（细胞生物学专业论文）集缩素smc蛋白对染色体集缩的影响.pdf

摘要 在细胞增殖过程中，染色质集缩是细胞分裂得以正常进行的重要条件，也是后期姊 妹染色单体分离的序曲。染色体结构维持蛋白( s m c 蛋白，s 仃u c t i l m lm a m e n a i l c eo f c h r o m o s o m ep m t e i n s ) 是2 0 世纪9 0 年代初发现的一类蛋白，它由两个s m c 亚基和三个 非s m c 亚基组成，是染色质的构成部分，参与有丝分裂染色体集缩和分离。为了进一 步研究集缩素对染色体集缩的影响，本实验建立起以g f p 为标记的真核表达质粒共转 染体系，利用实验室已有的特异干涉集缩素s m c 亚基的r n a i 质粒r h e 和r h c ，采 用r n a i 技术分别下调h e l a 细胞中s m c 亚基h c a p e 和h c a p c 的表达量。结果发现 在细胞内其它蛋白水平不变，只有集缩素s m c 亚基表达量被降低的情况下，细胞内染 色质集缩出现异常，细胞分裂不完全，表现为细胞多核现象和细胞间的染色质桥现象。 这些结果证明集缩素的两个s m c 蛋白亚基在染色质集缩为染色体的过程中，同时发挥 重要作用，缺一不可，是染色体正常集缩必不可少的蛋白。本实验首次利用共转染体系 及r n a 干涉技术对人类集缩素s m c 亚基进行研究，具有重要的生物学意义。我们得到 的结果为深入探讨集缩素在染色体集缩过程中的作用机制以及染色体的集缩机制的研 究提供了有价值的信息。 关键词：集缩素；s m c 亚基；共转染；r n a i ；染色体集缩 a b s t r a c t c h r o m o s o m ec o n d e n s a t i o ni sas i 卿f i c a n tp r o c e s so fc e l l 埘i u l t i p l i c a t i o na n do c c u r sa sa p f e l u d et os i s t e rc l l l o m a t i ds e 野e g a t i o nm a ti i l i t i a t e sa tt 1 1 e o n s e to fa 1 1 印h a s e s t n j c t u r a l m a i n t e n a n c eo fc l 啪m o s o m ep r o t e i i l s ，f 0 衄e db yt 、7 i r os m cs u b u i l i t sa n dt h r e en o n - s m c s u b u i l i t s ，w 舔d i s c o v e r e di i lt h e19 9 0 s n si n t e r g 硼to fc 1 1 i o m o s o m ea i l dt a k e sp a ni i l c h r o m o s o m ec o n d e n s a t i o na 1 1 dc l l i o m a t i ds e g r e g a t i o n w i t ht l l ep u r p o s eo f 向r t h e rs t u d yo f t h ei n n u e n c eo fc o n d e n s i nt oc i 啪m o s o m ec o n d e n s a t i o n ，w es e tu pt l l ee u k a r ) ，o t i ce x p r e s s i o n p l a s m i dc o t r a n s f e c t i o ns y s t e mw l l i c hi st a g g e db yg f p w e u s et h er n a ip l a s m i d sr h e 钺l d r h cw 1 1 i c ha r ec o n s t m c t e di no u r1 a b o r a t o r va i l di d i o i n t e 疵r em es m cs u b u i l i t so f c e n d e n s i nt ok n o c kd o w 1 1t h eq u a n t 蛔o f h c a p ea n d h c a p co fh e l ab yr n a it e c h l l i c w e f i n dt h a tc 1 1 r o m o s o m ec o n d e n s a t i o ni se x c 印t i o n a l ，c e l ld i v i s i o ni si m c o m p l e t e l y ，c l l r d m a t i n b r i d g ea p p e a r a n ti nt h ec e l l sa n da l s os o m ec e u sw h i c hh a v em o r et h a no n e 肌c l e u sa p p e a