（细胞生物学专业论文）可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备.pdf

可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 捅要 本文分别采用密度梯度离心、荧光显微镜观察、瑞氏染色和透射 电镜观察等四种方法对可口革囊星虫的血细胞进行分类，将其分为两 类：透明细胞和颗粒细胞，其中颗粒细胞又分为两个亚型：大颗粒细 胞和小颗粒细胞。 经密度梯度离心，血细胞在淋巴细胞分离液中被分为两层，透明 细胞主要位于上层，颗粒细胞则大部分位于下层。 在荧光显微镜下可观察到血细胞的自发荧光，在不同波长下透明 细胞与颗粒细胞产生的自发荧光不同。 利用瑞氏染色法光镜下观察，透明细胞大多数为圆形或椭圆形， 细胞质透明或淡紫色，细胞表面光滑无胞突，胞质稀少，细胞质内无 明显颗粒，核质比小。细胞核为粉色，核中含有深色的致密物质。小 颗粒细胞比透明细胞小，细胞质呈黄色或棕黄色，并且其中含有很多 黑色颗粒，细胞核呈粉色圆形，核质比大。大颗粒细胞数目最少，胞 质中充满了大的紫黑色的致密颗粒，细胞核粉紫色。 透射电镜下观察，透明细胞几乎不含细胞器，核内常染色质丰富。 小颗粒细胞的细胞质中有粗面内质网、高尔基体、线粒体等许多的细 胞器，还含有电子致密颗粒，有伪足。大颗粒细胞中充满了电子致密 颗粒。 以可口革囊星虫的血细胞作为抗原免疫b a l b c 小鼠，取其脾脏， 聚乙二醇为融合剂，将免疫小鼠的脾细胞和s p 2 o 小鼠骨髓瘤细胞融 合，用g i b c o 公司的r p m i 1 6 4 0 培养基培养杂交瘤细胞。应用酶联免疫 吸附实验( e l i s a ) 检测杂交瘤上清液，检测得到大量阳性杂交瘤细胞， 最终得到8 株具有较高分泌能力的杂交瘤细胞冻存备用。 有限稀释法克隆了8 株阳性杂交瘤细胞，通过密度梯度离心分离血 细胞与e l i s a 检测相结合，发现：单抗e b 3 与颗粒细胞发生阳性反应， 单抗d d l 、e d l 与透明细胞发生阳性反应；应用免疫磁珠与可口革囊 星虫的体腔细胞的反应，发现单抗d d l 与透明细胞细胞膜发生阳性反 应；单抗e b 3 与颗粒细胞细胞膜发生阳性反应。总而言之，单抗e b 3 似乎是非常有希望用于鉴别和区分颗粒细胞，并且这三株单克隆抗体 将被用于关于细胞的防御机制的进一步研究中。 关键词：可口革囊星虫、血细胞、形态结构、分类、单克隆抗体 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 a b s t r a c t f o u rm e t h o d sw e r eu s e dt oc l a s s i f yt h eh e m o c y t eo fp h a s c o l o s o m a e s c u l e n t a ，w h i c ha r ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n ，s t a i n e db yt h e w r i g h t s a n do b s e r v e d b y f l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e a n de l e c t r o n m i c r o s c o p e t h e t w ot y p eh e m o c y t e sc a nb es e p a r a t e db yd e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n ，w i t ht h eh y a l i n o c y t e sa n dg r a n u l o c y t c sm a i n l ya b o v ea n d b e l o wt h ei n t e r f a c e u n d e rf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e ，h a e m o c y t e sw e r e c l a s s i f i e di n t o h y a l i n o c y t e a n d g r a n u l o c y t e ，a c c o r d i n g t h ea u t o f l u o r e s c e n c eo fh e m o c y t e s s m e a r sw e r es t a i n e db yt h ew r i g h t sa n dt h e no b s e r v e du n d e rt h e l i g h tm i c r o s c o p e h y a l i n o c y t e sw e r es t a i n e dl i g h tp u r p l e t h e yd on o t c o n t a i nc h a r a c t e r i s t i cg r a n u l e s a m o n gg r a n u l o c y t e st w os u b t y p e sw e r e f u r t