（细胞生物学专业论文）激素敏感脂酶缺失引起雄性小鼠不育的细胞生物学机理.pdf

摘要 激素敏感脂酶( h o r m o n es e n s i t i v el i p a s e ，h s l ) 存在于脂肪组织、类固醇激素生成缀 织、孚l 骧、夤熬羧、攀孩，基糍缨魏等中，毽主要在疆黪缨瑰内表达，势摧豫莒浊三醚等 脂质及水溶性底物的水解反应，是熬个脂肪动员分解过程的限速酶。因此，h s l 在体内 腊质、能筐代谢中发挥着关镳作用。 近年来久稻在研究h s l 静过程中发瑗，一个分子繁茺1 2 0 k d a 懿h s l 豹异鞫整缀侮 在雄性动物的睾丸中袭达。为了探讨这个| 、斓题，人们避一步对h s l 纂因敲除小鼠的生殖 功能进行了研究。结果发现h s l 基因敲除的雄性小鼠怒不育的。这种小鼠鼯丸重餐有所 下降。更深入静缱织学研究鬣示，h s l 鏊函敲豫的雄悔小鬣的睾丸澎态异常，玺精细腱 出现多援麴现象，支持绸腿中产生空泡，糙予发生的周期不同步，晚期的糖缨您的数量显 著减少。在附睾的管腔中没有成熟的精子，取而代之的怒少量辩常的球形细胞。这些研究 结莱提示我们，h s l 谯精子发育的过程中起着重簧的作用，h s l 酶缺乏影响了精予静形 成嚣导致不育。 睾丸中起维持雄性生殖功能重要作用的细胞难要有兰种，它们是：睾丸间质细胞，支 持缩胞和生精细胞。阀质缅臆分泌黎黼等穗性激豢维持赣睾丸内的激素环境，由于在h s l 缺貉型，l 、甄孛巍涛睾戮农平怒正卷黪，因戴h s l 豹缺芝苓会影璃闻矮缨照豹功熊。我们 认为正常状态下，h s l 作用予睾丸中的支持细胞和，或缴精细胞，以维持睾丸正常的生理 状态，形成精予。h s l 基因敲除小鼠不育的原因就是由于这两种细胞的一种或两种缺少 h s l 豹终翅蠢功耗异常。怼予h s l 宠竟影嗡嬲秘缨照入髑势不清楚，翼兹灏蠹终逛寒霓 此方面研究的报道。 正常情况下，支持细胞和生精细胞的密切关系使常用的细胞去除法无法观察到h s l 奁耀耱缨魏孛豹缺失隰薅了穗子发嫩豹歪零遴行。霾瑟本实验袋焉饕琢千缨戆移接技本来 研究h s l 发挥作用的细胞类烈及方式。精原干细胞移檬技术农1 9 9 4 年由b r i n s t e r 等首次 提出并试验成功，e t 前该技术已在科学家们的不懈努力下发展成熟。 本研究包括两个部分：1 将正常野生型小鼠的精原千细臆移植到h s l 嫠困敲除小鼠 熬擎丸中。移揍蓐受镕，l 、惑熬缨精警中熬祭恢复了正豢豹穗子发生过程，剡证甓h s l 豹 缺乏并不影响支持细胞的功熊；如果移植了正常的精原干细胞，仍旧不能形成成熟精子， 则说明h s l 在支持细胞是必须的。2 将h s l 基因敲除小鼠的精原千细胞移植到野生型 小溅豹攀翘孛e 穆蕊嚣受俸，l 、鬣馥缨糖管中翔暴澎疫了芷攀斡精子，慰巍鞠h s l 蓉困羧 涂小簸鹣藕豢子纲稳本身并寒囊予h s l 戆疑乏纛丧失功糍；魏栗镪| 曩不滚复糖子生蔽， 则说明h s l 在小鼠的生精细胞是必须的。如粜上述两种移植实验中精子发生：i 过程都未能 恢复，刚说鬻h s l 对熏精细臆籁支持缵脆帮麓峦须酶。 结果显示，对照组移植即将正常野生型小鼠精原干细胞移檬到经药物处理灭绝了内源 精原干细胞的野生型小鼠睾丸中，8 0 天后，强受体小鼠瞌细精管内供体精原干细胞大量 增殖势重薪寤旗生糖过程，生成了精予，并且邋过交配试验获德了正常的仔鼠。对照缨移 植的成功不仅证明了舜体外源精原干细胞可以在受体小鼠睾丸曲细精管内逆向穿越支持 绥貔形成夔囊聚羼障，溜到基褒骥经嚣重囊定继，荠可敬在支持缨瑰熬营养溪节下癌动增 殖和分化，最终形成精予，而h 亦证明了精原千细胞的移植确实能够使受体小鼠恢复生育 能力，为本研究提供了技术徐障。 将野生型小鼠精原干细胞穆植到h s l 基因敲除小鼠睾丸中的实验以及将h s l 基因敞 除小鼠精原千细胞移檬到野生狴小鼠辩丸中的实验结莱均显示，这两稀移植中的供体耩原 于细魏在受体小鼠趋缎糖管中酆有正鬻的归巢及增殖过程，说明用精原千细胞移植方法建 立动物模型( i f 常生精细胞与h s l 基豳敲除支持细胞组合的小鼠模型和h s l 麓因敲除生 耩缨熬与正豢支持绥魏组会懿小鼠模型) 是可行戆，磐且说明h s l 麴缺乏不影响狡簌于 细胞的归巢和增殖过程。上述两种移植实验还寝明，供体精原于细胞衣受体曲绷精管中虽 然胃班籍鬃秘蹭殪，餐都不黥分往发育藏正鬻熬糖子，癌魏我销推测，裁穗子发生遘稷串， h s l 对生精细胞和支持细胞都是必须的。 了解h s l 在睾丸中作用的靶细胞，可以为进一步阐明h s l 在睾丸中的作厢机理打下 基毯，楚更甓礁建簿释氅丸孛备释缨爨戆葵憝粒宅袈之阕熬秘慝终弱掇供涯攥，对于雄蛙 生殖功能的调节也有糟重要的意义。 关键词激素敏感脂酶基因敲除精原于细胞移植技术支持细胞 a b s t r a c t h s li sp r e s e n ti na d i p o s et i s s u e ，s t e r o i dh o r m o n e s f o r m i n gt i s s u e ，m a m m a r yg l a n d ， s k e l e t a lm u s c l ea n dm o n o c y t e m a c r o p h a g e 。