（细胞生物学专业论文）组织蛋白酶b在棉铃虫幼虫血细胞中的表达研究.pdf

附件一 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：j 薹盈；日期：坦垒：翌! 型 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅：本人授权ll | 东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论支作者签名：4 玺! 聱导师签名：扬遗狮 期：型垒竺! ! 山东大学硕士学位论文 组织蛋白酶b 在棉铃虫幼虫血细胞中的表达研究 摘要 蛋白水解酶( p r o t e a s e ) 是催化多肽或蛋白质水解的酶的统称，简称蛋白酶。 广泛分布于动物、植物及微生物中，种类繁多。蛋白酶对机体的新陈代谢及生物 调控具有重要作用。蛋白酶按水解肽链的部位可分为内肽酶( e c 3 42 1 2 4 ，9 9 ) 及外肽酶( e c 3 41 1 - 1 9 ) 。根据各种内肽酶作用位点的催化基团又可将之分为四 大类，分别为丝氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。 组织蛋白酶( c a t h e p s i n ，c a t h ) 是一大类对有机体的生命活动非常重要的 半胱氨酸蛋白酶。组织蛋白酶通常指在酸性环境中被活化的蛋白水解酶。正常状 态下，组织蛋白酶位于溶酶体，并可非特异性水解多种蛋白质提供有机体需要的 氨基酸和能量。还可以参与有机体的其他生理活动，如骨质吸收和细胞凋亡等。 如果组织蛋白酶异常表达，它们也可以引起病理反应。如通过降解细胞外基质蛋 白，加速肿瘤细胞的迁移和扩散。 昆虫体内也有大量的组织蛋白酶分布，其中常见的为c a t h b 、c a t h d 和c a t h l ，表达和分布部位多见于脂肪体组织、幼虫的消化道、早期胚胎、卵母 细胞及幼虫的血细胞等。功能与昆虫的卵母细胞发生、早期胚胎发育、食物消化 以及变态过程中组织的解体和重建有关。 棉铃虫( e i i c o v e r p aa r m i g e r a ) 属鳞翅目夜蛾科，是一种分布广泛、危害 严重的农业害虫。本实验室己从棉铃虫卵中鉴定并纯化出棉铃虫组织蛋白 酶b ( ha r m i g e r ac a t h e p s i nb ，h c b ，e c3 4 2 2 1 ) ，并克隆了该酶的全长 c d n a ( g e n b a n ka f 2 2 2 7 8 8 ) 。h c b 属于半胱氨酸类蛋白酶，酶原的分子量约为3 7 k d a ， 成熟酶的分子量约为3 0 k d a 。该酶的最适p h 为3 o 一4 0 ，活性可以被半胱氨酸蛋白 酶抑制剂反一环氧琥珀酰一l 一自氨酰一( 4 一胍基) 一丁烷( e 一6 4 ) 抑制。在此基础上， 还进行t h c b 的体外表达研究，制备了抗h c b 的单克隆抗体，并进行了该酶的底物 特异性和组织分布研究。己证实该酶参与了棉铃虫胚胎发育过程中卵黄蛋白水 解、成虫脂肪体凋亡等生命活动，但对其在幼虫血细胞中的表达分布以及功能尚 未进行研究。 本文在实验室原有工作的基础上，对h c b 在棉铃虫幼虫血细胞中的表达分布 和功能进行了初步研究。首先对棉铃虫幼虫血细胞进行了分类鉴定。利用吖啶橙 和二碘化丙锭荧光染色法，微分干涉显微镜观察法，结合吉姆萨染色法在棉铃虫 山东大学硕士学位论文 幼虫血淋巴中鉴定出5 种类型的血细胞，分别是原血细胞、浆血细胞、粒血细胞、 珠血细胞和类绛色细胞，详细描述了其形态结构特征，同时也观察到类绛色细胞 体外排核的过程及浆血细胞体外黏附铺展等细胞行为。 在血细胞分类的基础上，对h c b 在棉铃虫幼虫血细胞中的表达进行了研究。 利用n o r t h e r nb l o t 研究发现h c b 在血细胞中的转录具有发育阶段特异性，在6 龄 4 8 h 幼虫血细胞中h c bm r n a 表达量最高；w e s t e r nb l o t 实验发现h c b 在血细胞中的 翻译也具有发育阶段特异性，6 龄9 6 h 幼虫血细胞中h c b 蛋白表达量最高。说明h c b 在棉铃虫幼虫血细胞中的表达属于转录后控制机制。通过原位杂交实验和免疫细 胞化学证实了h c b 在血细胞中的表达，h c b 在血细胞中的转录和翻译主要在浆血细 胞和粒血细胞中进行。h c b 在幼虫到蛹的变态过程中表达逐渐增加，说明血细胞 中表达的h c b 可能与棉铃虫幼虫到蛹的变态有关。造血器官的发育过程和幼虫到 蛹变态时血细胞在中肠和脂肪体的分布更加证实了这一点。 本文还对不同发育时期棉铃虫幼虫血细胞的数量变化进行了研究，发现6 龄幼虫浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞所占比例较高，原血细胞和类绛色细胞所 占比例较低。通过血细胞体内和体外对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的吞噬研究表 明，浆血细胞和粒血细胞在体内和体外对革兰氏阴性和阳性菌都能行使吞噬功 能，而且在细菌刺激下浆血细胞和粒血细胞的数量也发生了相应的变化。 