（细胞生物学专业论文）利用its序列和matk序列探讨中国部分原生棕榈科植物的亲缘关系.pdf

摘要 通过叶绿体t r n k 基因的内含子m a t k 序列及核糖体转录间隔区( i t s ) 序 列研究初步分析了中国原生棕榈科1 8 属间的系统发生。主要结果有以下三 点： 1 ) 测定了3 种中国原生棕榈科植物i t s 序列，并通过n c b i 网站对 g e n b a n k 数据库检索得到了部分棕榈科植物i t s 序列。结果表明：部分棕榈 科植物i t s 序列种内差异较大，提示其不同i t s 拷贝间没有完全实现同步进 化，同种棕榈科植物植物i t s 序列差异，有时候大于非同种棕榈植物间差异， 这种情况下，由i t s 序列构建的棕榈科植物系统树可能是不可信的； 2 ) 测定了1 1 种中国原生棕榈科植物m a r k 序列，并通过n c b i 网站对 g e n b a n k 数据库检索得到了其它8 种中国原生棕榈科植物m a t k 序列。结果显 示，棕榈科植物的m a t k 序列存在一定的信息位点，但是较为保守； 3 ) 总的来说，1 9 种样品代表了1 5 属棕榈科植物。通过对其m a r k 序列 的聚类分析表明： a ) 贝叶棕族植物细棕竹及小琼棕与鱼尾葵族鱼尾葵属植物亲缘关系比 其同其它贝叶棕族植物亲缘关系近，这与传统分类学对棕榈科植物 进行的分类不同； b ) 刺葵族植物刺葵与贝叶棕族植物亲缘关系较近； c ) 除桄榔属与鱼尾葵属间分支支持度较低外，其余各分支均大于6 0 ； d ) 水椰亚科及省藤亚科与其它棕榈科植物见亲缘关系较远，这与以前 的研究相一致； e ) 利用m a t k 序列对棕榈科植物进行系统分类研究与传统分类基本吻 合。 关键词：棕榈科植物；分子系统发生；m a t k m oie c ula rp h yio g e n e tic so f c hin e s ep aim a eb a s e do n nrd n ait sa n dc p d n am a r ks e q u e n c ed a t a p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sa m o n gt h e18o r i g i n a lg e n e r ao ft h ep a l mf a m i l yw e r e i n v e s t i g a t e du s i n gt w od n as e q u e n c ed a t as e t sd e r i v e df r o mm a t k ，t h em a t u r a s e - c o d i n gg e n el o c a t e di na ni n t r o no ft h ep l a s t i dg e n et r e k ，a n dt h ei n t e r n a lt r a n s c r i b e d s p a c e r ( i t s ) r e g i o no f18 s 一2 6 sn u c l e a rr i b o s o m a ld n a t oe x a m i n er e l a t i o n s h i p si n 18g e n e r a so fc h i n e s ep a l mf a m i l y t h em a i ns t u d yr e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 ) d e t e r m i n a t i o no ft h et h r e et y p e so fc h i n e s ep r i m a r yp a l mp l a n t si t ss e q u e n c e s ， a n dc o m p a r i s o nw i t l lo t h e rp a l mp l a n t si t ss e q u e n c e sf r o mt h en c b ig e n b a n k d a t a b a s e i nt h em a j o r i t yo fc a s e s ，m u l t i p l ec l o n e sf r o mi n d i v i d u a l sr e s o l v e da s m o n o p h y l e t i c ，w h i c hs u g g e s t s t h a td i f f e r e n tc o p i e so fi t sn o tc o m p l e t e l y s y n c h r o n i z e de v o l u t i o n , t h es a m es p e c i e so fp l a n tp a l mp l a n t si t ss e q u e n c e s ， s o m e t i m e sf a rg r e a t e rt h a nd i f f e r e n c e sb e t w e e ns p