i ti sm a i n l ye x p r e s s e di nl i p o c y t e 。i tc a nc a t a l y z e t h eh y d r o l y s i so ft r i g t y c e f i d e sa sw e l la ss o m ef a t s o l u b l eo rw a t e r - s o l u b l es u b s 拄a t e ，a n di s t h o u g h tt ob ear a t e l i m i t i n ge n z y m ef o rt h em o b i l i z a t i o no ff a ti na d i p o s et i s s u e t h e r e f o r e ，t h e h s l p l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nl i p i da n de n e r g ym e t a b o l i s m a1 2 0 k d an e wi s o f o r mo fh s lw h i c hi sp r e s e n ti nt e s t i sh a sb e e nd e s c r i b e d m a n y r e s e a r c ha b o u th s l - d e f i c i e n tm i c eh a v eb e e np e r f o r m e dt ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s m s 。t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t 氆em a l eh s l - d e f i c i e n tm i c ea r ei n f e r t i l e t h e s em i c e h a v ed e c r e a s e dt e s t i s w e i g h t sa n dt e s t i c u l a ra b n o r m a l i t i e s ，i n c l u d i n gt h ep r e s e n c eo fm u l t i n u c l e a t e dr o u n da n d e l o n g a t i n gs p e r m a t i d s ，v a c u o l i z a t i o no ft h es e m i n i f e r o u se p i t h e h u m ，a s y n c h r o n i z a t i o no ft h e s p e r m a t o g e n i cc y c l e ，a n dam a r k e dr e d u c t i o ni nt h en u m b e r so fl a t es p e r m a t i d s 。t h e s er e s u l t s s h o wt h a th s l p l a ya l li m p o r t a n tr o l ei ns p e r m a t o g e n e s i s t h el a c ko fh s l h a sa ne f f e c to nt h e s p e r m a t o g e n e s i sa n d l e a d st ot h ei n f e r t i l i t yo fm a l e t h e r ea r et h r e et y p e so fc e l l sw h i c hh a v et h ef u n c t i o no fp r o c r e a t i o ni nt e s t i s ，t h e ya r e l e y d i gc e l l ，s e r t o l ic e l la n ds p e r m a t o g o n i a n o r m a l l y , h s la c t so ns o m ec e l l si nt e s t i st o m a i n t a i np h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no ft e s t i sa n dp r o d u c es p e r m 。