关键词：棉铃虫；组织蛋白酶b ； 血细胞；变态 山东大学硕士学位论文 c a t h e p s i nb l i k ep r o t e a s ee x p r e s s l 0 ni n h e m o c y t e so fc o t t o nb o l lw o r ml a r v a e a b s t r a c t p r o t e a s e sa r et h ee n z y m e st h a th y d r o l y z ep r o t e i n so rp e p t i d e st h e r ea r em a n y k i n d so fp r o t e a s et h a td i s t r i b u t ew i d e l ya m o n ga n i m a l s ，p l a n t sa n dm i c r o o r g a n i s m u s u a l l y ，p r o t e a s e sp l a yi m p o r t a n tr o l e si nm e t a b o l i s ma n db i o l o g i c a lr e g u l a t i o no f v a r i o u so r g a n i s m sp r o t e a s e sa r ec a t e g o r i z e da se n d o p e p t i d a s e s ( e c 3421 - 2 4 ， 9 9 ) a n de x o p e p t i d a s e s ( e c 3411 - 19 ) a c c o r d i n gt ot h e i rc l e a v a g es i t e so nt a r g e t p e p t i d e se n d o p e p t j d a s e sa r ef u r t h e rd i v i d e di n t os e r i n ee n d o p e p t i d a s e s ，c y s t e i n e e n d o p e p t i d a s e s ，a s p a r t i ce n d o p e p t i d a s e sa n dm e t a l l o e n d o p e p t i d a s e sb a s e d o nt h ec h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ra m i n oa c i d si nt h ec a t a l y t i cc e n t e r s a m o n g t h e s ep r o t e a s e s ，c a t h e p s i n s ( c a t h ) a r ea l a r g eg r o u po fe n z y m e sw h i c ha r e m o r ei m p o r t a n tt ol i f ea c t i v i t i e so fo r g a n i s m sc a t h e p s i n sc a nb ea c t i v a t e du n d e ra c i d c i r c u m s t a n c ec a t h e p s i n sn o r m a l l ye x i s ti nl y s o s o m e s ，a n dc a nn o n s p e c i f i c a l l y d e g r a d es t o c kp r o t e i n si n t oa m i n oa c i d st os u p p l yt h ec e l l sw i t ha m i n oa c i d sf o r e n e r g ya n dg l u c o s ea sn e e d e dc a t h e p s i n sc a na l s ot a k ep a r ti nm a n yo t h e r p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e sa c r o s ss p e c i e s s u c ha sb o n er e s o r p t i o na n dp r o g r a m m e dc e l l d e a t hi fc a t h e p s i n se x p r e s s e da b n o r m a l l y ，i tc a ni n v o k ep a t h o l o g i c a lr e a c t i o n s ，f o r e x a m p l e ，d e g r a d a t i o no fe x t r a c e l l u l a rm a t r i x ( e c m ) p r o t e i n sb