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核质转运受体家族系统进化和表达调控的生物信息学研究 摘要 核质转运受体家族成员( k a r y o p h e r i nb s u p e r f a m i l y ) 介导了真核生物中大多 数生物大分子的跨核膜运输。目前人们已经发现了不同生理发育条件下细胞对底 物核质转运的多种调控机制，但对于该家族成员的系统进化与基因表达调控尚知 之甚少，因此我们采用生物信息学方法对这些未知的领域进行了初步的探索。通 过对8 个物种( 酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、爪蟾、原鸡、小鼠和人类) 中的核 质转运受体家族成员构建系统发生树，我们发现酵母中的10 个核质转运受体祖 先( k a p 9 5 ，k a p l2 3 ，k a p l14 ，k a p l 2 0 ，k a p l2 2 ，c r m l ，m s n 5 ，l o s l ， m t r l 0 和c s e l ) 与果蝇的x p 0 6 祖先，这1 1 个祖先直接进化为高等真核生物 体内相应的直系同源物；而酵母中的另外4 个祖先( k a p l 0 4 、n m d 5 s x m l 和 p s e l ) 和线虫的x p 0 7 祖先则在进化的过程中发生了基因倍增或内含子缺失事 件，最终进化为相应的旁系同源物。同时，我们研究了核质转运受体成员的表达 分布，发现绝大多数家族成员在人体各组织器官中普遍表达，但表达量有所差异； 在小鼠胚胎发育的过程中核质转运受体的表达量也被精确地调控着。进一步研究 该家族基因的表达调控机制，发现大部分家族成员的启动子区呈现管家基因的调 控方式，而s p 1 、c e b p 、m a z 和n f 一1 可能是起始或调控基因转录的关键因 子。这些发现有助于我们进一步理解随着真核生物生理功能日趋复杂，核质转运 受体家族成员在功能上与表达调控上更加多样化与精确化的趋势。 关键词：核质转运受体；系统进化；表达调控 核质转运受体家族系统进化和表达调控的生物信息学研究 a b s t r a c t k a r y o p h e r i nbs u p e r f a m i l yp r o t e i n sm e d i a t em o s tn u c l e o c y t o p l a s m i c t r a n s p o r to fm a c r o m o l e c u l e si ne u k a r y o t e s p r e v i o u ss t u d yh a sd i s c o v e r e dt h e p h y s i o l o g i c a la n dd e v e l o p m e n t a lr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fn u c l e o c y t o p l a s m i c t r a n s p o r t ，w h i l el i t t l e i sk n o w na b o u tt h ee v o l u t i o na n de x p r e s s i o np a t t e r no f k a r y o p h e r i nbf a m i l y i nt h i ss t u d yw eu s eb i o i n f o r m a t i c sa p p r o a c h e st o i n v e s t i g a t et h eu n c o v e r di s s u e s b yc o n s t r u c t i n gt h ep h y l o g e n e t i ct r e eo f k a r y o p h e r i nbf a m i l ym e m b e r si ns c e r e v i s i a e ，c e l e g a n s , d m e l a n o g a s 招5d r e r i o , x t r o p i c a l i s g g a l l u s , m m u s c u l ua n dh s a p i e n s , w ep r e s u m e dt h a tt e n k a r y o p h e r i na n c e s t o mi ns - c e