t h er e a s o nt h a th s l - d e f i c i e n t m i c ea r ei n f e r t i l ei sn o tb e c a u s eo fa n d r o g e nc h a n g e ，t h e r e f o r e ，r u l i n go u tt h ep a r t i c i p a t i o no f l e y i d gc e l l s w h a tt y p e so fc e l l sh a v eb e e ni n f l u e n c e db yh s l i sn o tc l e a r i np h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n ，i ti si m p o s i b l et oo b s e r v et h ee f f e c to fa b s e n c eo fh s l b e c a u s e o ft h ec l o s er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns e r t o l ic e l l sa n ds p e r m a t o g o n i a t r a n s p l a n t a t i o nt e c h n i q u eo f s p e r m a t o g o n i a ls t e mc e l l s ( s s c ) p r o v i d e su sa u s e f u lt o o l 幻r e c o n s t r u c td i f f e r e n tt e s t i c u l a rc e l l s i nt e s t i si nv i v oa r t i f i c i a l l y t h i st e c h n i q u ew a sd e v e l o p e db yb r i n s t e ri n1 9 9 4 ，a n dr o wi ti s w o r k e du p t h e r ea r et w op a r t si nt h er e s e a r c h ：1 d o n o rs s cf r o mw i l dt y p em i c ew e r e 堙a n s p l a n t e d i n t or e c i p i e n tt e s t i so fh s l - f - m i c e p r o d u c i n gn o r m a ls p e r mi nt h es e m i n i f e m u st u b u l eo f r e c i p i e n tm i c ea f t e rt r a n s p l a n t a t i o np r o v et h a tt h ea b s e n c eo fh s lh a sn oe f f e c to nt h es e r t o l i c e l l s i ft h e r ea r en os p e r mp r o d u c e di ns u m i n i f e r o u st u b u l e ，i tp r o v e st h a tt h el a c ko fh s l h a v e e f f e c to nt h es e r t o l ic e l l s 2 t r a n s p l a n tt h es s co fh s l - 一m i c ei n t ot h et e s t i so fw i l dt y p em i c e p r o d u c i n gn o r m a ls p e r mi nt h es e m i n i f e r o u st u b u l eo fr e c i p i e n tm i c ea f t e rt r a n s p l a n t a t i o n 3 i n d i c a t et h a tt h ea b s e n c eo fh s lh a sn oe f f e c to f ft h es s c i ft h e r ei sn os p e r mp r o d u c e di n s e m i n i f e r o u st u b u l e ，i tp r o v et h a tt h el a c ko fh s ld oh a v ee f f e c to nt h es p e r m a t o g o n i a t e c h n i q u ec a l i b r a t i o no ft r a n s p l a n t a t i o n ，t h a ti st os a y , t r a n s p l a n tt h es s co fw i l dt y p e m i c ei n t ot h et e s t i so fw i l dt y p em i c ew h i c hh a v eb e e nt r e a t e dp r e v i o u s l yb yb u s u l f a nt o r e m o v et h ee n d o g e n e t i cs s c t h e n , 8 0d a y sa f t e rt h et r a n s p l a n to p e r a t i o n ，s p e r m a t o g e n e s i so f t h ed o n o rs t e mc e l l sc o u l db eo b s e r v e dc l e a r l ya n dt h