yc a t h e p s i n si sr e q u i r e d f o rt u m o rc e l li n v a s i o na n dm e t a s t a s i s c a t h e p s i n sh a v ea l s ob e e nr e p o r t e di nn u m e r o u si n s e c t s ，m o s ti m p o r t a n to ft h e m a r ec a t hb ，c a t hda n dc a t hli n s e c tc a t h e p s i n sm a i n l yd i s t r i b u t ei nf a tb o d i e s ，m i d g u ta n dh e m o c y t e so fl a r v a e ，e a r l ye m b r y o sa n do o c y t e s t h e yc a np l a yv a r i o u sr o l e s i ni n s e c tl i f ep r o c e s s e s ，s u c ha so o g e n e s i s ，e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t ，f o o dd i g e s t i o n a n dh i s t o l y s i sa n dh i s t o g e n e s i sd u r i n gm e t a m o r p h o s i s t h ec o t t o nb o l lw o r m ，h e l i c o v e r p aa r m i g e r ai sb e l o n g e dt ol e p i d o p t e r a ： n o c t u i d a e ，a n di sak i n do fw i d e l yd i s t r i b u t e da n dh a r m f u lp e s ti np r e v i o u sw o r k ， c a t h e p s i nb l i k ep r o t e a s eh a db e e np u r i f i e da n di t sg e n eh a d b e e nc l o n e df r o mt h e c o t t o nb o l lw o r m n a m e dh a r m i g e r ac a t h e p s i nb ( h c b ；e c342 2 1 ：g e n b a n k a f 2 2 2 7 8 8 ) h c bi sac y s t e i n ep r o t e i n a s e p r o h c bi sa 3 7k d a p r o t e i na n dm a t u r e 1 山东大学硕士学位论文 h c bi sa b o u t3 0k d a ，i t so p t i m u mp hi s30 - 40 ，a n da c t i v i t yc a r lb ei n h i b i t e db y e 6 4 ，n 一【n 一( 1 ，3 - t r a i l s - c a r b o x y o x i r a n - 2 c a r b o n y l ) - l l e u c y i 一a g m a t i n em a n y w o r k s h a db e e nd o n eo nt h ee x p r e s s i o np a t t e r n ，t i s s u ed i s t r i b u t i o na n ds u b s t r a t es p e c i f i c i t yo f h c bm c a ba g a i n s th c bh a sb e e no b t a i n e dh c bh a sb e e nd e m o n s t r a t e dt ob e i n v o l v e di nt h ed e g r a d a t i o no fy o l kp r o t e i n si ne m b r y o n i cd e v e l o p m e n t a le g g sa n d a d u l tf a tb o d ya p o p t o s i s b a s e do nt h ep r e v i o u sw o r k s ，u t i l i z i n gb i o c h e m i c a l ，m o l e c u l a ra n dc e l lb i o l o g i c a l m e t h o ds u c ha sw e s t e r nb l o t , n o r t h e r nb l o t ，i m m u n o c y t o c h e m i s t r y , i ns i t uc e l l h