r w h e nt h es m cp r o t e i ne x p r e s s i o ni sk n o c kd o w n ，b u to t h e rp r o t e i n sa r ec o n s t a m t h e s e c o n s e q u e n c e sp r o v et h a tt h et w os m c s u b u n i t sp l a yi n l p o n a i l tr o l e si nt h ep r o c e s so f c h r o m o s o m ec o n d e n s a t i o n ，n o tas i l l 9 1 eo n e c a nb eo m i t t e d ，t h e ya r em ei n d i s p e n s a b l ep r o t e i n t oc l u - o m o s o m ec o n d e n s a t i o n t l l i se x p e r i m e n th a se s s e n t i a lb i o l o g ys i g n i f i c a n c et h a tw ef i r s t a d o p tt h ec o t 姗s f e c t i o ns y s t e ma n dr n a it e c l u l i ct os t u d yt h eh 咖m a nc o n d e n s i ns m c s u b u n i t si nt h i se x p e r i m e n t t h ec o n s e q u e n c e sw eg e tp r o v i d ev a l u a ：b l ei n f o m a c i o n sf o rm e d e e p l ys t u d yo ft h em e c h a m s m so fc 1 1 1 o m o s o m ec o n d e n s a t i o na 1 1 dt h ec o n d e n s i nw h i c ht a k e s p a r ti nc l l i o m o s o m ec o n d e n s a t i o n k e y w o r d s ：c o n d e n s i l l ；s m c s u b u i l i t ；c o 觚l s f e c t i o n ；r n m ；c l 啪m o s o m ec o n d e n s a t i o n l i 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所 取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：乏銎丕珏虹日期：二礁塑压业 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学 位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全 文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版 发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：重边氍辞 日 期：墨占札 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导撕签名：盗缝 日期：艘丛丛! 至乡 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 引言 1 8 7 9 年，w f l e 衄i n g 提出了染色质这一术语，用以描述细胞核中能对碱性染料强烈 着色的物质。1 8 8 8 年，w a l d e y e r 正式提出染色体的概念，用以描述有丝分裂时细胞内容 易被染色的棒状结构。真核细胞的染色质( 体) 位于细胞核中，主要由d n a 和蛋白质组 成，是遗传物质的载体。有丝分裂是真核细胞自身增殖的方式，一个细胞周期可以简单 分为分裂间期和分裂期。染色质和染色体就是同一物质在细胞周期的不同时期的两种存 在形式【1 】。染色质存在于分裂间期的细胞核中，呈松散的纤维状；进入分裂期后，染色 质纤维逐渐集缩为短粗棒状的染色体。染色质向染色体状态的改变保证了母细胞的遗传 物质能在有丝分裂后平均分配到两个子细胞中去。因此，研究染色质集缩成染色体的过 程是十分必要的。 近年来，细胞学中将调亡细胞中观察到的染色质团描述为“集缩的”。但是，过去十 年的研究提供的证据证明这些集缩结构是一些不同的实体。因此我们将有丝分裂染色体 集缩当成问期染色质变构为杆状有丝分裂结构的过程，并将它与其他种类的集缩区分开 来。染色质经过松散改组和集缩构成染色体。这并不是线性d n a 分子的简单压缩过程【2 】。 首先，染色质纤维松散改组成染色线，并形成松弛的染色体轮廓；之后进入染色体的集 缩阶段。