（细胞生物学专业论文）白色念珠菌热休克蛋白90单克隆抗体的制备及鉴定.pdf

- 、 c0 i 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作 所取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：童j 垫盈 日期： 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段 保存、汇编本学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名： 日期： 电话： 邮编： 一 煎算辫避 摘要 白色念珠菌是一种人和动物的常住型寄生菌，栖生于健康宿主的皮肤和黏膜，只有 当宿主的免疫力下降时，才会侵入皮肤粘膜内，进而进入深层组织和血液循环系统，引 起系统性感染或称深层念珠菌感染。白色念珠菌本身能分泌和合成大量的毒性分子和免 疫调节因子，它们参与真菌的粘附、降解宿主组织蛋白、调节白色念珠菌形态转换等过 程。其中某些是白色念珠菌的免疫优势抗原，如热休克蛋白9 0 、天冬氨酸蛋白酶等，它 们可诱导机体产生特异性抗体，并在系统性白色念珠菌感染中起着保护作用。 随着癌症患者在肿瘤治疗过程中化疗药物的长期使用，导致了患者免疫力下降，这 些患者的白色念珠菌的感染也越来越普遍。现阶段人们预防和治疗白色念珠菌感染主要 通过两个环节来进行，诊断和抗真菌治疗。由于该病没有明显的临床症状，加上现阶段 临床上人们对真菌的检测主要通过血培养法，而这种检测方法敏感性差、周期性长，导 致无法对该病进行有效的早期诊断、预防和治疗，病人的死亡率明显升高，因此如何建 立一套白色念珠菌感染的快速检测体系对患者来说将具有重要意义。但抗真菌治疗也存 在很多问题，比如真菌的耐药性，人们把解决这一难题寄希望于药物的协同治疗。但抗 真菌药物本身的毒性作用再加上它们之间的拮抗作用，使人们把眼光投到了抗体上，单 克隆抗体因其特异性高和细胞毒性弱等特点成为抗体中的首选。为了进一步研究白色念 珠菌感染的快速检测及抗真菌治疗方法，本研究制备了抗白色念珠菌热休克蛋白9 0 单 克隆抗体。 本实验利用p g e x 一4 t 一卜h s p 9 0 表达质粒，在大肠杆菌b l 2 1 中诱导表达白色念珠菌热 休克蛋白9 0 蛋白，再通过亲和层析法纯化热休克蛋白9 0 重组蛋白，并以热休克蛋白9 0 重组蛋白为抗原免疫b a l b e 小鼠。利用化学融合法将免疫好的小鼠脾细胞与骨髓瘤细 胞融合，经过h a t 、间接e l i s a 、有限稀释法等一系列方法对杂交瘤细胞进行筛选与纯 化，最后通过e l i s a 和w e s t e r n - b l o t 方法对杂交瘤细胞分泌出的抗体进行鉴定，我们 得到了两株分泌抗白色念珠菌热休克蛋白9 0 杂交瘤细胞系，并制备了抗白色念珠菌热 休克蛋白9 0 单克隆抗体，这为我们进一步研究白色念珠菌感染者的快速检测和治疗具 有重要意义。 关键词：白色念珠菌；热休克蛋白9 0 ：单克隆抗体 a b s t r a c t c a n d i d aa l b i c a n sb e l o n g st of u n g ia n dt h e c l a s si sc a n d i d a ，i ti sap e r m a n e n t t y p e b a c t e r i a lp a r a s i t eo fh u m a n sa n da n i m a l s ，i ti sb o r ni nt h eh e a l t h yh o s t ss k i na n dm u c o u s m e m b r a n e s ，w h e nt h eh o s t si m m u n es y s t e mi sr e d u c e do rt h en o r m a lf l o r ad e t u n i n g ，t h e yc a n g r o wi nd e e pt i s s u ea n db l o o dc i r c u l a t o r ys y s t e m s ，r e s u l t i n gi ns u p e r f i c i a l o rs y s t e m i c i n f e c t i o n c a n d i d aa l b i c a n sc a l ls y n t h e s i z ea n ds e c r e t eag r e a tn u m b e ro ft o x i cm o l e c u l e sa n d i m m u n e - m o d u l a t i n gm o l e c u l e si t s e l f , t h e yc a ni n v o l v ei nf u n g a la d h e s i o n ，d