r e v i s i a e ( k a p 9 5 ，k a p l2 3 ，k a p l 14 ，k a p l 2 0 ， k a p l2 2 ，c r m1 ，m s n 5 ，l o s l ，m t r l0a n dc s e l ) a n do n ea n c e s t o ro fx p 0 6 i n d m e l a n o g a s t e r e v o l v e d i r e c t l y i n t ot h e i rh u m a n o r t h o l o g s w i t h o u t d i v e r s i f i c a t i o n t h eo t h e rf o u ra n c e s t o r si n s c e r e v i s i a e ( k a p l0 4 、 n m d 5 s x m l 和p s e l ) a n do n ea n c e s t o ro fx p 0 7i nc e l e g a n se x h i b i tg e n e d u p l i c a t i o no ri n t r o nd e l e t i o n ，t h e ne v o l v ei n t ot h e i rp a r a l o g si nh u m a n f u r t h e r s t u d yo ft h e i rg e n ee x p r e s s i o np a t t e r n ss h o w e dt h a tm o s tk a r y o p h e r i n sa r e u b i q u i t o u s l yb u tu n e v e n l ye x p r e s s e di nd i s t i n c tt i s s u e sa n do r g a n s i nm i c e ， t h et i t e ro fs o m ek a w o p h e r i n s t r a n s c r i p t sa p p e a mt ob ep r e c i s e l yr e g u l a t e d d u r i n gd e v e l o p m e n t f u r t h e rv i r t u a la n a l y s i so fp r o m o t e rb i n d i n ge l e m e n t s s u g g e s t st h a tm o s tk a r y o p h e r i ng e n e sa r er e g u l a t e da sh o u s i n g k e e p i n gg e n e ， a n dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r sc e b p , m a z ，n f - 1a n ds p 一1m a yp l a yt h ek e yr o l ei n i n i t i a t i n ga n dr e g u l a t i n go fm o s tk a r y o p h e r i ng e n e s e x p r e s s i o n t h e s ef i n d i n g s g i v e u sb e t t e r u n d e m t a n d i n g o ft h em e c h a n i s m si nt h ef u n c t i o n a la n d t r a n s c r i p t i o n a l d i v e r s i f i c a t i o no f k a r y o p h e r i n b f a m i l yd u r i n ge u k a r y o t e e v o l u t i o n k e yw o r d s ：k a r y o p h e r i nb ：p h y l o g e n e t i ce v o l u t i o n ；t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o n 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人( 签冬) ：王漏 2 o o | 年1 3 其s 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 1 保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 不保密() ( 请在以上相应括号内打“4 ) 作者签名：王谭日期：o 秒口7 年殷 月巧日 导师签名： 习摊日期：厶呀年 犀o兮q田o，d记6西01oo击会oooooo卜正oz山击o岭oooooo卜正z山西noooooo上1oz山击西nnoooooo卜fll至z山o高ooooo上sz山状呆求q一函粥暖则v-1乏山z山血长嗥籁 。