（细胞生物学专业论文）编码tpa基因慢病毒载体的构建及其制备体系的建立.pdf

山东师范大学硕士学位论文 编码t p a 基因慢病毒载体的构建及其制备体系的建立 中文摘要 人组织型纤溶酶原激活剂( t i s s u e t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r ，t - p a ) 是人体内存在的多区 域丝氨酸蛋白酶，它可以特异性地激活纤溶酶原转变为纤溶酶，后者能在血栓局部有效地 溶解血栓中的纤维蛋白，使血管再通，是治疗血栓性疾病的特效药。正常人体组织内，t - p a 分布广，但含量非常低。随着科学技术的发展，t - p a 的生产也经历了从原组织中提取、原 核生物表达、真核细胞表达和动物乳腺生物反应器表达等几个发展阶段。目前动物乳腺生 物反应器制备t p a 已实现产业化，但是仍存在整合率低，转基因动物遗传不稳定，转基因 动物生长周期长等问题。 病毒载体是目前转移基因的最优手段之一。慢病毒载体因为可以介导外源基因在非分 裂细胞中稳定高效地表达而成为转基因动物和基因治疗研究的重要工具。在本课题中，我 们拟克隆人t - p a 酶活性区域，然后构建慢病毒载体，通过四质粒包装体系生产慢病毒颗粒， 从而为下一步研制转基因高等模式动物及基因功能的研究提供条件。 本研究通过高效t r i z o l 试剂快速从黑色素瘤细胞中提取总r n a ，自行设计引物采用 r t p c r 获得t - p a 基因酶活性区域( k 2 区和p 区) c d n a ，经测序鉴定后与g e n b a n k 报道序 列一致。为获得c m v 强启动子，将该基因片段用b a m hi 、h i n d l i i 双酶切后，连入p e g f p n 3 质粒中，采用脂质体2 0 0 0 转染n i h3 t 3 真核细胞，经荧光显微镜观察，在转染后2 4h 有 t - p a e g f p 蛋白表达，产生较强的绿色荧光，证实载体构建成功，为下一步构建慢病毒载体 奠定基础。 采用已构建的p e g f p n 3tp a 质粒，经p c r 克隆获得c m v t p a 片段。应用基因重 组技术，双酶切p l e n t i 质粒和目的c m v t p a 片段后进行连接，构建p l e n t i c m v - t p a 慢 病毒质粒。同时提取p l e n t i c m v - t p a 质粒和其他三个包装质粒，并测定其浓度，使用磷 酸钙共沉淀法将其转染2 9 3 t 细胞，在细胞中生产慢病毒颗粒，取上清用聚乙二醇均相沉 淀法浓缩病毒。通过观察病毒感染2 9 3 t 细胞后细胞表达e g f p 阳性克隆数，计算得知病 毒滴度均在1 5 x 1 07 t u m l 左右。将纯化后的病毒感染2 9 3 t 细胞并传代，经荧光显微镜观 察有绿色荧光，同时用t - p a 基因特异性抗体经w e s t e r nb l o t 检测细胞中有t - p a 蛋白表达， 且分子量为3 5 9 3 k d a 符合预测的蛋白大小，未感染病毒的细胞组无表达。 综上所述，利用r t - p c r 方法克隆得到t - p a 酶活性区域( k 2 区和p 区) c d n a ，构建的 l 山东师范大学硕士学位论文 重组真核表达质粒能在特定细胞中表达外源基因。随后进一步制备的慢病毒载体经过病毒 包装系统，成功包装出病毒颗粒，经g f p 荧光法检测其具有较高的病毒滴度。将纯化的病 毒颗粒感染细胞后，通过r n a 水平和特异性抗体的w e s t e r nb l o t 检测，证实目的基因插入 到染色体上，并随细胞传代而转录表达，说明慢病毒载体及病毒颗粒制备成功。这为研制 转基因高等模式动物的建立提供了物质基础。 关键词：t - p a ；慢病毒载体；基因克隆；d n a 重组 分类号：q 3 4 4 1 3 i i 山东师范大学硕士学位论文 t - p ai e n t i v i r u sv e c t o r sc o n s t r u c t i o na n dl e n t i v i r u sp r o d u c t i o n a b s t r a c t t i s s u e - t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r ( t p a ) i sak e ye n z y m ei nf i b r i n o l y s i ss y s t e m ，t h e p h y s i o l o g i c a lr o l eo fw h i c hi st oc o n v e r tz y m o g e np l a s m i n o g e ni n t oa na c t i v ef o r mo fs e r i n e p r o t e i n a s ep l a s m i n ，w h i c ht h e ni n i t i a t e so ra c c e l e r a t e st h ep r o c e s so ff i b r i n o l y s i sa n dd