y b r i d i z a t i o ne t c ，a s s o s c i a t i n gw i t hm o n o c l o n a la n t i b o d yt e c h n i q u e ，e x p r e s s i o na n d f u n c t i o no f h c bi n 且a r m i g e r ah e m o c y t e sw e r es t u d i e di nt h i sw o r k c o r o nb o l lw o r ml a r v a lh e m o c y t a sw e r ec l a s s i f i e db ya c r i d i n eo r a n g ea n d p r o p i d i u ms t a i n i n g ，u s i n gd i f f e r e n t i a l i n t e r f e r e n c ec o n t r a s tm i c r o s c o p e ，g i e m s a s t a i n i n gp r i m a r i l ya c c o r d i n gt ot h e i rm o r p h o l o g yc h a r a c t e r i s t i c s ，t o t a lf i v et y p e so f h e m o c y t e sw e r ei d e n t i f i e d ：p r o h a e m o c y t e s ，p l a s m a t o c y t e s ，g r a n u l o c y t e s ，s p h e r u l o c y t e a n d o e n o c y t o i d s c y t o m o r p h o l o g i c a l l y , t h eo e n o c y t o i d s b r e a ke a s i ly ，t h e p l a s m u t o c y t e sc a nd i s p l a ys h a p et r a n s f o r m a t i o ni nv i t r o ” h c bw a sh i g h l yt r a n s c r i p t e di n6 t h 4 8 ha n dn u m e r o u s l yt r a n s l a t e di n6 t h - 4 8 hl a r v a l h e m o c y t e s ，i tm e a n sap o s t - t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o no fh c be x p r e s s i o n h c b e x p r e s s i o ni nh e m o c y t e sw a sf o u n dt od i s t r i b u t e i np l a s m a t o c y t e sa n dg r a n u l a r h a e m o c y t e sd e t e c t e do nb o t ht r a n s c r i p t i o n a ll e v e la n dt r a n s l a t i o n a ll e v e l e x p r e s s i o n o fh c bi nh e m o c y t e se x h i b i t e dd e v e l o p m e n t a ls p e c i f i c i t y , a n di n c r e a s e db e f o r e p u p a t i o n i ts u g g e s t e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eh c be x p r e s s i o na n dl a r v a - p u p a m e t a m o r p h o s i sh e m a t o p o i e t i co r g a nd e v e l o p m e n t sa n dh e m o c y t e sd i s t r i b u t ei nm i d g u ta n df a tb o d yd u r i n gm e t a m o r p h o s i sd e m o n s t r a t e di ta l s o a t s o ，t h ec i r c u l a t i n gh e m o c y t ec o m p o s i t i o no f d i f f e r e n ts t a g eo f c o t t o nb o l lw o r m l a r v a eh a db e e nc o u n t e d t h er a t i oo f p l a s m a t o c y t e s ，g