h e r d i s t i n g u i s h e d ：t h es m a i lg r a n u l a rc e l l s w a ss m a l l e rt h a n h y a l i n o c y t c s a n dc o n t a i nn u m e r o u sg r a n u l e si n c y t o p l a s m ，t h eb i g g r a n u l a rc e l l sa r ef i l l e dw i t hv e r yo b v i o u sl a r g eg r a n u l e s t h eg r a n u l e s w e r es t a i n e dp u r p l e o b s e r v e da tt h eu l t t a s t r u c t u r a l l e v e l b y e l e c t r o n m i c r o s c o p e ， h y a l i n o c y t e sw e r ea g r a n u l a ra n ds h o w e dr o u n d i s hn u c l e u ss u r r o u n d e db y r e l a t i v e l y s m a l l c y t o p l a s m o r g a n e l l e s a r e s p a r s e c o m p a r e dw i t h h y a l i n o c y t e s ，g r a n u i o c y t e sp o s s e s sr e l a t i v e l ym o r eg r a n u l e sa n do r g a n e l l e si nt h e i r c y t o p l a s m t w ot y p e so fg r a a u l o c y t e sc a nb er e c o g n i z e d s m a l lg r a n u l ec e l l s c o n t a i nal a r g ec e n t r a l l yl o c a t e di r r e g u l a r l ys h a p e dn u c l e u s ，m i t o c h o n d r i a ， s m a l lv e s i c l e s ，l y s o s o m e s ，g o l g ib o d i e s ，c i s t e r n a eo ft h ee n d o p l a s m i c r e t i c u l u m 。o s m i o p h i l i c m e m b r a n eb o d i e s ，a n dn u m e r o u sg r a n u l e so f v a r y i n ge l e c t r o nd e n s i t y b i gg r a n u l ec e l l sa r ec h a r a c t e r i z e db yl a r g e o s m i o p h i l i cc y t o p l a s m i ci n c l u s i o n s t h eb a l b cm i c ew e r ei m m u n i z e db yh a e m o c y t e so fp h a s c o l o s o m n e s u l e n s p l e e n sf r o mt h ei m m u n i z e dm i c ew e r ed i s s e c t e da n dc e l l sf u s e d w i t ha ns p 2 1 0m y e l o m ac e l l l i n eu s i n gp o l y e t h y l e n eg l y c o la sf u s o g e n h y b r i d o m a c u l t u r em e d i u mw e r ca s s a y e db ym e a n so fe n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y s ( e l i s a ) al o to fp o s i t i v eh y b r i d o m a sw e r ef o u n d a n d8o ft h e mw h i c hs e c r e th i g ht i l e ra n t i b o d yw e r er e s e r v e da t 一8 0 c e i g h tp o s i t i v eh y b r i d o m a sw e r ec l o n e d ( d b 3 、d b 5 、d c l 、d d l 、 ，2 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 e b 3 、e d l 、f a 4 、f c 3 ) a n da n a l y z e db ye l i s aa n