3 ，用4 b v5 0 乙醇洗脱解吸率达8 9 7 。 1 3 2 7 高速逆流色谱法( h i g h s p e e dc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ， h s c c c ) h s c c c 是由美国y o i c h i r oi t o 博士于1 9 8 2 年发明并率先使用的一种基于液液分配 机理的新型色谱分离技术【删。它的原理【4 1 1 是应用特殊的流体动力学原理，利用螺旋管方 向性与高速行星式运动相结合，产生的一种独特的流体动力学现象，使相对移动、互不 相溶的固相和液相进行高效的接触、混合、分配和传递，按照分配系数的不同依次洗脱 而获得分离。h s c c c 对样品的预处理要求较低，适用于粗提取物的分离，已成功应用 于花色苷类色素的分离纯化。d e g e n h a r d t 等t 4 2 】从红甘蓝中分离出四种花色苷，从玫瑰茄 的乙醇提取物中分离到飞燕草色素3 b d 葡萄糖( 2 叶1 ) p d 木糖苷和矢车菊色素的 衍生物两种主要花色苷；d u 等【4 3 】从5 0 0 m g 越橘花色苷粗提物中，分离得到1 3 0 m g 飞燕 草色素3 o d d - 葡萄糖一( 2 _ 1 ) 一1 3 - d 一木糖苷和7 7 m g 矢车菊色素一3 - o p d - 葡萄糖- ( 2 叶1 ) 一p - d 木糖苷。我国高速逆流技术起步较早，近十年来开展了大量的研究工作，积累了丰富的 研究成果 4 0 , 4 4 1 。 1 3 3 影响花色苷类色素稳定性的主要因素 光照、温度、酸碱性、氧化剂、还原剂、盐金属离子和食品添加剂对色素溶液的稳 定性均有一定影响。对色素稳定性的研究通常采用分光光度法进行分析。 1 3 3 1 光照和温度 一般来讲不同花色苷类的热稳定性不尽相同。曹艳萍【4 5 】研究发现李子皮中红色素不 仅耐光性强，而且光照还可增色，耐热性也较好。刘建新1 研究表明叶子花红色素在 7 0 。c 以下稳定性较好，7 0 c 以上耐热性明显降低，建议在提取加工过程中应尽量避免强 光直射。黑莓红色素【4 7 3 对光、对热都比较稳定。紫甘薯红色素、紫李皮红色素、紫葡萄 红色素、紫苏叶红色素、黑豆红色素、黑米红色素对热都比较稳定，对光的稳定性依次 降低【4 8 1 。 1 3 3 2 p h 值 1 0 山东师范大学硕士学位论文 花色苷色素在酸性条件下较稳定，中性或碱性条件下则易迅速降解。李子皮红色素 提取率随提取剂p h 的减小而增大，p h _ 超声功率提取剂浓度 提取时间。 综合分析正交试验结果并考虑成本因素，确定最佳工艺条件为：a 3 8 3 c 1 d l ，即在紫荆干 花、提取2 次条件下，料液比1 ：2 0 ( g ：m 1 ) ，超声功率7 0w ，提取液浓度8 5 ，提取 时间1 5 m i n 。 表2 1 正交试验结果 t a b l e2 1r e s u l t so fo r t h o g o n a lt e s t 2 3 4 对比实验结果 由表2 2 可看出，与传统溶剂浸提法相比，超声法提取紫荆花色素的单次提取时间 由2 4h 减少为1 5 m i n ，提取率由8 9 9 提高到9 4 8 ；与微波法相比，超声法提取紫荆 花色素的料液比( g m 1 ) 由1 ：4 0 降低为1 ：2 0 ，不仅溶剂量减少了1 倍，缩短了溶剂 回收的时间，提取率也提高了2 2 ，同时还可避免微波产生的高温对色素活性造成影 2 0 山东师范大学硕士学位论文 响。 表2 - 2 对比试验结果 t a b l e 2r e s u l t so fc o n t r a s tt e s t 2 3 5 产率和色价 称得样品1 0 0 23g ，得粗色素产量o 1 0 14 9 ，产率为1 0 1 2 ，按公式计算色价。 色价计算公式【8 5 】：e i 。m = a c l ，其中a 为k m a x 处吸光度，c 为色素溶液质量分 数，l 为比色皿厚度l e m 。计算结果样品的色价为2 5 4 。 2 4 结论 超声法提取紫荆花色素的最佳工艺条件为：紫荆干花、碎花、2 次提取，料液比1 ： 2 0 ( g m 1 ) ，超声波频率2 0 - j ：i k h z ，超声功率7 0w ，提取剂8 5 z - 醇溶液，提取时间1 5 m i n 。 在这一工艺条件下获得的色素产品为具有特殊花香的紫红色浆状物，0 i h c ! 溶液在可 见光区的最大吸收波长为5 2 6 n m 。提取率为9 4 8 ，产率为1 0 1 2 ，色价e ( 1 ，5 2 6 n m ) 为2 5 。4 。与常规溶剂浸提法相比提取时间减少了9 6 倍，与文献微波法比较溶剂减少 了1 倍，因此超声技术适用于紫荆花天然红色素的提取，具有省时、高效、节能等优点， 值得扩大实验应用。 2 l 山东师范大学硕士学位论文 3 大孑l 树脂纯化紫荆花红色素的研究 3 1 前言 文献检索发现：大孔吸附树脂性质稳定、不溶于酸、碱和有机溶剂，选择性好，自 2 0 世纪7 0 年代以来，已广泛用于天然产物分离。近年来，国内应用大孔树脂技术提取 纯化花色苷类色素的研究很多。本实验研究了x 5 、d 4 0 2 0 、a b 8 、s 8 、n k a 9 五种 大孑l 吸附树脂对紫荆花色素的吸附、解吸能力，确定弱极性树脂a b 8 为色素纯化的最 佳树脂，1 0 0 丙酮为最佳洗脱剂。进行了a b 8 树脂的静态试验和动态试验，研究了 a b 8 树脂纯化紫荆花红色素的工艺条件，并在优化条件下纯化制备了红色素。 3 2 材料与方法 3 2 1 材料的制备 紫荆花提取液，按上述优化的超声工艺条件自制。 3 2 2 试剂与仪器 丙酮分析纯天津科密欧化学试剂有限公司 9 5 乙醇分析纯山东新泰康瑞医药公司 盐酸分析纯天津科密欧化学试剂有限公司 氢氧化钠分析纯天津科密欧化学试剂有限公司 大孔树脂分析纯天津市光复精细化工研究所 w f zu v - 2 1 0 0 型紫外可见分光光度计上海龙尼柯 7 2 2 e 可见分光光度计上海光谱 a r l l 4 0 电子天平美国奥豪斯 r e 5 2 a 旋转蒸发仪上海亚荣 b i l o n 9 6 i i 超声波细胞破碎机上海比朗仪器有限公司 p h s 3 c 酸度计上海雷磁 f d 1 b 5 0 真空冷冻干燥机北京博医康 3 2 3 实验方法 3 2 3 1 树脂预处理 山东师范大学硕士学位论文 大孔树脂的各项参数详见表3 1 。 将大孔树脂置于干净的烧杯中，加入体积分数为9 5 的乙醇浸泡2 4 小时，倾去上 层悬浮物。 湿法装柱，用9 5 的乙醇反复洗涤，至流出液与等体积去离子水混合无白色混浊为 止；然后用去离子水洗至无明显乙醇气味。 用1 h c l 浸泡5 小时，然后用双蒸水洗至p h 值为中性。 用1 n a o h 溶液浸泡5 小时，用双蒸水洗至p h 值为中性。 布