染色体集缩有助于消除姊妹染色单体间或相邻的非同源染色体间的缠结。其次， 间期染色质呈伸展状态，染色体集缩可以充分压缩间期染色质，使间期染色质的长度缩 短，在有丝分裂中能够正常分离，否则这些未集缩的染色质将不可能分开或者在分裂时 发生断裂【3 】。但目前对于染色体集缩的机制还不清楚，各种研究表明，到目前为止，可 能参与染色质集缩成染色体这一过程的蛋白主要有：组蛋白、染色体集缩调节物l ( r c c l ) 、d n a 拓扑异构酶i i ( t 0 p 0i i ) 和染色体结构维持蛋白( s m c 蛋白) 等。本文 主要围绕染色体结构蛋白在染色体集缩过程中的功能进行研究。 一、d n a 拓扑异构酶| l ( t o p o i i ) t o p o i i 是细胞核骨架的主要蛋白质成分，它是一种a t p 依赖型d n a 穿越酶，可以在 d n a 的一条链上产生切口，使另一条链得以穿过，然后填补切口1 4 j 。所有的真核生物都 有至少一种t o p o i i ；脊椎动物有两种亚型：t o p o l l 0 【和t o p o i i b ，它们在体外具有相同的催化 活性但是它们在体内的定位模式不同。t 0 p o i i p 在有丝分裂中多转移到细胞质中，与染色 体结合的非常少。而t 0 p o l l 0 【则相对稳定，无论是否发生有丝分裂，染色体上结合的 t o p o i i a 数量都很少发生变化【5 | 。 染色体上t o p o i i 的数量在细胞周期不同时期发生变化，在前中期最多，在末期后最 少【6 】。两型t o p o i i 离开染色体，一种在染色单体分离后离开，另一种在有丝分裂完成后 离开。人们发现在很多动物细胞及组织中，t o p o i i 聚集于着丝粒处。用药物抑制t o p o i i 的活性会引起染色体着丝粒和着丝点的缺失同时会激活有丝分裂纺锤体的检查位点。而 东北师范大学硕士学位论文 对拓扑异构酶进行的特异修饰，如将酶或不同的蛋白复合物与之结合，还是将t o p o i i 特 异结合在染色体的不同位置上，都得到同样结果。最近的研究表明，人的t 0 p o i i 特异位 点的磷酸化与它在有丝分裂染色体上的定位有关【7 j 。 体外构建染色体实验和体内实验都表明，t o p o i i 参与了染色体集缩这个生命过程。 n e 、v p o n 和1 a k a s u g a 分别用t 0 p o i i 抑制剂处理爪蟾卵抽提物和细胞核的温育混合物，结果 染色体的集缩受到了抑制【1 7 3 】。w r o o d 和a d a c h i 分别用自己的研究指出，在体外构建染色 体试验中，t o p o i i 参与染色体的集缩【7 4 】。u m e r a 等在研究裂殖酵母的t o p o i i 温度敏感突变 体的有丝分裂过程中发现，在非允许温度下，染色体集缩不完全，当温度升高时，观察 到清楚的有丝分裂染色体集缩【8 】。诸多实验证明，t o p o i i 在有丝分裂染色体集缩中起着 重要作用，但其参与染色体集缩的作用机制还不清楚，仍然需要进一步研究。 而有丝分裂染色体集缩完成后，如果除去t 0 p oi i ，染色体的形态保持不变，t o p o i i 可以很容易地从集缩的染色体上除去。这些结果证明，t o p oi i 不是保持染色体骨架所需 要的【9 】o 综上所述，当前的研究认为t o p oi i 不是染色体中起结构作用的成分，而是一种与 染色体结构动态相互作用的伴侣分子。很多实验证明t o p oi i 在有丝分裂染色体集缩早 期起重要作用，参与有丝分裂染色体集缩的建立，但不参与有丝分裂染色体集缩状态的 保持。t 0 p oi i 参与有丝分裂染色体集缩的作用机制仍是不清楚的【1 0 1 ，还需要进一步研究。 二、染色体结构维持蛋白( s m c 蛋白) 染色体结构维持蛋白( s m c 蛋白，s t m c t u r a lm a i l l t e n a n c eo fc h r o m o s o m ep r o t e i n s ) 是2 0 世纪9 0 年代初发现的一类蛋白，它参与有丝分裂染色体集缩和分离、性染色体剂 量补偿效应、姊妹染色单体的粘着、遗传重组与d n a 的修复等多种染色体活动，也有 人认为它是染色体轴的构成蛋白。 1 s m c 蛋白的结构 s m c 分子是由1 0 0 0 个左右氨基酸组成的大分子，从n 末端到c 末端可分为五部分： 即n 术端结构域、棒状区域、铰链区域、棒状区域与c 末端结构域( 图1 ) 【l l1 2 】。 w a l b r aw a i k 雠b e o i l 群1 c o i lc o i i 氍l 稍秘 图1s m c 蛋白的结构 s m c 头部n 端含有一个a t p 结合位点。中间棒状区域由两个铲螺旋伸展成卷曲螺旋 结构构成，每个卷曲螺旋含有2 5 叫o o 个氨基酸残基，由于其特殊的结构，使其能够通 过自身柔软的中间铰链区自身结合，形成折叠的发卡状结构。尾部c 端含有一个螺旋一 环一螺旋结构，构成球形结构域，富含天冬氨酸和丙氨酸，被称为d a 盒。