di m m u n o m a g n e t i c b e a d st e c h n i q u e s t h e yw e r ep o s i t i v et oh a e m o c y t ei nd i f e r e n ti n t e r f a c e s o fg r a d i e n td e n s i t yc e n t r i f u g a t i o nd e t e c t e d b ye l i s a m a be b 3w a s p o s i t i v et oo fg r a n u l o c y t e ，m a bd d l 、e d lw a sp o s i t i v et op l a s m ao f h y a l i n o c y t e u s i n gi m m u n o m a g n e t i cb e a d st e c h n i q u e s ，m a bd d lw a s p o s i t i v et op l a s m ao fh y a l i n o c y t e s ，m a be b 3t op l a s m ao fg r a n u l o c y t e i n c o n c l u s i o n m a be b 3s e e m st ob ea v e r yp r o m i s i n gm a b t oi d e n t i f ya n d d j f f e r e n t i a t eg r a n u i o c y t e s a n dt h et h r e em a b sw i l lb eu s e dj nf u r t h e r s t u d i e so nc e l l u l a rd e f e n c em e c h a n i s mr e s e a r c t k e yw o r d s ：p h a s c o l o s o m ae s c u l e n t a ；h e m o c y t e ；m o r p h o l o g y ；c l a s s i f i c a t i o n ；m o n o c l o n a la n t i b o d y 3 一 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。 论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写 或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助， 均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：吾舅谚 日 期：叫t 弓 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论 文被查阅和借阏。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：孑诵摹 指导教师签名：谚锡氏一 日期：m f 7 6 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 第一章前言 可口革囊星虫( p h a s c o l o s o m ae s c u l e n t a ) 俗称海丁、沙虫，隶 属于星虫动物门( s i p u n c u l o i d c a ) ，革囊星虫科( p h a s c o l o s o m a t i d a e ) ， 革囊星虫属( p h a s c o l o s o m al e u c k a r t ) 。该种为我国的特有种，也是 我国星虫中种群数量较大的一个种，分布于我国东南沿海，广布于 广西、广东、海南岛、福建、浙江和台湾“”。可口革囊星虫肉味 鲜美、营养丰富，加工成品“沙虫干”是著名的海产珍品之一，深 受国内外消费者欢迎。做成。土蒜冻”制品具有滋阴降火、补肾益 智、泻火的功效，而被誉为海洋中的“冬虫夏草”“”除做食品 之外，可口革囊星虫还可入药，以可口革囊星虫作为主原料。配上 枸杞等中药炮制两成的复方星虫口服液，具有滋阴补肾、益智等作 用。 过去对星虫的利用主要依靠采摘野生资源。髓着人民生活水平 的提高，可口革囊星虫的需求量越来越大，而海区自然资源数量逐 年减少，产品供不应求，因此需要发展养殖业来满足市场的需求 近年来针对可口革囊星虫人工养殖和人工育苗方面有了一些报道 。“”，但由于目前对革囊星虫的免疫防御机制了解甚少，在普及人 工养殖方面还存在一定困难。在革囊星虫免疫防御功能上，血细胞 起着非常重要的作用。深入研究星虫血细胞的分子免疫机制，对于 提高星虫抵抗病原微生物的免疫力有着积极的意义。而单克隆抗体 技术在研究细胞受体和病毒入侵途径上具有准确，特异和直观的优 点，因此其在星虫免疫研究和诊断领域将大有作为。 1 1 星虫动物的生理活性和营养成分的研究进展 1 1 1 星虫动物门简介 星虫动物门是一个较小的动物门类。