e c i e so fp a l mp l a n t s ，h o w e v e r , t h eh i g hl e v e l so fh o m o p l a s yi nt h ei t sd a t a s e t ，l e dt oc o n c e r n st h a tt o p o l o g i e s o b t a i n e df r o mt h e s ed a t am i g h tb eu n r e l i a b l e ； 2 ) d e t e r m i n a t i o no ft h eo r i g i n a l11c a t e g o r i e so fc h i n e s ep a l mp l a n t sm a t k s e q u e n c e s ，a n dc o m p a r i s o nw i t ho t h e r8c h i n e s ep a l mm a t ks e q u e n c ef r o mt h e n c b ig e n b a n kd a t a b a s e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp a l mp l a n t sm a t ks e q u e n c e i n f o r m a t i o no fc e r t a i np o i n t s ，b u tm o r ec o n s e r v a t i v e ； 3 ) i na j l ，19s p e c i e sr e p r e s e n t i n g15g e n e r ai np a l m a ew e r ee x a m i n e d o u ra n a l y s e s p r o v i d e dt h ef o l l o w i n gi n s i g h t s ：( 1 ) w h i c hs u b s t r i b ed o e sr h a p i sr o e b e l e n i ia n d c h u n i o p h o e n i xn a n ab e l o n ga r ei n c o n s i s t e n tw i t hp r e v i o u sc l a s s i f i c a t i o n s ；( 2 ) p h o e n i c e a ea n dc o r y p h e a eh a v ec l o s er e l a t i o n s h i p s ；( 3 ) e x c e p to fa r e n g aa n d c a r y o t a ，o t h e r sh a v eh i g hb o o t s t r a ps u p p o r t ，w h i c hi s 6 0 ；( 4 ) n y p o i d e a ea n d c a l a m i n e a ei ss i s t e rt ot h er e s to ft h ep a l m s ；( 5 ) t h er e s u l tw a sb a s i c a l l y c o n s i s t e n t 、析t ht h a to fp r e v i o u sc l a s s i f i c a t i o n s k e yw o r d s ：p a l m a e ；m o l e c u l a rp h y l o g e n y ；m a t k 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文 写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法 享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：互者海 伽年月和日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用 于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的 内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的 学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 保密( ) ，在年解密后适用本授权书。 | 2 不保密( v ( 请在以上相应括号内打“ ) 卿年 杖7 | f 月 ，x 月 刿日 日 ， 利用i t s 序列和m a t k 序列探讨中国部分原生棕榈科植物的亲缘关系 1 前言 1 1 棕榈科植物概况 1 1 1 棕榈科植物特征 棕榈科( p a l m a e ) ，亦称槟榔科( a r e c a c e a e ) ，属种子植物门单子叶植物纲 槟榔目( a r e c a l e s ) ，乔木或灌木，树干不分枝，有些种类攀援而多刺；具大型 掌状或羽状叶片，常聚生于树干的顶端；叶鞘常具网状纤维( 棕衣) ；有时具利 刺；茎单生或丛生，地上不分枝( 海菲棕属除外) ；花序佛焰状，常由大型苞片 紧包被，两性或单性；花被具花萼和花冠，3 裂瓣；雄蕊通常6 ；子房上位、1 3 室，有时4 7 室，心皮3 ，离生或仅基部合生；核果或浆果，不开裂，肉质， 具核，纤维质或坚果状，内果皮坚硬 1 。 