e g r a d eo fh o s t t i s s u ep r o t e i n s ，a n dr e g u l a t et h em o r p h o l o g i c a lc o n v e r s i o np r o c e s so fc a n d i d aa l b i c a n s s o m eo ft h e s em o l e c u l e sa r ei m m u n o d o m i n a n ta n t i g e n so fc a n d i d aa l b i c a n s ，s u c ha sh s p 9 0 a n ds a p 2 t h e yc a ni n d u c et h eh o s t st op r o d u c es p e c i f i ca n t i b o d i e s ，w h i c hp l a y sav e r y i m p o r t a n tr o l e i nt h ep a t h o l o g yd u r i n gt h ed e v e l o p m e n to fs y s t e m i c i n f e c t i o no fc a n d i d a a l b i c a n s a st h ea n t i b i o t i c sh a v eb e e nu s e dt ot r e a tt h ec a n c e rp a t i e n t s ，l e a d i n gt oc o m p r o m i s e d i m m u n i t y , t h e r ea r em o r ea n dm o r ep a t i e n t sw h os u f f e rf r o ms y s t e m i c c a n d i d aa l b i c a n s i n f e c t i o n c u r r e n t l y , d e t e c t i o na n da n t i - f u n g a lt r e a t m e n th a v eb e e nc o n s i d e r e dt op r e v e n ta n d t r e a tt h ei n f e c t i o n so fc a n d i d aa l b i c a n s h o w e v e r , t h ed i s e a s ei sn oo b v i o u sc l i n i c a l s y m p t o m s ，t ot h i sp o i n t ；t h em a j o rm e t h o do fd e t e c t i o nu s e db yd o c t o ri sb l o o dc u l t u r e ，w h i c h n e e d sl o n g e rt i m e ，s oi ti sar e a s o nt h a tc a nc a u s et h ep a t i e n t sd e a t h t h e r e f o r e ，d e v e l o p i n ga r a p i dd e t e c t i o ns y s t e mo fc a n d d aa l b i c a n si n f e c t i o ni su r g e n tt ot h i sk i n do fp a t i e n t s a l s o ， t h e r ea r em a n yp r o b l e m si nt h et r e a t m e n tt oc a n d i d aa l b i c a n si n f e c t i o n ，s u c ha sf u n g a l r e s i s t a n c e a l t h o u g hs o m ed o c t o r ss o l v et h i sp r o b l e mw i t hs y n e r g i s t i cd r u g s ，b u ta m o n gt h e d r u g s ，t h e r ea r et o x i ce f f e c t sa n da n t a g o n i s m ，s os o m ep e o p l et h i n kt ou s et h ea n t i b o d i e s ，t h e m o n o c l o n a la n t i b o d i e si st h ef i r s tc h o i c eo w i n gt oi t sf a i r l ys p e c i f i c i t ya n dl o w l yt o x i c i t y t