（细胞生物学专业论文）运用寡核苷酸芯片鉴定检测食源性致病菌技术的研究.pdf

运用寡桉苷酸芯片技术鉴定检测食源性致病菌技术的研究运用寡核苷酸芯片鉴定检测食源性致病菌技术的研究研究生：指导老师：专业：研究方向：高爽谢明杰曹际娟细胞生物学微生物分子生物学中文摘要：致病菌污染食品可导致多种疾病的暴发与流行，严重威胁人类的健康。因此，若想有效控制食品细菌性疾病的发生，快速而准确地检测食品中致病菌是关键的技术基础之一。传统的细菌培莽方法及生化鉴定，操作繁琐，且需要数天才能得到结果。免疫学方法和探针杂交技术也存在特异性或敏感性的问题。常规p c r 一次只能检出一种致病菌，对食品中分离的未知菌，或有多种细菌污染的样品则显得无从下手。为了实现对食品中致病菌的快速检测与鉴定，预防肠道细菌性疾病的发生，我们运用寡核苷酸芯片技术建立了对常见食源性致病菌进行检测的方法，检测的目的菌株是霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 、副溶血性弧菌、耶尔森氏菌、单增李氏菌、富氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌。我们利用在细菌分类学上具有重要意义的1 6 sr r n a 和2 3 sr r n a 基因作为检测的靶分子，并在其问设计探针，建立一套食品致病菌的基因芯片快速检测技术。不同细菌的1 5 sr r n a 和2 3 sr r n a 基因具有序列一致的恒定区和序列不同的可变区，恒定区和可变区交错排列。这样，我们在恒定区设计p c r 引物，在可变区设计检测探针；用四对引物在同一反应条件下就可以将全部九种致病菌的相应基因片段扩增出来，再用每种细菌的特异性探针阵列与标记的靶片段进行杂交反应，杂交后用专用设备读取分析荧光信号，可以定性和半定量地检出致病菌。通过杂交结果可以看出设计的探针特异性强，并且相对于传统的方法操作简单、用时少，稳定性、重复性都非常好，灵敏度可达到1 6 1 0 3 c f u m l ，另外，我们还对单独d n a 模板下多重p c r 扩增反应条件进行了摸索。上述实验结果表明运用寡核苷酸芯片技术所建立的检测方法准确、可靠、实用性强，是检测食品中常见致病菌技术的一次飞跃，并且可一次实验操作同时检测多种食源性致病菌。本文所建立的检测方法为今后在食源性致病菌检测、鉴定领域开展进一步的研究和更大规模的使用奠定了可靠的理论与技术基础。关键词：寡核苷酸芯片食源性致病菌鉴定和检测系统5运用寡核苷酸芯片技术鉴定捡澳j 食源性致病茵技术的研究文献综述l食品中常见致病菌及常规的检测技术l1 食源性致病菌危害的严重性食品是人类赖以生存和发展的物质基础，细菌导致的食源性疾病自然成为了人们关注的焦点，世界上大多数国家都非常重视食品安全性问题，各国政府都采取了相应的措施控制和检测食源性致病菌，并以立法的形式来确保食品的安全，但由于天然的食物源生产的全球化、新的食品生产工艺的应用、人们饮食习惯的改变等各种因素在一定程度上降低了食品的安全性。据权威资料报道，病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一“3 。近年来，在世界范围内食品安全方面的恶性、突发性事件屡屡发生。继大规模发生于日本、欧洲、美国的大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 食物中毒后，欧洲和日本又出现了牛海绵状脑病( b s e ，俗称疯牛病) 。法国出现了李斯特氏菌的疾病”1 ，香港出现了禽流感，比利时出现了二嚼英。以及具有多重抗药性的鼠伤寒沙门氏菌在多国的流行等”1 。其中有的引起大量急性发病乃至死亡；据不完全统计，1 9 9 9 年美国暴发了由冰激凌污染造成的沙门氏菌疾病估计有2 2 4 0 0 人患病：2 0 0 0 年全球有2 1 0 万人死于腹泻，大部分归因于食物和饮用水中致病菌的污染“1 ；全球每年约有1 4 0 0 0 例志贺氏菌病，估计发病人数达3 0 万。1 9 7 6 年在美国纽约暴发过一起耶尔森氏菌导致的疾病，有2 】7 名学生感染。据f i ) a统计，1 9 9 7 年美国加州等5 个州食源性疾病共为8 0 5 1 倒，其中志贺氏菌引起的为1 2 5 3例。自从1 8 1 7 年至今，在南亚地区，霍乱弧菌引起的食源性疾病大暴发己达七次：工业化国家每年患食源性疾病者高达3 0 。