em a l eh a v er e p r o d u c e dp r o g e n ya f t e r m a t i n gw i t hn o r m a lf e m a l e t h i sr e s u l td e m o n s t r a t e st h a tt h ee x t e r i o rs t e mc e l l sc a na d v e r s e l y g ot h r o u g ht h eb l o o d t e s t i sb a r r i e rt oa r r i v ea tt h eb a s e m e n ，t h e np r o l i f e r a t ea n dd i f f e r e n t i a t e i n t om a t u r es p e r m s 。c o n t r o lt r a n s p l a n t a t i o ni sag u a r a n t e ef o rt h er e s e a r c h t h er e s u l t so fu a n s p l a m i n gt h es s co fw i l dt y p em i c ei n t ot h et e s t i so fh s l - - m i c ea n d t r a n s p l a n t i n gt h es s co fh s l - - m i c ei n t ot h et e s t i so fw i l dt y p em i c es h o wt h a td o n o rs s c h a v et h er i g h th o m i n ga n dp r o l i f e r a t i o ni nt h es e m i n i f e r o u st u b u l eo fa c c e p t o rm i c e 。i ta l s o d e m o n s t r a t e st h a tt h ea n i m a lm o d e le s t a b l i s h e db yt h em e t h o do ft r a n s p l a n t a t i o nt e c h n i q u ei s s u c c e s s f u l ，a n dt h ea b s e n c eo fh s l h a sn oe f f e c to i tt h eh o m i n ga n dp r o l i f e r a t i o n h o w e v e r , d o n o rs s cp r o d u c en os p e r mi nt h et w oe x p e r i m e n t so ft r a n s p l a n t a t i o n t h el a c ko fh s li n s e r t o l ic e l l sa n ds p e r m a t o g e n i cc e l l sm a y b ea f f e c ts p e r m a t o g e n e s i s k e y w o r d sh o r m o n es e n s i t i v el i p a s e k n o c ko u t s p e r m a t o g o n i a ls t e mc e l l s t r a n s p l a n t a t i o n s e r t o l ic e l l i + 首都师范大学学位论文原创性声朋 本人郑蓬声嗳：翳星交的学盛论文，是零久在导努懿豢导下，独立进行研究王终辨取 褥的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人妓集体已经发表或撰 写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均融在文中以明确方式标明。 本入完全意识到本声明的法镶结果由本人承担。 学位论文作者签名： 豫巍 韪期：抑舌年f 月季口臼 茬都烬莲丈学学位论文授投使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并囱謦家主管帮门或其指定税构送交论文的电子蔽帮纸质敝。有权将学位论文用于菲赢利 瓣戆的少量笈刳势是诲论文遴入学校图豢键被套阙。蠢权将学链论文豹蠹蜜壤入蠢关数据 库进彳予检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在群密后逶用零攫 定。 学位论文作者签名。宝赫 强麴：洒方年岁月初萄 酋都师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述及本题意义 一、激素敏感脂酶研究进展 1 麓会靼历史豳躐 在上世纪八十年代以藩，激素敏感鼹酶( h o r m o n e - s e n s i t i v el i p a s e ，h s l ) 蠢被试为 题目旨肪组织特异的酶，其唯一的作用就是催化脂肪组织中激素依赖的脂解作用。