（细胞生物学专业论文）巨噬细胞吞噬烟曲霉的吞噬体形成过程的初步研究.pdf

巨噬细胞吞噬炯曲霉的吞噬体形成过程的初步研究巨噬细胞吞噬烟曲霉的吞噬体形成过程的初步研究细胞生物学专业研究生张称指导教师宗浩目的巨噬细胞能够高效吞噬烟曲霉孢子，所形成的吞噬体通常要先后与内膜系统及胞内细胞器发生复杂物质交换，才能成熟为具有杀死病原体能力的吞噬溶酶体，对包含烟曲霉的吞噬体成熟过程的研究目前还处于起步阶段。本研究探讨巨噬细胞吞噬烟曲霉分生孢子的杀菌规律、吞噬体成熟过程中细胞活性变化规律、影响细胞活性的因素以及吞噬体成熟的关键时间点，并初步探索包含烟曲霉分生孢子吞噬体的提取方法。方法本研究拟从细胞微生物学角度，以鼠巨噬细胞吞噬烟曲霉分生孢子为模型，用扫描电镜观察吞噬过程中细胞表面形态变化；采用t r i t o n 破膜法测定被巨噬细胞吞噬的孢子存活规律；采用荧光观察法测定巨噬细胞吞噬量的变化；采用m t t 的方法测定吞噬孢子后巨噬细胞的细胞活性的变化；利用免疫荧光标记以及激光共聚焦显微镜等技术，观察巨噬细胞吞噬烟曲霉孢子的吞噬体成熟过程；用蔗糖梯度离心的方法，提取包含烟曲霉孢子的吞噬体；利用紫外诱变的方法，筛选烟曲霉获得烟曲霉白化株。结果巨噬细胞吞噬乳胶颗粒比吞噬烟曲霉孢子的速度快，但最终吞噬量相同；被巨噬细胞吞噬的烟曲霉孢子在被吞噬后两小时裂解细胞涂平板培养，存活率明显下降；巨噬细胞吞噬正常的休眠孢子后会导致细胞活性下降，而吞噬白化株烟曲霉孢子后细胞活性没有下降，吞噬乳胶颗粒和菌丝后活性也没有下降；用吞噬体早期标志性蛋白标记吞噬孢子后不同时间的巨噬细胞，四川师范大学在3 0 o 这个时间点就有明显的环状结构，这种结构一直持续存在，到3 0 6 0 ，消失；而用晚期吞噬体标志蛋白标记后，在3 0 6 0 时才出现环状结构。同时，本研究还探索了一种新的提取包含烟曲霉分生孢子的吞噬体方法。结论烟曲霉孢子表面有抑制巨噬细胞吞噬的物质；本研究发现烟曲霉孢子能够抑制巨噬细胞细胞活性，萌发后的菌丝不抑制细胞活性，失去色素的白化株烟曲霉孢子也不抑制细胞活性，说明孢子表面的色素可能是抑制细胞活性的因素；巨噬细胞吞噬烟曲霉孢子lh 后活孢子数量开始下降，到2 h有5 0 的孢子失去活性，6h 后有8 0 以上的孢子失去活性；包含烟曲霉孢子的吞噬体在3 0 0 融合成为早期吞噬体，3 0 6 0 时融合成为晚期吞噬体。关键词：巨噬细胞烟曲霉吞噬体分生孢子p r e l i m i na r yr e s e a r c ho nm a t u r a t i o no fa f u m i g a t u s c o n t a i n i n gp h a g o s o m e si nm a c r o p h a g e sm a jo r ：c e l lb i o l o g ym a s t e ro f s c i e n c ec a n d i d a t e ：z h a n gc h e ns u p e r v i s o r ：z o n gh a oa b s 。i r a c 。i o b j e c t i v em a c r o p h a g e sp l a yak e yr o l ei nh o s td e f e n s ea g a i n s tv i r t u a l l ya l lp a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m s p r o f e s s i o n a lp h a g o c y t e sh a v ea sap r i m a 叮t u n c t l o nt h ee n 娜l f m e n to fm i c r o b i a li n v a d e r sw i t h i nam e m b r a n e b o u n dc o m p a n m e mc a l l e dap h a g o s o m e p h a g o s o m e sg ot h r o u g has e r i e so f m a t u r a t l o ns t e p s ，c u l m i n a t i n gi nt h ed e s t r u c t i o no ft h ei n t e r n a l i z e dc a r g o i nt h i sr e s e a r c h ，w ei n v e s t i 2 a t e dt h em e c h a s i m so ft h ep h a g o c y t o s i so fa f u m i g a t u sb ym a c r o p h a g e ；t h eb a s i cm a t u r a t i o nt i m ep o i n to fc o n i d i a - c o n t a i n i n gp h a g o s o m e s ；a n da p p l l e dam e t h o do fi s o l a t i n ga s p e r g i l l u sf u m i g a t u sc o n i d i ac o n t a i n i n gp h a g o s o m e