1 1 2 棕榈科植物研究历史及现状 棕榈科( p a l m a e ) 名称自j u s s i e u s ( 1 7 8 9 ) 确定以来，许多学者对该科进行 了系统的研究。m a r t i u s ( 1 8 4 9 1 8 5 3 ) 最早将该科区分为6 族( t i r b e s ) ： a r e c i n a e ，b o r a s s i n a e ，c o r y p h i n a e ， c o c o i n a e ， l e p i d o c a r y i n a e ， h e t e r o c l i t a e ；h o o k e r ( 1 8 8 3 ) 将该科区分为6 亚科：a r e c e a e ，p h o e n i c e a e ， c o r y p h e a e ，l e p i d o c a r y e a e ，b o r a s s e a e ，c o c o i n e a e 。此后，d r u d e ( 1 8 8 7 ) ， s a t a k e ( 1 9 6 2 ) ，p o t z t a l ( 1 9 6 4 ) ，m o r r e ( 1 9 7 3 ) 等学者提出不同的分类观点。 1 9 8 7 年u h l 与d r a n s f i e l d 联合出版了棕榈属志。将该科区分为6 亚科 ( s u b f a m i1i e s ) ：贝叶棕亚科( c o r y p h o i d e a e ) ，省藤亚科( c a l a m o i d e a e ) ，水 椰亚科( n y p o i d e a e ) ，蜡材榈亚科( c e r o x y l o i d e a e ) ，槟榔亚科( a r e c o i d e a e ) ， 象牙椰亚科( p h y t e l e p h a n t o i d e a e ) ，并在亚科下设若干族及亚族。该书确认了 全世界棕榈科共有2 0 0 个属，并详述了各属的分类学特征，系统位置( 其中2 个 属系统位置不明确) 和地理分布，他还根据化石与形态、解剖研究、细胞学、花 粉形态学提出该科起源、演化的观点 6 。 随着新学科新技术的发展，全世界棕榈科植物分类学研究也有了很大发展。 属的数目在不断变化，由1 9 8 7 年的2 0 0 属，到1 9 9 7 年的1 8 9 属，再到现在的 2 1 0 属。一些属被归并，另外又有一些新属产生。很多高等级分类群已被证明是 单系的，但一些亚科、族、亚族的关系和界限还不是很清楚，存在不少问题。目 利用i t s 序列和m a t k 序列探讨中国部分原生棕榈科植物的亲缘关系 前对于棕榈科植物分类学的研究一般都基于解剖学、等位酶分析、分子系统学或 其它数据。 棕榈科植物是单系发生的 7 ，它同其它单子叶植物遗传距离比较远，但是 对质体d n a 序列的研究则表明棕榈科内部之间的亲缘关系较其它科属内部间近。 其叶绿体d n a 变化速率较慢，研究表明棕榈科植物叶绿体r b c l 基因序列进化速 度比禾本科植物慢5 倍 8 ，9 ，而核a d h 基因则比禾本科植物慢2 5 倍左右 1 0 。 因此确定其内部根比较困难，因为利用进化比较快的长度多变序列研究则不能同 合适外群比较，而利用长度保守序列研究则不能提供足够的变异位点。基于分子 序列对棕榈科的系统发育研究一直存在争论，研究不同的序列或者选择不同外 群，得到的结果有时候存在一定的差异。以水椰为例，采用薯蓣为单一外群并对 叶绿体序列酶切分析和对叶绿体非编码序列拓扑结构研究得出的结论相冲突 1 1 。找到合适的序列以及外群，对于棕榈科植物的系统发生研究尤为重要。1 9 9 9 年，b a k e r 等基于t r n l - t r n f 序列得出龙棕( t r a c h y c a r p u s 刀a 门“sb e c c ) 独立成 为一支 1 2 ，利用5 s 核糖体d n a 非转录间隔区( 2 0 0 0 ) 研究棕榈科六个属间亲 缘关系 6 9 ；a s m u s s e n 等用r p s l 6 内含子和t r n l - t r n fd n a 序列( 2 0 0 0 ) 的研究 结果表明：龙棕与石山棕( g u i h a i aa r g y r a t a ) 有很近的亲缘关系 7 0 ，用编码、 非编码区质粒d n a ( 2 0 0 1 ) 研究棕榈科植物的系统发育得出棕榈( t r a c h y c a r p u s f o r t u n e d 与石山棕( g u i h a i aa r g y r e t a ) 及欧洲矮棕( c h a m a e r o p s 力m i l l s ) 有着 较近的亲缘关系：h a h n ( 2 0 0 2 ) 等人利用a t p b ，r b e l 和1 8 sn r d n a 序列研究棕 榈科的分子系统发育关系得出棕榈属( t r a c h y c a r p u s ) 独立成一支，与欧洲矮榈属 ( c h a m a e r o p s ) 及棕竹属( r h a p i s ) 有着较近的亲缘关系 1 3 。 