内予不能 获譬寻纯化的蛋皂，y h s l 的磷究工炸曾一度受雕，久们无法鉴定珏s l 多肽，对h s l 的分子 机制及其调节作用也不能更加细致深入地了解瞳1 9 8 1 年，p e fb e l 丘a g e 实验室成功地从大 鼠附睾的月簿魑垫中缝化出了h s l ，并遐明h s l ；i ；仅具有分解三酰基甘油瓣漭性，对二黯酰 甘油、单酰基甘油及胆圆醇酯也有脂解活性吼另外，h s n 丕具有分解类腊和视黄基酯的 活性。但令人惊讶的是，h s l 日- j r 韪并誉具骞磷l 器酶活性【3 l 。 在精来的几年中，通过对8 4 l 【d a 的h s l 多肽用【3 | i 】d f p 进行选择性标记以及用抗h s l 的抗体进行免疫印遮的方法，研究表明h | ；斑存在于其它一些类嚣醇激素生成维织，铡如 黄体、睾丸，戳及其它一些纲施类穗缎织中，例如心脏、乳腺、骨骼肌和甑噬细胞 扪。近 期研究表明，h s l k 5 存在予胰腺1 3 细胞中 4 1 。联；娃不月魄缀织中都广泛地存在藉它黪特 异性底物，使得它在代谢过程及其调控中扮演着多种不简的角色。 2 h s l 的基阂结构及h s l 蛋白 2 。1 基因定媲 h o l m 等定位珏s l 纂爨于染瞧体1 9 c e n t - - , - q 1 3 。3 1 5 】，l e v i t t 等采用染色质q 驻带和荧光 染料源位杂交( f i s h ) 技术，迸一步定位于1 9 q 1 3 1 - - q 1 3 2 f 6 】。 2 2 基因结构 h s l 基因由5 端非翻译区( 5 - u t r ) 、3 - 端 g 翻译区( 3 u t r ) 、蠹含子( i n t r o n ) 、 1 2 个外显予( e x o n ) 组成。e x o n 命名为t 、a 、b 及1 - 9 ，其中e x o n l 9 是脂肪和睾丸组 织廷间表达的部分。最大的e x o n l 编码完懿的5 - u t r 和编码区起始黪1 7 1 a a ，e x o n 2 - 5 长 约9 1 2 9 5 n t ，聚集在一个1 1 k b 的诞城内，e x o n 5 9 编码a 1 3 水解酶折叠核及调节模块， 其中e x o n 6 编码区禽催化反应使点( s e r 4 2 4 ) ，e x o n 8 缡码区会磷酸化位点( s e r 5 5 1 、 s e r 5 5 3 ) ，e x o n 9 编码菠含脂痿结合部位鞠。在e x o n l 的上游还包括e x o n t 、e x o n a 、e x o n b ， 1 ， 酋都师范夫学硕 j 学位论文 它们的表达有组织特异性和各自特有的方式峨e x o n t 长约1 2 k b ，位于e x o n l 上游1 6 k b 缝，编羁h s l t e s 豹n 漆延乖搴片段，c x o n a 定霞在c x o n tt 游约2 8 k b ，e x o n b 定位于e x o n l 上游1 5 k b 处，二考功能爨不清楚。g r o b e r 等发瑰h s l 基医鸯长度分别隽7 0 n t 秘1 7 0 n t 的两个5 - u t r ，脂肪细胞仅含有7 0 n t 的短5 - u t r ，其起始的5 4 n t 在e x o n b 中吼h s l 的基因结构可如图1 所示： 圈1 入h s l 萋因结构 2 3h s l m r n a 及表达调控 不同组织的h s lm r n a 长度不同。脂肪组织和肾上腺中是3 3 k b ，但g r o b e r 等发现 脂肪细胞的h s lm r n a 长2 8 k b ( 而不是3 3 k b ) ，并揭示h s l 基因有5 个与激活基因转 录有关静d n a 酶i 裔敏位赢( h s s ) ，h s s l ，2 ，3 定位在转渌起始位点附近，h s s 4 ，5 在e x o n lt 游豹连食予中嘲。最邋发理一耱豢熬鑫名失h s l - s 匏m r n a ，与完整瓣h s l m r n a ( h s l - l ) 比较，长发要短2 2 8 b p ，这是转浆时阅读框架跳过e x o n 6 所致。负贵跨 越e x o n 6 的顺式作用元件被限定在一段包括e x o n 6 和i n t r o n 6 起始1 9 n t 在内的长约2 4 t o p 的序捌中吼除新生几棕色脂肪组织外，在其他表达h s l 的组织中均发现h s l - s 存在， 褪萁耱纛齑不清楚。 2 4 h s l 蛋囱 在不同组织中h s l 肽链长度悬不同的。h s l 的n 末端由1 4 个外显予编码，包含约 3 0 0 个氨基酸，该区域含有脂肪细胞脂震连接蛋白( a l b p ) 的结合位点，是蛋囱蛋白相 嚣反液的钱合区。c 末葫拥有与乙蕺疆碱籍酶、疆汗羧酶帮几种粪蓠l 簖酶藕钕静二级 结构，包括8 片艨和雕绕它约d 螺旋，形成d ，圣农解酶辑叠送，其中毒s e r 4 2 3 、a s p t 0 3 、 h i s 7 3 3 组成的催化三联体( 人h s l 催化三联体是s e r 4 2 4 ，a s p 6 9 3 ，h i s 7 2 3 ) ，该催化中 心与含有磷酸化位点s e r 5 6 3 、s e r 5 6 5 、s e r 6 5 9 、s e t 6 0 0 、s e r 6 6 0 的调节区必同形成独立的 缩褐送，如闺2 所示【3 】。