sb yu l t r a c e n t r i f u g a t i o no nas u c r o s ed e n s i t yg r a d i e n t m e t h o d sb yc h a l l e n g i n gm a c r o p h a g ew i t hg f p e x p r e s s i n gc o n l d i 如w ec o n s t r u c t e dam o d e lf o rp h a g o c y t o s i sr e s e a r c h i n t e r n a l i z a t i o no tc o n i d i ab ym a c r o p h a g e sw a sr e v e a l e db ys c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p y c o n i d i ak i l l i n gr a t ew a sd e t e r m i n e db ya n t i b i o t i cp r o t e c t i n ga s s a y c e l la c t i v i t yw a sm e a s u r e db ym i c r o d l a t e m t tc o l o r i m e t r i ca s s a y ；m a t u r a t i o no fa f u m i g a t “s c d 聆矧聆1 n gd h a g o s o m e sw a sr e v e a l e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ya s s a y p h a g o s o m e sc o n t a i n i n ga f u m i g a t u sc o n i d i aw a si s o l a t e db yu l t r a c e n t r i f u g a t l o no nas u c r o s ed e n s i t yg r a d i e n t c o n i d i ap i g m e n tm u t a n t sw e r eo b t a i n e db ye x p o s u r et ou v 撒di s o l a t e db yt h ec o l o ro fc o l o n y r e s u i t sn er a t eo fp h a g o c y t o s i so fc o n i d i ab ym a c r o p h a g e sa r es l o w e rm a ni i i四j i i 师范大学p h a g o c y t o s i so fl a t e xb e a d s m a c r o p h a g u sb e g a nt ok i l la f u m i g a t u sc o n i d i aw i t h i no n eh o u r e i t h e ra f u m i g a t u sc o n i d i ao rs w l l e nc o n i d i ai n h i b i t sa c t i v i t yo fm a c r o p h a g e sb u tn o th y p h a e t h ec o n i d i ao fw h i t em u t a ts t r a i nd i dn o ti n h i b i ta c t i v i t yo fm a c r o p h a g e w eu s e da n t i b o d i e ss p e c i f i c a l l yr e c o g n i z i n gv a r i o u sm e m b r a n em a r k e r so ft h ee n d o c y t i cp m h w a ys u c ha sc a t d ，e e a1 ，l a m p1t od e t e r m i n et h ee x t e n tt ow h i c ht h ea f u m i g a t u s c o n t a i n i n gp h a g o s o m e si n t e r a c t e dw i t hc o m p a r t m e n t so ft h ee n d o c y t i cp a t h w a y a te a r l yt i m ep o i n t s ，at y p i c a lp h a g o s o m em a r k e ro fc a t dw a so b s e r v e do n3 0 0 ，w i t ho c c a s i o n a l l yal a r g e rr i n gl i k es t r u c t u r e b e t w e e n a3 0 0 a n d3 0 3 0 ，t h ee a r l yp h a g o s o m em a r k e ro fe e a lw a