e g r a d e s t h ef i b r i nn e t w o r ko ft h r o m b ia n db l o o dc l o t s ，i st h em e d i c i n ef o rt h et h e r a p yo ft h r o m b o t i c d i s e a s e s t - p ai sw i d e l yd i s t r i b u t e di nt h en o r m a lt i s s u e w i t ht h ed e v e l o p m e n to fs c i e n c e t e c h n o l o g y ，t h em a n u f a c t u r eo ft - p ag o e st h r o u g hm a n ys t a g e so fd e v e l o p m e n tw h 。i c hi n c l u d e d t h e o r i g i n a l t i s s u e e x t r a c t i n g ，p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，e u k a r y o t i c e x p r e s s i o na n da n i m a l m a m m a r yg l a n db i o r e a c t o re x p r e s s i o n a tp r e s e n t ，a l t h o u g ht h em a n u f a c t u r eo ft - p ab ya n i m a l m a m m a r yg l a n db i o r e a c t o re x p r e s s i o nh a sa c h i e v e di n d u s t r i a l i z a t i o n ，t h e r ew e r ec e r t a i nd e f e c t ， f o re x a m p l et h ep r o b l e mo ft h el o wr a t eo fi n t e g r a t i o n ，t r a n s g e n i ca n i m a lg e n e t i ci n s t a b i l i t y ， g e n e t i ci n s t a b i l i t yo ft r a n s g e n i ca n i m a l ，g r o w t hc y c l el e n g t ho ft r a n s g e n i ca n i m a la n ds oo n n o w o p t i m a lm e a n sf o rt r a n s g e n i ca r et h eu s a g eo fv i r u sv e c t o r s a so n eo ft h e m ，l e n t i v i r u s p r o v i d e se f f e c t i v em e a n sf o re x p r e s s i o no fe x o g e n o u sg e n e si nm a m m a l i a nc e l l s ，w h i c hh a d p r o v e de f f i c i e n ta n da c h i e c e ds t a b l el o n g - t e r me x p r e s s i o no ft h et r a n s g e n e s ，s oi tw a sd e v e l o p e d a sa ni m p o r t a n tt r a n s g e n i cv e c t o rf o rt r a n s g e n i ca n i m a l sa n dg e n et h e r a p y i nt h i sr e s e a r c h ，w e c l o n e dt h ea c t i v i t yr e g i o no fh u m a nt - p ac d n a ，c o n s t r u c t e dt - p al e n t i v i r a lv e c t o ra n dp r o d u c e d h i g h - t i t e rl e n t i v i r u sb yf o u r - p l a s m i ds y s t e mi n2 9 3 tc e l l s t h e s ew o r k sp r o v i d et h eb a s i s f o r g e n e r a t i n gt - p at r a n s g e n i ca n i m a l t h et - p aa c t i v i t yr e g i o n a le d n aw a so b t a i n e df r o mm e l a n o m ac e l lt h