（细胞生物学专业论文）虾夷扇贝毒素yessotoxinsytxs毒性作用的初步研究.pdf

1i 虾夷 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谓十的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 洼! 塑逡直基丝盂蔓挂型壹鳗鳆! 奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：以杉年j ，月必日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1 、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2 、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社用于出版和编入c n k i 中国知识资源总库， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 新签字方诈 签字日期：7 o 年j 月 2 日签字日期：冲年，月地日 本论文所用缩略语 a s p , a m n e s i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g 记忆缺失性贝毒 a z p ，a z a s p i r a c i d 原多甲藻酸毒素 b t x ，b r e v e t o x i n 裸甲藻毒素 c a m p , c y c l i ca d e n o s i n em o n o p h o s p h a t e 环一磷酸腺苷 c c m p , t h ep r o v a s o l i g u i l l a r dn a t i o n a lc e n t e rf o rc u l t u r eo fm a r i n ep h y t o p l a n k t o n 美国浮游生物研究中心 c f p , c i g u a t e r af i s hp o i s o n i n g 西加鱼毒 c t x ，c i g u a t o x i n 西加鱼毒素 d a ，d o m o i ca c i d 软骨藻酸 d a g , d i a c y l g l y c e r o l 甘油二酯 d m s o ：d i m e t h y ls u l p h o x i d e 二甲基亚砜 d s p , d i a r r h e i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g 腹泻型中毒 d t x ，d i n o p h y s i st o x i n s 鳍藻毒素 e g f , e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r 表皮生长因子 e g t a ，e t h y l e n eg l y c o lt e t r a a c e t i ca c i d 乙二醇二乙醚二胺四乙酸 e l i s a ，e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附测定法 f c s ，f e t a lc a l fs e r u m 胎牛血清 f g f , f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r 成纤维细胞生长因子 g y m ，g y m n o d i m i n e 米氏裸甲藻毒素 h p l c ，h i 曲一p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 i p 3 ，i n o s i t o l1 , 4 ，5 一t r i s p h o s p h a t e 三磷酸肌醇 i s e l ，i ns i t ue n d l a b e l i n g 原位末端检测技术 l c - m s m s ，l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y 液质串联色谱 l s c m ，a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y 激光扫描共聚焦显微镜 m b a ，m o u s eb i o a s s a y 小鼠生物毒性分析 m t t ，3 一( 4 ，5 一d i m e t h y l t h i a z o l - 2 一y 1 ) 一2 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e 3 ( 4 ，5 二甲基噻 唑，2 ) 2 ，5 二苯基四氮唑溴盐 因子 s p e c t r o m e t r y 超高效液相 虾夷扇贝毒素( y e s s o t o x i n s ，y t x s ) 毒性作用的初步研究 摘要 虾夷扇贝毒素( y e s s o t o x i n s ，y t x s ) 是近年来在海产品质量监测方面颇受 关注的一种聚醚类赤潮藻类毒素，它能在贝类体内累积进而对人类健康造成威 胁。目前针对y t x $ 的毒性作用在国际上展开了很多相关的研究，但是尚未得出 较为明确的结论。