so b s e r v e d a t3 0 6 0 ，t h el a t ep h a g o s o m em a r k e ro fl a m p1w a so b s e r v e d t h el a s t ，i no u ri n d e p t hi n v e s t i g a t i o no ft h em e t h o do fp h a g o s o m ei s o l a t i o n ，w ea d a p t e dt h em e t h o dt op u r i f yc o n i d i a - c o n t a i n i n gp h a g o s o m e sf r o mi n f e c t e dm a c r o p h a g e s c o n c l u s i o nt h es u r f a c e so fx f u m i g a t u sc o n i d i ah a v es o m e t h i n gw h i c hc a ni n h i b i tp h a g o c y t o s i s m a c r o p h a g eb e g a nt ok i l lc o n i d i aw i t h i n1ha n d5 0 o fc o n i d i aw e r ek i l l e di n2 h ，8 0 o fc o n i d i aw e r ek i l l e da f t e r6 h e i t h e ra f u m i g a t u sc o n i d i ao rs w l l e nc o n i d i ac a ni n h i b i to x i d a t i o na c t i v i t yo fm a c r o p h a g e s w h i t ec o n i d i aa n dh y p h a ed o n ti n h i b i ta c t i v i t yo fm a c r o p h a g e s m e l a n i nh a sb e e ne s t a b l i s h e da sa ni m p o r t a n tv i r u l e n c ef a c t o r , i n h i b i t i o no x i d a t i o na c t i v i t yo fm a c r o p h a g e s p h a g o s o m ea c q u i r em i c r o b i c i d a la n dd e g r a d a t i v ec a p a b i l i t i e so n3 0 6 0 k e yw o r d s ：m a c r o p h a g e sa s p e r g i l l u s f u m i g a t u sp h a g o s o m ec o n i d i a四川师范大学学位论文独创性及使用授权声明本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师塞浩指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。本人承诺：已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因不符而引起的学术声誉上的损失由本人自负。本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定：学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生必须按学校规定提交印刷版和电子版学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库供检索；2 ) 为教学、科研和学术交流目的，学校可以将公开的学位论文或解密后的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所或在有关网络上供阅读、浏览。本人授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：习留皋导师签名：签字日期o 口年弋月丛日签字日期：加d 年心月文泊巨噬细胞吞噬烟曲霉的吞噬体形成过程的初步研究1 文献综述1 1 烟曲霉及其与侵袭有关的致病因子1 1 1 烟曲霉烟曲霉是大自然中最为常见的子囊菌门的腐生真菌，常常分布于土壤、空气和腐败的食品中，它的孢子很容易脱落，而且大小不等直径是2 - 5p m ( 1 】。由于孢子很容易悬浮于空气中，所以大多数曲霉病都是吸入了孢子而引发的。i 临床中最常见到的由烟曲霉引起的感染主要有三种：变态反应性支气管肺曲霉病( a l l e r g i cb r o n c h o p u l m o n a r ya s p e r g i l l o s i s ，a b p a ) 、曲霉瘤( a s p e r g i l l o m a )和侵袭性曲霉病( i n v a s i v ea s p e r g i l l o s i s ，i a ) 。