r a n u l o c y t e sa n ds p h e r u l o c y t e a r ed o m i n a n ti nt h e6 t hi n s t a r , a n dt h ep r o h a e m o c y t e s ，o e n o c y t o i d sa r el o w t h r o u g h t h ep h a g o c y t o s i sa s s a y ，p l a s m a t o c y t e sa n dg r a n u l o c y t e sc a np h a g o c y t e d g r a m p o s i t i v ea n dg r a m n e g a t i v eb a c t e r i ab o t hi nv i v oa n di nv i t r o t h eh e m o c y t e s n u m b e rf l u c t u a t e du n d e rb a c t e r i as t i m u l a t e d k e yw o r d ：h e f i c o v e r p aa r m i g e r a ；c a t h e p s i n b l i k ep r o t e i n a s e ；h e m o c y t e ；m e t a m o r p h o s i s 4 生查奎兰堡主堂垡笙苎 缩略词 a o b c i p b p a d e p c d i g d t t e - 6 4 e d t a f i t c h h c b h r p k d a m e a b m l n m o p s n b t p b s p i r d m s d s s d s p a g e s e c t a e t b s t r i s h c l 缩略词表 英文全称 中文全称 a c r i d i n eo r a n g e 吖啶橙 5 - b r o m 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y p h o s p h a t e 5 - 溴_ 4 氯一3 一吲哚磷酸盐 b a s e d a i r 碱基对 d a y 天 d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 焦炭酸二乙酯 d i g o x i n 地高新 d it h i 。t h r e it o l 二硫苏糖醇 n i n 一( 1 3 - t r a n s c a r b o x y o x i r a n 反一环氧琥珀酰一l 一白氨酰 一2 - c a r b o n y l ) 一l - l e u c y l - a g m a t i n e ( 4 一胍基) 一丁烷 e t h v l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e 异硫氰酸荧光索 h o u r 小时 舶，c o y e r p aa r m i g o r ac a t h e p s i nb 棉铃虫组织蛋白酶b h o r s e r a d i s hd e r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 k il o d a lt o n 千道尔顿 m o n o c l e n a la n t ib o d y 单克隆抗体 m i n u t e 分 3 一 n m o r p h 0 1 i n o p r o p a n e s u l f o n i ea c i d 3 - ( n 一吗啡啉) 丙磺酸 n i r t ob l u et e t r a z o l i u m 硝基四氮唑盐 d h o s p h a t e b u f f e r e ds a li n e 磷酸缓冲盐溶液 p r o p i d i u mio d i d e 二碘化丙锭 r e v 0 1 u t i o n s 口e rm i n u t e 转每分钟 s i d i u md o d e c v ls u i f a t e 十二烷基硫酸钠 s d s p 0 1 y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s d s - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 s e c o n d 秒 t r i s a c e t a t e e d t a b u f f e r t r i s 乙酸e d t a 电泳缓冲液 t r i s - b u f f e r e ds a l i n e t r i s 缓冲盐溶液 t r i s h y d r o c h l o r i d e t r i s 盐酸盐 山东大学硕士学位论文 1 1 组织蛋白酶概述 1 1 1 蛋白酶的性质和分类 第一章前言 蛋白水解酶( p r o t e a s e ，e c 3 4 ) 是催化多肽或蛋白质水解的酶的统称，简 称蛋白酶。