现有动物约3 0 0 种，下设 2 纲4 目6 科1 7 属：革囊星虫纲( p h a s c o l o s o i i i i d a ) ，包括盾管 星虫目( a s p i d o s i p h o n i f o r m e s ) 、革囊星虫日( p h a s c o l o s o m a f o r m e s ) ； 方格星虫纲( s i p u n c u l i d a ) ，包括戈芬星虫目( g o l f i n g i a f o r m e s ) 、方格星虫且( s i p u n c u l i f o r m c s ) 。我国估计有6 0 余种， 现仅发现4 0 余种“”1 。 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 星虫动物属于海生、闭管式循环的体腔动物，广泛分布于三大 洋中，除幼虫期外，皆营底栖生活。多数栖息在热带和亚热带浅海 泥沙内和珊瑚间j 川 星虫是具有食疗保健作用的功能性食品，其滋味鲜美，风味独 特，且在南方沿海产量较大，故自古以来就被沿海居民所食用。根 据中医理论，其性凉味寒，归肺、肾经，具滋阴降火、清肺热、祛 痰咳之功效，民间用作冬虫夏草代用品”。主治阴虚盗汗骨蒸潮 热，肺痨咳嗽等症”南海海洋药用生物中记载：“星虫：清 肺、滋阴降火，可治牙龈肿痛”7 中国药用动物志记载： 。健 脾，主治夜尿症。“”1 用作药材的星虫，除光裸方格星虫全体， 在浙江省尚有海冬虫夏草，即可口革囊星虫；海涂虫，即土钉虫 ( p h a s c o l o s o m ac h e n e 删e h ) 1 据研究，星虫含有人体需要的多 种氨基酸、微量元素和能够调节大脑功能的牛磺酸，具有增强机体 免疫功能豹作用。由于其风味独特、经济价值及药用价值较高，是 非常理想的优良增养殖种类“ i 1 2 星虫生理活性的研究 现代医学研究表明星虫含有多种活性物质，能够调节机体多种 机能。早在1 9 8 1 年，浙江中医学院就对星虫进行了药理实验3 发现星虫的水煎醇沉液具有以下几方面的效果。 1 管系统的作用：麻醉犬静脉注射星虫承煎醇沉液0 ，6 1 5 g k g ，在短暂轻度降压后，血压迅速上升对失血性血压升压幅度 大于正常血压犬。该提取液可使离体兔心，活体犬心冠脉血流量增 加。水煎醇沉液1g k g 静注，可使犬心律、心输出量均增加。还 可使离体兔耳灌流量显著减少，静注可拮抗血管舒缓素产生的扩张 犬血管作用。酚妥拉明和普萘罗尔能部分阻断星虫的心血管作用。 2 增强耐缺氧能力： 1 0 0 星虫水煎醇沉液沉淀0 2m l 1 0g 给小鼠腹腔注射，显 著提高小鼠负压缺氧耐受力。预先给予大剂量普藜罗尔，星虫的保 护作用不明显。 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 3 镇静、镇痛及兴奋平滑肌： 1 0 0 星虫水煎醇沉液0 2m l 1 0g 给小鼠腹腔注射，对小鼠 自发话动有抑制作用，对酒石酸锑钾所致扭体反应有抑制作用。星 虫对离体肠段，子宫有轻度兴奋作用，使自主收缩频率、张力略增， 对肾上腺素所致肠段松弛，兴奋作用明显。 4 毒性：星虫水煎醇沉液小鼠腹腔注射的l d ；。为( 2 2 4 3 i 0 1 ) g k g 。星虫对家兔尿量、小鼠凝血时间均无显著影响。 1 9 9 0 年，福建中医学院又对星虫的制成品一土蒜冻进行了药学 研究】。从1 9 9 7 到2 0 0 3 年的几年问，又对复方星虫口服液进行了 包括急性毒性和长期毒性”、致突变力”、对小鼠免疫功能的 影响和药效学方面仲5 1 的研究。急性毒性试验说明该制剂无毒。 药效学实验证明该制剂可显著延长小鼠耐缺氧时间和抗疲劳时闻。 并对小鼠的体液免疫和细胞免疫功能均有较强的促进作用。致突变 试验表明该制剂临床使用是安全的，无遗传毒性。2 0 0 3 年和2 0 0 4 年，海军医学研究所先后对海洋星虫提取物的抗疲劳作用”及延 缓衰老作用进行了研究。实验采用含0 1m o l l n a c l 的1 0m m o l l 的磷酸缓冲液( p h 7 2 ) 抽2 4h 。9 0 0 0 9 离心3 0m i l l 。上清液经截漉 相对分子量为1 0 万的超滤膜超滤，滤液离心所得沉淀再用0 1 m 0 1 l 的n a o h 碱解4 0m i n ，用盐酸调节p h 7 2 ，9 0 0 0g 离心3 0m i n ， 上清液同样用截流分子量为1 0 万韵超滤膜板式超滤器超滤。所得滤 液冷冻干燥，最后得到自色粉末8 0g ，即为星虫提取物。随后的动 物实验证明提取物能够显著延长小鼠负重游泳时问并显著加快运 动后小鼠血乳酸的消除、降低运动后小鼠血清尿素氮水平及显著延 长雌雄果蝇的平均寿命。 1 1 3 星虫营养物质的分析 近几年，为了更好地合理开发和保护可口革囊星虫，一些科学 家对可口革囊星虫的基本营养成分，无机元素、氨基酸和脂肪酸的 组成和含量进行分析和评价。 胡笑从托引用原子吸收光谱法全面系统地对星虫肉中微量元素 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 含量进行分析测定、评价星虫肉中的微量元素的含量。结果表明样 品中营养元素赫g 、e a 、f e 、z n 、s e 等含量丰富，两有害微量元素， 如a s 、p b 、c d 等含量低。