1 1 3 中国原生棕榈科植物的综合利用 棕榈科位于禾本科和豆本科植物之后是世界第三大经济作物，在我国长江以 南地区广泛栽培，既是观赏植物，又是经济植物。 1 1 3 1 观赏 中国原生的棕榈植物的许多种类可作为观赏植物，它们在园林中的应用有着 悠久的历史。公元前二世纪，尔雅就对棕竹一类的植物进行了记载；晋代的 南方草木状有了蒲葵、桄榔等的描述；对椰子的记录可以追溯到公元前2 世纪的汉朝。棕竹一类的植物常作盆栽观赏，棕榈常见在寺庙栽培。上世纪2 0 6 利用i t s 序列和m a r k 序列探讨中国部分原生棕榈科植物的亲缘关系 年代开始，陆续有原生的棕榈植物出现在现代城市中 2 。 1 1 3 2 经济价值 棕榈是重要的经济植物：世界上约有1 0 个属的棕榈种类的果实、种仁，可 以生产食用油脂或工业、药用油脂。以油棕( e a e i sg u i n e n s i sj a c q ) 和椰子 ( c o c o sn u c i f e r al ) 最为典型。世界上产糖的棕榈植物约有1 1 个属，多数 是从花序上割开后采集其花汁，将花汁经过蒸煮与加工而成食用棕榈糖，如糖棕 ( b o y a s s u sf a b e l l i f e rl ) 、桄榔( 砂糖椰子) ( a r e n g ap i n n a t a ( w u r m b ) m e r r ) 。有些棕榈植物树汁或果汁可以直当作饮料饮用或发酵成酒和醋，如智利 椰子( j u b a e ac h i l e n s i sb i l l ) 。蜡棕属棕榈植物的树叶表面覆盖有一层蜡质， 可以提取优质的工业、医药及日常用的蜡 3 。 此外，蒲葵、椰子和水椰的叶子可以盖凉亭或者屋顶；黄藤、大部分的省藤 属种类，部分的钩叶藤属种类，加工后可以用于编织各种类型的藤器、工艺品等； 董棕的木质坚硬，可作水槽和水车的材料；剥取棕榈的棕皮纤维( 叶鞘纤维) ，可 作绳索、棕棚、编蓑衣、地毡、棕垫、棕箱、制刷子、扫把和沙发填充料等，嫩 叶经过漂白可以编织草帽；蒲葵的叶片可以做蒲扇，叶裂片的肋脉可以制作牙签： 椰子的果实外壳可以制成各种器具和工艺品 4 ，5 。 1 1 3 3 药用 对于棕榈的药用，我国古今文献都有记载与研究。唐朝白居易在题为“西湖 晚归回望孤山寺赠诸客曾写到“拼榈叶战水风凉 ；宋朝嘉祜本草也有棕 榈的记载；明朝李时珍在本草纲目中记载棕榈的笋、花、果及皮均可以药用； 清朝赵其光在本草求源中称棕榈“能引血归经，止上卜失血，止下优良血， 不但性涩能收脱也。此物止血，不在烧灰，但血见黑则止之说，病习己久，姑从 之。 棕榈的叶鞘纤维( 俗称棕皮) 及叶柄( 俗称棕板) 锻炭入药有止血的作用，根 治淋病，果实、叶、花、根也可入药；蒲葵的果实供药用，对癌症、白血病等有 一定的疗效，根可治哮喘，叶可治功能性子宫出血；槟榔又称大腹果( 子) ，种 子中含有很多种生物碱和单宁，有杀虫、破积、下气、行水的功效，可治虫积食 滞，脘腹胀痛和疟疾，能祛除肠道寄生虫，花序和花、花苞均可入药，能清热止 咳、健胃；椰子的根入药，治急性黄疸型肝炎，果壳油能治皮炎、脚癣、慢性湿 7 利用i t s 序列和m a t k 序列探讨中国部分原生棕榈科植物的亲缘关系 疹；棕竹的根和叶鞘纤维也可入药 3 ，4 。 1 1 4 我国原生棕榈科植物应用存在问题 棕榈科植物主要分布于亚洲、美洲热带地区。巴西是世界上棕榈植物最丰富 的国家。据统计原产于我国的有1 8 属1 1 7 种，主产地为云南、广东、海南、广 西、台湾、福建。四川、湖南、江西、浙江、贵州。西藏的一些温暖地区也有分 布。 有效的分类鉴别是棕榈科植物应用工作中首先要解决的问题。分类上的混乱 或不明确已经成为棕榈科植物应用开发的严重阻碍，由于棕榈科植物在形态结构 上和其他木本植物有明显的差异，如茎常不分枝；叶大型，常羽状分裂或掌状分 裂，并聚生于茎顶或在藤本种类呈散生状；无形成层，其茎不能像双子叶木本植 物那样随时间推移逐渐增粗等，故很容易通过对营养器官的辨认使棕榈科和其它 科区分开来。但在属、种间的分类却不是那么简单，对幼苗期的植物区分尤其困 难。这给棕榈科植物的系统演化、多样性保护研究和资源开发应用都带来了不利 影响。因此，与其它植物一样，分子系统学的研究无疑是解决问题的有效方法之 一o 1 2 成熟酶编码基因( m a t k ) 和核核糖体d n a 转录间隔区( 1 t s ) 系统学或分类学是生命科学中争议最多的领域之一。种、属、科以及更高的 分类单元的定义常常带有主观性。较之分类学，系统发育学内的矛盾少一些，因 为它首要考虑的是有机体间的进化关系，而将某一类群归属到一个确定的分类单 元等级，则是次要的工作。然而，系统发育学与分类学的关系相当紧密，因为有 机体的分类反映它们的进化历史。 