r o u g hr t p c ra n d c o n f i r m e db yd n a s e q u e n c ea n a l y s i s i no r d e rt og e ts t r o n gp r o m o t e r ，w ef i r s t l yc o n s t r u c e d p e g f p - n 3 一t p av e c t o r s a n dt h e nt h et - p al e n t i v i r a lv e c t o r sw e r eg e n e r a t e db ys u b c l o n i n g r e c o m b i n a n tt e c h n o l o g ya n dc o n f i r m e db yr e s t r i c i t i o ne n d o n u c l e a s ea n a l y s i s i no r d e rt op a c k a g ev i r u s ，w ee x t r a c t e da n dp u r i f i e dr e c o m b i n a n tp l a s m i da n dt h ee l s et h r e e p a c k a g i n gp l a s m i d sa n dm e a s u r e dt h ed e n s i t yo fp l a s m i d s t h ef o u r - p l a s m i ds y s t e mw a s c o t r a n s f o r m e di n t o2 9 3 tc e l lf o rl e n t i v i r u sp r o d u c t i o n t h el e n t i v i m si nc e l lc u l t u r em e d i u m w e r ec o l l e c t e d ，c o n c e n t r a t e db yp e ga n dq u a n t i f i e d t h eg e n e r a t e dr e c o m b i n a n tv i r u sw a su s e d t oi n f e c t2 9 3 t c e l l ，d e t e c t i n gt h en u m b e ro fp o s i t i v ec l o n eo fe g f pt oc a l c u l a t et h e v i r u l e n c e ，w h i c hg r o s s l yw a s1 5x 1 0 7 t u m l t h ee x p r e s s i o no f t p ai n2 9 3 tc e i l sw a sd e t e c t e d b yr t - r c ra n dw e s t e r nb l o t ，a n dt h em o l e c u l a rw e i g h to ft h er e c o m b i n a t e dp r o t e i nw a s 3 5 9 3 l ( d aa so u rf o r e c a s t i n 山东师范大学硕士学位论文 a sac o n c l u s i o n ，t h et - p ae d n aw a ss u c c e s s f u l l yc l o n e du s i n gr t p c rm e t h o df r o m m e l a n o m ac e l l t h er e c o m b i n a n tt - p al e n t i v i r a lv e c t o r sw e r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e db yt h e m e t h o do fm o l e c u l a rc l o n i n ga n dr e c o m b i n a n tt e c h n i c s t h eg f pp r o t e i nw a sd e c t e c t e db y f l u o r e s c e n tm i c r o s c o p ea n dt - p ap r o t e i nw a sd e c t e c t e db yr t p c ra n dw e s t e r nb l o t t i n g a n a l y s i si n2 9 3 tc e l l h i g h t i t e rl e n t i v i r u sw a ss u c c e s s f u l l yp r o d u c e da n di d e n t i f i e dt ob ea b l et o g e n e r a t et h et r a n s g e n i ca n i m a l k e yw o r d s ：t - p a ；l e n