为星虫的经济价值、营养价值以及药用 功能的进一研究和开发利用提供了重要依据 从其测定结果可以看出，星虫中各微量元素的含量从高到低 依次为：k n a m g c a f e z n c u n i m n c r s e s n c d c o a s p b 常量元素k 、n a 、m g 、c a 是人体内必需的宏量元素，星虫中含量丰 富常量元素c a 是骨骼、牙齿、软组织结构的重要成分，并参与机 体的能量代谢。f e 和z n 捧在这四者之后，含量也较高。f e 、z n 、 c u 参与多种酶活性中心的构成，对核酸、蛋白质的合成及免疫过程 都有直接或间接作用。微量元素m n 在增强人体免疫功能、抗衰老 补肾壮阳方面有重要作用”。可口革囊星虫中s e 元素含量为0 2 3 m g 1 0 0g ，z n 元素含量为1 9 8 3m g 1 0 0 9 “，s e 和z n 能改善机体 免疫状态及新陈代谢，并周抗癌、抗衰老、治疗溃疡性疾病等有关， s e 作为谷光苷肽过氧化物酶的活性中心元素，参与机体的物质能量 代谢，为人体生长发育所必需，s e 可以防治克山病、大骨节病，能 增强机体的免疫能力，抑制心血管疾病的发病，可抗癌、防癌，预防 老年病等；z n 与人体的生长发育、生殖及寿命密密切相关，是母 婴健康、新生儿大脑发育、儿童智力发展、身体发育的必需微量元 素。 微量元素与人体的各项生理机能有着密切的联系，体内缺乏微 量元素或微量元素过多会导致多种疾病。人体内微量元素主要来自 食物。因此，星虫的营养价值与其所含的微量元素有着密切关系。 它能对人体所缺乏的各种元素起到补充调节作用 蒋定文，沈先荣等从海洋星虫制备得到海洋星虫提取物，测定 其提取物中蛋白质含量高达5 5 3 ，富含牛磺酸( 3 1 2 ) 、精氨酸 ( 6 7 2 ) 及人体必需氨基酸“。黄晓春、苏秀荣等对可口革囊星虫 的氨基酸进行测定，结果表明星虫的氨基酸含量高，种类齐全，包括 了人类的全部8 种必需氨基酸，几乎占到所测1 8 种氨基酸的1 2 。 所测氨基酸中谷氮酸含量最高，天门冬氨酸次之，甘氨酸、亮氨酸、 丙氨酸、赖氨酸和精氨酸含量也较高”1 。 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 谷氨酸不但是鲜味氨基酸，还是脑营养剂，是人类消耗最多的 一种氨基酸，能促进神经细胞兴奋，对大脑功能和中枢神经系统的 正常活动具有重要意义，用于治疗小儿神经发育落后、神经衰弱和 提高智力等。天门冬氨馥含量( 4 6 1 ，4 9 4 ) 次之，甘氨酸、亮氨酸、 丙氨酸、赖氨酸和精氨酸含量也较高。大量研究表明，大剂量精氨 酸除了具有显著的免疫促进作用外，也常用于治疗肝昏迷，近年来 研究发现，精氨酸与精子的生成有关，可治疗由于精子数量减少所 致的原发性男性不育症“”1 。 一种营养价值较高的食物蛋白质不仅所含水量的必需氨基酸 种类要齐全，而且必需氨基酸之间的比例也要适宜，最好能与人体 需要相符合，这样必需氨基酸吸收最完全，营养价值最高。局化斌将 可口革囊星虫与温州沿海的几种海洋生物比较，发现干样中必需 氨基酸的含水量高于小荚蛏、泥蚶、长竹蛏和星虫状海葵，低于嫁 虫戚盯1 。根据f a o w h o ( 1 9 7 3 ) ”提出的人体必需氨基酸均衡模式 进行比较，可口革囊星虫中必需氨基酸之间的比例基本符合人体需 要。可见。可口革囊星虫的氨基酸配比合理。易于被人体吸收，是营 养价值高的完全蛋白质。同时其赖氨酸的含量较高占必需氨基酸总 量的1 9 4 2 ，略低于泥蚶。但高于小荚蛏，长竹蛏、嫁虫戚和星虫 状海葵，赖氨酸是人体必需氨基酸之一，由于人体不含赖氮酸转化 酶，自身不能合成，所以完全依靠外界食物供给。根据现代营养学理 论。赖氨酸有利于提高儿重食欲，增进钙的吸收，促进生长发育。 可口革囊星虫脂肪酸的含量相对较高，不饱和脂肪酸( u f a ) 的 含量高于饱和脂肪酸( s f a ) 。占总脂肪酸的8 1 2 2 ；不饱和滕肪酸中 高度不饱和脂肪酸( h u f a ) 的含量较高，占总脂肪酸的5 4 2 7 。 c 2 0 ：5 ( e p a ) 和c 2 2 ：6 ( d h a ) 的含量分别为3 9 和0 1 2 。高度不饱 和脂肪酸( h u f a ) 。具有很强的生理活性，是动物生长发育所必需的 物质，能够抗血栓，防止血小板聚结，舒张血管，降低胆固醇和甘油 三脂的综合作用，增高高密度蛋白胆固醇，降低低密度蛋白胆固酵， 从而降低血液枯度，使血压下降 ”。- 3 系列高度不饱和脂肪酸 都具有生物活性，尤其d h a 和e p 已被生物化学家公认为具有高度 生物活性的物质能竞争性地椰稍脂肪氧化酶等作用，从而抑制血 小板的聚集，养活血栓的形成，预防心脏血管梗塞，人体不能合成这 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 些不饱和脂肪酸，必须从食物中摄取”。 综上所述，星虫含有丰富全面的营养物质，蛋白质和不饱和脂 肪酸含量高，氨基酸种类齐全，各种氨基酸的比例比较接近联合国 穰农组织( f a o ) 1 9 7 3 年规定的人体必需氨萋酸均衡模式标准，无机 元素种类多，富含多种人体新陈代谢所必需的微量元素。可口革囊 星虫的开发，符合当前广大人民群众追求营养丰富，风味独特、种 类丰富、口味多样的绿色健康饮食文化需要，是一种开发前景较好 的小型海洋经济动物。 1 2 单克隆抗体技术及应用 众所周知，7 0 年代开始的生物工程技术将人类带入一个新时 代。