目前，最难以被治疗的曲霉感染就是侵袭性曲霉病( i a ) 。我们每天都会吸入大量的烟曲霉孢子，而没有引发感染，这是因为我们的免疫功能正常，吸入的烟益霉孢子可以被人体或动物的肺泡巨噬细胞( p u l m o n a r ya l v e o l a rm a c r o p h a g e s ，p a m ) 杀灭并清除【2 】。但是如果免疫功能低下的人，尤其是免疫缺陷人群、接受了器官移植或骨髓移植的患者，烟曲霉孢子可以在体内膨胀、发芽并形成菌丝，最终发生肺曲霉病，现在它的发病率不断上升，已经成为仅次于念珠菌感染的疾病。曲霉病之所以难以治疗、成为致死性疾病，是因为烟曲霉是真菌，和人类同属于真核生物，导致抗真菌的药物开发受到很大的制约，对人体安全高效的药就更少了。由于这些原因，现在医学界一直致力于研究病原真菌。由于没有高效的特异的药物来治疗曲霉病，从人体自身免疫系统来研究其抗菌机制也是目前的热点之一。巨噬细胞具有趋化性和活跃的变形运动，当受到烟曲霉孢子、菌丝及其代谢产物的刺激后，可以做定向运动，将其粘附和包围，形成吞噬体或吞饮泡而进入胞质内，与初级溶酶体接触、融合，进行细胞内消化。随着近年来的广泛研究，目前已发现了很多因素都与烟曲霉致病性相关关，如各种毒素、粘附素、疏水蛋白、朊酶类、磷脂酶类、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、金属离子螯合机制等，但没有哪一种因素能够完全解释清楚烟曲霉的致病性1 3 】。烟曲霉基因组序列测定已经完成，大规模基因组比对研究并没有发现烟曲霉具有独特的致病基因，因此巴斯德研究所的f r e d jt e k a i a 和四川师范大学j e a n p a u ll a t 9 6 教授撰文指出：未来对烟曲霉致病机理的研究侧重点应是宿主免疫系统，而不是鉴定特殊真菌毒力因子【4 1 。1 1 2 烟曲霉与侵袭有关的致病因子( 1 ) 烟曲霉孢子细胞壁的组成成分p l ，3 一葡聚糖是烟曲霉孢子细胞骨架的重要组成成分，也是胞壁中含量最多的多糖。p l ，3 一葡聚糖的生物学活性多种多样，它能够锚定半乳甘露聚糖和壳多糖，还可以使补体激活，促进炎性介质释放。在对深部感染曲霉的患者体内可以检测到b 一1 ，3 一葡聚糖，研究发现它能够影响宿主的炎症反应和免疫反应【3 j 。烟曲霉孢子在膨胀过程中暴露b 一1 ，3 一葡聚糖位点，宿主细胞表面受体识别b 一1 ，3 一葡聚糖将其吞入细胞内部。本实验室对其研究还发现，b l ，3 一葡聚糖能够激活上皮细胞的p l d 。烟曲霉菌丝和孢子中都存在半乳甘露聚糖，它是一种多聚抗原，是由a f m p l 编码的，在和细胞受体识别、黏附细胞中起重要作用。半乳甘露聚糖还与纤连蛋白和层粘连蛋白的结合有关，在烟曲霉侵犯组织早期就可释放入血，并能在血液中持续存在卜8 周1 4 】。壳多糖( c h i t i n ) 又称几丁质也存在于烟曲霉细胞壁中。为n 一乙酰葡糖胺通过b 连接聚合而成的结构同多糖。烟曲霉中存在多种壳多糖合成酶( c h s ) 。壳多糖可使细胞壁稳定，这可能是壳多糖合成酶成为真菌致病因子的原因。用使壳多糖裂解的抑制剂，如菌霉素等进行研究，发现它通过增加胞膜的通透性，而提高其对棘球白素、伊曲康唑等的敏感性，产生协同效应。这些抑制剂自身不会破坏烟曲霉，但希望通过研究它们之间的相互作用，为治疗曲霉病提供一些新的方法1 5 j 。( 2 ) 烟曲霉孢子细胞表层成分在烟曲霉孢子表面的最外面是r o d l e t 层，在这层上面有很多疏水性蛋白存在一些，而在菌丝表面无此蛋白。疏水蛋白是孢子抑制宿主免疫防御的关键。疏水蛋白是由r o d a p 和r o d b p 组成的难溶物质j 。对r o d a 突变株进行研究，发现丢失r o d a 蛋白后孢子具有亲水性，而且不易黏附胶原蛋白和白蛋白，但是与层粘连蛋白和纤维蛋白原的黏附能力不变【7 j 。2巨噬细胞吞噬烟曲霉的吞噬体形成过程的初步研究黑色素是烟曲霉分生孢子细胞壁的组成成分。已经确定黑色素是重要的致病因子，它可以抑制宿主的免疫防御、抵抗肺泡巨噬细胞和中性粒细胞的活性氧族( r o s ) 的破坏作用来保护真菌。研究发现它可以调控孢子细胞壁各个组分正确的装配，所以它可能还有间接的毒力。烟曲霉色素是通过d h n 一黑色素合成途径来合成的，其中p k s p a l b l 和p k 铲a r p 2 是关键性合成基因峭j 。如果p k s p a l b l 或p k s p a r p 2 发生突变，则孢子将无法合成色素。进一步研究发现色素缺失后孢子的细胞壁变得更加平滑、表面的纤连蛋白、层粘连蛋白显著增加、负电荷和表面的疏水性都显著地下降了、疏水蛋白缺失等【9 】。突变后的烟曲霉孢子较易黏附于补体，菌壁易穿透，对抗真菌药物敏感i l0 1 。( 3 ) 烟曲霉产生的毒素在烟曲霉产生的毒性代谢产物中，曲霉菌素是研究最多的一种，它具有广泛免疫抑制作用。烟曲霉可产生一些真菌毒素如烟曲霉素( f u m a g il li n ) 、胶霉毒素( g l i o t o x i n ，g t ) 和烟曲霉酸( h e l v o l i ca c i d ) 以及内毒素、c 物质等【1 1 l 。其中胶霉毒素( g t ) 研究较为清楚，它具有较强的毒性，能够抑制机体的免疫反应，这种抑制作用不具有特异性，它可以抑制肺泡巨噬细胞的吞噬、杀菌活性等【l2 1 。