o f u r t h e rs t u d yt h er a p i dd e t e c t i o no fc a n d i d aa l b i c a n si n f e c t i o n sa n dt h et r e a t m e n to f a n t i - f u n g a l ，w ep r e p a r e dt h ea n t i - c a n d i d aa l b i c a n sh s p 9 0m o n o c l o n a la n t i b o d y i nt h i sp a p e r , t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp g e x 4 t - l - h s p 9 0o fp r o k a r y o t i cw eu s e dw a s c o n s t r u c t e db yo u rl a b o r a t o r y , t h ep r o t e i nh s p 9 0w a se x p r e s s e di ne c o lb l 2 1c o m p e t e n tc e l l s ， t h ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yw a sp e r f o r m e dt op u r i f yt h er e c o m b i n a n tp r o t e i n sh s p 9 0 ，w e i n j e c tt h eb a l b cm i c ew i t ht h ep r o t e i nh s p 9 0 ，t h ec h e m i c a lf u s i o nm e t h o dw a su s e df o rc e l l f u s i o n ，t h ei m m u n e ds p l e e nc e l l so fm i c ea n ds p 2 0c e l l sw a sf u s e dw i t hp e g 4 0 0 0 ，a f t e rs o m e s e r i e so fh y b r i d o m as c r e e n i n ga n dp u r i f i c a t i o nb yh a t 、e l i s a 、l i m i t e dd i l u t i o nt h e h y b r i d o m ac e l l s ，a n dt h e nw ei d e n t i f yt h ea n t i b o d i e ss e c r e t e db yh y b r i d o m ac e l l st h r o u g h h c e l ll i n ec e l l sw h i c hc a l l p r e p a r e t h em o n o c l o n a l f o rd e v e l o p i n gt h er a p i d 中文摘要 英文摘要 目录 引言 l 白色念珠菌1 1 1 白色念珠菌研究现状。1 1 2 白色念珠菌热休克蛋白9 0 1 1 2 1 h s p 9 0 在分子水平的研究2 1 2 2h s p 9 0 表位的研究2 1 2 3 白色念珠菌h s p 9 0 的研究进展2 2 单克隆抗体3 2 1 抗体简述3 2 2 单克隆抗体的应用4 实验材料与方法6 1 实验材料6 1 1 实验材料6 1 2 实验器材二6 2 实验方法6 2 1 白色念珠菌h s p 9 0 抗原的表达及纯化6 2 2 白色念珠菌h s p 9 0 重组蛋白浓度及纯度鉴定7 2 3w e s t e r nb l o t 鉴定h s p 9 0 重组蛋白的免疫原性7 2 4b a l b c 小鼠免疫方案8 2 5 细胞融合8 2 5 1 饲养细胞制备8 2 5 2 细胞融合8 2 6 杂交瘤阳性细胞的筛选及亚克隆二：9 一 2 7 腹水制备9 2 8 单克隆抗体的免疫学鉴定9 2 8 1s d s - p a g e 法用于g s t 蛋白定量实验9 2 8 2e l i s a 法对单克隆抗体的特异性鉴定1 0 2 8 3e l i s a 法对单克隆抗体针对的抗原表位的线性与构象型初部件定1 0 2 8 4 用w e s t e r nb l o t 方法鉴定单克隆抗体的特异性1 0 i v v 11 1 ： 1 ：! 13 14 15 】【5 15 1 ( ； 17 ：2 0 ：21 ：1 4 ：1 5 ：1 9 3 ( ) 东北师范大学硕士论文 引言 1 白色念珠菌 1 1 白色念珠菌研究现状 白色念珠菌是一种人和动物的常住型寄生菌，栖生于健康宿主的皮肤和黏膜，只有 当宿主的免疫力下降时，它才会侵入皮肤粘膜内，深层组织和血液循环系统，引起浅层 或系统性感染。