蛋白酶在某一阶段存在于细胞内，有的释放出细胞后发挥作用，如胰 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶和补体系统；而有的存在于细胞中，在细胞内发 挥作用，因此，根据蛋白酶的作用部位，可将蛋白酶分为细胞内蛋白酶 ( i n t r a c e l l u l a rp r o t e a s e s ) 和细胞外蛋白酶( e x t r a c e l l u l a rp r o t e a s e s ) 。细 胞内蛋白酶的分子量一般在2 0 - 8 0 0k d a 左右，有的为单体( m o n o m e r i c ) ，有的由 亚基组成。由多个亚基组成的大的蛋白酶可能与细胞内蛋白质分解的选择和调控 有关，这种酶通常具有非蛋白质组分，如糖类和脂类；有的需要二价阳离子或其 他配体。 蛋白酶按其水解底物的部位又可分为内肽酶( e n d 。p e p t i d a s e se c 3 4 2 卜2 4 ，9 9 ) 及外肽酶( e x o p e p t i d a s e se c 3 4u 一1 9 ) ，前者水解蛋白质中间部分 的肽键，常见的有胃蛋白酶( p e p s i n s ) 、胰凝乳蛋白酶( c h y m o t r y p s i n ) 和胰蛋 白酶( t r y p s i n ) 等；后者则自蛋白质的氨基或羧基末端逐步降解氨基酸残基， 常见的如羧肽酶a 、羧肽酶b 以及胺肽酶等。内肽酶因其催化中心不同而又分为 四大类，即丝氨酸蛋白酶( s e r i n ep r o t e i n a s e s ) ，半胱氨酸蛋白酶( c y s t e i n e p r o t e i n a s e s ) ，天冬氨酸蛋白酶( a s p a r t i cp r o t e i n a s e s ) 和金属蛋白酶( m e t a l l o p r o t e i n a s e s ) ，一些未知催化机理的蛋白酶被暂时归入e c3 4 ，9 9 类 b o n da n d b u l t e r ，1 9 8 7 。丝氨酸蛋白酶的特征是在活性中心存在一个唯一的具活性的丝氨 酸侧链，其催化机制在于催化底物与丝氨酸残基的共价连接。丝氨酸蛋白酶包括 胰凝乳蛋白酶类和枯草杆菌蛋白酶类。丝氨酸蛋白酶活性可被二异丙基氟磷酸 ( d f p ，d i f p 或d i p f ) 抑制。组织蛋白酶a ，g 和r 属于丝氨酸蛋白酶。天冬氨 酸蛋白酶又被称为酸性蛋白酶类( a c i dp r o t e i n a s e s ) ，它们的活性中心是由两 个天冬氨酸残基所组成。通常认为天冬氨酸的催化为酸碱反应，而不是共价的酶 一底物中间化合物的反应方式。天冬氨酸蛋白酶可被p e p s t a t i n ( 由放线菌提取 的酰化五肽) 和重氮乙基化合物( d i a z o a c e t y lc o m p o n d ) 抑制。组织蛋白酶d 、 e 属于天冬氨酸蛋白酶 卢士英等，2 0 0 4 ：t u r ke ta 1 ，2 0 0 1 。金属蛋白酶在活 山东大学硕士学位论文 性中心含有金属离子，金属蛋白酶可被螫合剂e d t a 和l ，l o 一菲绕啉( 1 ， 1 0 p h e n a n t h r 0 1 i n e ) 抑制。半胱氨酸蛋白酶活性中心含有一个必需的半胱氨酸 残基，参与底物形成共价中间复合物。细胞的高度还原环境可能对他们的作用是 非常重要的。其可被低浓度的对羟基汞苯甲酸酯( p 一- h y d r o x y - m e r c u r i b e n z o a t e ， p h m b ) 、对氯高汞苯甲酸( 9 - c h l o r o m e r c u r i b e n z o a t e ，p c m b ) 和烷化剂如碘乙酸 ( i o d o a c e t a t e ) 、n 一乙基马来酰亚胺( n - 一e t h y l m a l e i m i d ，nem ) 抑制。 反一环氧琥珀酰一l 一自氨酰( 4 一胍基) 一丁烷 ( n 一 n 一( 1 ，3 - t r a n s c a r b o x y o x i r a n 一2 一c a r b o n y l ) 一l - l e u c y 一- a g m a t i n e ，e 一- 6 4 ) 是它的特异性抑制剂。可根据各种酶的特异性抑制剂来鉴定蛋白酶。 蛋白酶在创造生物活性分子或消除生物活性分子或肽类方面起重要作用。前 者主要包括信号和修饰酶及激活酶等，后者则包括溶酶体组织蛋白酶和a t p 一依 赖蛋白酶。蛋白酶在细胞中清除残缺、不正常多肽控制着细胞内酶和多肽的潜在 浓度，在蛋白质创造氨基酸和细胞内含物持续更新方面具有营养作用；其广泛的 蛋白水解能力允许组成细胞的蛋白质类型和数量变化，因而使细胞能通过食物、 激素和其他环境因子来适合不同需要。蛋白酶的这两种作用，使细胞内多种活动 得以实现，如细胞骨架的重组、成肌细胞融合和分化、记忆、衰老、免疫识别分 子的产生和细胞内物质的降解等。