在烟曲霉孢子中也可检测到g t ，但是只有大约1 2 的菌株能产生g t 。它可以抑制细胞的活性氧，对巨噬细胞产生很强的细胞毒性。烟曲霉可通过g t 介导的单核细胞的凋亡抑制t 细胞免疫反应【l 。g t 可能在烟曲霉的呼吸道感染中起到一定作用，是因为它在烟曲霉的正常发育过程中产生量非常少，当它在高通气状态下能够快速产生。除胶霉毒素外，曲霉还可产生其他一些特殊类型毒素，包括核糖毒素( r i b ot o x i n ) 。核糖毒素是一类灭活核糖体的碱性蛋白，相对分子质量约1 71 0 3 ，包括局限曲霉素( r e s tr i c t o c i n ) 、q 束格孢素( q s a r c i n ) 等。这些毒素可通过催化灭活核糖体大亚基，而抑制蛋白合成，其中限制素微量水平即可对哺乳细胞产生高度毒性作用i l 引。( 4 ) 烟曲霉产生的酶烟曲霉能够产生很多胞外酶，包括蛋白酶、磷酸酶、核酶和肽酶。它们以降解大分子物质的方式为真菌生长提供营养，降低机体的防御能力，从而引起曲霉感染，导致i a ，严重可危及生命【1 4 1 。四川师范大学与抗r o s 相关的酶：烟曲霉孢子可以分泌抗r o s 的酶，比如过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶( s o d ) 等。这些酶可以清除免疫细胞分泌的r o s如过氧化氢或超氧离子，这些离子参与破坏病原菌，所以清除r o s 的毒性作用可以使真菌的致病力增强，能够控制r o s 作用的酶就被认为是烟曲霉的致病因子【1 5 1 。弹性蛋白酶：在小鼠实验中证实，烟曲霉所产生的弹力蛋白酶的活性与毒力相关。在动物组织中，宿主存在一些生理屏障，这些屏障主要由蛋白质组成，致病性丝状真菌利用细胞外酶降解它们。研究发现，不产生弹力蛋白酶的菌种无致病力，而产生弹力蛋白酶的菌株可以在1 - 3 小时内引起肺泡坏死【l6 1 。所以具有溶胶原和溶弹性蛋白活性的酶在真菌感染中有重要作用。1 2 巨噬细胞的吞噬作用和吞噬体成熟过程1 2 1 巨噬细胞的吞噬作用细胞吞入外源颗粒的过程被称为吞噬作用，这些颗粒包括微生物、凋亡细胞、坏死细胞、以及环境中的碎屑【1 1 1 。吞噬作用是宿主消化外源性物质的直接途径，是最重要的免疫防护机制之一【l 引。专职吞噬的细胞主要包括巨噬细胞、白细胞、树状突细胞等，它们能够清除细胞程序性死亡产生的碎片，在组织内环境中扮演重要的角色。吞噬作用的吞噬机制是一个复杂的细胞肌动蛋白骨架重排，用囊泡将大颗粒物质包裹并吞入细胞的过程，涉及宿主防御、免疫反应、大分子运输、代谢途径的调节和信号转导等一系列生理生化过程。吞噬细胞有特异性的表面蛋白，它们可以识别外源颗粒，如f c r ( f cr e c e p t o r s ) 和c r s ( r e c e p t o r sf o rc o m p l e m e n t ) n - i 以分别结合经抗体和补体调理的病原体并介导吞噬作用发生。虽然f c r - 和c r - 介导的吞噬作用存在形态学的不同，但是两种信号途径都能够使小r h og t p 酶的启动，导致肌动蛋白骨架的重排【l9 1 ，细胞膜包裹外源颗粒，从而将颗粒吞入细胞内部形成吞噬体。1 2 2 吞噬体成熟过程吞噬过程必须借助于细胞膜的变形而进行，膜内陷产生的吞噬性囊泡被称为吞噬体。从吞噬体产生到顺序性地和早期内含体、晚期内含体融合，4巨噬细胞吞噬烟曲霉的吞噬体形成过程的初步研究直至生成具有杀菌能力的吞噬溶酶体，这一过程被称为吞噬体成熟。吞噬体成熟是吞噬细胞功能的正常组成部分，是杀死和降解胞内病原体所必需的过程【2 l 】，成熟的吞噬体中包含一系列水解酶，其内部p h 在4 - - 一4 5 之间。因此，病原体不是被细胞内摄作用本身杀死的，而是被吞噬溶酶体的极度敌对的内腔环境杀死的。一般认为，融合过程的次序是极具特异性的新形成的吞噬体仅仅可以同早期内含体融合，在这之后才能够和晚期内含体融创2 2 1 ，通过特异性的融合吞噬体获得必需的蛋白质。其中许多因子已被证明在吞噬体成熟过程中起重要作用，如磷酸肌醇及其他脂质、小g t p 酶等。对囊泡融合模型的研究证明，可溶的s n a r e 蛋白质、在膜融合中起作用的r a b 家族的小g t p 酶，以及这些蛋白家族的其他几个成员集中出现于溶酶体吞噬体阶段【2 3 1 。而不同的成熟阶段，其标志蛋白不同，e e a l ( e a r l ye n d o s o m e sa n t i g e n1 1是早期吞噬体的标志性蛋白，其在吞噬体中的峰值出现在3 0 m i n 时，c m v b 6( c h a r g e dm u l t i v e s i c u l a rb o d yp r o t e i n6 ) 在吞噬体形成6 0 m i n 时在吞噬体中的含量达到峰值，l a m p l ( l s a s s o c i a t e dm e m b r a n ep r o t e i n s ) 是晚期吞噬体的标志性蛋白，峰值出现在9 0 m i n 2 4 1 。而c a t d ( c a t h e p s i nd ) 是吞噬体的标志性蛋白，伴随吞噬体产生，随时间的增加c a r d 含量增加，在1 0 5m i n 时含量最高，随后略有降低【1 引。