比如在正常情况下，白色念珠菌与人体皮肤粘膜表面的其它菌类如大 肠杆菌等是相互制约的，而在人体免疫力下降的情况下，或者局部抵抗力下降时，白色 念珠菌可在局部或全身大量繁殖，作为一种致病体通过浅层粘膜组织进入血液循环，引 起深层感染。 对于大部分真菌感染，细胞免疫是宿主防御的主要途径口1 。现阶段，人们对于白色 念珠菌的感染机制有了进一步的认识：细胞免疫应答反应在白色念珠菌感染中仍然处于 非常重要的地位。但对于白色念珠菌感染来说，体液免疫的效应分子一抗体也发挥了一 定的作用1 。 白色念珠菌的细胞壁和胞浆内都存在大量的抗原分子，并且在不同的形态下存在的 抗原也有所不同：在细胞壁中，存在的抗原分子主要有热休克蛋白7 0 、甘露糖、甘露糖 蛋白等h 1 ：另外白色念珠菌的胞浆内也存在一些抗原分子，它们是白色念珠菌本身合成 和分泌的，其中最主要的为热休克蛋白9 0 ，天冬氨酸蛋白酶畸1 。这些抗原分子在调节白 色念珠菌形态转换、细胞粘附等方面起非常重要的作用】。热休克蛋白9 0 和天冬氨酸蛋 白酶都是白色念珠菌的免疫优势抗原，它们可诱导机体产生特异性抗体，并在系统性白 色念珠菌感染中起着主要的免疫保护作用h 1 。 1 2 白色念珠菌热休克蛋白9 0 白色念珠菌热休克蛋白9 0 是热休克蛋白( h e a ts h o c kp r o t e i n ，h s p ，以下正文中 均用h s p ) 的一种，是白色念珠菌在不利的条件下合成并分泌的一种蛋白质，主要存 在于白色念珠菌的胞浆内3 ，是白色念珠菌的一个调节因子，对白色念珠菌自身 的生长和生理活动起着非常重要的作用。首先，h s p 9 0 作为一种分子伴侣在保护和修复 白色念珠菌细胞方面起着非常重要的作用阳1 。其次，它在白色念珠菌生长和分裂、d n a 的合成、基因转录、翻译等生理过程中也起到了非常重要的调节作用n 们。此外，白色念 珠菌h s p 9 0 作为白色念珠菌的一种免疫优势抗原，可诱导机体产生特异性抗体，并在系 统性白色念珠菌感染中起着主要的免疫保护作用】。 在白色念珠菌死亡患者中，相当一部分人是由于在白色念珠菌感染的初期没有得到有效 的治疗，由于该病没有明显的临床症状1 ，加上现阶段临床上人们对真菌的检测主要通 过血培养法，而这种检测方法敏感性差、周期性长啪1 ，导致无法对该疾病进行有效的早 期诊断、预防和治疗。所以快速检测白色念珠菌的感染，是有效预防和治疗白色念珠菌 感染的关键，h s p 9 0 为白色念珠菌的一种免疫优势抗原，而抗h s p 9 0 抗体，作为一种重 要的探测分子和中和抗体有可能成为系统性念珠菌感染的诊断和治疗试剂嘲，因此如何 建立一套白色念珠菌感染的快速检测体系对于患者治愈具有重要意义。 在疾病治疗方面：临床上白色念珠菌感染多进行抗真菌治疗，但抗真菌治疗存在很 2 东北师范大学硕士论文 多问题，由于白色念珠菌具有多态性，能够逃避宿主的识别，其耐药性也逐渐增强瞳7 1 ， 加上抗真菌药物本身明显的毒性作用等因素的制约，至今还没有研究出一种特别有效的 真菌药物。人们期望能通过协同治疗解决这个问题，但考虑到药物间的拮抗作用和抗 真菌药物的毒性，这一想法很难实施，而抗体在抗真菌治疗中是安全有效的1 ，因此， 抗体和抗真菌药物协同治疗成为目前抗真菌治疗最好的选择。白色念珠菌h s p 9 0 是白色 念珠菌的免疫优势抗原盯1 ，现阶段，科学家已经对白色念珠菌h s p 9 0 在免疫学感染中作用 的靶位点有了一定的了解，已经确定了其c 末端的3 个连续表位，即表位c 、表位b 和表位 h n 引，目前，临床上能够用于白色念珠菌感染的单克隆抗体只有抗白色念珠菌芽管胞壁 外膜抗原的单克隆抗体m a b 0 3 2 c i c 2 ，它在体外能抑制白色念珠茵芽管的形成，从而抑制 白色念珠菌对上皮细胞、内皮细胞的粘附，降低白色念珠菌的侵袭力啪3 。但是它主要针 对的是白色念珠菌浅层感染，对于系统性白色念珠菌感染来说，起不到应有的作用，所 以，筛选白色念珠菌免疫优势抗原单克隆抗体，将对系统性白色念珠菌感染的治疗具有 重要意义。 本研究以重组的白色念珠菌h s p 9 0 蛋白作为免疫原免疫b a l b c 小鼠，通过杂交瘤技 术，筛选出分泌抗白色念珠菌h s p 9 0 蛋白抗体的细胞系，为进一步研究系统性白色念珠 菌感染的诊断和治疗方法提供新的实验材料。 2 单克隆抗体 2 1 抗体简述 从抗体产生到现在，已经有1 0 0 多年的历史，它已经经历了三代：多克隆抗体、单克 隆抗体、基因工程抗体口。在抗体的发展历程中，最先出现的是多克隆抗体，大多数抗 原分子具有多个表位，每种表位均可刺激机体1 个b 细胞克隆产生1 种特异性抗体，传统制 备的免疫血清被称为多克隆抗体d 羽。在2 0 世纪2 0 至3 0 年代，抗血清应用于治疗疾病，象 征着多克隆抗体发展到了鼎盛时期羽。但是，抗血清存在毒性大、特异性差、批间差异 明显等缺点，目前仅用于很小范围的治疗和预防】。 