但同时蛋白酶的活性必须受到高度调控，以保 证蛋白酶参与的重要代谢过程的顺利进行。此外细胞内酶在某些疾病中具有重要 作用，如糖尿病、恶性肿瘤、肌营养不良等，并且，由于具有蛋白水解功能而在 许多生理过程中具有重要作用，如蛋白质的成熟和转运、受精、萌芽、肿瘤转移 和其他形态发生等 d ec l e r c ke ta l ，2 0 0 4 。 1 1 2 组织蛋白酶的研究进展 在众多蛋白酶中，半胱氨酸蛋白酶是一类重要的细胞内蛋白酶，参与多种生 理和病理过程，如细胞凋亡、激素的合成与分解、病毒与细菌感染以及多种神经 系统疾病，对其结构和性质已有较系统的研究 b o w n e sa n dh a r r i e s ，1 9 9 7 ： h a r a n i s h i m r ae ta 1 ，1 9 9 5 ：k a t u n u m aa n dk o m i n a m i ，1 9 9 3 ：k u m a r ，1 9 9 5 ：y u a n e ta 1 ，1 9 9 3 。该类酶含有巯基，多数具有普遍的蛋白酶活性，可参与蛋白质降 解的开始和结束。半胱氨酸蛋白酶可分为木瓜蛋白酶、i c e c e d 3 型蛋白酶类和天 冬酰胺特异性内肽酶这三个结构家族，其中木瓜蛋白酶( p a p a i n ) 家族是最大的一 个家族。木瓜蛋白酶在真核生物中存在较多，研究也较为深入。组织蛋白酶 7 山东大学硕士学位论文 ( c a t h e p s i n ，c a t h ) b ，c ，k ，l ，m ，n 和s 等属于半胱氨酸蛋白酶 b o n da n d b u l t e r ，1 9 8 7 。 组织蛋白酶通常指在酸性p h 值环境中被活化的，能够裂解肽键的溶酶体蛋 白水解酶。组织蛋白酶的一个重要功能是参与溶酶体的蛋白质水解作用，从而参 与有机体的生理活动 b a r r o se ta ，2 0 0 4 ：l a n ge a 1 ，2 0 0 4 。此外，如果 组织蛋白酶被释放到细胞外，它们可以降解细胞外基质的蛋白，从而引起病理反 应。如肿瘤细胞在发生这种反应时可以加速肿瘤细胞的迁移和扩散 d ec l e r c k8 a - ，2 0 0 4 。 组织蛋白酶广泛地存在于动植物组织中，其中对动物有机体中的组织蛋白酶 研究最多。在动物组织中，从无脊椎到脊椎动物都有组织蛋白酶的分布 a r a n i s h ie a 1 ，1 9 9 8 ：c a r n e v a l ie t 日，2 0 0 l ：m a r k sa n db e r g ，1 9 8 7 。 组织蛋白酶的生理功能也并不仅仅局限在溶酶体内降解蛋白质，一些基因敲 除小鼠( g e n ek n o c k o u tm o u s e ) 研究表明，组织蛋白酶具有对有机体的正常生 理活动非常重要的功能，而且这些功能往往与组织特异性分布的组织蛋白酶有关。 表卜1 半胱氨酸类组织蛋白酶的分布( 自b r o m m ee a 1 9 9 9 ) t a b l e1 - lt i s s u ed i s t r i b u t i o no f c y s t e i n ec a t h e p s i n s m l 船，s 持 ( m b 4 m t ( 、0 k * 崩 娃 0 拙i k 口i t 0 c a t i i q , ! ；i n # t 。3 i 1 1 ：龇i nx 1 # b d 潞mt “。黜，啦y 鼯0 茹n h d * t k 2 ”审 ” 。一0 ：t h y 群辩2 女# i “蛰h h o l t “。k 柚：j 、p b ，# t k k t u c y , 、n ) # ，t n i t y 羝4 m k e k 蛳“。_ “b * a i , i 啦to v 艇tm a ，：r t 稿i 擗瓤 i ，3 # tk 翻8 印p 粗o c b m 。k f 辔 k i d m i 采锄1 t a 、沁h 娶s 曲j ：n 、 如“，、“t y t f 擎i ：啦，l “ c 曩h # ”m “s ( 、m j ) 5 m ，n ( 。0 ：“0 f l lv c a f 站m m 书 鼯i 黜和雌“ 撕o h4 吣俐，p 蕾站f 蚋g 端砖，n 3 f t b w ；a # 也州，批# s # 诤曲o z h l 龇瓢济s ”j 咖m 艇 “蹲；似f ” o 矗 n j h ，r 移l 拙l t f ) n n ：h “e m b r y o 。t l t 蠡j ，4 、i n 矗b m “n ：抛塔 e o n 琳t 融、啦竹槲m s p ；档# ，l ? i 带b ! j 饼辟，$ # c 越每f ”o # 。x o 。 b 1 q 斑m ：y k s j 哺乳动物和人类的组织蛋白酶非常丰富，多种组织中都有组织蛋白酶的分 布。其中以c a t h b 、l 和h 的分布最为广泛，其它如c a t h f 、0 、x 和c 的分 布也较为广泛，而c a t h s 、k 、w 和v 的分布限定在一些特殊组织中( 表卜1 ) 。 组织蛋白酶不但分布广泛，而且还可以参与人体的多种生理活动。