与溶酶体融合后获得的几种蛋白质中，s l c l l a l 是巨噬细胞有效杀死细菌的关键性的蛋白质，可能参与了吞噬溶酶体内部二价阳离子的调节，但具体机制还不清楚1 2 5 1 。1 2 3 吞噬体成熟过程研究的主要方法2 0 世纪7 0 年代，开始用电镜来研究病原体感染巨噬细胞后存活与吞噬体的关系。研究发现，结核分枝杆菌( m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ) 可以抑制吞噬体和溶酶体融合【2 6 。而沙门菌属( s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m ) 贝t 是抑制吞噬体与溶酶体的二次融合【27 1 。为了更清楚的研究吞噬体具体功能，在1 9 9 4 年，d e s j a r d i n s等【2 8 j 首先用乳胶颗粒刺激巨噬细胞产生吞噬体，并用蔗糖梯度离心的方法成功地将其提取出来。随后，对吞噬体的研究越来越多，使用各种吞噬性细胞( 包括鼠巨噬细胞、内阿米巴属、盘基网柄菌、人中性白细胞、滋养体、胚胎血细胞寄生虫等) 吞噬乳胶颗粒作为模型，蛋白质组学、免疫荧光和电镜等技术四川师范大学得到广泛的应用。吞噬体的成熟过程决定了其蛋白组成的复杂性和动态变化性，为深入研究这一动态变化过程的细节，必须借助于大规模、高通量蛋白分析鉴定手段，这使得蛋白质组学技术的引入顺理成章。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。蛋白质组学能阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式【2 9 1 。双向电泳技术仍是目前蛋白质组学研究中最常用的技术之一，而高通量的质谱分析技术已经越来越成为蛋白质组学技术的主流。在已经报道的研究中，吞噬体一般是通过亚细胞结构的梯度离心方法获得的，为获得足够量的吞噬体以供蛋白质组学研究，细胞数量一般要求在1 0 9左右【2 7 1 。s o l d a t i 等【1 9 1 在2 0 0 2 年时在破碎细胞后加入m g a t p 孵育1 5m i n 再进行蔗糖梯度离心。这样处理后提高了提取出吞噬体的纯度，从而为其蛋白质组学研究提供了很好的素材。目前研究多用乳胶颗粒作为吞噬物，吞噬体内蛋白质包括细胞表面蛋白、膜泡转运蛋白、内质网蛋白、线粒体蛋白、水解酶、g t p 酶、细胞骨架和一些信号转导蛋白1 30 。1 3 巨噬细胞在烟曲霉感染中的作用1 3 1 巨噬细胞是清除烟曲霉的主要吞噬细胞肺巨噬细胞是定位于肺泡的独特的组织巨噬细胞，对侵入病原体起重要的早期识别和杀灭作用【3 1 】，同时也是连接天然免疫和获得性免疫的重要交叉点【3 2 】。免疫正常人群在每天反复吸入烟曲霉孢子而很少发生烟曲霉感染，这主要归功于天然免疫系统的巨噬细胞。目前对于烟曲霉与天然免疫的认识主要集中在表面受体识别及基本吞噬规律方面，模型细胞系一般为鼠巨噬细胞。研究发现半乳甘露聚糖和葡聚糖的特异识别受体d c s i g n 和d e c t i n 1 促进了鼠巨噬细胞对烟曲霉孢子的内吞作用，而对于t l i 也( t o l ll i k er e c e p t o r2 ) 和t l r 4 在信号识别中的作用尚有争议p 3 1 。体外吞噬研究发现鼠巨噬细胞可以迅速的黏附和吞噬烟曲霉孢子，并可能通过一种氧化性机制杀死并降解微生物体1 3 4 1 ；吞噬需要肌动蛋白聚合以及磷脂酰肌醇3 一磷酸激酶的活性【3 5 j 、酪氨酸6巨噬细胞吞噬烟曲霉的吞噬体形成过程的初步研究激酶活性【3 6 】：6 0 - - 8 0 的内吞孢子在4 小时内被杀死【3 7 】，这些研究结果从不同侧面反映了鼠巨噬细胞对烟曲霉孢子的吞噬规律，在一定程度上体现了吞噬的复杂性，然而在对此过程缺乏整体性把握之前，单纯对某种或某类蛋白的研究难免存在片面性。研究发现某些胞内寄生细菌能够利用不同的策略颠覆吞噬体成熟过程，如布氏菌属、军团菌属和沙门氏菌属等【3 圳。烟曲霉是否存在类似机制还不清楚。已有研究证实，虽然鼠巨噬细胞对热灭活的烟曲霉孢子和正常孢子有相似的吞噬行为，但是只有活孢子能够诱导高水平的细胞因子表达 3 9 1 。这一结果暗示活孢子在被吞噬过程中能够发挥某种还未被认识的“主动性 ，影响宿主细胞炎症反应的进程，因此有必要对烟曲霉在吞噬体成熟过程中所扮演的角色进行进一步的探讨。1 3 2 影响巨噬细胞吞噬作用的因素烟曲霉多种代谢物可干扰吞噬细胞功能，较为重要的有烟曲霉素、a f a l p和局限曲霉素。但巨噬细胞能够快速高效的吞噬烟曲霉孢子，这一方面依赖细胞的肌动蛋白骨架，l u t h e r 等1 4 0 】发现巨噬细胞在摄取烟曲霉过程中伴随局部肌动蛋白细胞骨架重组，这种重组有助巨噬细胞快速吞噬烟曲霉分生孢子。另一方面依赖其表面受体密切相关：( 1 ) t o l i 样受体( t o l ll i k er e c e p t o r ，t l r ) ，一种i 型跨膜受体，最早在果蝇中发现，其作为一类天然免疫相关的模式识别受体( p a t t e mr e c o g n i z er e c e p t o r , p r r ) ，在机体抵御感染中发挥重要作用【4 ，n e t e a 等【4 2 j 发现，巨噬细胞表面t l r 一4 能识别烟曲霉分生孢子信号，而对烟曲霉菌丝却无此作用。