t i v i r a lv e c t o r ；g e n ec l o n i n g ；d n ar e c o m b i n a n t c l a s s i f i c a t i o nn u m b e r ：q 3 4 4 13 i v 山东师范大学硕上学位论文 英文缩写一览表 v 山东师范大学硕士学位论文 v i 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏 可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 导师签字：彳刁彳复 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂拉可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 渊 导师签字： 抛 签字日期：2 。f 年月7 日 签字日期：2 。歹年矿月7 日 山东师范大学硕士学位论文 1t - p a 基因概述 综述 心血管疾病所引发的血栓并发症是当前严重威胁人类生命，导致死亡和病残的主要疾 病之一。全世界每年心血管病患者多达几千万，且治疗后复发率较高。防栓和溶栓是防治 该病的关键。当前应用于临床的溶栓药暂限于人尿激酶( u r o k i n a s e ，u k ) ，链激酶 ( s t r e p t o k i n a s e ，s k ) ，但二者的溶栓效率有限且无纤维蛋白溶解特异性，容易发生治疗性 出血。组织型纤溶酶原激活剂，又称组织型纤溶酶原激活物( t i s s u e - t y p ep l a s m i n o g e n a c t i v a t o r ，t - p a ) 或纤溶酶原激活因子( t i s s u ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r ) ，是体内纤溶系统的生理 性激动剂，在人体纤溶和凝血的平衡调节中发挥着关键性作用，与尿激酶和链激酶相比， 人t p a 与血栓基质有很高的特异性亲和力，能大大降低治疗过程中出血的危险，是一种用 于治疗急性心肌梗塞等血栓性疾病的特效药物【l 羽。 作为一种内源性蛋白质，t - p a 在正常组织和体液中广泛存在，但含量非常低，人血中 浓度约为ln g m l ，其在人体内的半衰期也较短，仅仅4 5 分钟1 4 ；作为一种蛋白水解酶， 其具有溶血作用，当t p a 接触到血栓后，立刻形成纤维蛋白、t - p a 及纤溶酶原三元复合体， t p a 选择性地激活血栓中的纤溶酶原，后者生成纤溶酶从而水解纤维蛋白，起到溶解血栓 的作用【2 1 。除此之外，t - p a 还与组织再造、神经突触重塑、记忆形成、细胞迁移、补体激 活、激肽产生、肿瘤侵袭等一些重要的生理与疾病过程密切相关。随着血栓性疾病的逐年 上升，市场对溶栓药物的需求量逐年增加，t - p a 因其对机体副作用小，作用效率高稳定性好 的优势，已成为治疗血栓性疾病的特效药。 1 1 t p a 基因的分子机构及功能 t p a 基因位于第八号染色体，包括1 3 个内含子和1 4 个外显子【5 1 。t p a 分子是一种糖蛋白， 由5 2 7 个氨基酸组成，分子量为6 20 0 0 7 00 0 0d 。天然t p a 为单链分子，受纤溶酶或胰蛋 白酶催化水解a r 9 2 7 5 - - 1 1 e 2 7 6 肽键，转变为由单二硫键相连的双链t p a 。双链t p a 的n 端是 重链( 或a 链) ，c 端为轻链( 或b 链) ，见图1 1 【5 1 。氨基端在重链，羧基端在轻链，两条链 在空间盘转扭曲，形成了具有各自独立功能的区域。按其形状和功能分为5 个相对独立的 蛋白质结构域。t - p a 重链( h ) 位于肽链的l 2 7 5 位，包括指形区、表皮生长因子区及两 个三角区，决定了t p a 对纤维蛋白的亲和力；轻链位于2 7 6 , - - 一5 2 7 位，与胰蛋白酶等丝氨酸 山东师范大学硕士学位论文 蛋白酶有很高的同源性，含有t p a 活性中心，且1 h i s 3 2 2 、a s p 3 7 1 和s e r 4 7 8 t 5 6 】。 ( 1 ) 指形区：t - p a 分子1 , - 4 3 位氨基酸与纤维结合蛋白分子的指形区结构同源性很高， 称为指形区( f ) 。实验证实，该区域与纤维蛋白吸附，纤维蛋白裂解活性密切相关，其中 区域2 3 - - 2 5 和4 2 - - 4 9 同迅速清除相关，而1 4 3 2 则在纤维蛋白裂解活性方面起到重要作用 【7 】 o 图1 - 1 t - p a 分子的一级结构i 副 ( 2 ) 表皮生长因子区：t - p a 分子的4 4 9 1 位氨基酸结构与人表皮生长因子的同源性很高， 称为表皮生长因子区( e ) 。 ( 3 ) 三角区：t - p a 分子有两个三角区( k l 和k 2 ) ，分别由氨基酸残基9 2 1 7 3 、1 8 0 2 6 1 组成。k l 和k 2 都与纤溶酶原分子、凝血酶原分子的三角区有较大的同源性。k 区是参与 凝血及纤溶的调节性蛋白酶中独立的结构域和功能区【8 】。