1 9 7 5 年德国学者k o h l e r 和英国学者m i i s t e i n 发明了杂交瘤技术，他们成功的将骨髓 瘤细胞和产生抗体的b 淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，其分泌的抗体是由识别一种抗原决 定簇的细胞克隆产生的均一性抗体，故称之为单克隆抗体。杂交瘤技术的问世使产生 仅识别1 种表位的同源抗体成为可能，它根基于3 个原理：动物免疫、细胞融合及杂交瘤 细胞的筛选m 3 。首先是动物免疫，动物体内的b 淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可 以大量增殖变成浆细胞，以分泌针对于该抗原的抗体，这种抗体具有特异性。动物免疫 作用就是用特定的外来抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激其分泌对于该抗原的b 淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一反应的b 淋巴细胞。接下来是细胞融合，这 也是杂交瘤技术的难点及关键，b 淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但在体外 存活时间很短，而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活，如果将这 染性疾病m 1 。目前，利用单克隆抗体进行疾病的诊断现已被广泛应用，目前已批准使用 的诊断剂有：用于结肠癌的v o t o m a b 和a r c i l u m o n a b 倒，用于探测感染部位的s u l e m a b 硎， 用于卵巢癌的i g o v o m a b 呻1 ，用于黑色素瘤的t e c n e m a bl ( - 1 呻3 等。 在疾病治疗方面，自1 9 8 2 年单克隆抗体首次应用于人体治疗以来，由于其专一性在 疾病治疗中倍受人们关注。目前利用单克隆抗体对疾病进行治疗已取得了很大的成果， 4 东北师范大学硕士论文 而单克隆抗体治疗药物也迅速发展，一些已经被应用于临床。1 9 8 6 年，f d a 批准了第一个 单克隆抗体治疗性药物：莫罗单抗( m u r o m o n a b - - c d 3 ，o r t h o c l o n eo k t 3 ) ，它是用于。肾移 植病人防止异体排斥反应的第一只鼠源型单克隆抗体哺。最近，将单克隆抗体应用于癌 症及艾滋病的治疗已成为人们研究的两大热点，第一个获准用于癌症治疗的单克隆抗体 是r i t u x i m a b ( m a b t h e r a ) ，其作用标靶为c d 2 0 ，多中心临床研究显示：本品能有效治疗 复发的低度滤泡型非何杰金淋巴瘤嫡副。在疾病治疗中，单克隆抗体药物虽不能独立担任 主药治疗，但可以作为辅助药物与主药耦联，再与病原体或特异抗原结合可使疗效提高。 例如它可以与化疗药物联用，作为辅助药物治疗肿瘤，可使疗效提高哺羽。单克隆抗体药 物虽不能根治任何疾病，但可以提高缓解率，延长缓解期，改善生活质量】。 近些年美国f d a 连续批准多个单克隆抗体药物上市，这无疑是临床医学、制药领域中 的巨大突破。但是，单克隆抗体药物还存在一些尚未解决的问题，最突出的问题是如何 降低单克隆抗体的免疫原性，单克隆抗体的异源性所引起的抗体反应，不但降低了单克 隆抗体的效价，而且会给患者带来严重的后果嘶1 。因此，对异源性单克隆抗体进行改造 以及人源性单克隆抗体的研制成为单克隆抗体研究的重要方向。 i g g 抗体、石蜡油产自 化进大肠杆菌b l 2 1 ，将 转化菌液涂布于含氨苄抗生素的l b 培养基平板上选择培养，3 7 过夜。挑取单克隆菌 接种于含氨苄抗生素的4 m ll b 液体培养基中，3 7 ，2 0 0 r p m ，过夜震荡培养。将过夜 培养的菌液放入含氨苄抗生素的2 0 0 m ly t a 液体培养基中，2 0 0 r p m ，3 7 ，震荡培养3 h 后，i p t g 诱导目的蛋白的表达，其诱导浓度是0 5 m m ，诱导条件是2 0 0 r p m ，3 0 ，4 h 震荡培养。诱导表达结束后，4 ，8 0 0 0 r p m 离心l o m i n 收集菌体，加入1 2 0 体积预冷 的p b s ( n a c l1 3 7 m m l ，k c l2 7 m w l ，n a ：h p 0 44 3 m m l ，k h 2 p 0 41 4 r a m l ) 溶液重悬菌 体。然后用超声破碎仪破碎菌体，破碎过程一直在冰上进行。然后加入1 的t r i t o n x 一1 0 0 6 东北师范大学硕士论文 ( 3 0 t r i t o nx - 1 0 0 母液：2 8 2 m l0 1 m l ，p b s7 2 8 m 1 ) ，震荡半小时。最后4 ，9 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 收集上清备用。 