相反，t l r - 2 在分生孢子和菌丝识别过程中均发挥作用；( 2 ) 经典c 型凝集素( d e c t i n - 1 ) ，属于i i 型跨膜受体，是除t l r 外的一种p r r ，称为t l r ；( 3 ) 衔接蛋白髓样分化因子8 8 ( m y e l o i dd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r8 8 ，m y d 8 8 ) ，是一种细胞内衔接蛋白，可介导大多数来源于t l r 的信号，因此在机体抗烟曲霉感染中也具有一定作用。m a r r 等【4 3 】研究指出，衔接蛋白m y d 8 8 在宿主接触菌丝后刺激巨噬细胞炎症反应上发挥一定作用，而对于接触分生孢子所发挥的作用却不大；( 4 ) 正五聚蛋白3 ，可以通过半乳甘露聚糖与分生孢子结合，增强肺泡巨噬细胞对烟曲霉的识别和摄取，还可以促进肺7四川师范大学产生保护性细胞因子l 州。虽然已经确认巨噬细胞在清除烟曲霉孢子的过程中起关键作用，但相互作用方式的细节不清楚，是否存在某种免疫逃避机制还不了解。由灭活和非灭活的孢子在诱导巨噬细胞细胞因子表达上存在差异1 4 引，我们推断在巨噬细胞吞噬烟曲霉孢子以及吞噬体的成熟过程中，烟曲霉孢子可能通过改变自身基因和蛋白的表达，抵抗吞噬细胞的吞噬和氧化降解，从而与宿主吞噬细胞的蛋白表达及信号转导产生交互影响。虽然烟曲霉并非专性胞内寄生菌，其在免疫正常宿主体内最终命运是被降解清除，但对烟曲霉在吞噬体内的基因表达、对吞噬体成熟的影响、可能存在的免疫干扰机制等进行研究，有望解释免疫受损情况下烟曲霉大量繁殖的原因，从而揭示烟曲霉的条件致病机理。8巨噬细胞吞噬烟曲霉的吞噬体形成过程的初步研究2 巨噬细胞吞噬烟曲霉孢子吞噬规律的初步研究2 1 实验材料2 1 1 菌株表达g f p 绿色荧光蛋白的烟曲霉菌株a t c c l 3 0 7 3 由f r a s e ru n i v e r s i t y 的m a r g om m o o r e 教授馈赠。烟曲霉临床分离株a f 2 9 3 美国n i hl a b o r a t o r yo fc l i n i c a li n f e c t i o u sd i s e a s e sk j k w o n c h u n g 教授惠赠。2 1 2 细胞系j 7 7 4 a 1 鼠巨噬细胞为本实验室保存。2 1 3 主要试剂沙氏培养基：北京友康公司产品细菌琼脂粉：北京友康公司产品，d m e m 高糖培养基：g i b c o 公司产品d m e m f 1 2 培养基：g i b c o 公司产品胎牛血清( f b s ) ：杭州四季青生物技术研究所产品制霉菌素：i n a l c o 公司产品牛血清白蛋白( b s a ) ：s i g m a 公司产品胰蛋白酶：a m r e s c o 公司产品t r i t o n x 1 0 0 ：s i g m a 公司产品鬼笔环肽( p h a l l o i d i n t r i t c ) ：s i g m a 公司产品噻唑蓝( m t t ) ：s i g m a 公司产品二甲基亚砜( d m s o ) ：a m r e s c o 公司产品其余化学试剂均为国产分析纯2 1 4 主要仪器设备及耗材微量移液器：e p p e n d o r f 公司c 0 2 细胞培养箱( f o r m as e r i e si i ) ：t h e r m o 公司9四川师范大学电热恒温培养箱( h h b 1 1 - 3 6 0 ) ：天津中环试验有限公司电热恒温鼓风干燥箱( d h g 9 0 7 0 a ) ：上海精宏实验设备有限公司电热恒温加热磁力搅拌器( s h 一3 a ) - 常州国华电器公司电热恒温水槽( d k s d ) ：上海精宏实验设备有限公司层析实验冷柜( y c 2 ) ：北京亚泰科隆实验技术开发中心台式恒温振荡器( t h z d ) ：太仓实验设备厂漩涡混合器( v o r t e xg e n i e 2 ) ：基因有限公司台式冷冻离心机( c e n t r i f u g e5 4 1 8 r ) ：e p p e n d o r f 公司台式高速冷冻离心机( a l l e g r ax 2 2 r ) ：b e c k m a n 公司台式冷冻离心机( c e n t r i f u g e5 8 0 4 r ) - e p p e n d o r f 公司超净工作台：上海淀山湖牌组织培养倒置显微镜( c l 4 1 ) ：o iy m p u s 公司倒置荧光显微镜( d m i r e 2 ) ：l e i c a 公司正置荧光显微镜( b x 51 ) ：o l y m p u s 公司酶标仪( s p e c t r am a xm 5 ) ：m o l e c u l a rd e v i c e s扫描电镜( s 3 4 0 0 n ) - 日立公司生物安全柜( b i i ) ：n u a i r e 公司生物安全柜( 1 3 0 0s e r i e s a 2 ) ：t h e r m o 公司细胞培养皿( 3 5 m m ，1 0 0 m m ) ：c o a s t e r 公司细胞培养皿板( 3 5 m m ，2 4 孔板，9 6 孔板) ：c o a s t e r 公司2 1 5 主要试剂配制磷酸盐缓冲液p b sp h7 4n a c i8gk c l0 2gn a 2 h p 0 41 4 4gk h 2 p 0 40 2 4g去离子水9 0 0m l调整p h 制至7 4 ，用去离子水定容至1 0 0 0m l ，1 2 1 2 0m i n 高压灭菌，l o巨噬细胞吞噬烟曲霉的吞噬体形成过程的初步研究4 保存。