d a 盒在家族成 员中更加保守，是s m c 蛋白家族最具有特征的基序，是潜在的d n a 结合结构域。最近的 2 东北师范大学硕士学位论文 s m c 蛋白在体内一般以完全或接近对称的二聚体【1 5 ，1 6 1 的形式存在，在原核生物中形 成同二聚体，在真核生物中形成异二聚体。有实验表明，s m c 蛋白的分子内折叠和他们 的二聚作用都是由链与链( 1 1 i n g e h i n g e ) 间的相互作用介导的( 图2 ) 【1 7 】。 图2s m c 蛋白二聚体结构图 2 s m c 的功能 s m c 蛋白具有多种重要功能，参与染色体动态变化的许多方面。真核生物中，两个 不同s m c 蛋白组成异源二聚体，这种异源二聚体又是大的功能复合物的核心组分。两个 不同s m c 蛋白组成异源二聚体的结合不是随机的，而是遵守一种配对规则： s m c l s m c 3 ，s m c 2 s m c 4 和s m c 5 s m c 6 。s m c l s m c 3 异源二聚体主要与染色体的粘 着以及遗传重组和d n a 修复有关；s m c 2 s m c 4 异源二聚体主要与染色体的集缩和剂量 补偿效应有关；s m c 5 s m c 6 异源二聚体在不依赖集缩和粘着的高级染色体结构的组织 中起作用，对于保持基因组完整性和d n a 损伤反应十分重要( 图3 ) 【l7 | 。 s m c 蛋白的几种重要功能如下：( 1 ) 参与有丝分裂中姐妹染色单体的粘着( 具有该功 能的蛋白复合物被称为粘着素，是有丝分裂中使姐妹染色单体粘着并抵制由微管牵引带来 的分力的一种蛋白复合物) 【l8 1 9 】；( 2 ) 参与有丝分裂中染色体的集缩( 具有该功能的蛋白 复合物被称为集缩素) 【2 0 斟】；( 3 ) 参与剂量补偿【2 2 2 3 】；( 4 ) 参与d n a 重组和修复【2 4 1 。 搿f z ，阳e l 仁辱懈 图3s m c 蛋白复合物 b z 伊 q t 倍 俊g 一心峄 东北师范大学硕士学位论文 3 粘着素和集缩素 s m c 蛋白的第一种重要功能是参与有丝分裂中姊妹染色单体的粘着。具有该功能 的蛋白复合物被称为粘着素( c o h e s i n ) ，含有s m c l 一s m c 3 异二聚体和至少两个非s m c 亚基( s c c l m c d l 依a d 2 1a 1 1 ds c c 3 s a s ) 。粘着素是有丝分裂中使姊妹染色单体粘着，抵 抗由微管牵引带来的分离力的一种蛋白复合物【2 5 2 6 2 7 2 8 】。 s m c 蛋白的第二类重要功能是参与有丝分裂中染色体的集缩。具有该功能的蛋白复 合物被称为集缩素( c o n d e l l s 蛐【2 9 1 。根据目前的研究，普遍认为，s m c 蛋白自身的折叠和 s m c 蛋白间的相互作用都是通过两种方式进行的。一种是a t p 依赖型作用，另在一种是 非a t p 依赖型作用。在a t p 依赖型作用中，s m c 亚基的h e a d 结构域通过a t p 的介导实现 相互结合和分离。在非a t p 依赖型作用中s m c 亚基通过其铰链区，也就是我们所说的a n n 结构域来实现自身以及相互之间的结合与分离【1 7 1 。 s m c 二聚体的构象非常柔韧，通过电镜可以观察到他的多种构型。包括：o p e n - v ， c l o s e d v 和r i n g 1 i k e 型( 图4a ) 。有趣的是，根据电镜检测结果，尽管集缩素和粘着素 都具有两臂结构，二者的构象还是有显著的差异。集缩素的h i n g ed o m a i n 是闭合的，其 两臂也是闭合在一起的。三个非s m c 亚基复合物与二聚体h e a d 相结合，构成了“棒棒糖 状结构”。相反的，粘着素的h i n g ed o m a i n 大张开，其两臂也向两侧伸展开。非s m c 亚基 复合物表面上搭在两个h e a dd o m 咖之间，整体构成了“指环状结构( 图4b ) 1 7 3 0 ，3 1 3 2 1 。 螽。v 。 。， 。 够， 一。 。泌掣，0 、8 ：。j誊i ：誊唆j 。：0 ，j 。气：t ：磐： j ，蝥誓蛰j ， 霉。7 j 。：，o ，。，。蟹。：。誊1 - ，? 雳+ 荔答 。 ， w。#，t， 。，| 。： j ? ? i ：? ? t ? ；，磐_ - 毒一? j 4 4 。，磊 i o 。一_ ，移* ：u 。 4 一；二。，鼍 - 警棼；j：警“雩攀j 簪：善，、j ，爹，j 。- 镶。一j 1i ? 一；* j 图4a ，电镜下s m c 二聚体的构型b ，左边为集缩素构型右边为粘着素构型 在真核生物中，以s m c 2 s m c 4 异源二聚体为核心，与三种非s m c 蛋白一起构成五 个亚基的集缩素复合物的集缩素在有丝分裂染色体集缩中发挥重要作用图( 5 ) 【3 3 1 。 图5 集缩素结构 集缩素复合物首先在爪蟾卵中被发现。利用去膜精子作为底物的研究发现，集缩素 的两个主要亚基x c a p e x c a p c 是组装有丝分裂染色体的成份，免疫荧光检测发现 x c a p c 沿染色体轴分布。