其毒性作用过程尚未完全清楚。 近两年来，在我国贝类样品中检测到y t x s 存在，但是国内关于这种毒素的 研究尚未见报道。 本论文主要是通过体内、体外实验对y t x 在个体水平、组织水平和细胞水 平的毒性作用进行研究，并对其作用的可能机制进行分析，主要结果如下： 1 通过组织学和免疫学方法对y t x 的神经毒性作用进行研究，发现y t x 可以使雌性i c r 小鼠小脑浦肯野细胞发生明显的组织学变化。s 1 0 0 抗体的特异 性免疫染色发现，y t x 处理组小脑浦肯野细胞的s 1 0 0 表达量增多，而s 一1 0 0 又是一种钙结合蛋白，因此y t x 的作用可能与钙离子浓度相关。 2 对三株产y t x s 的甲藻一一网状原角藻( p r o t o c e r a t i u mr e t i c u l a t u m , c c m p 2 7 7 6 ) 、多边舌甲藻( l i n g u l o d i n i u mp o l y e d r u m ，c c m p l 9 3 1 ) 以及具刺膝 沟藻( g o n y a u l a x 印砌咖r o t ，c c m p 4 0 9 ) 产物进行l c - m s m s 分析，发现几种甲 藻均产y t x 、h o m o y t x 、4 5 一o h y t x ，但是产毒能力不强，各藻种y t x 产量 低于已有报道。而pr e t i c u l a t u m 所产毒素物质最多，且其中h o m o y t x 产量最 高，达到2 8 8 p g c e l l 。 3 将y t x 与人类的三种细胞系肝细胞h l 7 7 0 2 、肝癌细胞b e l 7 4 0 2 及 h e l a 细胞进行孵育，通过光学显微镜观察、h o e c h s t 3 3 3 4 2 p i 双染色、d n a 琼脂 糖凝胶电泳等方法，同时对细胞内c a s p a s e3 酶活力进行分析，发现y t x 及藻毒 粗提液能使三种细胞发生凋亡。另外，利用流式细胞术对细胞内线粒体膜电位及 胞 细 而 能 离 p r e l i m i n a r ys t u d yo n t h et o x i c i t yo fy e s s o t o x i n s ( y t x s ) a b s t r a c t y e s s o t o x i n ( y r x ) a n d i t sa n a l o g u e sa r ed i s u l f a t e dp o l y e t h e rc o m p o u n d sw h i c h h a v eb e e nc o n c e r n e dm o r ei ns e a f o o dq u a l i t ym o n i t o r i n ga n ds h e l l f i s hi n d u s t r i e s r e c e n t l y t h e ym a y a c c u m u l a t ei ns h e l l f i s ha n db e c o m eah e a l t hc o n c e r nf o rh u m a n c o n s u m e r s m a n ys t u d i e so nt h et o x i c i t yo f y t x s h a db e e nc a r r i e do u t ，b u tt h er e s u l t s s h o w e da p p a r e n td i s c r e p a n c i e s j u s tt h e s ed i s c r e p a n c i e sh a v ee n c o u r a g e dm a n y r e s e a r c h e r st os t u d yt h em e c h a n i s mb yw h i c hy t x e x e r t si t sa c t i o n h o w e v e r ，t h e p r o c e s ss t i l lr e m a i n sl a r g e l yu n c l e a r y t x sw e r ed e t e c t e di ns h e l l f i s hi nc h i n ar e c e n tt w oy e a r s ，b u tt h e r ew a s n or e p o r t o fa n yr e s e a r c ho ni ty e ti nc h i n a t h i st h e s i sa i m st os t u d yt h et o x i c i t yo fy t x sb ym e t h o d si nv i v oa n d i nv i t r o t h e ni t sp o s s i b l ea c t i o nm e c h a n i s mw i l lb ea n a l y z e da sw e l l t h em a i n r e s u l t sa r ea s f o l l o w s ： ( 1 ) t h et o x i c i t yo fy t x s t a n d a r do nn e r v et i s s u ew a ss t