过去研究植物系统分类和演化的方法是在群体的整体水平上，以物种的形态 特征特别是生殖系统的形态特征及繁殖方式、代谢物种类，结合古生物学、植物 地理学、统计学等进行研究。随着现代生物技术迅速发展，8 0 年代开始利用d n a 分子标记技术研究植物系统学，形成了植物学研究的一个新的热点植物分子 系统学。在分子水平研究物种亲缘关系其主要的理论依据是中性进化理论和分子 钟假说。 分子钟( m o l e c u l a rc l o c k ) 的概念来源于分子进化的中性突变假说。该假说 认为，生物大分子在进化过程中其速率是近似地保持恒定的。而根据分子钟的原 r 利用i t s 序列和m a t k 序列探讨中国部分原生棕榈科植物的亲缘关系 理来推断生物类群的起源和分歧时间就是将分子系统学的研究和古生物学的化 石记录证据相结合来推论生命史上进化发生事件的时间表。分子钟假说认为核苷 酸和氨基酸的替代速率在进化过程中是近似地保持恒定，尽管替代速率的观察值 受随机误差的影响。z u c k e r k a n d l 和p a u l i n g ( 1 9 6 2 ，1 9 6 5 ) 及m a r g o l i a s h ( 1 9 6 3 ) 在比较了几种动物的血红蛋白、细胞色素c 的序列后最先注意3 , 1 - 这些蛋白质的 氨基酸取代速率在不同的种系间大致相同，即分子水平的进化存在恒速现象。于 是，z u c k e r k a n d l 和p a u l i n g 提出了进化在分子水平存在“时钟”。若用公式表示 分子钟的概念，则首先需要根据化石、生物事件及性状的成对距离比较来确定物 种分类单元同源序列( 包括蛋白质序列或氨基酸序列) 最近的分歧时间，然后比较 同源序列的氨基酸或核苷酸取代数目，就可以计算出此分类单元的平均氨基酸或 核苷酸取代速率，即：r = k 2 t ，其中r 为氨基酸或核苷酸取代速率；k 为两同源序 列的氨基酸或核苷酸取代总数；t 为物种间的分歧年代。此时，若我们认为得到 的平均取代速率基本是恒定的，我们称这个恒定取代速率为分子钟 1 4 。 由于不同性状间或同一性状可能存在着异速进化现象。若我们在重建系统发 育关系时，不加考虑地接受分子钟假设，那么可能导致一些错误的结论。其中之 一便是应用某一已知的分子钟来估算目的物种的分歧时间时，可能因建立分子钟 的物种和研究的物种在分歧后进化速率不同，采用这个分子钟就导致估算出的年 代过早或过晚而与真实的情况不符；另外一种可能的错误是当系统树上各物种发 生分歧后各自独立进化，因此它们之间的进化速率有可能并不相同。若此时我们 选取一定的性状并接受分子钟的假设来重建物种的系统发育关系，会因忽略各分 枝的不同进化速率，可能使分歧早的物种变成晚的，而分歧晚的变成早的，于是 得到错误的系统进化树。故在选取建立系统关系树的方法时，应注意该方法是否 需要分子钟的假设。因此，在仅需要重建系统关系的情况下，采用不需分子钟假 设的方法，如p h y l i p ( f e l s e n s t e i n ，1 9 9 3 ) 软件包内距离法中的n e i g h b o r j o i n t i n g 方法或p a u p ( 3 0 ) ( s w o f f o r d ，1 9 9 3 ) 中使用的各种简约法。但若要估计 物种的绝对分歧年代而需要选用需分子钟假设的方法时，如使用p h y l i p ( f e l s e n s t e i n ，1 9 9 3 ) 软件包内距离法中的u p g m a ( u n w e i g h t e dp a i r g r o u pm e t h o d w i t ha r i t h m e t i cm e a n ) 方法或最大似然法，则应特别慎重 1 4 。 分子系统学研究中目的基因的选择是一个重要的问题。一般来说，要根据所 利用i t s 序列和m a t k 序列探讨中国部分原生棕榈科植物的亲缘关系 研究的具体分类群选择适宜的基因：在高级分类阶元( 科级以上) 间的系统发生分 析中，选择一些在进化中较为保守的基因或基因片段( 如核编码的蛋白质( 酶) 基 因、核糖体基因( 1 8 s r r n a 基因、2 8 s r r n a 基因等) ；在较低级的分类阶元间，可 以选择进化速率较快的基因或基因片断( 如某些核编码基因的内含子或转录间隔 区( i t s ) 以及一些细胞器基因( 线粒体基因和叶绿体基因) 等) 。对每一个具体的研 究对象，可以选择的基因数目可以是多个的，至于哪些是最有效的，这通常要依 据具体情况做比较分析后才能得出结论。有时针对某些涉及到多种层次分类阶元 的复杂分类群时，可以采取组合分析的方法：即推断位于系统树基部的深层次的 谱系发生时，运用较保守的基因作为目的基因；推断位于系统树中段的谱系发生 时，采用进化速率较为适中的基因；在系统树顶端的终端分类单元时，采用进化 速率较快的基因。这样可以在不同阶层的演化关系中都获得可信的结果 1 5 。 1 2 1 叶绿体d n a ( c p d n a ) m a r k 的特点 1 2 1 1c p d n a 的特性 叶绿体d n a 为双链环状分子，一般周长约4 0l am - 4 51 1m ，分子量约为9 0 m d a 。 