说明集缩素在染色体轴的形成过程中起了构件作用，而且有 证据表明纯化的s m c 二聚体在d n a 存在时有相互作用的可能性，它们可能相互作用，从 4 一赛鸡 蓼；a蕊 囔，# 、 东北师范大学硕士学位论文 而起一个结构骨架( a r c l l i t e c t l l r a l ) 作用【1 5 ，1 6 】。 大量的实验证明集缩素参与染色体集缩，其中的主要证据可以归纳为两个方面：一 方面是，在爪蟾卵提取物中添加的精子d n a 可以装配成集缩的有丝分裂染色体，并且， 在爪蟾卵提取物中检测到染色体集缩的机制与体内起作用的生理机制相关；另一方面 是，在芽殖和裂殖酵母中，集缩素亚基是保守的，而且对于细胞存活是必需的，在酵母 集缩素亚基发生突变，染色体不能正常集缩【3 4 ，3 5 ，3 6 ，3 7 1 。 在线虫中，m 1 是一种s m c 2 型蛋白，作为线虫集缩素的一个亚基参与有丝分裂 中染色体的集缩和分离。线虫m 1 纯合突变体的第二代1 0 0 表现胚胎致死。这些胚胎 中出现各种染色体畸变，而在两细胞期明显表现为染色体的分离缺陷，最普遍的特征是 细胞分裂后期出现染色质桥，表明姊妹染色单体没有分开或复制后的d n a 间的缠结没有 去除。同时，这些突变体的间期核膨大并且形状不规则，一些情况下，d n a 聚集成团块， 这可能是由于全部染色体集缩缺陷或d n a 多轮复制而细胞没有进行分裂( 核内复制) ， 可以认为这些现象很大程度上是由于m 一1 在有丝分裂中的功能受到阻碍引起的( 图6 ) 【3 8 1 。 图6 线虫集缩素亚基s m c 4 突变表型 在果蝇中，集缩素亚基d m s m c 4 发生突变，破坏姊妹染色单体分离而不破坏染色体 的纵向缩短，表明染色体集缩过程中除了集缩素的调节，还存在目前不清楚的负责染色 体集缩的机制。但在d m s m c 4 突变体细胞有丝分裂过程中，大多数细胞在后期和末期都 出现染色质桥，如图7 所示，表明集缩缺陷与后期正确分离的能力相关。进一步研究证 明在d m s m c 4 突变体的脑中成神经细胞凋亡增加，这是由于染色体发生了不可逆断裂的 结果【3 9 1 。在果蝇中集缩素的非s m c 亚基b a r r 基因发生突变，也出现类似的染色质桥现象 4 0 。 霄，j nr _” 图7 果蝇集缩素亚基d m s m c 4 突变模型 h u d s o n 等人报道在鸡d t 4 0 细胞中条件敲除集缩素亚基s c l i s m c 2 后，有丝分裂 染色体集缩被推迟，虽然在中期时染色体的集缩最终可以达到正常的水平，但这些染色 东北师范大学硕士学位论文 体的结构完整性受到损害。实验证明s ci i 对于有效的姊妹染色单体分离和前期染色体 的集缩是需要的，后期细胞表现染色质桥，而且也出现胞质分裂沟但随后退化，可能是 由于胞质分裂被大量落后的染色质阻断不能完成。随着时间进展出现双核或巨大细胞的 比率增加( 图8 ) 【4 1 1 。 在线虫、果蝇、和鸡中集缩素或集缩素的亚基发生突变后，染色质发生不同程度的 集缩缺陷，在后期和末期出现染色质桥或细胞彭大现象，说明在这些生物中集缩素亚基 的缺陷与姊妹染色单体的分离相关。 4 s m c 蛋白对有丝分裂染色体集缩和分离的可能作用机制 尽管作为热点问题长久以来被众多科研工作者关注，但是受限于试验手段等多种因 素，s m c 蛋白在有丝分裂染色体集缩和分离的作用机制始终没有定论。目前大体上说来， 存在这样几种推测：首先是在同一二聚体内部，如果是两个h e a d 区域结合，这种情况下 会形成指环状分子( 图9a ) ，如果是c o i l e d c o i l 结构域结合，则形成闭合的v 字状分子( 图 9c ) 。其次在不同二聚体间，如果发生h e a d - h e a d 连接，那么可以产生许多种不同的结构， 如：d o u b l e s i z e dm g s ，f i l a i i l e n t sa n dr o s e t t e l i k es t m c t u r e s( 图9b ) 。如果是c o i l e d c o i l 结构域引起的蛋白之间的相互作用，也会有多种连接形式( 图9d ) 【15 | 。最近，一些可 靠的证据表明，分子间的蛋白蛋白间的相互作用只有在存在d n a 的情况下才会出现， 在不存在d n a 时，几乎检测不到这种相互作用的存在【4 2 j 。 6 东北师范大学硕士学位论文 图9s m c 蛋白分子内部和分子间作用机制 a ，同一二聚体内部的两个h e a d 区域结合，形成闭合的环状结构b ，相邻二聚体的h e a d 区域结合后 可能形成多种结构c ，同一二聚体内部的c o i l e d c o i l 结构域结合，形成闭合v 状结构d ，相邻二聚 体的c o i l e d c o i l 结构域结合后可能形成多种结构。 在对s m c 蛋白分子作用机制的研究基础上，有人提出了s m c 蛋白复合物集缩素和 粘着素的作用机制。 集缩素首先通过一个c o i l e d - c o i l 结构域与d n a 结合，之后a t p 水解与其h e a d 结构 域脱离，结合在一起的h e a d 结构域打开，将d n a 环抱在集缩素两臂之间。