u d i e da tf i r s tu s i n g h i s t o l o g i c a la n di m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o d s t h e r e s u l ts h o w so b v i o u s m o r p h o l o g i c a lc h a n g e so fp u r k i n j ic e l l si nc e r e b e l l a t i s s u eo ff e m a l ei c rm i c e ，s u c h a ss h r i n k a g e ，d e e ps t a i n i n go fc y t o p l a s m ，n o n m o t t l e dn i s s l sb o d ya n d s oo n a c c o r d i n gt ot h ei m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n go fc a l c i u mb i n d i n gp r o t e i n s 10 0 ， t h e r ei sam o r ep o s i t i v er e s p o n s et oy t x i nt e s tg r o u pt h a nc o n t r o lg r o u p i ts e e m s t h a ty t xi n d u c e st h ei n c r e a s eo fc a l c u i mc o n c e n t r a t i o ni np u r k i n j ic e l l so f m i c e c e r e b e l l u m t h et o x i c i t yo f y t xm i g h tb er e l a t e dt ot h ec h a n g eo fc a l c i u m c o n c e n t r a t i o n v ( 2 ) p r o l o c e r a t i u mr e t i c u l a t u m ，l i n g u l o d i n i u mp o l y e d r u m ，g o n y a u l a xs p i n i f e r a w e r em a i np r o d u c e ro fy t x sa n dt h e s es t r a i n sw e r ep u r c h a s e df r o mc c m p f o rt h i s s t u d y t h eg r o w t hc u r v eo fe a c hs t r a i nw a s o b t a i n e db yc u l t u r i n ga n dt h ep r o d u c t i o n w a se x t r a c t e db ym e t h a n 0 1 t h ei n g r e d i e n t si ne x t r a c t i v eo fe a c hs t a i nw e r ea n a l y z e d b yl c - m s m s t h er e s u l ts h o w st h a ta l lt h e s et h r e es t r a i n sc a np r o d u c ey t x ， h o m o y i xa n d4 5 o h y i ) ( b u tt h ec o n c e n t r a t i o no fy i sl o w e rt h a nt 1 1 0 s e r e p o r t e di n t h ew o r l d t h es t r a i no f p r o t o c e r a t i u mr e t i c u l a t u mc a np r o d u c em u c h m o r et o x i n st h a na n yo t h e rs t r a i n sa n dc a np r o d u c em u c hm o l eh o m o y t x ( 2 8 8 p g c e l l 。) t h a no t h e ra n a l o g s s ot h ep r o t o c e r a t i u m r e t i c u l a t u me x t r a c tw a su s e di n t h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n t si no r d e rt os t u d yt h ec y t o t o x i c i t yo fy t x s w e l l ( 3 ) t oi n v e s t i g a t et h ea p o p t o s i si n d u c e db yy t x o rt h ep r o t o c e r a t i u mr e t i c u l a t u m e x t r a c to nh u m a nl i v e rc e l ll i n eh l 7 7 0 2 ，h e p