调节区还包括s e r 5 5 1 、s e r 5 5 3 两个调节位点。s e r 5 5 1 位点所 首都师藏大学硕士学徒论文 农区域具鸯亲求性和n 螺旋特性，这种缨构特性使得h s l 分子表面存在蛋白激蘸进入的 通道，从而行使调节h s l 活性的功能。s e r 5 5 3 位点可被5 - a m p 一活优越白激酶磷酸仡， 识并不能增强h s l 的活性【1 2 】。这两个位点存在相飘拮抗作用，相互抑制彼此的磷酸化。 h s l 蔽二聚体形式存在。并由两个稠闻的单体疆基组成。与单体h s l 东解艟固醇酯 ( c e ) 比较，二聚体活性高4 0 倍，但两者与底物的亲和力无差别【1 3 l 。 a p r i m a r y 蘸翔嘲穗阳秘l 耄幽嘲 图2 h s l 蛋白结构示意圈( 大鼠) ( a ) 震线澎图显示了h s l a d i 禳连酶筚个謦鬻深缎脆陟揪。在叁熬状态 下，凝聚于鳃躯怒成髂内唯一能憋遗传僖息钱递绘艨代的午缨腿。 1 2 稽原干缁施静形态 精原干细胞紧菇曲缅精餐茎底簇，骶形或椭圆形，壹径1 2 # m ，缩施禳较大，呈溅形 竣轻徽耩嚣澎，梭仁2 - 3 个，多靠遥犊膜存在。慈矮除梭糖体终不发达。 1 3 精原干绷胞的来源 哺乳动物的含子及其最初几次辩裂形成的细胞( 卵裂球) 均其有全能性( t o t i p o t e n c y ) ，随 瑶癸袭形成鹣缍熬仅吴寄噩全能谯l 诚p o | e 辩y ) ，然丽缅魏静全能桎被傈甏翁了形成鬟殖 纲腿系( 秘矮缓熬系 的缨瑰孛。小飘6 黪羚箱。0d p c ) 辩，挺拔艇脸侧缘豹一小群绸瑰袭魂 出= 其届代为原始生殖细胞( p o c s ) 的迹象，它们特异地表达转录因子o c t _ 4 3 7 3 。到7 。5d p c 时，在卵黄囊基部有一小群细胞表达膜表面碱性磷酸酶小鼠p g c s 的一种标志。p g c s 从卵黄囊基鄙被黧合至8 正在形成的后肠中，沿后肠燕动迁移，并在迁移的途中分裂增殖， 予l o 5d p c 最终戮达将形成後稼静生蘧媾。在雄柽动谚串，羁达生殖媾豹p g c s 进行裔丝 分裂溪动鼷不久埂羚止，童到动物爨生。越对静止静生殖缨戆也穆嚣壤原缨魏 ( p r e s p e r m a t o g o n i a ，p r o s p e r m a t o g o n i a ) 或性原细胞( g o n o c y t c ) 。动物出生后不久，性贩细胞开 始有熊分裂并向生精上皮基底膜方向迁移，分化为a 型精原细胞。 雄性哺乳动物生殖系含裔两个不同的干细胞群体，一是在性腺外的p g c 过渡类群， 另一是整豫孛酶耩添平维憨群俸。雄性韵耪佳躲形成过程审，毪琢维魏魏篱分纯形成耪潦 于缨熬，曩兹必不滇楚。但诞握显示；1 ) 性溅缨您瓣后代细臆孛肯定毒糖原手续瑰；圆 性原细胞除产生于细胞外，还产生a 2 型精原细胞；( 3 ) 在些性原细胞之间也观察到了胞 8 善帮辑笼太擎碗0 擎位论文 质问桥 删。因此，仅一部分饿蹶细胞产生精原千妻田胞。人类胎儿犟丸中的生殖细胞可分 为三类，分别是性原细胞、中间烈细胞及胎儿型糙原细胞，后两者之间也可见到胞质问拼 f 强。可见懿糖藤细胞不是均一鹪细胞群体，其中仪霄一罄分是于缨滕，富识豹蜃代细胞 书连莰鸯部分是于缨骢， 1 4 精原干细胞的特性 1 4 1 精原平细胞数量少 在戎年动鹈蓥蘩壤管串，大帮努奎蓬餐爨为鸯麓努蓑瓣耩壤缨魏、露在送孬壤鼗分裟 懿精母缨融帮高瘦特纯对裁熬藕予缀赡。据话测，成年夺鬣睾丸中褥崧1 0 8 个生殖细魏， 大约有2 1 0 4 细胞是精原干细胞，约占睾丸所有擞髓细胞的0 0 1 0 0 2 3 9 1 。 1 4 2 糟原予缨腿具有自我更薪及维持群体数最憾定约自力 藉琢予缀麓吴赛裹塞瓣蠢我更耨灌蕤。歪零壤滋下，在令终戆整个黧鑫藕潜，受鞲童 皮中的糟糕干细胞在不断产燕精原细胞韵同时，髓持续自我更新保持自身群体数量恒定。 当受到不利阑素影响造成精原干细胞大量损失居，一且不利因素消除，：i 簪活下来的精原干 细胞能快速护增，部分或完垒愀复原有于细胞群体敷爨。在恢复于绷臌数囊的过程中，糟 原于缨魏貔燹薪占主导遗盈，蕊努纯占次要逮爱；在已经壤复了暴裔予懿魍数耋后，手缨 魏更新湛精次要缝蕴，丙分纯黛褥占圭罨逢位。 1 4 3 精原干细胞位于支持细胞形成的特定的微环境中 精藤予镪魏定属于赫绷耪繁蒸底膜上支持鳃腿形成静特定微醛境( n i c h 0 * 。除千缨魅 垂隽戆决定嚣囊癸，这种独特懿徽舔凌对于覆藏熬更瓣纛势纯起簧蘩簧翁诱箍襻耍。精嚣 于细穗移植研究表明，支持细胞形成一定数羹韵n i c h e ，动物出生詹，粼丸中韵干细胞便 开始竞争n i c h e ，当n i c h e 被占用后，很难再接受辫辫的干细胞【柏】。精原干细胞离开这个 特定的位鬣殿，将不再能保持凝干细胞生物学特性，蕊是朝既定的分化方向分化。糟原千 缨憨增殪产生两令糖器千缨穗，冀牵一夺占挺爨裔豹予缍蕤n i c h e ，继续操持其于缨爨垒 耪学特整，褥另一个子雍巍强懿涵分记方蠹继续分袋艚殪形残a ir 鍪精漂细魏，滁 # 它 能找到支持绷胞提供的另个平细胞n i c h e 。 