之后伴随着 a t p 的结合，集缩素的h e a d 结构域重新结合。此时有可能发生两种情况，即集缩素分 子内部的h e a d 结构域间结合和集缩素分子间的h e a d 结构域结合。在分子内部结构域结 合时，每个集缩素可以引入一个手性1 0 0 p ，之后通过相邻集缩素之间的h e a d 结构域的 结合，进一步折叠染色质，形成蔷薇状结构。而当a t p 重新结合后首次h e a d 结构域结 合发生在两个相邻的集缩素间的时候，则是在两个相邻的集缩素分子间引入了手性 l o o p ，进而折叠为蔷薇状结构。这样形成的若干个蔷薇结构继续压缩，完成染色质向染 色体的集缩( 图l o ) 【4 3 4 4 4 5 ，蛔。 在s m c 蛋白分子作用机制的基础上对粘着素作用机制则做出了如下推测：首先是通 过单个粘着素连接两条姊妹染色单体，这是通过粘着素两臂的环抱作用完成的。这种粘 着作用有可能仅仅依靠单个粘着素的作用，也有可能在环抱姊妹染色单体的粘着素之间 还存在着相互连接，这种连接更为牢固。还有一种可能是每个粘着素环抱一条染色单体， 通过与位置相对的另一条染色单体上的粘着素的连接实现姊妹染色单体间的粘着。这种 粘着素间的连接有可能是通过h e a d 结构域也有可能是通过c o i l e d c o i l 结构域间的作用实 7 东北师范大学硕士学位论文 冬附州m g 图1 0 集缩素的作用机制 8 东北师范大学硕士学位论文 bi 2 图1 1 粘着素的作用机制 三、集缩素与t o p o 的作用关系 集缩素与t o p o i i 是染色体上两类主要的非组蛋白，在染色体形成过程中起了重要的 作用。长期以来，集缩素和t o p o i i 在染色体集缩过程中分别扮演了什么样的角色，它们 之间存在着什么样直接或者问接的联系，这些问题始终没有得到肯定的答案。 首先，我们都知道，集缩素和t o p o i i 与染色体的结合都需要a t p 的参与。同时，通 过电镜，免疫荧光等手段对集缩素与t o p o i i 进行定位观察后，发现二者均沿染色体轴向 分布。根据这些实验结果，一些学者们提出，集缩素与t o p o i i 在定位关系上是共定位， 在此基础上，又进一步假设，集缩素与t o p o i i 之间存在着直接的作用，这种作用对于染 色体的集缩是必不可少的【”】。 s a k a 等人发现在s p o i n b e 中c u t 3 与t o p o i i 可以通过同样的方式发挥对染色体的集缩 作用，但是二者之间没有直接的相互作用【5 2 】；通过免疫共沉淀、共定位及酵母双杂交发 现的超螺旋活性可以促进染色体的集缩【5 3 1 。不过，由于这种实验只能提示其中的结合关 系而不能具体说明二者的关系及各自的功能，有人认为这样的结果并不令人信服。另外 一些学者在不同的细胞中进行试验后，认为，t 0 p o i i 在染色体上存在两种分布方式，一 9 东北师范大学硕士学位论文 种是轴向分布，另一种是沿染色体均一分布。 其次，对于集缩素和t 0 p o i i 是否真的参与了染色体的构建，还存在着很多争议。有 人认为t o p o i i 参与染色体的构建作用，荧光标记定位、f 凡心( 荧光淬灭恢复) 及免疫电 镜标记等，都支持该观点髀。五3 6 】；用对人t o p o i s o m e r a s e l l 0 【特异的单克隆抗体鼬s 1 标 记、重组体系进入有丝分裂前加入t o p o i s o m e r a s e i i a 抑制剂b i s d i o x o p i p e r a z i n e s ( i c r f 1 5 4 ， i c i 江1 8 7 ，i c i 江1 9 3 ，e t c ) ，那么染色体就不能够形；在体外重组实验中向体系中加入d n a 复制抑制剂g e m i n i n 或a p h i d i c o l i n 染色体的形成不受影响，能正常形成。但是如果没有 1 o p o i s o m e r a s e l l 0 【，染色体的形成会受到巨大影响。根据这些结果，有学者提出，在染色 体形成过程中，d n a 的复制与否并不重要，没有复制的d n a 分子仍然能够进行集缩， 形成正常的染色体，说明t o p o i i 是染色体形成所不可缺的，免疫去除与恢复技术也证明 了这一点。但是也有人对此提出异议：盐抽提、d n a s ei ，i a s e 消化等强处理条件可以 将1 o p o i s o m e r a s e l l 0 【从染色体上分离下来，而且仍能维持染色体形态结构不变，d n a 复 制之后，有丝分裂早期轴结构的形成需要t o p o i i 的参与，没有t o p o i i 不能形成染色体结 构，但是t o p o i i 可能没有起到构建的作用。在体外重组实验中，在h s s ( 高速离心提取 物) 中，t o p o i i 与c o n d e n s i n 对染色体的组装是必需的，但是其后t o p o i i 可以在盐作用下 抽提下来而不影响轴结构的稳定性，染色体的结构也没有发生大的变化。