a t o m ac a r c i n o m ac e l ll i n eb e l 7 4 0 2a n d h e l ac e l ll i n e ，t h em e t h o d so fo p t i c a lm i c r o s c o p y , h o e c h s t 3 3 3 4 2 p r o p i d i n ei o d i d e s t a i n i n g ，d n ag e le l e c t r o p h o l e s i sw e r eu s e da n dt h ea c t i v i t yo fc a s p a s e3 w a s a n a l y z e d t h er e s u l ts h o w s t h a tn o to n l yy t xb u ta l s ot h ee x t r a c tc a ni n d u c e a p o p t o s i si na l lt h e s et h r e ek i n d so fc e l l s m e a n w h i l e ，f l o wc y t o m e t r yw a s a l s ou s e dt o i n v e s t i g a t ec h a n g e so fm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a la n d c a l c i u mc o n c e n t r a t i o n t h et o x i nc a nr e d u c et h em i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a la n dm a k ec a l c i u m c o n c e n t r a t i o ni nc e l l sr i s i n g ( 4 ) t h ee x a c tc h a n g e so fc a l c i u mc o n c e n t r a t i o ni n s i d et h e s et h r e el i n e so f c e l l s c a u s e db yy 下xo rt h ee x t r a c tw e r ea n a l y z e du s i n gl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y ( l s c m ) i ti ss h o w e d t h a ty t xa n dt h ee x t r a c tc a ni n d u c et h er i s eo fc a l c i u m c o n c e n t r a t i o ni nc e l l sa n dt h ec h a n g ec a nb ep r e v e n t e db yn i f e d i p i n ea n de g t a t h e r em u s tb es o m er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ea c t i o nm e c h a n i s mo fy t x sa n dc a l c i u m s i g n a lc h a n n e l y t x sc a ni n d u c ec a l c i u me n t r yi nt h e s ec e l l s k e yw o r d s ：y e s s o t o x i n s ；t o x i c i t y ；a p o p t o s i s ；m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l ； c a l c i u mc o n c e n t r a t i o n 目录 目录i 1 文献综述1 1 1 赤潮藻类毒素简介1 1 2 赤潮藻类毒素的检测方法5 1 3 毒理学研究方法概述7 1 4 细胞毒性研究的技术与方法8 1 4 1 细胞存活率的测定。9 1 4 2 细胞凋亡的检测1 0 1 5 虾夷扇贝毒素( y e s s o t o x i n s ，y t x s ) 研究概况1 3 1 5 1y t x s 简介1 3 1 5 2y t x s 的生物来源及分布1 3 1 5 3y t x 及其衍生物的结构特征1 7 1 5 4y t x s 的毒性作用研究进展2 1 1 5 5y t x s 的检测及定量方法_ 2 3 1 5 6 我国y t x s 的研究现状一2 6 1 6 本论文的研究目的与意义2 7 2 虾夷扇贝毒素标准物质y t x 对小鼠小脑浦肯野细胞的影响2 9 2 1 材料和方法一3 1 2 1 - l 实验材料3 1 2 1 2 实验方法一3 1 2 2 实验结果3 3 2 2 1 行为观察：3 3 2 2 2 组织学染色结果：一3 3 2 2 3s 10 0 免疫组化染色结果：3 5 2 3 分析讨论3 5 3 几种产y t x s 甲藻的培养及产物分析3 7 3 1 材料和方法：一3 9 3 1 1 实验材料一3 9 i 3 1 2 实验方法3 9 3 2 实验结果4 2 3 2 1 藻种生长曲线4 2 3 2 2 藻毒粗提液l c m s m s 分析4 4 3 3 分析讨论4 8 4 虾夷扇贝毒素对体外培养肝细胞h l 7 7 0 2 、肝癌细胞b e l 7 4 0 2 以及h e l a 细胞的凋亡诱导作 j j f j ：! ；( ) 4 1 材料和方法5 3 4 1 1 实验材料5 3 4 1 2 实验方法5 4 4 2 实验结果。