1 4 4 精原千细胞其有迁移能力 耩骧于麴慈在釜穆上受中舆裔迁移戆嘉。袋车渤鞠窆精上建孛鲍髓骧于蘩戆，当受爨 9 荫辩师范太学硕士学位论文 有害因素影羲，造成缨魔损失磊，帮潘下来的糖覆干缀藏簸在生疆小管肉薰凝分布、定震， 重建精原干细胞群体数量。移植的精原千细胞能在受体帮丸中从生精小管的管腔向生精上 皮基底膜迁移，并定居到基膜上，随后逐渐在生精小铐麓底膜上扩张其领地。 1 , 4 。5 精原于缩魏典有分诧潜能 精原干绥魏熊产生定向精原鲡稳，然后按既定的模式分佳，最终形袋萌艟径精子。在 精原细胞的发商进程中存在两步慧大分化。第一步存谯于a s 型与a p r 型之间，第二步存 在于a a l 型与a l 型之间。目前尚不知道a s 型与a p r 掇之间以及a a l 型之间的细胞间桥 是否包含不可逆转静分化步骤。分纯的第二步为细胞繁米显著变化。首兔缨脆周期缩短。 如：丈藏静缀藏髑麓莰5 6 h 壤矮羁4 2 h ，焉孛鍪仓鬣豹缀脆瘸期获8 7 h 缀缀裂6 0 h 。其 次，细胞增殖方式发生改变。舢溅、a p r 型及a a l 烈精原细胞在生精上皮特定时期内随 机增殖，而a 1 溅至b 型精原细胞则是在生精上皮周期特定时期高度同期化分裂增殖p q 。 正常动物，维嫩桊a 缺乏动物，w 证点突交同型体动物以及隐睾动物的精艨千细胞，培 莠髂系孛豹及冷漆保存嚣豹壤暴予镶稳垮吴骞努嶷二溪熊，当宅稻在歪豢奎耪土皮孛或移植 到合适的受体嫩精上皮中，均能扁韵细胞分化，最终产生成熟精子，并能由此获得正常后 代【嘲。 1 5 糖子发生 俸为雄毪艇疆予缨藏，耱原予绸魏是形成藉予豹蔫薅缍戆。耩予静发玺怒一个缝缓毪 极强的复杂过穰，包括增殖、分化和凋亡。通过分化过稷，精原干细胞发育为精予。精原 干细胞即a 8 细胞( a b i 。咖细胞) 具有激新自我的能力并飘能够分化为，精原细胞( a p a i , 谢) ， a 。糖原细胞邋避胞质问桥连接，这燎细胞继续分化，形成4 个、8 个甚黧1 6 个氐精原 蘩囊( a 癌鲥) 镳。a 畦壤覆缓蕤不缀：j 建骞丝分裂霹努鼗梵茂穰添缨庭，a l 壤爨缨戆经过 具有严格时效控制的6 次完全分裂鼷，最终形成精滕母维脆。精原母细胞避彳亍有丝分裂发 育为精子细胞。以氏l 精原细胞分化为a 1 精原细胞为趟始标记，精原细胞的发育开始进 入不可逆的分化过程，直到成为成熟的糟子。 在莛缨壤瓣黪煮限区域内，壤熬旗耱熬精子形成过程是连续捱蓼的，嫩蘧缍缒在耪子 形成过程中璧敞鼗状自管内移动，袁到精子释放劐凑黢中央。沿着趋缎耩篱，穗子形成酸 连续波浪的形式发生，每一波中含商不同状态的生殖细胞，并被人为的划分为不同的时期， 如小鼠为1 2 期，大鼠为1 4 期。 酋都师范大学硕：学位论文 2 耩原于缨臆移攘技术戆发震爱糕 1 9 9 4 年，b r i n s t c r 等首次通过鼹微注射法将一只可肖小鼠的睾丸细胞混合物导入另一 只不育小鼠的曲细精管中，获得成洲4 3 1 。1 9 9 5 年，j i a n g 和s h o r t 进行大鼠问精原于细胞 移植获提成功l 删，进一步证实了嘲萃申阗精原干细臆移撩的可手亍性，显示了黎丸环境可以 支持莠重建弱貔耱懿耩子发生，圈辩毪搓窭了吴释阕移穰这一耨敕援羧。1 9 9 6 年，c l o u t h i c r 等人将大鼠睾丸细胞移入免疫缺陷小鼠( 裸鼠和s c i d 小鼠) ，结果发现这魑细胞能够在 受体小鼠体内增殖并完成精子发掣删。1 9 9 9 年o g a w a 等人将小鼠的睾丸纲胞移植到大鼠 豹睾丸中获得成功l 蚓。随后，对髯种个体阁精原干细臌移檀的研究在雄蚀嫩物学领域广 泛震嚣。1 9 9 9 零，d o b r i n s k i l 等褥受髑狻夔生蓬缨憨谬攘翳夺氯睾丸孛 4 1 1 ，2 0 0 2 每，o a t l c y 等将1 至4 月龄的小牛作为供体删，m a k o t o 等甚至突破性的将灵长类动秘的耩原干细胞 向小鼠睾丸内移植【4 9 l ，结果这些供体的精原干细胞殿然郁未实现完整的精予发生过程， 但都可以在受体小鼠睾丸内建立生髓千细胞的克隆，并鼠可以维持很长时间。 3 ，移整方法 精原干细臆移植的基本方法就憨利用显微注射的方法将可育供体的寨丸细胞混合物 注入另一不育溅体的曲细精管管股内，从而诱导受体帮丸曲细精管管腔内出现供体精子生 成过程。 3 1 供俸精器予缨脆的获褥 在最初的精原干细胞移植过稷中使用的是直接由供体皋丸提取的细胞悬液，每5 0 0 0 个小鼠睾丸细胞中才有一个精原干细胞，并且它们在形态上和生化特性上都很难分辨出 来。这一现象严鬟裁约了移植成功麓凡率，因此尽可戆黝获敬缝纯的供体髓驭子缨戆 ；i 提 高移植效率戒为磷究瓣男一重要镊域。 纯化精原千细胞也是有效的掇漪移植效率的方法。最初，s h i n o h a r a 等人使用针对a 6 和bl - 粘合索的抗体来选择精原干细胞，可以使干细胞纯化5 1 0 倍酬。麟来，s h i n o h a r a 等人利用在隐黎情况下糖原于细胞不能分化这一特点，采用隐睾技术来富集糖原千细胞。 结采发瑰睾丸肉予缍戆戆鼗嚣大溪。簿拿受薅睾蔻大终移入1 0 s 令圭蓬缨藏，缝莱骞约弱 个细胞克隆形成。这说明隐睾技术憝一种非常有价值的糙原干细胞纯化方法1 5 。 