沉淀要经过变性及复性处理，首先用8 m 尿素溶解沉淀，常温过夜；4 c ，9 0 0 0 r p m 离心3 0 m i n 收集上清并转移至截留分子量为1 0 ，0 0 0 k d a 的半透膜透析袋进行透析复性处 理；透析过程逐步进行，即分别用6 m 尿素、4 m 尿素、2 m 尿素和p b s 逐步进行，透析过 程在冰上，每次换液间隔2 h ；透析结束后，4 ，9 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 收集上清备用。 应用亲和层析法对h s p 9 0 重组蛋白进行纯化，具体步骤如下：首先平衡亲和层析柱， 室温条件下用1 5 倍柱体积的p b s 缓冲液平衡柱子，然后将蛋白混合液加入层析柱过柱， 过柱结束后，用2 0 3 0 倍柱体积p b s 缓冲液洗涤层析柱，去除非特异性结合，接着用2 0 r a m 谷胱甘肽洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来并依次收集到1 5 m le p 管中。最后，为了能 够更好的保存浓缩蛋白样品，采取冻干蛋白样品的方法。首先将蛋白洗脱液转移至透析 袋中，放置在p b s 缓冲液中4 透析过夜，透析结束后，将重组蛋白冻干，- 8 0 保存备 用。 2 2 白色念珠菌h s p 9 0 重组蛋白浓度及纯度鉴定 取一管h s p 9 0 重组蛋白冻干粉，加入p b s 溶解混匀，采用考马斯亮蓝染色法测定蛋 白浓度，具体方法如下：用p b s 溶解b s a ，配制成l g g p l 的b s a 标准液母液和考马斯亮 蓝染液待用，再用p b s 及b s a 标准液母液配置7 个b s a 浓度梯度，分别为0 “g n 、 0 1 9 9 肛l 、0 2 腿p 1 、0 4 p g n 、0 6 腿p 1 、0 8 腿肛l 、l 肛g n ，每个b s a 浓度梯度溶 液取出1 0 0 “1 ，分别加入5 m l 考马斯亮蓝试剂混匀，静置2 m i n 后，分光光度计于5 9 5 n m 处测吸光值，根据吸光值绘制标准曲线。测量h s p 9 0 重组蛋白的吸光值，根据标准曲线 计算重组蛋白的浓度。 应用s d s - p a g e 法鉴定纯化h s p 9 0 重组蛋白的纯度，根据h s p 9 0 重组蛋白分子量的大 小，我们选用8 的丙烯酰胺凝胶进行电泳。其操作步骤如下：首先将制备的重组蛋白原 液( 8 p 1 ) 混合磷酸盐包被缓冲液做一系列浓度梯度，各浓度梯度上样体系中含重组 蛋白样品量分别为8 垤、4 心、2 、l 、5 0 0 n g ，样品体积为2 0 p l ，上样前沸水浴煮5 m i n ， 浓缩胶8 0 v ，分离胶1 2 0 v 恒压电泳。电泳结束后考马斯亮蓝染色，根据蛋白中杂蛋白量 初步确定蛋白纯度。 2 3w e s t e r nb l o t 鉴定h s p 9 0 重组蛋白的免疫原性 配置8 丙烯酰胺凝胶，h s p 9 0 重组蛋白上样量为2 腿，浓缩胶8 0 v ，分离胶1 2 0 v 进 行恒压电泳。当溴芬蓝指示试剂到达底端时进行转膜处理，转膜时电压设为7 0 v ，时间 为2 h ，之后用丽春红染色，鉴定蛋白是否转移到膜上，再用7 脱脂奶粉封闭，封闭条 件是室温，摇动，时间为1 h 。封闭结束后倒掉脱脂奶粉，将膜放入杂交袋中，一抗为白 色念珠菌t i s p 9 0 免疫多克隆兔血清，同时设阴性对照，4 c 过夜。之后在室温条件下， 摇动l h 。用p b s t 摇动洗涤，洗涤三次，每次5 m i n 。然后加入h r p 酶标二抗( 山羊抗小 7 ，离心5 m i n ，弃上清液。轻轻振动管底，振散细胞，使沉淀在管底的两种细胞均匀混 8 东北师范大学硕士论文 合。加入4 0 预热的5 0 无菌p e g 4 0 0 0 ，开始进行细胞融合。再用选择培养基重悬细胞， 最后加入到含饲养细胞的9 6 孔细胞培养板中，3 7 ，5 c 0 ：培养箱中静置培养。 2 6 杂交瘤阳性细胞的筛选及亚克隆 杂交瘤阳性细胞的筛选采用间接e l i s a 法，这一实验一般要等杂交瘤细胞克隆生长 到细胞培养孔底面积的2 3 左右、换完液的第三天进行，具体方法如下：首先包被h s p 9 0 重组蛋白，置于湿盒中，4 过夜。取出酶标板，甩去液体，用缓冲液洗涤酶标板，先 用p b s t 缓冲液洗3 次，再用p b s 洗2 次，每次3 m i n ，每次洗后甩净液体，并在滤纸上 轻轻拍打，尽量除尽液体。洗涤结束后，每孔加入2 0 0 9 l 用p b s 配置的5 脱脂奶粉封闭 液进行封闭，置于湿盒中，3 7 ，1 h 。洗涤同上，待检一抗为杂交瘤培养液上清，每孔 1 0 0 斗1 ，设阴性对照，置于湿盒中3 7 ，1 h 。洗涤，酶标二抗( 山羊抗小鼠) 用封闭液 按1 ：5 0 0 0 稀释，每孔加l o o g l ，置于湿盒中3 7 ，4 5 m i n 。