0 2 5 胰蛋白酶液胰蛋白酶粉0 2 5gp b s1 0 0m l混匀溶解后过滤分装西林瓶中，- 2 0 保存。双抗( 青霉素、链霉素)硫酸链霉素( 1 0 0 万单位) 4 0 0 万单位青霉素( 8 0 万单位) 4 0 0 万单位p b s4 0 m l混匀溶解后过滤分装于l m l 离心管中，- 2 0 保存，使用时，在1 0 0m l培养基内加母液0 1m ld 。m e m f 12 基础培养液d m e m f 1 2 基础培养基( g i b c o )一袋( 1 0 0 0m l 量)n a h c 0 33 7g双蒸水9 0 0m l盐酸调p h 至7 卜7 2 ，用双蒸水定容至1 0 0 0m l ，滤器滤过除菌，分装后一2 0 保存。d m e n u f 1 2 完全培养基( 1 0 f b s )d m e l v l f 一12 培养基2 2 5m l胎牛血清2 5m l双抗( 1 0 万单位毫升)2 5 0p , l充分混匀后，4 保存待用。m t t 溶液m t t 粉末2 0m gp b s4m l涡旋振荡至完全溶解，用5c m 的滤器过滤，放入4 黑暗保存。四川师范大学2 2 实验方法2 2 1 巨噬细胞d 7 7 4 a 1 细胞复苏、培养、传代( 1 ) 巨噬细胞j 7 7 4 a 1 细胞复苏1 ) 从液氮罐中取出冻存的巨噬细胞j 7 7 4 a 1 。2 ) 迅速将其放入3 7 水浴中，不时摇动尽快解冻。3 ) 在超净工作台中用酒精棉球擦拭冻存管后，无菌打开管口，将细胞悬液加入至离心管中。4 ) 加入7m ld m e m f 1 2 完全培养基，反复吹打混匀。5 ) 1 0 0 0r p m5m i n 低速离心，弃上清，加入适量d m e m f 1 2 培养基，将沉淀重悬6 ) 接种至细胞培养瓶，放入3 7 5 c 0 2 细胞培养箱中培养。( 2 ) 巨噬细胞j 7 7 4 传代细胞传代前，先将细胞培养基、p b s 和胰酶从4 冰箱拿出，使之恢复室温，待用。1 ) 用酒精灯烧灼瓶口灭菌，将培养瓶中的培养基倒入废物缸中。2 ) 在培养瓶中加入1 0m lp b s 漂洗一遍，倒干净。3 ) 在培养瓶中加入胰酶，只要将细胞刚刚覆盖即可，消化大概2r a i n 左右，在显微镜下观察，大部分细胞变圆，但不要等细胞漂起，加入5m lp b s 终止消化。用弯头毛细吸管将细胞从培养瓶壁上吹打下来，放入无菌的1 5 m l 离心管中，1 0 0 0g ，3m i n 离心。4 ) 离心后，弃掉上清，加入5m i 新鲜的完全培养基重悬细胞，吹打混匀5 ) 按照实验需要用血细胞计数板计数，传入实验培养板中6 ) 在培养瓶中加入8m 1 新鲜的完全培养基，将剩下的细胞悬液滴加入培养瓶中，将培养瓶放倒，轻轻摇匀让培养液铺平于瓶底，用酒精灯烧灼瓶口灭菌，用培养瓶盖旋紧后，稍稍往后旋松一点，放入培养箱中进行培养。2 2 2 烟曲霉的培养与孢子悬液的制备( 1 ) 烟曲霉复苏与保存1 ) 在p 2 实验室中，从菌库储存烟曲霉a t c c1 3 0 7 3 的试管中挑取适量菌苔，1 2巨噬细胞吞噬烟曲霉的吞噬体形成过程的初步研究在p b s 中混匀。2 ) 取lm l 孢子悬液加入到s d a 平板上，用涂菌棒涂匀。3 ) 放入3 7 的恒温箱中培养3 - 4 天。4 ) 刮取少量菌苔在s d a 斜面上划折线，放入3 7 的恒温箱中培养3 - 4 天。待长出菌落后置于室温菌库中保藏。( 2 ) 烟曲霉孢子的培养与收集1 ) 将常温保存的烟曲霉涂布接种于s d a 平板，3 7 倒置培养4 8 - 7 2h 。2 ) 将5m l 含0 1 t w e e n2 0 的p b s 加到烟曲霉旺盛生长的培养平面上，用玻璃刮铲轻轻刮下孢子并将悬液收集到离心管中。3 ) 再用8 层无菌纱布将孢子悬液过滤2 遍，收集于离心管中，以除去菌丝。4 ) 3 0 0 0r p m ，1 0r a i n 离心，弃上清，再用p b s 漂洗孢子一遍。5 ) 用5 m lp b s 重悬孢子并用血球计数板进行计数，制备好的孢子悬液于4 中保存待用。2 2 3 荧光观察烟曲霉孢子萌发过程( 1 ) 荧光显微镜观察孢子形态在载玻片上滴加蒸馏水，挑取适量旺盛生长的a t c c l 3 0 7 3 的菌落于蒸馏水中，压片，封片，用正置荧光显微镜( o l y m p u sb x 5 1 ) 光镜观察拍照后，用蓝色荧光激发绿光荧光拍照。( 2 ) 荧光观察烟曲霉孢子萌发过程1 ) 将新鲜的烟曲霉荧光株a t c c1 3 0 7 3 孢子加入沙氏液体培养基中，孢子浓度为1 1 0 0 。2 ) 置于台式恒温振荡器上2 2 0r p m ，3 7 振荡摇菌。3 ) 不同的时间点吸出l m l 菌液1 0 0