1 9 7 5 年k o e h l e r 和m 订s t e i n 创造了杂交瘤技术，经过不断提 高，单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y ) 己经应用于生物学各个领 域。免疫学知识告诉我们，当异种蛋白进入机体后，因其具有多个 抗原决定簇，可激发b 淋巴细胞形成许多不同的浆细胞群，并进一 步分化，产生针对不同抗原决定簇的混合抗体，如何将这些混合抗 体相互分离开来，是生物学家多年梦寐以求的愿望。上面提及的两 位科学家在细胞融合的基础上创立了淋巴杂交瘤技术，在世界上首 次获得了单克隆抗体( m c a b ) 从而使昔日的梦想变为现实本文将介 绍m c a b 的概念、建立方法和应用。 1 2 1 淋巴细施杂交瘤和单克隆抗体技术介绍 动物体内的b 淋巴细胞群体可产生多达百万种以上的特异性抗 体。但研究发现，b 淋巴细胞都只能分泌一种特异性的抗体。显而 易见，如果要想获得大量的单一抗体，就必须从一个b 淋巴细胞出 发，使之大量繁殖成无性系细胞群体，即克胫。而由这种克隆制备 到的单一抗体称为单克隆抗体。 1 9 7 5 年，联邦德国k o h l e r 和阿根廷m i l s t e i n 两位学者用细胞融 合技术，进行体细胞杂交制备单克隆抗体。这是人类首次能按自己 的意图在体外产生预定的针对某一抗原决定簇单抗的里程碑。2 d 多年的实践检验，这个最基础的开创性理论研究在生物学和医学各 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 领域产生巨大的影响，以致被誉为免疫学中的一次革命。1 9 8 5 年l o 月1 5 日，k o h l e r 和m i ls t e i n 荣获1 9 8 4 年度的诺贝尔医学奖“。 b 淋巴细胞杂交瘤技术不但将淋巴细胞产生单一抗体的能力和 骨髓瘤细胞无限增生的可能性巧妙地结合起来，并且可以通过融合 后进一步的筛选获得具有期望专一性的抗体。 单克隆抗体的最主要优点在于它的抗原决定簇专一特异性、抗 体分子均一性、灵敏性以及无限量制备的可能性研究人员可以根 据需要，制备针对各种抗原物质上特定抗体识别位的单抗。所以单 抗己被生物学研究、疾病诊断和治疗，以及多种大分子物质的制备 和纯化等领域广泛应用，成为现代生命科学领域中不可缺少的生物 学研究工具。 1 2 。2 单克隆抗体技术的基本原理 分泌抗体的正常细胞一般不能在体外长期培养生长，所以将具 有无限增殖能力的肿瘤缀胞和经抗原栽澈韵免疫细胞通过诱导，按 比例混合融合成杂交瘤细胞 在含有氨基喋吟( a ) 、次黄嘌吟( h ) 和胸腺嘧啶核苷( t ) 的选择 性培养基( h a t 培养基) 中，只有杂交瘤细胞才能生存。而未融合的 其它细胞都会死亡。因为正常细胞具有核酸合成主要通路和旁路 所必需的酶，但不能在体外长期生长：瘤细胞只具有r n a 和d n a 合成 所必需的主通路的酶，而缺乏利用胸腺嘧啶核苷合成d n a 的胸腺嘧 啶核苷激酶( t k ) 或利用次黄嘌吟合成r n a 的磷酸核糖转移酶( h g p r 了 其中的一种酶。在h a t 培养基中细胞的核酸合成主要通路被氨基喋 吟( a ) 阻断后，非杂交瘤细胞则因核酸合成障碍或不能在体外长期 培养生长而死亡。杂交瘤细胞具有瘤细胞和抗体分泌细胞双重特 征，在h a t 中得以生存”。 阳性克隆孔中需进一步用有限稀释法从多克隆杂交瘤细胞的 混合群体中分离出单克隆的杂交瘤细胞，筛选出识别特异性抗原的 抗体分泌克隆，才能最终得到特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 1 2 3 单克隆抗体制备的基本方案 1 2 3 1 一般抗原制备和免疫途径 免疫动物用的抗原可分为颗粒性抗原和可溶性抗原。颗粒性抗 原( 如动物细胞) 一般都有良好的免疫原性，可直接免疫动物，但细 胞表面的抗原性成分复杂，给特异性细胞克隆的筛选带来困难。可 溶性抗原的免疫原性主要取决于化学结构和分子量，大分子多肽抗 原性较好，分子量较小的肽或其它半抗原物质，可用福氏完全佐剂 混合，制成油包水乳剂进行免疫。选择进行免疫的动物必须对刺激 的抗原具有良好的以特异性抗体( a b ) 产生为特征的免疫应答能力。 在实际工作中，b a l b c 纯系小鼠应用最为广泛，一般选用4 周龄的 雌性小鼠迸行初次免疫。 免疫途径和计划一般采用：第一次用腹腔注射完全佐剂和大剂 量抗原激发免疫应答，间隔3 周后，用不完全佐剂和抗原作第一次 加强免疫，再间隔1 周后，用抗原作第二次加强免疫，再问隔1 周后， 进行第三次加强免疫，在第三次加强免疫后第3 天无菌取脾，进行 细胞融合1 。 1 2 3 。2 骨髓癯细胞的选择和培葬注意事项 b 细胞杂交瘤细胞克隆既能遗传决定正常浆细胞特定抗体特异 性的基因物质。也具有骨髓瘤细胞所特有的能在体外无限增殖的潜 能。杂交瘤细胞是由两个亲本细胞融合而成，它兼有两个亲本细胞 的无限增殖和产生抗体的特性。亲本细胞的生理状态和免疫功能是 细胞融合是否成功的关键，故必须加以慎重选择小鼠骨髓瘤细胞 有多种可供选用。一般首选在实验室条件下能迅速大量繁殖的瘤细 胞系，同时还要考虑所用癌细胞是否产生或分泌小鼠本身的免疫球 蛋白 n s - l 细胞系是p 3 一x 6 3 一a 9 8 的一个变异株，仅在胞质内产生原细 胞系的i g gk 链，但不分泌至细胞外。