洗涤，每孔加底物显色液a 和b 各5 0 p l ，置于室温显色1 2 m i n 。结束后，用2 mh ：s o 。溶液终止反应。在酶标仪上于 4 5 0 h m 和6 2 0 h m 处测定吸光值。当检测值阴性对照值2 1 时，视为阳性值。 饲养细胞在阳性杂交瘤细胞亚克隆前一天制备，方法同上，在阳性杂交瘤细胞的筛 选结束后，我们选取检测值为阳性的孔，将细胞吹打成细胞悬液，台盼蓝细胞染色计数 后，用细胞培养基稀释细胞悬液至终浓度为8 个m l ，将细胞悬液加入含有饲养细胞的 9 6 孔细胞培养板中，每孔加入1 0 0 “1 。将细胞放入到3 7 ，5 c 0 ：的培养箱中静置培养。 经几次亚克隆后在细胞培养瓶中扩大培养，冻存。 2 7 腹水制备 取出b a l b c 小鼠，腹腔内注射石蜡油，每只小鼠5 0 0 9 l ，两周后，取出生长状态良 好的杂交瘤细胞制成细胞悬液，台盼蓝细胞染色计数，每种细胞取出1 1 0 6 个，注射进 小鼠腹腔，7 1 0 天左右，抽取腹水，4 。c ，1 0 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃沉淀，- 8 0 c 保存。 2 8 单克隆抗体的免疫学鉴定 我们对单克隆抗体的两方面免疫学性质进行鉴定：一是对单克隆抗体特异性鉴定， 二是对单克隆抗体所针对的抗原表位是线性还是构象型进行初步鉴定。以下我们将针对 这两方面进行实验设计。 2 8 1s d s p a g e 法用于g s t 蛋白定量实验 s d s - p a g e 法定量g s t 蛋白是我们在通过e l i s a 法对单克隆抗体的特异性鉴定实验之 前必须要进行的一个实验，其实验方法如下：转化p g e x - 4 t - 1 表达载体进入b l 2 1 表达 菌体中，诱导表达，诱导条件为3 7 ，4 h ，0 5 m mi p t g ，诱导结束后，超声破碎细胞， 取上清液，对表达产物上清液进行s d s - p a g e 电泳，电泳时设置一个标准蛋白( 所谓标 准蛋白是指蛋白的浓度和大小已知，本实验采用已经测好浓度的h s p 9 0 重组蛋白作为标 9 东北师范大学硕士论文 准蛋白) ，h s p 9 0 重组蛋白上样量为1 魄，g s t 蛋白表达产物上样液为一系列体积梯度的 诱导表达的全菌蛋白产物上清液，即5 p l 、1 0 肛1 、1 5 “l 、2 0 肛l ，上样前沸水浴煮5 m i n ， 浓缩胶8 0 v ，分离胶1 2 0 v 恒压电泳。电泳结束后考马斯亮蓝染色，借助b a n d s c a n 5 0 软件对蛋白电泳条带进行光密度分析，通过与标准蛋白的对比来定量g s t 蛋白表达量。 选择g s t 蛋白表达量与标准蛋白灰度值一致的上样孔，并记录上样体积，以后备用。 2 8 2e l i s a 法对单克隆抗体的特异性鉴定 e l i s a 法对单克隆抗体的特异性鉴定，具体步骤如下：首先是包被蛋白，我们准备 了h s p 9 0 重组蛋白，g s t 蛋白表达液，平行包被两种蛋白，每个酶标孔包被蛋白量为 0 0 1 心，体积为1 0 0 p 1 ，设阴性对照，置于湿盒中，4 。c 过夜。取出酶标板，甩去液体， 用缓冲液洗涤酶标板，先用p b s t 缓冲液洗3 次，再用p b s 洗2 次，每次3 m i n ，每次洗 后甩净液体，并在滤纸上轻轻拍打，尽量除尽液体。洗涤结束后，每孔加入2 0 0 9 l 用p b s 配置的5 脱脂奶粉封闭液进行封闭，重新放入湿盒中，3 7 ，l h 。洗涤同上，待检一抗 为杂交瘤培养液上清，每孔1 0 0 斗1 ，阴性对照为细胞培养基，置于湿盒中3 7 ，1 h 。洗 涤，酶标二抗( 山羊抗小鼠) 用封闭液按1 ：5 0 0 0 稀释，每孔加1 0 0 p 1 ，置于湿盒中3 7 ，4 5 m i n ，洗涤，每孔加底物显色液a 和b 各5 0 肛1 ，室温显色1 2 m i n 。结束后，用2 mh ：s 0 。 溶液终止反应。在酶标仪上于4 5 0 n m 和6 2 0 n m 处测定吸光值，当检测值阴性对照值 2 1 时，为阳性值。 2 8 3e l i s a 法对单克隆抗体针对的抗原表位的线性与构象型初步鉴定 我们通过间接e l i s a 法对单克隆抗体所针对的抗原表位的线性与构象型进行了初步 鉴定，方法如下：首先包被h s p 9 0 重组蛋白，每个酶标孑l 包被蛋白量为o 0 1 垤，体积为 1 0 0 9 l ，置于湿盒中，4 过夜。取出酶标板，甩去液体，用包被液配置一系列浓度梯度 的盐酸胍溶液，浓度梯度为6 m 、4 m 、2 m 、0 m ，加入包被孔，3 7 ，处理3 0 m i n 。处理结 束后，用缓冲液洗涤酶标板，先用p b s t 缓冲液洗3 次，再用p b s 洗2 次，每次3 m i n ， 每次洗后甩净液体，并在滤纸上轻轻拍打，尽量除尽液体。