懈仅舔枯卅嘲武窖岳熏霉牛 l 一葡oido墨 。困醐嚣叵垛锄状因醐g靼礤聚谳镫醴区礤1匠卜文。站链，哥舞，霉眯，羽胛蜜，蟹乓，霞隧，蓝、f，糕 i 芝西乱z 正ev一埘正口2 心口i - n o q 卜山)i霜一协k 螂雄 田z i _ 山q 式o k o i - 正毫n日=一pol-芟 哼皿：一 i n 1 1 兮焉no t正“秀 n z ： 可= 一 l _ ：正oo“i-oi_卜“ni_乱d2onl山蔓 i ： o 芝z叶= t 受 哼：一 i _ 山山 竹由n k _ 正v ) i 童怒gc耍o c砸58leo 霉rl8每os 协_匕一c母西llo西coe西西oco西ckdll盘。套仃)-o x 母；c _ 仃4 co；：一o。-o芑母pop二了西。工卜寸。一d_，上 。剥辎晕岌g乎接s牛柑瑙搽茸似心毒毒蟮辎寸琳 妖蠢扑硇逛s划g辍举图样品睾制螺瞵辎搽故杈蚓喜毒峰蜒 核质转运受体家族系统进化和表达调控的生物信息学研究 爹o f i g u r e8 ：p h y l o g e n e t i ct r e eo f4 6k a r y o p h e r i nbs u p e r f a m i l ym e m b e r s t h et r e ei sb a s e do np r i m a r ys e q u e n c e so fo d h o l o g o u sp r o t e i n so fh u m a nr a n b p 5 ， r a n b p 6 。i p 0 7 ，i p 0 8 ，x p 0 4 ，x p 0 6 ，x p 0 7 ，r a n b p l 7 ，t n p 0 1 ，t n p 0 2a n dx p o t f r o m6o r g a n i s m st gg a l l u s , t r o p i c a l i s , d r e r i o , d m e l a n o g a s t e 5c e l e g a n sa n ds c e r e v i s i a e ) u s i n gt h ek a p 9 5p r o t e i nf r o ms c e r e v i s i a ea so u t g r o u p i tw a s c o n s t r u c t e d b yu s i n gt h en e i g h b o rj o i n i n gm e t h o du n d e rt h es u b s t i t u t i o nm o d e lo f “p - d i s t a n c e ” p r o v i d e db ym e g a 3 1 图8 ：核质转运受体家族4 6 个成员进化树 采用人类的r a n b p 5 ，r a n b p 6 ，i p 0 7 ，i p 0 8 ，x p 0 4 ，x p 0 6 ，x p 0 7 ，r a n b p l 7 ， t n p 0 1 ，t n p 0 2 和x p o t 蛋白质在6 个物种( 原鸡、爪蟾、斑马鱼、果蝇、线虫、酵 母) 中的直系同源蛋白质序列。利用k a p 9 5 做外标，使用m e g a 3 1 工具，采用邻接法 和“p 距离”。 核质转运受体家族系统进化和表达调控的生物信息学研究 然而并非所有的核质转运受体成员都起源于酵母。例如：转运肌动蛋白( a c t i n ) 出核的e x p o r t i n6 在细胞的生命活动中发挥重要的作用删，但是在酵母( s c e r e v i s i a e ) 和线虫( c e l e g a n s ) 中却没有发现它的身影。系统发生树显示x p 0 6 的祖先最早出现在果蝇( d m e l a n o g a s t e t ) 中，逐渐进化为人类的直源同源基因 x p 0 6 。