己知叶绿体d n a 大小约为7 1 k b - 2 1 7 k b ，但绝大部分在1 2 0 k b - 1 6 0 k b 。叶绿体d n a 平均浮力密度为1 6 9 4 9 c m 3 1 6 8 9 9 c m 3 ，g c 含量2 5 一3 8 1 6 。 大多数叶绿体d n a 有两个反向重复序列，亦称为倒位重复( i n v e r t e dr e p e a t ， i r ) 。裸子植物叶绿体d n a 缺少倒位重复，但对黑松的研究发现，黑松叶绿体基 因组中有残余的倒位重复序列，裸子植物的这种缺少倒位重复或仅有残余重复序 列的现象被科学家认为是次生形成的。两个反向重复序列将叶绿体环状分子分隔 成两个大小不同的单拷贝区，大单拷贝区( 1 a r g es i n g l ec o p y ，l s c ) 长度在 7 8 5 k b l o o k b ，小单拷贝区( s m a l ls i n g l ec o p y ，s s c ) 长度在1 2 k b 一7 6 k b 。其中， 叶绿体所有r r n a 基因( 4 5 s ，5 s ，1 6 s ，2 3 s ) 及部分t r n a 基因位于反向重复序列 内，大部分t r n a 和光合机构中的基因分布在l s c 区。 大多数叶绿体基因组为多顺反子转录单位，如操纵子p s b b p s b h p e t b p e t d 编码光系统i i 和细胞色素b 6 f 蛋白复合体；操纵子r p s 2 - a t p i a t p h a t p f a t p a 为一个编码核糖体蛋白s ：和a t p 合酶亚基的结构复杂的操纵子。一般的，叶绿 体的这种多顺反子的组织可以使用较少数目的转录起始位点。 大多数学者认为叶绿体中存在两种甚至两种以上具有不同功能的r n a 聚合 利用i t s 序列和m a t k 序列探讨中国部分原生棕榈科植物的亲缘关系 酶，其中一种在叶绿体d n a 制备过程中紧密的与d n a 缔合，形成d n a 一蛋白质复 合物，称之为结合的r n a 聚合酶；另一种是可溶的r n a 聚合酶，由多个亚基( 7 种- 1 4 种多肽) 组成。但叶绿体r n a 聚合酶到底是由核编码的还是由叶绿体基因 编码的，则还是一个讨论中的问题。 叶绿体基因组的基因分为两大部分，一是遗传系统的基因如：r r n 基因和t r n 基因，二是光系统的基因，其基因产物参与光合作用，如r b c l 基因和n d h 基因。 叶绿体基因表达的调控与核基因相似，有转录水平的调节，转录后调节和修饰， 翻译调节和翻译后修饰等。 叶绿体在不同植物中的遗传方式各异，大多数的被子植物为母系遗传，约 2 0 为双亲遗传，如月见草属、天竺葵属、苜蓿属；母系遗传的被子植物仅在猕 猴桃属的植物中有过报道；针叶树的叶绿体是父系遗传。叶绿体的单亲遗传有效 防止了不同来源的基因组之间的相互作用，而松科植物的父系叶绿体，则在传粉 到受精的将近1 3 个月的时间里为雄配子提供了营养 1 7 。 1 2 1 2m a r k 基因及在植物系统发育分析中的应用 m a t k 基因位于叶绿体t r n k 基因的内含子中，长约1 5 0 0 b p ，为单拷贝基因， 编码一种成熟酶( m a t u e a s e ) ，这种成熟酶参与r n a 转录体中ii 型内含子的剪切 1 8 。是现知被子植物中进化速率较快的基因，多用于科下属间系统发育关系的 研究 1 9 。 h i l u ( 1 9 9 9 ) 等在探讨禾本科植物的m a t k 基因核苷酸插入删除的进化含义 时指出：m a r k 基因的3 端的插入删除和核苷酸的替换在鉴别草本植物的某些 主要进化中有重要作用。l b p 的缺失引起了开放阅读框的转换，在禾本科，两个 最基本进化支s t r e p t o c h a e t a 和a n o m o c h l o a 的位置由一个关键的突变所支持。 另外l b p 的缺失造成开放阅读框的提早终止是e h t h a r t a 独有的。1 个6 b p 的插 入支持了p a n i c o i d e a e ，a r u n d i n o i d e a e ，c e n t o t h e c o i d e a e 和c h l o r i d o i d e a e ( p a c c ) 4 个亚科的单系发生。这个标记在区分p a c c 支与察看p a c c 支和它的姐 妹群关系时有重要作用。来自苔鲜植物，裸子植物和种子植物的氨基酸序列对准 表明这个区域是相对保守的，但是在p o a c e a e ，该区域的变异程度很高 2 0 。 m o r t ( 2 0 0 1 ) 等用m a t k 基因推断景天科( c r a s s u l a c e a e ) 的系统发育关系 和进化，他们用景天科的1 1 2 个种，这1 1 2 个种包括了3 3 个属和6 个亚科。分 1 1 利用i t s 序列和m a t k 序列探讨中国部分原生棕榈科植物的亲缘关系 析表明，6 个亚科中，5 个不是单系发生的。他们的结果同近来叶绿体的限制性 位点分析相一致。分析还表明：景天科起源于南非，向北扩展至地中海区，再从 地中海区扩展到亚洲东欧和北欧，欧洲的2 个独立的进化支又向南美扩散并经 历物质上的分化。