5 7 4 2 1 虾夷扇贝毒素对肝细胞h l 7 7 0 2 的凋亡诱导作用5 7 4 2 2 虾夷扇贝毒素对肝癌细胞b e l 7 4 0 2 的凋亡诱导作用“ 4 2 3 虾夷扇贝毒素对宫颈癌细胞h e l a 的凋亡诱导作用7 0 4 3 分析讨论7 6 5 虾夷扇贝毒素对体外培养肝细胞h l 7 7 0 2 、肝癌细胞b e l 7 4 0 2 以及h d a 细胞胞内c a 2 + 的影 响8 ( ) 5 1 材料与方法8 3 5 1 1 实验材料8 3 5 1 2 实验方法8 3 5 2 实验结果8 4 5 2 1 虾夷扇贝毒素对肝细胞h l 7 7 0 2 细胞内钙离子浓度的影响8 4 5 2 2 虾夷扇贝毒素对肝癌细胞b e i 7 4 0 2 细胞内钙离子浓度的影响8 8 5 2 1 虾夷扇贝毒素对h e l a 细胞内钙离子浓度的影响一9 3 5 3 分析讨论9 7 6 总结1o o 参考文献10 4 攻读博士期间发表的文章：1 1 5 致谢116 中国海洋大学博士学位论文 1 文献综述 1 1 赤潮藻类毒素简介 赤潮，是海洋中的浮游藻类、原生动物或细菌在一定的环境条件下爆发性繁 殖或聚集从而发生的一种生态异常现象，有些甚至严重危害生态系统健康。 那些有毒的或者能导致危害的赤潮被称为为有害藻华( h a r m f u la l g a l b l o o m s ， l 蝎) 或者有害赤潮( h a r m f u lr e dt i d e s ，h i 汀) 。目前，有害藻华( 有 害赤潮) 已成为了当今全球海洋灾害之一，引起国际社会各研究机构的高度关注。 据统计，海洋中可以产生毒素的藻类约有9 0 种，其中甲藻约7 0 种。这一数 目随着对赤潮的研究，有毒藻类的数目很有可能继续增加。赤潮藻类毒素主要是 海洋中的浮游生物所产生的一类生物活性物质，由于一开始人们不知道毒素的真 正来源，因此根据引起人们中毒的是何种海洋生物而将这些毒素定义为贝毒、鱼 毒。 目前已知的能通过鱼类、贝类对消费者造成影响和危害的赤潮藻类毒素主要 有以下几种：麻痹性贝毒( p a r a l y t i c s h e l l f i s hp o i s o n i n g ，p s p ) 、腹泻性贝毒 ( d i a r r h e t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，d s p ) 、记忆缺失性贝毒( a m n e s i cs h e l l f i s h p o i s o n i n g ，a s p ) 、神经性贝毒( n e u r o l o g i c a ls h e l l f i s hp o i s o n i n g ，n s p ) 和西加鱼 毒( c i g u a t e r af i s hp o i s o n i n g ，c f p ) ( u s f d a ，19 9 8 ) 。 能够产生这几种主要毒素的赤潮藻类如表1 1 所示。 表1 1 各种藻类毒素的生物来源及中毒症状( 周宏农，1 9 9 9 ) t a b l e1 - 1t h eb i o l o g i c a ls o u r c ea n dp o i s o n i n gs y m p t o mo fa l g a et o x i n s 毒素种类赤潮藻种 中毒症状 p s pa l e x a n d r i u ms p p 食用染毒水产品3 0 r a i n 后，嘴巴和舌头会开始出现 a a n d e r s o i ； 刺痛麻痹的感觉，逐渐延伸到面部、颈部甚至指尖： a a n g u s t i t a b u l a t u m ； 引发头痛、晕眩、恶心、呕吐、腹泻等症状。严重 彳? p 脑。 时，能够引起明显的肌肉麻痹，呼吸困难，出现哽 彳警甜妨塞窒息的感觉，甚至会造成因呼吸麻痹而2 4 h 死亡 a m 伽u t u m 一一一。 a t a m i y a v a n i c h i 的事件 g y m n o d i n i u m p y r o d i n i u m d s p d i n o p h y s i ss p p 食用染毒水产品3 0 r a i n 后，出现腹泻、作呕、呕吐、 n a c u t a ； 腹部疼痛、寒战等现象。长期感染能引发消化系统 na c u m i n a t e ； 恶性肿瘤，但无死亡案例发生。 d f o r t i i ； d m i t r a ；+ p r o r o c e n t r u ms p p a s pp s e u d o n i t z s c h i as p p 食用染毒水产品3 5 小时后，会出现作呕、呕吐、 p s a u s t r a l i s ； 腹泻以及腹部绞痛等症状。