同样在酵母中也没有发现x p 0 4 、x p 0 7 和r a n b p l 7 的存在，推测这 三个成员可能在酵母之后、线虫之前起源于一个共同的未知祖先( 图8 ) ；大约 在果蝇之后、斑马鱼( d r e r i o ) 之前，x p 0 4 开始从这个共同祖先中分离出来独立 进化：而这个祖先则进化成为x p 0 7 ，并在爪蟾( xt r o p i c a l i s ) 之后、原鸡( gg a l l u s ) 之前通过基因倍增事件产生了r a n b p l 7 。 通过同源分析与序列比对，我们也发现了一些核质转运受体家族的新成员 ( 表4 ) 。例如：原鸡中的l o c 4 1 8 7 8 3 和l o c 4 2 7 2 1 9 可能分别是人类r a n b p 6 和t n p 0 2 的直系同源基因。 2 4 讨论 在进化的历程中t n p 0 2 、r a n b p 6 、i p 0 8 和r a n b p l7 作为新基因的产 生具有怎样的意义? 它们与母基因t n p 0 1 、r a n b p 5 、i p 0 7 和r a n b p l6 相 比具有了哪些新的功能? 是我们感兴趣的问题。 通过研究这些核质转运受体的底物和功能我们发现，核质转受体家族的旁系 同源蛋白质成员在功能上具有某些相似性，例如：i p 0 7 与i p 0 8 都以结合并转运 g r ；而t n p o l 与t n p 0 2 均可转运h u r 与h n r n p 入核。这可能是由于它们具 有相似的蛋白质一级序列，进而形成了相似的空间三维结构，以致它们可以结合 并转运相同的底物。然而某些非旁系同源关系的核质转运受体也可以转运相同的 底物，例如：k p n b l ，k p n b 2 ( t n p 0 1 ) 和k p n b 3 ( r a n b p 5 ) 都可以转运组蛋白和核 糖体蛋白等。但这三个基因分别起源于不同的祖先，在进化的过程中也保持了各 自的独立性，蛋白质一级序列的同源性很低，它们之所以能够转运许多相同的底 物，可能是由于形成了相似的三维空间结构。 除了可以转运相同的底物外，每个旁系同源蛋白质也拥有各个独特的功能。 例如：t n p 0 2 除了与t n p o l 一样可以转运h u r 、h n r n pa 1 4 2 1 之外，还参与了 m r n a 的核输出过程( 通过结合m r n a 接头蛋白t a p 8 1 】等协助m r n a 复合体 出核) 。i m p 8 除了可以与i m p 7 一样在体外结合g r 2 8 之外，还可以转运s r p l 9 3 1 核质转运受体家族系统进化和表达调控的生物信息学研究 信号识别因子入核i s 2 。目前人们尚未发现r a n b p 6 与r a n b p l 7 的任何底物，据 报道r a n b p l7 基因与人类t 细胞急性淋巴性白血病( t - c e l la c u t el y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a ，ta l l ) 的发生有判弱】。r a n b p 6 似乎是核质转运受体家族中一个特殊 的成员，它没有该家族保守的i b nn 结构域，并且在长达4 5 8 0 b p 的基因编码 区中没有任何内含子，这在哺乳动物的基因组中显得尤为特殊。目前尚未发现它 的任何底物，推测它可能在核质转运之外发挥一些特殊的功能。 核质转运受体家族成员并不是在进化的过程中一直保持成员数目增多的趋 势，某些家族成员在一些物种中选择性的丢失了。例如i p 0 4 起源于酵母的 k a p l 2 3 ，出现在果蝇、斑马鱼、爪蟾和人类中，却在原鸡中消失了。这种丢失 现象在营寄生生活的原生动物中表现的更为明显，如线虫只有1 0 个核质转运受 体家族的成员，而丝虫只保留了4 个家族成员。这种核质转运受体家族的成员选 择性丢失或增加的现象与特定物种的生理特点有关，根据每个物种生命活动的不 同需要，具有特定功能的核质转运受体成员仿佛被选择性地配置在不同的生物 中。 随着物种进化过程中生理功能的复杂和完善，细胞核与细胞质之间的信息交 流日趋繁多与精确，由此推动核质转运受体家族成员的功能与结构的多样化，以 至于不同核质转运受体之间序列的同源性较低。考虑到进化的过程与其功能的相 关性，对核质转运受体家族的成员进行重新定义就显得尤为重要，新的定义不仅 要考虑到蛋白质的结构特征，也要兼顾整体序列与底物的特性。 核质转运受体家族系统进化和表达调控的生物信息学研究 第三章核质转运受体的表达分布 3 1 意义与目的 生物体在不同生理发育时期，各个组织器官的细胞对底物进出细胞核的“需 求量”不同，因此决定了该细胞中各种核质转运受体的“供应量 也有所不同。 