所以对于t o p o i i 在染色体上的构件关系还不能给予定谢羽。 同时，还有一些学者，在不同的细胞系中进行试验后发现，在一些细胞中，对集缩 素或t 0 p o i i 进行免疫剔除或基因敲除后，有丝分裂染色体集缩正常进行。如果是这样的 话，那么就否定了集缩素和t o p o i i 在染色体集缩过程中的作用。这些学者就根据自己的 试验结果，抛开集缩素和t o p o i i ，提出了其他的染色体集缩机制【，7 5 8 ，5 9 1 。 四、人类集缩素的研究 人集缩素由两个s m c 亚基h c a p e 和h c a p c 和三个非s m c 亚基h c a p g 、 h c a p d 2 和h c a p h 组成。s m c 蛋白h c a p e 属于s m c 2 亚族，h c a p c 属于s m c 4 亚族，二者构成s m c 2 一s m c 4 型异二聚体h c a p e l l c a p c 【6 0 6 1 ，6 2 】。 l9 9 8 年，s c h m i e s i n g 等人鉴定了人h c a p c 和h c a p e 并证明h c a p c 和h c a p e 在细胞中形成异二聚体。他们根据序列保守性和有丝分裂染色体上的定位，证明 h c a p c l l c a p e 异二聚体是爪蟾x c a p c c a p e 二聚体的人同源物。2 0 0 0 年， s c h m i e s i n g 等人证明在人细胞中存在集缩素复合物。2 0 0 1 年，m u r a 等人报道从h e l a 细胞核提取物中纯化出人集缩素复合物。随着更多的实验结果的发表，人集缩素越来越 多的进入到人们的视野之中，散发迷人光彩。对他的研究也越来越深入，b a l l 等人在之 后进一步研究和鉴定了人集缩素中非s m c 亚基h c a p d 2 c n a p l e 9 7 【6 3 】。他们发现 h c a p d 2 的c 末端具有一个不需要集缩素其他亚基的有丝分裂染色体靶定结构域。缺 少这个区域的h c a p d 2 突变体，尽管仍能够结合到集缩素，但不能与有丝分裂染色体 结合。在体外实验中，此突变体成功地靶定到染色体上的能力与它们可以直接结合组蛋 白h 1 和h 3 的能力相关。在体内实验中含有靶定结构域的亚片段可以与组蛋白h 3 相互 1 0 东北师范大学硕士学位论文 作用。因此，可以确定h c a p d 2 的c 一末端区通过一个组蛋白结合结构域靶定到有丝分 裂染色体上。 关于人集缩素的研究主要集中在各个亚基的活性和功能上。根据现有文献报道，集 缩素中起中心作用的是s m c 异二聚体，其他三个非s m c 发挥调节s m c 异二聚体活性 的作用。现在对于h c a p h 和h c a p d 2 已经有所研究，但对于人集缩素核心成分h c a p e h c a p c 所起的作用和作用机制还不清楚，是人集缩素研究的热点问题。 五、研究的目的意义 人类细胞的分裂过程主要分为间期，前期，中期，后期，末期几个阶段。染色质集 缩为染色体保证了这些生命过程的顺利进行。首先，在染色质复制以后，如果染色质不 能集缩为染色体，那么会引起姊妹染色单体间的缠结，影响姊妹染色单体的正常分离， 很容易引发染色体断裂，易位，互换等现象；其次。如果染色质集缩不完全，那么在后 期染色体移向两极的过程中，由于染色体过长，会有部分不能成功迁移，被新形成的细 胞板截断，这样的就使新形成的细胞中染色体数量发生改变，有的缺失，有的增加。这 些染色体改变对于人类细胞来讲，大部分是致死的。当生殖细胞存在这种现象的时候， 会使胎儿致死，或者致畸。很多人类遗传疾病就是由染色体异常引起的【2 。 因此，对染色质集缩为染色体这一生命过程的研究，就变得尤为重要。根据以往的 研究，我们认为集缩素在这个集缩过程中发挥重要作用，但是，目前关于人类的集缩素 研究虽然已经集中在集缩素各个亚基上，却并没有阐述清楚他们各自的工作机制。在人 集缩素的五个亚基中，h c a p h 和h c a p d 2 近来分别有研究报道【6 4 6 5 1 ，对于两个s m c 亚基h c a p c 和h c a p e 的研究报道还很少，有待进一步的研究。 本实验采用r n a i 技术研究了h c a p e 和h c a p c 在有丝分裂染色体集缩中所起的 作用。通过共转染体系，采用脂质体方法共转染h e l a 细胞，根据转染后细胞不同于对 照细胞的各种变化，研究人集缩素中s m c 蛋白所起的作用，首次在人细胞中观察到染 色质桥和多核现象。采用这种基因功能研究方法阻断了人集缩素s m c 蛋白亚基的功能 后，表现出特征性的表型，这一结果证明人集缩素亚基在有丝分裂染色体集缩过程中起 重要作用，影响后期和末期的染色体分离。 东北师范大学硕士学位论文 实验材料和方法 一、实验材料 1 细胞及其培养试剂 1 1 h e l a 细胞由上海细胞所购进，本实验室保存。 1 2i m d m 培养基购于g i b c o 公司，小牛血清购于科隆生物工程公司。 