研究表明人 和哺乳动物组织蛋白酶除了能够参与蛋白质降解外，还与抗原提呈，骨质吸收， 激素加工以及个体发育和组织分化等作用相关。c a t h l 、c a t h v 、c a t h b 、 山东大学硕士学位论文 c a t h d 、c a t h f 署f l c a t h s 对免疫系统正常功能的行使作用非常重要 c h a p m a np t a 1 ，1 9 9 7 ：b r o m m eo a 1 ，1 9 9 9 。在c a t h k 缺陷的小鼠中会出 现和凰硬化症( o s t e o p e t r o s i s ) 病人同样的症状 c h a p m a ne ta 1 ，1 9 9 7 ： s a f t i ge ta 1 ，1 9 9 8 。 组织蛋白酶也参与调控哺乳动物个体发育和组织分化过程。在大鼠出生后 6 至2 5 天，c a t h l 在大脑皮层、小脑和中脑中的活性呈现出下降的趋势，而最高 酶活性出现在大鼠出生后的第6 天，说明大脑发育过程中组织蛋白酶起到了非常 重要的作用 c h e r n a y a ，2 0 0 1 。在胎牛肌肉发育过程中，c a t h b 在胎牛发育到 第8 0 至2 5 0 天的时候表现出逐渐下降的趋势，胎牛和成年牛的c a t h b 特性相同， 但成年牛肌肉中的酶活性比胎儿牛中的酶活性低5 至6 倍。实验表明成年牛组织 中酶活性的下降是由于组织蛋白酶转录水平的降低，这说明了在发育早期的组 织分化过程中，组织蛋白酶的活性变化与发育调控密切相关 b e c h e te ta 1 ，1 9 9 6 。 在其他脊椎动物如鱼类中也有组织蛋白酶分布。利用组织蛋白酶的特异性 底物测定在一种鲭鱼( s c o m b e r j a p o n i c u s ) 的肌肉中有c a t h b 的分布 a o k ie t a 1 ，2 0 0 2 ，通过荧光底物测定在一种日本鳗鱼的表皮中有c a t h l 和b 的分布 a r a n i s h ie ta ，1 9 9 8 。 两种鲈鱼中c a t h a 、b 、d 和l 等参与了胚胎和幼鱼的发育过程。在对河 鲈( p e r c af l u v i a t i l i s ) c a t h l 的测定中发现，胚胎发育过程中c a t h l 的活性 逐渐升高，到孵化后第l 天达到最高，而在孵化后第3 天开始迅速下降 c a r n e v a l i e ta 1 ，2 0 0 1 。另一种海鲈鱼( b i c e n t r a r c h u sj a b r a x ) 从受精卵到幼鱼的发 育过程中不同的组织蛋白酶表现出了不同的活性变化。随着胚胎发育到桑椹胚 阶段，c a t h b 的活性达到最高水平，c a t h a 并h c a t h l 在体节分化阶段活性最强， 而c a t h d 在孵化阶段活性最为明显。这充分说明组织蛋白酶在卵黄降解利用和幼 鱼孵化中的作用 k e s t e m o n te ta 1 ，1 9 9 9 。 除了脊椎动物，在许多无脊椎动物中也广泛地分布着各种组织蛋白酶，并 参与了诸如个体发育、变态和消化等方面的活动。在一种太平洋牡蛎 ( c t a s s o s t r e ag i g a s ) 的早期发育过程中发现，c a t h d 在发育到第1 9 天的时候 活性达到高峰，而c a t h b 的活性高峰则出现在第2 4 天，说明太平洋牡蛎的发育 受到了不同组织蛋白酶的调控 d o n a l dp a ，2 0 0 3 。用组织蛋白酶特异性 底物分析表明，在血吸虫( s c h i s t o s o m am a n s o n i ) 的发育过程中同样有着组 织蛋白酶的调控。一种3 2 k d a 的组织蛋白酶在整个发育过程中均有存在，而另一 山东大学硕士学位论文 种3 1 k d a 的组织蛋白酶则只在成虫中出现 m o n r o ya n dd r e s d e n ，1 9 9 6 。 组织蛋白酶在无脊椎动物的肠道内也有普遍的分布，参与消化是组织蛋白 酶的另一主要功能。在同样的血吸虫体内，分布在消化道中的c a t h b 帮助寄生 虫分解宿主血液中的蛋白质以供血吸虫维持生命 s a j i de ta 1 ，2 0 0 3 。c a t h b 同样赋予线虫( h a e m o n c h u sc o i l t o t t u s ) 肠道内的组织蛋白酶活 性 s h o m p o l ea n dj a s m e r ，2 0 0 1 。用特异性底物和抑制剂的方法探测到 c a t h b ；f u c a t h l 分布在骚扰锥蝽( y r i a t o g al n f e s t a n s ) 肠道内，不但与消化 有关，而且活性随着取食时间的变化而变化 k o l l i e ne ta 1 ，2 0 0 4 。 1 2 昆虫组织蛋白酶的研究进展 近百年来，许多昆虫被用来探明昆虫的各种生理机制，例如用蝗虫和蜚蠊 来阐明昆虫体内的消化、吸收和排泄的液流循环，用黄粉甲来阐明隐肾复合体 的水分盐分调节机制，用吸血蝽和天蚕蛾来阐明变态的激素调控作用，用蝗虫 和蚊子