为了更好的理解每种核质转运受体功能的发挥，我们研究了它们在人体不同组织 器官和小鼠胚胎发育过程中的表达分布。 3 2 材料和方法 1 ) 调出基因表达数据 我们采用g n fs y m a t l a sf 7 2 l 数据库g n f ih g c r m a 和g n f lm g c r m a 基因芯片实验结果，它覆盖了2 4 ，2 7 7 个人类基因在7 9 组织器官中和3 2 ，9 0 5 个小鼠基因在6 1 个组织器官中的表达数据。调出人类与小鼠的核质转运受体家 族成员基因的平均差异表达数据( a v e r a g ed i f f e r e n c ev a l u e ) ，所选用探针编号见 附录3 。平均差异表达数值( a v e r a g ed i f f e r e n c ev a l u e ) 代表样品中该基因的 m r n a 含量的比例。 2 ) 基因表达水平的分析 采用统计学的方法对来自g n fs y m a t l a s 的基因芯片实验数据进行处理。对 小鼠胚胎阶段基因的平均差异表达数值( a v e r a g ed i f f e r e n c ev a l u e ) 取以2 为底 的对数( 1 0 9 2a dv a l u e ) ，结果计为a 。并用”，号表示a 的大小，以反映基因表达 水平的高低( ”+ ”代表a 7 ；”+ + ”代表7 a 9 ；”+ + + ”代表9 a 11 ；”+ + + + ”代表 1 1 4 ) ，称该基因在此组织器官内“高表达 ( h i g he x p r e s s i o n ) ；当2 s p m o口。一cojqpco o = o e acij：口口c母o：一_c俺p乞：c=：口侣c一ccocaol仃y卜o co一西okao ocoa-oj母e_c：田 一日。一q母一 梏求教僻g壬醛樱怔越簦巨j)!|i虾皿稚繇囊糕柑蝗烈心毒毒峰辎旧僻 恹毒扑嚼妲s酬g衩器毂群冥暮稍繇帐辎搽母似卿辩峰蜒 卜n 。肇恒星*故搽困瑚誊哒墨f，k星坦蔌餐憔秣伞。暖焉功o|)籁莨g世状n群一划qv)骧巅超群g止杓因醐鄙鑫錾酲磁靛 釜善车! 丰- t 圭： 4 - 牛4 - + 4 - 车4 - 丰4 - 丰+ 各善 丰；辜圭丰丰丰丰丰丰4 - 丰4 - + ：3 善丰i 丰 圭丰丰丰丰丰丰丰4 - + 量i t ) 善 车；丰 辜辜丰丰车丰- 牛i - 丰4 - + o 疗 牛i 圭妻丰丰丰丰丰丰4 - 丰+量暑善 x + i 辜 妻 丰 丰丰 车 丰 ： 丰 + u o 日 絮+ 簋a + i 丰 丰 车丰 + 丰 丰丰 + 毛 譬 o k o 霎喜萎 萋妻 霎霎 董 茎量菱 茎茎差薹霍：薹霍薹 口 旧 o ， 曩 o o 粤 萋 垂 霎茎茎耋 羹：| 萋蓁 萎 至 茎 舌& c罡 星 搴 = 曩 j o z 苦 暑 c = 。 茎蔓。耋n 。耄耋。 耋薹喜 o 量量 o 量羹奏茎童垂董| | 室室呈c o 萎 o c o a 妖奄扑确妲s删譬辍器斛群罢s裂螺蛹辎搽母烈删辱辜螟挺 核质转运受体家族系统进化和表达调控的生物信息学研究 3 3 2 核质转运受体在小鼠胚胎发育阶段的表达分布 在胚胎发育中，细胞快速增殖与分化导致大量的蛋白质及r n a 进出细胞核。 在此过程中，核质转运受体家族成员的表达量也被精确地调控着，以满足生命活 动的需要。根据g n fs y m a t l a s 数据库的基因芯片实验结果，我们分析了小鼠胚 胎发育期( 从受精卵至交配后1 0 5 天) 核质转运受体家族成员的基因表达模式， 发现大部分小鼠的核质转运受体基因在胚胎发育过程中表达量逐渐升高，常常在 6 5d p c ( d p c ，d a y sp o s t - c o i t u s ，交配后天数) 至9 5d p c 达到峰值，而在1o 5d p c 普遍有回落趋势( 图9 ) 。 通过基因表达的相似性分析( s i m i l a r i t ym e a s u r e ) ，我们将1 9 个小鼠的核质 转运受体基因( 没有x p 0 6 的数据) 分为几种表达模式。第一种表达模式为 t n p 0 3 、x p 0 1 和i p 0 7 基因，它们在胚胎发育的过程中始终保持较高的表达水 平，直到1 0 5 天开始逐渐回落( 图9 a ) 。第二种表达模式为x p o t 、t n p 0 2 、i p 0 4 、 i p o ll 和i p 0 13 基因( 图9 b ) ，在胚泡( b l a s t o c y s t