洗涤结束后，每孔加入2 0 0 9 l 用p b s 配置的5 脱脂奶粉封闭液进行封闭，重新放入湿盒中，3 7 ，1 h 。洗涤同上，一 抗为冻存的杂交瘤培养液上清。每孔1 0 0 肛1 ，置于湿盒中3 7 ，1 h 。洗涤，酶标二抗( 山 羊抗小鼠) 用封闭液按l ：5 0 0 0 稀释，每孔加1 0 0 9 l ，置于湿盒中3 7 ，4 5 m i n 。洗涤 结束后，每孔加底物显色液a 和b 各5 0 p l ，置于室温显色1 2 m i n 。用2 mh 。s 0 4 溶液终止 反应。在酶标仪上于4 5 0 n m 和6 2 0 r i m 处测定吸光值，利用s p s s 软件对吸光值进行分析， 确定数据之间的差异性。 2 8 4 用w e s t e r nb l o t 方法鉴定单克隆抗体的特异性 8 丙烯酰胺凝胶进行电泳，h s p 9 0 重组蛋白上样量为1 腿，浓缩胶8 0 v ，分离胶1 2 0 v 恒压电泳。等到溴芬蓝指示试剂到达底端时进行转膜处理，转膜时电压为7 0 v ，时间为 1 0 东北师范大学硕士论文 2 h 。转膜结束之后用丽春红染色，鉴定蛋白转移。用7 脱脂奶粉封闭，封闭条件是室温， 摇动，时间为1 h 。倒掉脱脂奶粉，将膜放入杂交袋中，加入制备的小鼠腹水，设阴性对 照，4 c 过夜处理。在室温条件下，摇动1 h 。用p b s t 摇动洗涤，共洗三次，每次5 m i n 。 然后加入h r p 酶标二抗( 山羊抗小鼠) ，二抗用7 脱脂奶粉l ：1 0 0 0 稀释，在室温条件 下，摇动4 5 m i n ，洗涤同上。最后显色，采用a e c 为底物显色，3 0 秒左右蒸馏水冲洗终 止反应。 2 8 5 实验数据统计分析 本实验数据利用s p s s1 5 0 软件进行分析和统计。运用单因素方差分析法对本实验 数据中各个数据之间的差异显著性进行分析，当p 0 0 5 时，设为数据之间差异性不显 著，当p 0 0 5 时，设为数据之间差异性显著。 0 5 m mi p t g 诱导4 h ， 得到的细菌培养物超 所示。为了得到未经 声破碎后的上清部分 p t g 诱导的全菌蛋白 目的蛋白诱导表达成 1 2h s p 9 0 蛋白纯化 进一步采用考马斯亮蓝染色法测定纯化的h s p 9 0 重组蛋白浓度，然后通过s d s p a g e 电泳分析重组蛋白的纯度，结果如图2 。 1 2 东北师范大学硕士论文 12 。3 ，。4 ，移。纛蝴秽6 。穗 9 7 4 k d a 一 乡 够 一 6 6 2 k d a 麟稳嘲霸黪_ _ 麟嘲蝴彬一一 ， 4 3 k d a 懈 3 1 k 1 ) a 融， 。誓j 。j j ? 7 镌极 图2 纯化的h s p 9 0 重组蛋白纯度分析电泳图 1 小分子量m a r k e r2 h s p 9 0 纯化蛋白( 8 垤)3 h s p 9 0 纯化蛋白( 4 腿) 4 h s p 9 0 纯化蛋白( 2 垤)5 h s p 9 0 纯 化蛋白( 1 心)6 h s p 9 0 纯化蛋白( 0 5 心) 由图2 表明，上样量越大，杂蛋白含量越少，说明我们纯化的蛋白样品纯度较好。 2 纯化蛋白的免疫原性分析 用w e s t e r nb l o t 杂交实验对纯化蛋白的免疫原性进行分析。实验结果如图3 所示。 l2 图3 重组质粒p g 麟- 4 t - 1 h s p 9 0 表达产物的w e s t e r nb l o t 分析 1 纯化的h s p 9 0 重组蛋白( h s p 9 0 重组蛋白+ 白色念珠菌 h s p 9 0 蛋白多克隆抗体免疫血清+ h r p 标记的酶标二抗) 2 阴性对照( h s p 9 0 重组蛋白+ 阴性血清+ h r p 标记的酶标二 抗) 由图3 可以看出，与白色念珠菌h s p 9 0 多克隆抗体血清杂交后，在分子量7 0 k d a 处 出现了明显的杂交带，而阴性对照组没有，证明纯化的h s p 9 0 重组蛋白有免疫原性。 东北师范大学硕士论文 3b a l b c 小鼠的免疫效果分析 将免疫的5 只b a l b c 小鼠分为两组：第一组2 只，分别命名为一组l 号、一组2 号；第二组3 只，分别命名为二组1 号、二组2 号、二组3 号。两组小鼠免疫时间相隔 一周。在免疫的第2 4 天、第4 5 天检n d , 鼠免疫血清在4 5 0 r i m 处的吸光值，免疫结果如 图6 所示。 量 呙 鼍 昌 甘 8 。爹移 梦梦梦 b a l b c d x 鼠 图4 b a l b c 小鼠免疫血清吸光值分析 由图4 表明，各组b a l b c 小鼠免疫后第2 4 天在4 5 0 n m 处血清免疫吸光值与第4 5 天相比发生明显变化。根据判定阳性的标准方法，如果待检测样品值是阴性对照值的2 1 倍以上即为阳性。因此在免疫的第2 4 天，虽然吸光值较低，但五只小鼠都均为阳性， 在免疫的第4 5 天，五只小鼠的吸光值都有了明显的增长，说明小鼠的免疫方案是可行 的，并且免疫效果是显著的。选取