景天科的染色体的基数是8 ，多倍体在7 个进化支中扮演了重 要的角色，其中的3 支是完全的多倍体( s e m p e r v i v u m 支和k a l a n c h o e 及a e x o i u 支内的两个亚支) ，而另外4 支( c r a s s u l a ，t e l e p h i u m ，l e u c o s e d u m 和a c r e ) 同 时是二倍体和多倍体。在a c r e 支，多倍体尤其繁盛而它的细胞学进化也尤其复 杂 2 1 。 s o l t i s ( 2 0 0 1 ) 等对m a t k 基因序列数据进行分析，讨论c h r y s o s p l e n i u m 的系统发育关系和进化，分析表明，叶序是一个较好的用来探讨属内关系的指标， 0 p p o s i t i f o l i a 和a l t e r n i f o l i a 这两个组是单系发生的，并指出这个属起源于 东亚，而不是传统形态学上认为的南美，而且南美东、西部的植物随着大陆的漂 移而分化 2 2 。 h i l u 和a l i c e ( 1 9 9 9 ) 在探讨m a t k 基因序列分化在植物系统种的应用时指 出：在解决系统问题时，3 端是最有用的；相对保守的3 端和缺少保守的5 端的出现提供了两组性状以用于从族到个体不同的分类水平的分析 2 3 。 到目前为止，该基因被认为在叶绿体基因组中的所有编码蛋白基因中进化速 率最快。在被子植物科内水平的近缘关系研究中己被使用。m a t k 基因与其它叶 绿体基因有很大差别：m a t k 的序列变异中转换和颠换的频率，密码子三个位置 的变异频率没有严重的偏离，因此m a r k 序列的变异较均一，在构建系统树时不 必对不同类型的变异进行加权，这同时也极大地增强了分子系统树的可靠性 1 5 。 1 2 2n r d n ai t s 的原理与特点 现代分子生物学技术的迅速发展，为系统与进化植物学研究提供了丰富而详 实的资料，为解决分类学、系统发育、物种形成与进化等力一面的难题提供了极 为有力的技术途径。前些年的研究中，除了涉及到核总d n a 、核5 s ，1 8 s ，2 6 sn r o n a ， m t d n a 等之外，主要是关于c p d n a 的酶切位点和序列变异研究 2 4 。c p d n a 的研 究为探讨科及科以上分类阶元的系统发育关系提供了重要依据，并将在这方面的 研究中继续发挥重要作用。由于c p d n a 的进化速率远低于核基因组，这就限制了 1 2 利用i t s 序列和m a t k 序列探讨中国部分原生棕榈科植物的亲缘关系 其在低级分类阶元( 如属、亚属) 的应用，尤其是对于关系非常密切及近期才发生 分化的分类群，c p d n a 就无能为力了 2 5 ，2 6 ，2 7 。因此，1 8 s 一2 6 s 核r r n a 基因 的内转录间隔区( i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r ，i t s ) 从而成为系统与进化植物 学研究中的重要分子标记。 i t s 原理与特点：高等植物中的r r n a 基因( r d n a ) 是高度重复的串联序列单 位，1 8 s ，5 8 s 和2 6 sn r d n a 联结在一起，作为一个转录单位，而5 sn r d n a 则 位于另外的位点( 图1 - 1 ) 。1 8 s 一2 6 sn r d n a 在植物中有一至数个位点，拷贝数可 达5 0 0 - 4 0 0 0 0 ，基本结构如图i - i 所示 2 8 ，由1 8 sn r d n a ，2 6 sn r d n a ，5 8 sn r d n a 和位于三者之间的基因内转录间隔区( i t s ) 组成，其中i t s 区由被5 8 sn r d n a 所分隔的i t s l 和i t s 2 两个片段组成。i t s l 、i t s 2 的转录产物在r r n a 加工过程 中被切掉，但这两个片段在r r n a 成熟过程中具有重要作用。 itsl工ts2 图i - i ：植物1 8 s2 6 sr d n a 的基本结构 在被子植物中i t s l 的长度为1 8 7 2 9 8 b p ，i t s 2 为1 8 7 2 5 2 b p 2 9 。张文驹 等( 1 9 9 8 ) 对4 个供体的普通小麦基因组的i t s l 和i t s 2 及i t s 序列分析，得出了 唯一的最大简约树，三者拥有相同的分支结构，因此有些作者仅用i t s l 或i t s 2 就能得到合理的结果 3 0 。i t s 序列变异较快，可以提供较丰富的遗传信息，己 证实它是研究许多被子植物类群系统与进化的重要分子标记，不仅可以解决科、 亚科、族、属、组内的系统发育和分类问题，而且可用于重建多倍体复合体的网 状进化关系，探讨异源多倍体的起源过程。