其中k 2 区具有较强的l y s i n e 亲和 力，实验发现f 区和k 2 区介导了t - p a 对于纤维蛋白的亲和性，并且k 2 在此过程中起到了 主要作用。k 2 区在纤维蛋白蛋白吸附上起着自主的功能并且介导了t - p a 在纤维蛋白参与 下的纤溶酶原激活功能【9 ，1 0 1 。 ( 4 ) 丝氨酸蛋白酶结构域( p 区，2 7 6 5 2 7a a ) ，为整个分子发挥酶活性的催化活性区，催 化纤溶酶原使之转化为纤溶酶，内含有结合纤溶酶原激活剂抑制剂( p a i 1 ) 的区域【1 1 ，1 2 】。 ( 5 ) 糖链：t p a 分子含糖6 8 ，有三个糖基化位点，分别位于a s n l l 7 、a s n l8 4 和a s n 4 4 8 。 实验表明a s n l 8 4 位点的糖基化明显降低了纤维蛋白依赖的t p a 活性；a s n l l 7 和a s n 4 4 8 位点的糖基化却降低了无刺激条件下的t - p a 活性；并且a s n 4 4 8 糖基化位点影响了t - p a 对 2 山东师范大学硕士学位论文 于纤维蛋白吸附与血栓的裂解活性 1 3 】。说明糖链对t p a 活性非必须，但有一定影响。同时 还发现缺少糖链或无糖链的缺失突变c d n a 表达的新型t - p a ，其血浆半衰期显著延长，且 特异活性有所提高，具有更大的应用价值【1 4 】。 1 2t - p a 研究进展 随着科学技术的发展和基因功能研究的深入，t - p a 又有许多的新功能被发现，其不仅 具有溶栓功能，还在应激反应、信号传导、细胞凋亡以及多种疾病的发生和发展过程中发 挥了一定的作用。这些新的发现为t p a 在溶栓过程中出现的不良反应提供理论依据，也开 拓了t p a 的应用范围，为其用于治疗其他相关疾病奠定了基础【15 1 。 近些年来发现，t - p a 与神经传递和突触可塑性过程都有关系，是小胶质神经细胞、星 状细胞、s c h w a n n 细胞功能的一种主要调节剂【1 6 1 。对t p a 的调节可能改变目前对脑卒中、 a l z h e i m e r 病及其他神经变性疾病的治疗方法【1 7 ，18 1 。同时t p a 作为低密度脂蛋白受体相关蛋 i 刍( l r p ) 的配体，与l r p 相互作用共同调节神经血管单位的通透性和完整性【1 9 】。不仅如此， 其还在信号转导发面起到一定作用，实验证实t p a 可以诱导肾间质成纤维细胞中m m p 9 基因的表达和蛋白分泌，起到细胞因子的作用。其作用机制为结合细胞膜受体l r p 1 ，诱 导其酪氨酸磷酸化，从而激发细胞内信号传导，最后诱导肾间质成纤维细胞中特殊的基因 表达【2 0 】。k u m a d a 等的研究结果表明，内源性t p a 而不是尿激酶型纤溶酶原激治剂 ( u p a ) ，在n m d a 导致的视网膜细胞损伤中起着一种促进剂的作用。 科学家对t p a 小鼠的研究表明，t - p a 在应激反应和严重的抑郁性障碍( m d d ) 的促 发中发挥着重要的作用。一项对p a l 1 ( t p a 的主要抑制物) 血清水平的研究发现，患m d d 的 女性比正常对照组血清中p a l 1 的浓度更高，从而得出t p a 纤溶酶原系统可能在m d d 的发 病中发挥作用2 2 1 。r e n c k e n s 等发现，败血症也与t p a 的表达量有关。他们发现在大肠杆 菌导致的腹部败血症过程中，t - p a 起到一种新的保护功能，而且这种功能似乎独立于纤溶 酶产生时t p a 的作用【2 4 1 。研究发现由于某些肿瘤细胞具有较强的合成t p a 能力，血浆中t p a 水平的异常升高预示着肿瘤恶变、侵袭、转移和复发增强的可能，因此人们正通过对血浆 中t p a 含量的检测作为肿瘤早期诊断和治疗的辅助观察指标。 1 3t - p a 的生产 随着生物技术的发展，转基因技术的不断完善，t - p a 的生产也经历了从原组织中提取， 原核表达，真核表达以及乳腺生物反应器等几个阶段【5 1 。相比较前几种方式，转基因动物 乳腺生物反应器具有不可比拟的优越性，其产量高，成本低，表达产物可修饰和加工，生 3 山东师范大学硕士学位论文 物活性较高，是世界各国科学家关注的一种全新的生产模式。 转基因乳腺生物反应器的构建主要从两方面入手，一方面是采用重组d n a 技术，另一 方面是转基因技术，将乳汁中本身存在的蛋白基因的调控序列与外源t p a 基因相连，转入 动物受精卵，使其整合到动物的染色体中，并特异性地在乳腺上皮细胞中表达，然后通过 分泌得到的乳汁，从中回收具有活性的t p a 。该项工作较为繁琐，采用了多项技术，但一 旦生产体系建立，可高效低耗的实现t p a 的工业化生产。 1 9 8 7 年，g o r d o n 等【2 5 】首次建立t p a 乳腺定位表达的转基因小鼠体系，指导了t p a 的 c d n a 在小鼠乳汁中的表达，其表达量分别达n 2 0 0n g m l 及4 0 0n g m l ，但转基因率较低。 1 9 9 0 年，m e a d e 等【1 4 】利用牛的a s l 2 酪蛋白基因的调控序列指导的在小鼠乳汁中高水平表达 人的尿激酶蛋白，表达水平达到1 2m g m l 。