1 3 细胞冻存液： 5 0 i m d m4 0 f b s1o d m s o 1 41 0 h a n l ( s 溶液： 1 6 9n a c l ，o 8 9k c l ，o 2 4 9n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，o 1 2 9k h 2 p 0 4 ，0 2 9葡萄糖，0 0 4 9 酚红，定容至2 0 0 i i d 。 1 5 1 0 t r i p s i n ： 5 9 呻s i i l 溶于2 0 0 1 1 1 l1 h a n k s ，3 7 水浴作用o 5 h 以上，抽滤除菌。 2 质粒 2 1p c d n a + g f p 质粒为本所保存。 2 2 干涉质粒r h c 和r h e 为本实验室王洪震博士构建。 3 菌株 大肠杆菌d h 5 a 为本所保存。 4 工具酶 4 1d n a 限制性内切酶：曰删h i 、觑棚i 、髓d r i 等购于大连宝生物公司。 4 2d n a 修饰酶：嘲d n a 聚合酶，t 4 d n a 连接酶购自大连宝泰克生物工程有限公 司。 5 试剂 二甲基甲酰胺( n ，n d i m e t h y l f o 姗锄i d e ) ，异丙基硫代半乳糖苷( t g ) ，p c r 引物购 自上海生工生物工程公司。硝酸纤维素膜( n c ) ，r n a 提取试剂阿z ( 15 5 9 6 0 2 6 ) 购自 i n v i t r o g e n 。逆转录试剂盒( a 3 8 0 1 ) ，购自p r o m e g a 。r e a lt i m ep c r 试剂盒( d r r 0 3 3 a ) ， 反转录用引物( 随机引物) ，反转录用d n t p 购自做a r a 。e c lp l u s 免疫杂交化学反应 试剂( r p n 2 1 3 2 ) ，还原性谷胱甘肽转移酶偶连的层析( 1 7 0 7 5 6 0 1 ) 购自a m e r s h a m b i o s c i e n c e s 。d n a 分子量标准购自大连宝泰克生物工程有限公司。蛋白质分子量标准购 自华美生物公司 。其它所用试剂均为分析纯。 8 仪器设备 h z q - x l o o 恒温振荡培养箱；星宇d a k w - d 水浴锅；s i 舯a 低温高速离心机；r e a lt i m e p c r 仪( a b ip r i s m7 0 0 0s e q u e n c ed e t e c t i o ns y s t 锄，a ba p p l i e db i o s y s t e m s ) ；超净工 作台( a i rt e c h ，苏州净化仪器厂) ；台式高速冷冻离心机( b e c k m a nc o u l t e r ) ；p c r 仪 ( t h e 册oe l e c 仃o nc o 印o r a t i o n ) ；荧光分光光度仪( t u 【n l e rd e s i 印st d 2 0 2 0 ) ； c 0 2 培 东北师范大学硕士学位论文 养箱( t h e r m of o r m a3l l1 ) ；电泳仪及电转移装置( b i o r a d ) ；倒置显微镜。 二、实验方法 ( 一) h e l a 细胞培养 1 h e l a 细胞细胞培养于含1 0 胎牛血清，1 青霉素、1 链霉素的i m d m 培养基 中，置于3 7 的5 c 0 2 培养箱中培养。选生长良好的h e l a 细胞一瓶，轻轻摇动培养 瓶数次，悬浮起附着在细胞表面的碎片，然后连同生长培养液一起吸出，用h a n k s 液洗 一次。 2 加入4 5 血h a i l l 【s 溶液，o 5 面l o t r i p s i n ，3 7 作用3 5 m i n ，倒置镜下见细胞 呈圆形，吸尽溶液。 3 沿细胞面加入适量i m d m 培养基，洗下细胞，并用吸管吹打数次，使细胞分散开， 加入适量血清，按l ：2 或1 ：3 分配传代培养。 4 3 7 培养，接种后3 0 1 1 ：1 i 1 1 左右可贴壁，4 8 h 可换生长液，一般3 4 d 可形成单层， 传代培养。 ( 二) 质粒的制备 1 活化 ( 1 ) 取7 0 保存的菌种2 0 0 “l 转入31 1 1 ll b 液体培养基中，3 7 过夜震荡培养， 至o d 5 5 0 1 1 m ( 0 4 0 5 。 ( 2 ) 保存菌种，菌液与等量4 0 甘油混匀，分装成1 0 0 0 肛班脚e n d o r f 管，一7 0 保 存。 2 质粒的大量制备 2 1 质粒大量制备的试剂 ( 1 ) l b 培养基 聊e t o n e y b a s te x t r a c t n a c l 1 2 1 2 0 m i l l ( 2 ) 溶液i 2 5 m m t r i s h c l q h8 o ) 1 0 m me d t a ( p h8 0 ) 不加葡萄糖 ( 3 ) 溶液1 1 0 2 mn a o h 1 s d s ( 4 ) 溶液i i i 5 0 0 血 5 mk a c 冰醋酸 无菌水 1 0 0 0 皿 1 0 9 5 9 5 9 l 0 0 0 m l 2 5 m 1 1 o mt r i