s p 2 oa g l 4 则是杂交瘤细胞 系，它己完全失去产生抗体的能力，因此多被采用一般多用b a l b c 小鼠腹腔注射矿物油或2 6 。1 0 ，1 4 一四甲基五葵烷后，接种杂交细 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 胞株，使其在腹腔内大量生长，腹水中含有大量的单抗_ 圳。 在进行细胞培养中，除了细胞来源、培养液以及培养器具等要 严格按实验要求准备外，还应注意定浓度的营养液仅能支持一定 数量的细胞的生长，因此，要及时换液：培养起始的p h 为7 4 最合适， 当p h 低于6 8 时对细胞生长有抑制作用：在一个密闭培养系统内保 持留有足够空气的空问是非常必要的：细胞需要高浓度氧的，在浅 的培养液( 2 r a m ) 中生长较好：细胞需求低氧的，则培养液深度较深比 较好( s m m ) ：但培养液的深度大于5 m m ，气体扩散可能受到限制。 1 2 3 3 细胞融合 融合细胞可以通过化学、物理、和生物学三种方式获得。生物 学方法，主要以病毒( 仙台病毒h v j ) 为媒介，在病毒酶作用下产生 融合细胞：物理学方法是甩特定波长及波型的电脉冲诱导细胞融合： 化学方法常用聚乙二醇( p e g ) 作细胞融合诱导剂，p e g 对细胞是一种 毒性物质，操作中应严格掌握作用时间和强度，以浓度4 5 ，分子 量2 0 0 0 为宜 1 2 3 4 筛选特异性杂交癌细胞 一般采用荧光抗体技术( f a t ) 和酶联免疫吸附试验( e l i s ) 作 为阳性克隆筛选方法。 1 2 3 5 杂交癌细胞的单克隆培养 可采用有限稀释法，软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激 活分类器等方法。 1 2 3 6 大量制备单克隆抗体 细胞培养法、微囊培养法、腹水法、大规模灌往培养法、中空 纤维细胞培养系统。 l 。2 3 。7 单克隆抗体纯化 硫酸铵沉淀法、超滤法、盐析法。 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 1 2 4 常用的两种筛选特异性杂交瘤细胞的技术 1 r 4 i 荧光抗体技术( f a t ) 它具有免疫学反应的特异性和荧光技术的敏感性，其基本原理 是：以荧光素标记抗体或抗原，使其与相应抗原或抗体相结合后， 借助荧光检测仪察看荧光现象或测量荧光强度，从而判断抗原或抗 体的存在，定位和分布情况或检测受检标本中抗原或抗体含量。荧 光素一般选用异硫氰酸荧光黄( f i t c ) ，四乙基罗丹明、丫啶橙、溴 化乙锭等。 1 2 4 2 酶联免疫吸附试验( e l is ) 酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 是一种固相的非均相酶免疫测定 法，e l i s a 的基本原理是：受检物中的抗原或抗体与固相表面的抗体 或抗原发生免疫反应并结合在固相表面，此抗原抗体复合物又脂结 合相应的酶标记物，用洗涤方法除去未结合而游离的酶标记物，继 加酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产物，显色的程度与受检 物中的抗原或抗体的量直接相关由此，可根据显色的深浅进行定 性和定量测定。由于该法具有操作简便、灵敏度高、特异性好、试 剂稳定、结果容易判断等优点，使其成为免疫测定中应用最为广泛 的一项技术。 1 2 5 单克隆抗体的应用 1 2 5 1 在食品检测上的应用 随着生活水平的提高，人们对食品卫生的要求也越为严格，尽 管科学家考虑到影响食品卫生的各种因素，但全世界每年还有许多 食物中毒发生。如何迅速准确一检测出引起中毒发生、如何迅速准 确一检测出这些引起中毒的病原微生物和毒素，这个问题深受食品 科技工作者关注，目前己取得可喜成绩。如沙门氏菌检验，按常规 法从采样、增菌、培养、鉴定到出结果共需7d ，费时、费力、费 钱，将许多检测人员来束缚于繁琐劳动的枷锁中。单抗技术的应用 为食品侠速检测带来福音。国内已初步研制成抗沙门氏菡单抗的试 剂盒，在沙门氏菌检测中，不需要经过三糖铁和生化反应，而只需 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 检测选择性增菌液即可，整个检测周期只需2d ，并具有高度的准 确性和敏感性。除此之外国内外还相继建立了弯曲杆菌、大肠杆菌、 志贺氏菌的单抗检测体系。在霉菌检测上变已开始用单抗检测牛奶 及其制品中黄曲霉毒素。在食源性寄生虫检测方面如何在宰前快速 判断待宰猪是否带虫一直是科学家们苦苦探求的课题之一，由于寄 生虫自身的独特性，它的抗原成份复杂，并且有些寄生虫在不同的 生活周期抗原性也不一样，用单纯的血清学方法来鉴定往往造成假 阳性问题，给生产带来不利影响。现在利用生化技术，用提纯寄生 虫的几种特定抗原制备的混合单抗用来检测猪弓浆虫、猪囊虫、猪 旋毛虫，能大大缩短检测时间。 1 2 5 ，2 应用单克隆抗体对病原体进行分型和对抗原结构进行精 细研究 用常规血清对细菌，病毒和寄生虫进行分类既费时又不准确， 单克隆抗体可克服这方面问题。在寄生虫的研究中，一个较大困难 就是抗原的复杂性，无法区分寄生虫种、株抗原问的差异，使用单 抗技术可以解决。