检测结果尿激酶具有活性，这说明利用转基 因动物生产大量的富含半胱氨酸的非乳汁蛋白是可行的，从而为转基因乳腺生物反应器生 产具有高活性的t p a 提供了极大可行性。随后e b e r t 等【2 6 2 刀首次利用转基因乳羊生产长效 t - p a ( l a t p a ) ，并检测发现在乳腺中表达了有活性的l a - t - p a ，其所构建的载体的基本构件 为：5 端为2 1 6k b 的鼠乳清酸蛋白的启动子，中间为l a t p a 的c d n a ，37 端是s v 4 0 的转录终 止序列。紧接着e b e r t 等【2 6 在1 9 9 4 年又用将启动子换为p 酪蛋白的启动子，构建了转基因羊， 并从中获得3m g m l 的l a t - p a 高表达。到了2 l 世纪，加拿大耐克西亚公司利用转基因动物技 术，采用原核显微注射技术，获得了转基因波尔山羊，其表达t p a 蛋白水平均在5m g m l 以 上，实现了用乳腺生物反应器生产具有商业价值的t p a 。 在利用乳腺生物反应器生产t p a 取得辉煌成果的同时，一系列矛盾问题仍有待解决： ( 1 ) 转基因动物的整合率低；( 2 ) 所表达蛋白的水平不稳定；( 3 ) 乳蛋白的提取纯化 有一定难度：( 4 ) 过量表达t p a 对动物造成伤害；( 5 ) 转基因动物遗传的不稳定性；( 6 ) 转基因动物生长周期长。随着近几年先后出现的几种新的转基因动物制作方法，尤其是慢 病毒载体，可大大提高了转基因动物的制作效率，解决以上诸多问题，为动物乳腺生物反 应器生产t - p a 提供了基础。相信在不久的将来，t - p a 的生产将逐步完善，将成价格低廉、 疗效显著、毒副作用低的溶栓药物，为人类战胜心脑血管疾病提供有力保障。 2 慢病毒载体概论 伴随着生物技术的发展，病毒载体作为一种新的转基因运载工具已被得到广泛应用， 其中尤以逆转录病毒和腺病毒载体最为成熟。以往的非病毒方法，例如磷酸钙沉淀法、脂 质体法，以及直接注射、电穿孔等物理方法，效率低，操作繁琐价格昂贵，已经不能满足 需求，正渐渐的被病毒载体所取代。相比腺病毒载体而言，慢病毒载体不仅能感染非分裂 山东师范大学硕士学位论文 细胞和分裂细胞，转移较大的基因片断，而且具有更为广泛的宿主范围，通过载体修饰大 大降低了重组的机会，具有高效整合、高效表达，不会引起宿主的免疫反应等特点，因此 成为目前广为关注的真核生物基因转移载体 2 8 - 3 i 】。 慢病毒( l e n t i v i r u s ) 属于逆转录病毒科( r e t r o v i d a e ) ，为r n a 病毒，因其毒粒中含有依赖 r n a 的多聚酶即逆转录酶，故名为逆转录病毒。目前应用的慢病毒载体来源于多个物种， 包括人类免疫缺陷病毒1 型( h r v 1 ) 、2 翌f l _ ( h i v 2 ) 、马传染性贫血病毒( e i a v ) 、猴免疫缺陷 病毒( s t y ) 、猪免疫缺陷病毒( f i v ) 以及牛免疫缺陷病毒( b r v ) 等。其中尤以h i v - 1 的研究最 广泛和深入，因此我们以h i v 1 载体为代表，综述了慢病毒载体的研究进展。 2 1h i v - 1 慢病毒载体的结构及生活周期 2 1 1h 1 慢病毒载体的结构 h i v - l 为双链r n a 病毒，共有9 个基因( 如图1 2 ) 。包括三个编码病毒基本结构基因g a 昏 p o l 、f f n v ，两个调节基因t a t 、r e v ，以及四个辅助基因v i f ( 病毒感染因子) 、v p r ( 病毒r 蛋 白) 、v p u ( 病毒u 蛋白) 、n e f ( 负调控因子) 3 2 】。其中g a g 基因编码病毒的核心蛋白，包 括基质蛋自、衣壳蛋白、核衣壳蛋白。p o l 基因编码病毒复制所需的酶，如反转录酶、整合 酶、蛋白酶。e n v 基因编码病毒的包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主的靶向性。t a t 和r e v 分别 编码两个反式激活因子t a t 蛋白和r e v 蛋白，前者在h i v 1 基因组复制和转录延伸过程中发 挥重要作用，后者则可促使h i v 1 基因的表达由早期向晚期转化【3 3 】。4 个辅助基因编码的蛋 白作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染【3 4 1 。两端为长末端重复序列( 1 0 n gt e r m i n a l r e p e a t s ，l t r ) ，内含有真核启动子，转录调控顺式作用位点，病毒编码的反式作用因子与 其结合后可以反式激活基因的表达，起到重要的调控作用。s d 为剪接供体位点，、i ，为包装 信号，它可使r n a 包装入病毒蛋白壳内【3 5 1 。 d 一倒刮 卜删司 h l v 1 图1 - 2 h i v 1 基因组结构图 2 1 2h i v 生活周期 h i v 的生活周期包括吸附、穿入、逆转录、环化、整合、转录、翻译、装配、出芽， 见图1 3 。 