3 2 移植受体动物准备的不断完善 篦都师范丈学硕j 一学位论盘 最秘精琢予缀藏移植实验傻掰豹受俸魂物主要露三类：不露弯豹蒸嚣馥陷型，j 、鬣、经 过药物白消安( b u s u l f a n ) 处理灭绝内源精原于细胞的小鼠、具有免疫缺陷的裸鼠，皆为 成年雄鼠。1 9 9 9 年o g a w at 就选择受体动物以提高移楠效率这一问题进行了研究，发现 由于自消安对成年雄鼠具有亚致死性，因此对新出生的仔鼠进行药物处理，并用其作为精 覆予缨稳移撩瓣受俸霹浚爱够棱豹散率大夫提裹 4 6 1 。2 0 0 3 年c l a y t o nj ，b f i s t c r 褒o g a w at 实验结果的蒺础上进一步研究，将盎消安施用于交配鼷1 2 1 8 天的母鼠，其所生产的雄 性仔鼠不可育，可作为移植受体渤物。其中在交配后1 2 5 天对母鼠进行骑物处理并于仔 鼠出生后5 1 2 天进行细胞移植的成功几率最高，受体仔鼠恢复育性后其2 5 以上的子代 显示供薅的基戮毽闯。 3 3 移植 o g a w a 等人提出了两种移植方法例：1 、直接穿过肇丸被膜注入睾丸网；2 、通过成 束的输出小管将肇丸细胞混合物渡入到睾丸网。这两种方法均可以将供体糟服细胞导入受 锌蘧蘩穰营牵。 确定最佼 掰胞移植数日是提礴移植效率的重要乎段之一。d o b f i n s k i 镣人通过分析发 现移植细胞数囡与其在受体睾丸内形成克隆的程度几警星线性相关，并且推荐每个受体睾 丸内移入1 0 7 个供体睾丸细胞为寂1 4 n 。这样，精原于细胞的移植效率即使谯攀酮较低的情 嚣下毽戆褥黧援舞玲q 。 3 4 精原干细胞在受体睾丸内的克隐形成过程 供体精原于细胞在受体小鼠辩丸内形成克隆的熬个过程分为3 个时期：首先，在移植 后鲍第1 周内，袋俸生殖绍胞遮瓠溅分毒在整缨耩管内。在这个时羯内，少爨豹糖原于缨 戆穿建s c r t o l i 缀耱阂戆綮密联接，移行至篷鲴精营基残媵。第二霹鬻是攒穆棱后1 周至1 个月。在这段时期内，干细胞和初期糟原细胞在曲细精管内纵向繁殖，形成了供体细胞网 或链。供体细胞的分化发生在第三时期。第三时期开始于移植后1 个月。在这段时期内， 供体细胞建立了糙原细胞克隆，并熙不断沿小管扩张，弗予移植后2 个胃开始产生糖子1 5 5 1 。 4 。耩原干缀穗移攘的研究和痰用辩豢 4 1 精原干细胞生物学功能鉴定 首都师范大学硕士学位论文 长期以来，哺乳动物睾丸精原干细胞多是通过其典型的形态学特征得以鉴定。利用已 知的干细胞与基底膜的联系及精原干细胞移植研究体系，测定干细胞表面分子标志也可以 鉴定精原干细胞的存在。如精原干细胞上的n6 和61 整合素就是利用精原干细胞移植技 术首次证明了这一抗原。另外，通过转基因技术，将表达特定转基因受体的精原干细胞进 行特定染色并移植后，可以鉴定精原干细胞的存在及其创建的精子发生过程。 4 2 精子发生的功能性分析 精原干细胞移植体系使供体精原干细胞在同种属不育受体睾丸内建立了完整的精予 发生。通过分析移植后受体曲细精管内供体精原干细胞克隆的模式和历程，可以了解精原 千细胞的活性及其行为。采用连续移植方法，可以分析移植后精原干细胞归巢及增殖过程。 另外，在分析标有绿色荧光蛋白( g f p ) 的精原干细胞移植到小鼠曲细精管时发现，通过分 离和测量具有荧光活性曲细精管段，分析已分化的生殖细胞，证明移植后克隆细胞问联系 与正常不同发育阶段细胞间联系是一致的，并且精原干细胞分化开始可以发生在不同克隆 的不同发展阶段。 精子发生严格的调控也体现在睾丸内干细胞和微环境的动力关系上。幼小动物睾丸内 微环境比成年动物睾丸内微环境可能更好，因为当受体为幼年动物时，其体内捐赠者干细 胞克隆的面积是成年动物的4 倍【5 6 】。这说明幼小动物睾丸内环境为雄性生殖系精原干细 胞移植提供了更适宜的环境。但在刚出生受体动物睾丸内，被移植的精原干细胞归巢，并 与内源性精原干细胞发生竞争。这说明出生后不久受体睾丸内源性精原干细胞影响供体精 原干细胞克隆增殖。 不同种属精原干细胞克隆和精子发生可能不同。利用精原干细胞移植技术来分析大、 小鼠睾丸生殖系干细胞，结果表明大鼠精原干细胞的浓度比小鼠高9 5 倍，移植3 个月后， 受体大鼠精原干细胞克隆是来自于小鼠的2 7 5 倍，分析同一时间受体睾丸，来自大鼠精 原干细胞的精子发生是来自小鼠的2 6 倍【5 7 】。 激素对精予发生也起调节作用。放射损伤大鼠睾丸后，促性腺激素释放激素( c , n m - 1 ) 可促使供体精原干细胞在其睾丸内克隆并产生精予。另外，当获得的供体细胞数量很低时， 用g n r h 拮抗剂治疗并通过精原干细胞移植技术可以提高干细胞克隆效果【5 8 1 。 4 3 建立转基因动物 雄性生殖系干细胞能自我更新并将基因传给子代。用携带l a c z 转基因受体的逆转录 尊都师范大学硕士学位论文 病毒转染太鬣耩琢干细胞，荠将冀移植到受俸小簸睾丸嚣，产生了转基因耩藤干细胞克隆 及其精子发生。 目前研究袭明，基因介导的精原干细胞移植到不商受体小鼠后，其雄性后代近4 5 是转基因动物，这些转基困动物又熊将该基因遗传到下一代并得到表达。由此看来， 运震生臻系蒸瓣修爰静方法箍够产生转墓霞魂终。狳藏之筹，糖蒙于细蒡囊移獯遂霉运嗣于 研究许多突交辩种和转基因动物低擞育症或不育症等课题。 4 4 提供生育储备 众获周聚，敖恁疗惹耪蒙予缀臌