i t s 之所以成为被子植物系统与进化 研究中的重要分子标记，主要基于以下两个方面原因：第一，作为1 8 s 一2 6 sr d n a 的一个组成部分，i t s 在核基因组中是高度重复的，在被子植物中的拷贝数可达 成1 0 0 0 - 1 0 0 0 0 个，而且通过不等交换和基因转换，这些重复单位间己发生了位 点内或位点间的同步进化，即不同i t s 拷贝间的序列趋于相近或完全一致，这就 为对p c r 扩增产物直接测序奠定了基础；第二，被子植物的i t s 区段长度较裸子 1 3 利用i t s 序列和m a r k 序列探讨中国部分原生棕榈科植物的亲缘关系 植物稳定，为测序带来了方便，同时，1 8 s ，5 8 s ，2 6 sn r d n a 的序列非常保守， 有利于通用引物的设计，目前研究中所用的引物是w h i t e 等( 1 9 9 0 年) 在真菌系 统学研究中设计的引物，也有作者采用调整后的引物。关系密切的物种间i t s 长度接近，而序列有一定程度的变异，因此该片段特别适合于属、种级的系统发 育和分类研究 3 1 ，3 2 ，3 3 。 i t s 序列分析目前己经成为被子植物系统学研究的重要手段。在小麦、大豆 等许多农作物和花卉树木的系统研究中取得了巨大的成果，验证或重新确定了它 们的分类地位和演化关系。由于同步进化的原因，i t s 序列在许多物种内不存在 变异，因而一般不适用于种内分类水平上的研究。 1 3 构建系统树常见算法及分析软件 自达尔文时代起，许多生物学家都有一个梦想，那便是重建地球上所有生命 的进化历史，并以系统树的形式描述这部历史 3 4 。经典的系统生物学家试图通 过化石记录及其形态性状等方面的特征，来描述一幅进化历史的清晰图像。但化 石记录的相对不完整，形态性状的相对缺乏和其系统学意义的不确定性，在一定 程度上限制了这门学科的深入和拓展。在分子水平上研究生物之间的关系早在2 0 世纪初就开始了。科学家发现，当把一个生物体的血液注射到另一个测试生物体 中时，产生免疫反应的程度与这两个生物体的进化关系直接相关，由此最早正确 地推断出人和猿比它们和其它灵长类动物有更近的共同祖先。直至l j 2 0 世纪中期， 分子数据才开始被广泛应用于系统发生研究。蛋白质电泳使得我们可以在一些浅 层特征上，如分子大小和电荷，来分离和比较相关的蛋白质。2 0 世纪6 0 年代，蛋 白质测序成为可能；2 0 世纪7 0 年代，研究者开始能够获得基因组信息，特别是d n a 序列。蛋白质序列和d n a 序列为分子系统发生分析提供了可靠的数据 3 5 ，3 6 ，3 7 。 在现代分子进化研究中，根据现有生物基因或物种多样性来重建生物的进化 史是一个非常重要的问题。一个可靠的系统发生的推断，将揭示出有关生物进化 过程的顺序，有助于我们了解生物进化的历史和进化机制。根据核酸和蛋白质的 序列信息，可以推断物种之间的系统发生关系。其基本原理非常简单，从一条序 列转变为另一条序列所需要的变换越多，那么，这两条序列的相关性就越小，从 共同祖先分歧的时间就越早，进化距离就越大；相反，两个序列越相似，那么它 们之间的进化距离就可能越小。为了便于分析，一般假设序列变化的速率相对恒 1 4 利用i t s 序列和m a t k 序列探讨中国部分原生棕榈科植物的亲缘关系 定。 1 9 6 9 年，z u c k e r k a n d l 在生物进化历史的档案一文中指出：“存在于 每一个生物个体中的d n a 分子都是其进化历史的积累一，生物大分子蕴涵着极 其丰富的生物进化信息，进化的第一原因是基因突变。由核苷酸替代、插入缺 失、重组和基因转换等引发的突变基因或d n a 序列，通过群体水平的遗传漂变和 自然选择进行扩散，并最终在物种中得以固定 3 8 。所有的生物都可以追溯到共 同的祖先，生物的产生和分化就像树一样地生长、分叉，以树的形式来表示生物 之间的进化关系是非常自然的事。可以用树中的各个分支点代表一类生物起源的 相对时间，两个分支点靠得越近，则对应的两群生物进化关系越密切。因此，当 对某一类群构建了一棵有效的系统树，我们就可以找到具有此突变性状的谱系。 研究突变、自然选择、遗传漂变和重组等的相对重要性是群体遗传学的一个重要 课题。为此，群体遗传学家现在正在对一个基因座上的不同等位基因进行测序， 来了解它们的进化历史。在这里，问题不是物种的系统树，而是同一物种内不同 等位基因的系统树 3 9 ，4 0 ，4 1 。 在研究从病毒到人类的各种生物的进化历史中，d n a 序列的系统发育分析已 经成为一个重要方法。不同的基因或d n a 片段的进化速率存在较大的差异 4 2 ， 我们可通过这些基因或d n a 片段研究几乎所有水平上的有机体间的进化关系( 例 如，界、门、科、属、种以及种内群体) 。系统发育分析对于阐明多基因家族的 进化式样以及理解在分子水平上适应性进化的进程也是十分重要的 4 34 4 。 基因或生物体的系统发育关系常常用有根或无根的树状结构来表示。前者被 称为有根树，后者为无根树( 图1 - 2 ) 。所谓树，实际上是一个无向非循环图。 系统发生树由一系列节点( n o d e s ) 和分支( b r a n c h e s ) 组成，其中每个节点代 表一个分类单元( 物种或序列) ，而节点之间的连线代表物种之间的进化关系。 树的节点又分为外部节点( t e r m i n a ln o d e ) 和内部节点( i n t e r n a ln o d