5 山东师范大学硕士学位论文 ( 1 )首先是h i v 的c n v 蛋白g p l 2 0 同细胞表面c d 4 + 受体相结合，导致v 3 1 0 0 p 和 v 1 胞区构象发生改变，随后膜融合，脱去包膜和核衣壳，病毒核酸进入胞浆； ( 2 ) 病毒r n a 在逆转录酶的催化作用下，形成线状的双链d n a ，然后环化成闭合的 双链d n a ； ( 3 )闭合的d n a 被转运到细胞核，整合到细胞染色体中，形成前病毒，并随着细胞 的分裂而传给子代； ( 4 )前病毒d n a 转录出m r n a ，经拼接修饰后核糖体表达早期病毒调节蛋白； ( 5 )待调节蛋白的量达到一定阈值后，病毒开始晚期转录，产生未拼接的m r n a 部 分用来指导合成病毒的结构蛋白； ( 6 )部分为拼接的m r n a 作为病毒的基因组，与结合蛋白进行装配形成病毒核心颗 粒，由出芽时从细胞膜上获得包膜和膜蛋白。 n a t u r er e v i e w slm i c r o b i o l o g yv o l u m e5lf e b r u a r y2 0 0 7l9 5 图1 - 3 h v 的生活周期3 6 】 2 2 慢病毒载体系统的构建策略 慢病毒载体的构建原理就是将h w 1 基因组中的顺式作用元件( 如包装信号、长末端重 复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离，将其基因组分装于几个质粒载体中，删除毒 6 山东师范大学硕士学位论文 性基因，以避免重组产生有复制能力的病毒( r c v ) ，然后再共转染细胞，最后获得只有一次 感染能力而无复制能力的h i v 1 载体颗粒。到目前为止，已经发展经历了四个阶段，并不 断改造修饰以完善其安全性。 2 2 1 三质粒表达系统 为最大限度的降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒的可能性，n a l d i n il 等构 建了三质粒表达系统【3 7 ，3 8 1 ，该系统包括包装质粒、异源包膜蛋白质粒和转移质粒，将病毒 包装成分分别构建在两个质粒上，一个表达g a g 矛1 p o l ，另一个表达v s v - g ，删除包装信号， 使得包装序列不能整合到病毒基因组中，这样病毒感染细胞后也就缺乏复制能力。同时用 编码水疱性口炎病毒g 蛋白( v s v g ) 基因代替e n v 基因，增加了载体的稳定性，使病毒载体 具有更高的滴度，扩大了靶细胞的范围。转移质粒含有感染靶细胞及转移目的基因( 或报告 基因) 的所必须的顺式作用基因序列及用来携带目的基因的限制酶切位点。 2 2 2 四质粒表达系统 为了提高病毒载体的安全性，现将三质粒又细分改进成四质粒系统，即将病毒基因组 分别构建与四个质粒中，从而大大降低了r c v 产生的可能性，增加了载体系统的安全性。 四质粒系统包括：质粒一携带y g a g ，p o l 编码序列及r r e ；质粒二包含了编码r e v 的序列； 质粒三是载体质粒；质粒四表达e n v 。z u f f e r e yr 等【3 9 】又对l t r i - 又域进行操作，删除y 3 7 l t r 增强子和启动子序列，产生自身失活慢病毒载体( s r n ) 。该区域是h i v 1 行使逆转录功能的 主要区域，逆转录过程形成的载体缺乏h i v 1 的增强子和启动子序列，产生了一个灭活的 前病毒，但外源启动子仍能启动基因的转录与表达。这样就降低了慢病毒整合入宿主基因 组中时发生插入突变的机率，同时由于载体r n a 不能表达，进一步消除 r c r 的可能性4 0 1 。 同时r e v 表达质粒的构建提高了基因组质粒和包装质粒的出核转运。s i k o r s k ir 等【4 1 1 对病毒 基因组进行改造，使宿主的范围更广，并加入了c m v 启动子和绿色荧光蛋白基因( g f p ) 。 随着人们不断的改进构建技术，不断完善的病毒构建中出现的问题，一种高效安全的慢病 毒载体将更好的服务于人类。 2 2 3 安全性修饰 p a u l u s 等建立了四环素调控系统，以逆转录病毒为载体，在c m v 启动子调控下根据四 环素调控方向产生四环素调控转录( t t a ) 【4 2 】。x uk 等旧用t e t 反应元件( t i 辽) 替代载体的3 非翻译调控区，由于在体外可以对g f p 或目的基因的表达进行调控，称为可调控的慢病毒 载体。s u s a nl 等构建双启动子自我失活载体研究i s r e 的作用机制，证实利用慢病毒可 7 山东师范大学硕士学位论文 以用来构建双启动子载体，为同一组织出现复杂疾病的基因治疗中提供了有力的工具。 虽然在载体的构建中己删除了许多基因，但是为了避免同源重组的发生，还应尽可能 删除并精简与患者同源的载体中部分序列，一个有效的包装质粒需要位于5 非翻译区g a g 基 因的氨基酸末端编码区，虽然有研究表明保留g a g 基因的4 0 个核苷酸就可以行使正常功能， 但是在h i v - 1 的g a g - p o l 表达质粒和h i v - 1 载体之间仍有两个同源性区域，任何保留的g a g 基 因都与用来产生载体的g a g - p o l 表达区有同源性：由于g a g 、p o l 和e n v 基因的表达都依赖于 r e v r e v 反应因子调控元件系统，载体基因组和g a g - p o l 表达区都有r e v 。