严重时，能引起面部扭 p s m u l t i s e r i e s ； 曲、晕眩、幻觉、短期失忆和呼吸困难，甚至能导 p s p s e 埘b a e i i c 谢s s i m n 致死亡， n s pk a r e n i ab r e v e 食用染毒水产品3 5 小时内，脸部刺痛，并蔓延到 全身，头痛、冷颤、腹泻物理，肌肉关节疼痛，严 重时，会冷热感倒错、瞳孔放大视觉重叠，甚至说 c f p a m p h i d i n i u ms p p 食用染毒鱼类1 2 2 4 h 内发作，会有腹痛、腹泻、 彳c a r t e r a e ； 呕吐、头晕、手脚肌肉麻痹刺痛的感觉。中毒严重 a k l e b s i i ； 时会冷热感倒错，平衡协调能力障碍，心跳、血压 g a m b & r d i s c 淞7 伽i c u s ； 下降，偶尔会因呼吸困难导致死亡。 2 中国海洋大学博士学位论文 表1 1 中多种藻类在我国沿海亦有分布，如塔玛亚历山大藻( a l e x a n d r i u m t a m a r e n s e ) 、微小亚历山大藻( a l e x a n d r i u mm i n u t u m ) 、短凯伦藻( k a r e n i ab r e v i e ) 等，并且引发过赤潮事件，进而造成相应的中毒事件。1 9 6 7 1 9 7 9 的几十年间， 浙江沿海宁波、舟山海域，相继发生因食用织纹螺( n a s s a r i u ss p ) 而引起的中 毒事件共4 0 起，造成4 2 3 人中毒、2 3 人死亡( 符锡春，1 9 8 2 ) ：而1 9 9 1 1 9 9 5 年间，连云港市也发生过4 起食用染毒荔枝螺中毒事件，其中共有5 人死亡( 赵 文彬等，1 9 9 7 ) 。我国是海洋水产养殖大国，尤其是扇贝、牡蛎等养殖，产量居 世界首位。由于我国近海生态环境的不断恶化，沿海一带频繁发生的赤潮，一些 有毒有害藻种不断被发现，局部海域贝类体中毒素沾污严重。2 0 0 6 年秋季调查 结果表明，仅腹泻性贝毒在全国沿海2 3 7 个贝类样品中，检出率为7 1 3 1 ，呈 现出由北至南增高的趋势，渤海检出率为3 0 5 6 ，平均含量0 0 3m u g ；黄海 检出率为6 8 6 9 ，平均含量0 0 6m v g ；东海检出率为8 1 8 2 ，平均含量0 0 7 m u g ；南海检出率为9 3 1 0 ，平均含量o 0 8m u g 。贝毒污染限制了我国贝类 等水产品出口，危害食用者生命安全，不利于海水养殖业的健康持续发展。因此 迫切需要对加强对赤潮藻类毒素物质的研究，揭示这些毒素物质的毒性特征及作 用机制。 麻痹性贝毒( p s p ) 是一种四氢嘌呤毒素。主要是由甲藻中的亚历山大藻属 ( a l e x a n d r i u m ) 产生。主要中毒症状就是面部、四肢麻木，严重时可以造成呼 吸肌麻痹而导致窒息死亡。p s p 的主要活性成分是石房蛤毒素( s a x i t o x i n s t x ) 及其衍生物，最早是从阿拉斯加奶油蚌( s a x i d o m u sg i g a n t e u s ) 中分离得到，因 此以其命名( s c h a n t ze ta 1 ，1 9 5 7 ) 。p s p 的毒性作用机制主要是阻断钠离子经过 n a + 通道进入细胞膜，进而影响神经传导，造成人类中毒( k a o ，1 9 9 3 ) 。 腹泻性贝毒( d s p ) 主要来源于甲藻中的鳍藻属( d i n o p h y s i s ) 和原甲藻属 ( p r o r o c e n t r u m ) 藻类( v i v i a n i ，1 9 9 2 ) ，是一系列热稳定性较好的脂溶性聚醚 类化合物。其中最常见的就是大田软海绵酸( o k a d a i ca c i d ，o a ) 及其衍生出的鳍 藻毒素( d i n o p h y s i s t o x i n s ，d t x s ) 。d s p 毒素能够使食用者腹泻、呕吐，不像 p s p 那样具有强烈的急性毒性作用。d s p 的毒性作用机制主要是通过抑制蛋白磷 酸酶1 和蛋白磷酸酶2 a 的活性，使得蛋白质过磷酸化，从而影响生物的生理机 能，o a 由于可以诱导蛋白质发生超磷酸化作用以及增生基因的表达，因而具有 3 虾夷扇贝毒素( y e s s o t o x i n s ，y t x s ) 毒性作用的初步研究 强致癌作用。 记忆缺失性贝毒( a s p ) 的主要成分是软骨藻酸( d o m o i ca c i d ，d a ) ，是一 类氨基酸类活性物质，最早从红藻属的树状软骨藻c h o n d r i aa r m a t a 分离得到， 因此得名。d a 是谷氨酸的异构体结构，能和谷氨酸受体结合，从而作用于兴奋 性氨基酸受体和突触传递介质。这类物质可以与控制细胞膜n a + 通道的神经递质 谷氨酸受体特异性结合，提高c a 2 + 的通透性，导致细胞长时间处于兴奋状态而死 亡( h a m p s o n ，1 9 9 2 ) 。由于d a 的存在能引起中枢神经系统与记忆有关的区域 如海马区、丘脑区损伤，因而能引起记忆力丧失( t r y p h o n a se ta 1 ，1 9 9 0 ) 、。 引起神经性贝毒( n s p ) 的赤潮甲藻多属多为裸甲藻属g y m n o d i n i u m 或一些 环沟藻属g y r o d i n i u m 。n s p 的主要活性物质是短裸甲藻毒素( b r e v e t o x i n s ， b t x s ) ，由裸甲藻属的短凯伦藻( k a r e n i ab r e v i e ) 产生。