p r a t t 制备了1 6 株抗墨西哥利什曼原虫或巴西 利什曼原虫的反应的单抗，其中单抗b 7 至b 1 4 株，可与全部巴西 利什曼原虫反应，但不与墨西哥荦j 什曼原虫亚马逊亚种原虫反应， 从而便利地将巴西利什曼原虫3 个亚种区分开来。t o r i a n 用单抗 对阴道毛滴虫的研究证明它至少有两个抗原型，m u r r e n 和m u s o r e 用1 0 株单抗将泰勒原虫分成了3 个抗原型。国内有关研究单位用 马立克病毒三个血清型特异型单抗对马立克病毒进行的血清反应 表明，对同源病毒反应强烈滇度很高，两对不同源病毒完全没有反 应。 1 2 5 ，3 用于抗原物质的纯化 单抗免疫吸附亲和层析法可用于抗原纯化，特别对那些含量 低、难和其它物质分离的抗原。对一些未知抗原的纯化，将有利于 弄清结构和功能，如单克隆提纯干扰素，使纯度比原来提高1 0 0 倍， 此外还可提纯甲胎蛋白，人血凝因子v 等。 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 1 2 5 4 在肿瘤方面的研究 肿瘤细胞上存在有肿瘤特异性抗原。近年来科学家们正集中精 力寻找肿瘤特异性抗原和相关抗原研究人员发现人体细胞致癌基 因至少有1 3 种已搞清定位染色体上的己超过l o 种。癌基因并不 是肿瘤细胞才有，正常细胞也有这种基因，仅当这种基因发生变位、 缺失和突变时才导致癌变。如何识别这种不同于正常机体的肿瘤细 胞抗原是早期诊断肿瘤的重要手段之一，而研究鉴定肿瘤抗原最有 力的工具是m c a b 。人类淋巴瘤时至假日在分型上仍很混乱，单纯 人组织学形态上进行分类越来越不能适应研究的需要，国内外学者 目前都致力于通过单抗技术对白血病进行深入细致的分类己取得 很大进展在兽医学上利用单抗技术区分马立克病和鸡白血病，这 无疑会促进对这两种鸡肿瘤病发病学上的研究。另外在肿瘤治疗学 上单克隆抗体也显示出无与伦比的优越性，目前使用的抗肿瘤药副 作用大。关键是这类抗胂癌药在杀伤肿瘤细胞的同时还可能造成对 健康细胞的损害。6 0 年代早期，英国剑桥大学率先使用单克隆抗 体联接抗肿瘤药，使它尤如导弹样能准确捕获肿瘤细胞并将其杀 死，现己进行临床实验 1 2 5 5 基础学科上的应用 单克隆抗体己广泛用于病理、免疫、遗传等学科的研究，用单 抗能同相应抗原决定簇发生特异反应的特点，研制出b 细胞系列和 t 细胞系列的，它们有利于研究个体基因型、抗体合成、抗体结构 t 杂交瘤细胞株的建立，使得人们有可能在体内针对某一个t 细胞 亚群的单个克隆进行研究并鉴定它们的表型，功能及释放的各种湛 巴因子，确定其表面受体的性质和各种微细特异性等，这对于从细 胞和分子水平上了解和探明种类免疫活性细胞问的相互作用，细胞 间信息传递，淋巴因子的调控作用等具有重要意义。 1 2 5 6 单克隆抗体及其在血细胞分类及分化上的应用 1 9 7 5 年，联邦德国k o h l e r 和阿根廷m i l s t e i n 两位学者报道 用细胞融合技术，使经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤 细胞相融合，建立能定向产生抗绵羊红细胞的单抗( m c b ) ，并指出 可口革囊星虫血细胞的分类和单克隆抗体的制备 在体外可将所得细胞大规模培养以提供特异性抗体。这是人类首次 能按自己的意图在体外产生预定的针对某一抗原决定簇单抗的里 程碑，从而将科学家们的梦想付诸现实。2 0 年的实践检验，这个 最基础的开创性理论研究在生物学和医学各领域产生巨大的影响， 以致被誉为免疫学中的一次革命。 近几年，应用单克隆抗体技术研究无脊椎动物( 水产) 的报道不 断增多，t i m o t h y ( 1 9 8 3 ) 研制出5 株腹足类( b i o m p h a l a r i a g l a b t a t a ) 循环血细胞膜表面抗原的单克隆抗体，并用其将血细胞 分为四类：k a n o s t ( 1 9 9 4 ) 通过研制昆虫( m a n d u c as e x t a ) 血细胞亚 群的单克隆抗体，应用免疫细胞化学技术定位将血细胞分为三类； s c a p i g l i a t i “ ( 1 9 9 7 ) 研制出昆虫( b a c i l l u sr o s s i u s ) 血细胞单 克隆抗体，得出只与细胞防御反应因子中的分子量为1 8 0 ，0 0 0 道 尔顿的多肽结合；s c a p i 9 1 i a t i ( 1 9 9 9 ) 利用研制的昆虫( s a c i l l u s r o s s i u s ) 血细胞的单克隆抗体研究血细胞的发生及分化过程，发现 该种血细胞在卵期、胚胎期及发育后第五周都出现；s t r a n d ( 1 9 9 9 ) 通过研制蛾类( p s e u d o p l u s i ai n c l u d e n s ) 血细胞单克隆抗体将血 细胞分为5 类；f u k u m o t o ( 2 0 0 1 ) 研制被囊动物( h a l o c y n t h i a r o r e t z i ) 大颗粒细胞的单抗并解析该种细胞的发生及分布； r e n a u l t ( 2 0 0 1 ) 利用研制出的欧洲牡蛹( o s t r e ae d u l i s )