k o ts o p o u l o ue 等 蛔构建了一个完整的合成基因( s y n t h e t i ch i v - 1g a g - p o l g e n e ( s y ng p ) ) ，优化了包装结构中 的部分非编码区；使该序列与任何自然发生的h i v 1g a g - p o l 序列无同源性，而且与转移载 体基因组g a g 区无重组的可能。由于s y ng p 系统完全不依赖于r e v ，因此r r e 可以从g a g - p o l 表达盒中删除，进一步减少了潜在重组的同源区。s a c h d e v ag 等【4 5 】用h i v 1 和h i v - 2 杂交或 嵌合，进一步提高了载体的安全性。 2 3 慢病毒载体系统的应用 慢病毒是一种安全高效的转基因载体，目前与其他技术结合，如感染干细胞或成纤维 细胞制作转基因嵌合体或转基因克隆动物。l v 载体与小的干扰性r n a ( s i r n a ) 或s h r n a s 技术结合抑制特异基因的表达或k n o c k d o w n ( 敲除) ，也可能成为制备抗病毒动物的有效方 法。 2 3 1 转基因动物方面 近年常规的转基因技术主要有显微原核注射法，逆转录病毒感染法，胚胎干细胞介导法， 精子载体法，体细胞核移植转基因法，人工酵母染色体( y a c ) 法等。其中逆转录病毒感染 法是将目的基因重组到逆转录病毒r n a 载体上，制成高滴度的病毒颗粒，人为感染着床前 或着床后的胚胎，也可以让胚胎与能释放逆转录病毒的单培养层细胞共孵育以达到感染的 目的【蛔。逆转录病毒i a 进入宿主细胞后，被反转录为d n a ，并在整合酶和其末端特殊核 酸序列作用下，整合到宿主细胞的基因组，进行表达和遗传得到转基因动物。与其他方法 比较，该法简单，无需昂贵的显微操作仪器，效率较高，可引入单拷贝的基因【4 7 1 。因此慢病 毒载体日益广泛地运用于转基因动物研究，并取得了令人满意的结果。p f e i f e ra 掣4 8 1 用慢 病毒感染的胚胎干细胞注入小鼠的桑椹胚，从而得到外源基因在胚和子代小鼠中稳定高效 表达。l o i sc 等开展了转基因大鼠和小鼠的研究，通过注射1 0p l - - 1 0 0p l 携带绿色荧光 基因的慢病毒浓缩液到小鼠受精卵的卵黄间隙中( 透明带下注射) ，培养7 2h 后观察发现发育 r 山东师范大学硕上学位论文 到桑椹期或囊胚期的胚胎有荧光表达，移植到代孕小鼠体内转染效率高达了8 0 ，而在大 鼠的研究中，感染后胚胎携带外源基因和出生小鼠表达荧光的比例也分别达到了5 9 1 和 4 0 9 并且在f 1 代也有荧光表达，说明慢病毒载体法可以用于性腺遗传。自此揭开了慢病毒 载体法制备转基因动物的序幕，在其后有多个实验室投入到慢病毒转基因动物的研究中。 随后进行了猪、牛等大动物的转基因研究。h o f m a n na 等【5 0 】利用慢病毒载体法首次成 功制备绿色荧光蛋白转基因猪，同时证实了外源基因能通过性腺遗传给后代。为了进一步 对大动物进行转基因研究，h o f r n a n na 等【5 l 】又对牛进行了慢病毒研究，用慢病毒感染了牛胚 胎成纤维细胞，进行了核移植，产下了1 头转基因克隆牛，也有稳定的外源基因表达。 m c g r e wmj 等对慢病毒载体法制备转基因禽类和鸟类进行了研究，并利用该方法高效制 备了转基因鸡，效率比以往其他方法高出数百倍。w o l f g a n gmj 等【5 3 】应用慢病毒载体系统 将外源基因( 绿色荧光蛋白，g f p ) 引入恒河猴胚胎，结合胚胎注射体外受精等技术，经 g f p 的抗体检测孕猴子代，结果发现新生猴中均有g f p 的表达。r y uby 等【5 4 】研究慢病毒载 体感染精原干细胞( s s c s ) ，注射到大鼠睾丸中，可大规模生产转基因动物，这种方法同样 拓宽了慢病毒载体法的思路。目前慢病毒载体又与纳米技术相结合，掀开了转基因动物研 制的新篇章【5 5 】。 2 3 2 基因治疗方面 在癌症治疗方面，g e r o l a m i 掣5 6 】将带有h s v t k g f p 融合基因的慢病毒载体分别转染 从体内体夕b h c c ( 肝癌细胞) ，并以正常肝细胞做对照，结果发现，慢病毒载体在体内体外都 能有效地转染h c c ，并且有效的抑制了其生长，不引发肝脏毒性效应，而不对正常肝细胞 起作用。y u 等【5 7 1 则用前列腺癌细胞做为研究对象设计了类似研究，结果他们也只在癌细胞 中观察到了e g f p 的表达，并且雄性激素能促进e g f p 的表达而不改变表达特异性。这些实 验充分展示了慢病毒载体在治疗癌症方面的发展前景。 在心血管系统方面：有实验利用慢病毒载体转染新生儿和成年人心脏细胞，通过直 接注入心脏，显示慢病毒来源的载体能够成功的在体内和体外转染心肌。血液系统的方面： 镰状细胞贫血是由b 球蛋白基因单一点突变，形成异常血红蛋白，研究选择了防止血红