b t x s 是一类脂溶性的 环状聚醚类化合物，耐酸耐热，能与n a + 通道上的5 位点牢固结合，使离子通道 激活进而增强n 矿内流，与p s p 有互相拮抗的作用( b i d a r d ，1 9 8 4 ) 。 西加鱼毒素( c f p ) 是热带海洋珊瑚礁鱼群常累积的一种毒素，也是主要由 有毒甲藻生成的一种有毒活性物质。主要包括脂溶性的西加毒素( c i g u a t o x i n s ， c t x s ) 及水溶性的刺尾鱼毒素( m a i t o t o x i n ，m t x ) 、水螅毒素( p a l y t o x i n ) 两 大类。c t x s 是一种强神经毒素，主要作用于n a + 通道上的5 位点，作用机制与 b t x s 相似，因此与b t x s 共同作用时竞争结合受体( y a s u m o t o ，1 9 9 5 ) 。m t x 主要作用于电压门控c a 2 + 通道，增强c a 2 + 的渗j 藿性( m u r a t a ，1 9 9 1 ) 。 近十年来，其他还有一些的藻类毒素或存在在水产品中的毒素陆续被发现， 如原多甲藻酸毒素( a z a s p i r a c i d ，a z p ) 、螺环内酯毒素( s p i r o l i d et o x i n s ) 、米 氏裸甲藻毒素( g y m n o d i m i n e ，g y m ) 等。本论文的主要研究对象虾夷扇贝毒素 ( y e s s o t o x i n s ，y t x s ) 曾经也被分类为d s p 毒素，后来因为其作用与d s p 毒素 完全不同，因此2 0 0 2 年从d s p 中独立出来单独作为一类毒素存在( e c ，2 0 0 2 ) 。 4 中国海洋大学博士学位论文 1 2 赤潮藻类毒素的检测方法 近年来，各滨海国家食用海洋贝类中毒患病事件屡有发生。赤潮藻类毒素的 危害引起了各国政府的重视，许多国家相继建立了海产品的毒素检测，并对赤潮 藻类毒素的检测方法进行了很多研究。目前各国贝毒素检测方法主要有以下几 种： 1 小鼠生物毒性分析法( m o u s eb i o a s s a y ，m b a ) ：生物毒性分析最早建立于 北美国家，利用小鼠腹腔注射赤潮藻类毒素物质，通过测定注射后到死亡的时间 来确定毒性的大小。该方法经a s s o c i a t i o no f o f f i c i a la n a l y t i c a lc h e m i s t s ( a o a c ) 制定标准操作而成为目前普遍接受的经典赤潮藻类毒素检测方法。该方法的原理 是采用适宜的方法提取对不同种类赤潮藻类毒素，然后向固定品系和体重的小鼠 腹腔注射毒素提取液，通过记录小鼠的存活时间来计算样品毒素的毒性。毒性大 小以小鼠单位( m u ) 表示。由于藻类毒素种类及结构存在差异，因此对不同毒素1 m u 代表的意义也略有不同：如对p s p ，1 m u 表示使体重2 0 9 的雄性小鼠1 5m i n 致死的剂量，而对d s p 则表示2 4h 内造成小鼠死亡的剂量。小鼠生物毒性分析 法适用于所有赤潮藻类毒素的检测，但对脂溶性的d s p 类毒素物质，样品提取 液中所存在的游离脂肪酸将造成检测结果出现假阳性的现象。虽然小鼠生物毒性 分析法作为普遍使用的经典毒素检测方法，具有可靠性强、使用广泛、历史数据 丰富、能表达出样品中实际毒性、不需复杂设备等优点；但也有一些不可忽视的 缺点，如不够灵敏、假阳性高、准确性和重现性差、不能断定个体毒素成分、操 作要求较高技巧、对试验动物的种系及体重要求苛刻等。 2 高效液相色谱分析法( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) ： 与生物分析法相比，h p l c 方法具有灵敏性高、准确性强、使用广泛、校正容易、 能确定各种毒素成分、所需检测样品量少等优点。不同的赤潮藻类毒素物质所采 用的h p l c 方法不同。如p s p 类毒素物质h p l c 方法原理是：通过氧化剂将样 品提取液中的毒素物质柱前或者柱后衍生转化成可发荧光的衍生物质，进而被荧 光检测器检测，这样减少了人工操作，简化了操作步骤。d s p 类毒素物质的h p l c 检测主要将荧光物质与毒素分子上的羧基反应生成强荧光性物质，经柱分离后荧 光检测。h p l c 对赤潮藻类毒素分析最成功的是对a s p 类毒素物质中的d a 的 虾夷扇贝毒素( y e s s o t o x i n s ，y t x s ) 毒性作用的初步研究 分析。在一般条件下，h p l c u v 即可使d a 及其衍生物得以分离并有效检测， 因此该方法被许多国家制定为标准方法对毒素物质加以检测。此外，也相应建立 了h p l c 对n s p 、c f p 等毒素物质的检测方法。虽然该方法优点突出，但该方 法需昂贵的设备及高素质的操作人员：测定的不同化合物( 包括同分异构体) 需 要对应的标准物质分别测定；毒素标准品价格昂贵；样品前处理要求较高；不能 同时检测大量样品等缺点也限制了其在基层的普及应用。 3 酶联免疫吸附测定法( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) ：日 本于2 0 世纪9 0 年代初率先研制出检测d s p 类毒素物质主要毒素o a 的竞争 e l i s a 免疫试剂盒。该试剂盒的原理是以细胞融合杂交瘤