例如，美国每年约有7 6 0 0 万例食源性致病菌导致的疾病，其中有3 2 5 0 0 人住院治疗，5 0 0 0 人死亡；包括我国境内的江苏、浙江、安徽、山东等地在内暴发的大肠杆菌0 1 5 7 ：盯食物中毒，至今也导致近万人发病”1 ：2 0 0 1 年i月7 日，法国卫生部宣布，由于受到单核细胞增生李斯特氏菌的污染，法国已有9 名食用受污染肉制品的消费者发病，其中两名死亡，其他人昏迷不醒”1 。而且据世界卫生组织( w h 0 ) 统计报告表明，食源性疾病的实际发病率要比报告的病倒数多3 0 0 5 0 0 倍，全世界的患病者以达数亿，并且每年的统计数值都居高不下，消耗了大量的人力和物力。在美国由7 种特定的食源性致病菌引起的疾病花费和生产损失每年高达3 5 0 亿美元；沙门氏菌，特别是对几种抗生索有耐药性的伤寒沙门氏菌的感染人群i 3 以上需要住院治疗，约3 的病例死亡”。1 9 9 1 年秘鲁出现的霍乱弧菌污染，导致鱼和鱼产品年出口损失达5 亿美元”1 。细菌污染造成的食源性疾病( 食物中毒) 也仍是我国食品安全中最突出的问题。在我国，食源性致病菌如大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 、志贺氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌、耶尔森氏菌、刨伤弧菌等被公认为主要的食源性致病菌。据卫生部统计，2 0 0 0 年共收到重大食物报告达1 5 0 起，中毒6 2 3 7 人，死亡1 3 56运用寡核苷醯芯片技术鉴定检测食j 橐性致病菌技术的研究人9 1 ：2 0 0 1 年共发生重大食物中毒事件1 8 5 起，1 5 7 1 5 人中毒，1 4 6 人死亡“。这些由于各种因素导致的食源性疾病影响的国家范围之广、危急健康人群之多都是其他原因引起疾病所不及的，而且还给国家之问相关的食品贸易带来危机。这使得食品安全问题受到了空前的关注。这些事实也可以充分说明尽管现代科技已经发展到了相当高的水平，但食源性致病菌导致的疾病不论在发达国家还是在发展中国家，都没有很好的被控制，仍然危害着人民的健康、食品安全面临着严峻的挑战。1 2 常见的食源性致病菌目前，常见的食源性致病菌有以下一些种类：单核细胞增生李斯特氏菌( 以下简称单增李氏菌) 属于李斯特氏菌属，致病菌株的血清型一般根据菌体( 0 ) 分为1 2 b 、i 2 c 、3 a 、3 b 、3 c 、4 a 、5 、1 2 a 和4 b ，后两型尤多。是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜李氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，该菌在4 c 的环境中仍然可以生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一- 。沙门氏菌属于肠杆菌科，嗜温性细菌，在常温、中性p h 、低盐和高水活度条件下生长最佳。在伯杰细菌分类手册( 第8 版) 中对该属细菌作如下描述：革兰氏阴性直杆菌，大小0 7 一l - 5 2 0 - 5 0 蛔“。沙门氏菌属含有许多种，主要分为肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌等。沙门氏菌病潜伏期一般6 h r - 7 2 h r ，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤、头痛，病程一般1 - 2 天或者更长，感染剂量为1 5 2 0 个菌，死亡率达1 一4 。最易感人群是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等“。志贺氏菌属于志贺氏菌属，其形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2 - 3 m 宽0 5 - 0 7 。不形成芽孢、无荚膜、无鞭毛、有菌毛。d n a 的g + c 为4 9 5 3 9分子( t m 法) 。主要分为弗氏志贺氏菌和宋氏志贺氏菌，人和灵长类是志贺氏菌的适宜寄主，营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更易感染。志贺氏菌主要是经过水和食物传播，只需少量病菌( 至少1 0 个细菌) 进入体内，就可引起细菌性痢疾，严重时可导致毒血症1 。副溶血性弧菌属于弧菌属中致病菌之一，是近2 0 年才被发现和重视的，其主要污染的食品有鱼类和贝类，尤其在夏秋季节的沿海地区常会出现含有副溶血性弧菌的海产品引起的暴发性食物中毒，主要能引起胃肠炎，常出现恶心、腹泻、腹部痉挛、呕吐、头痛等症状“。空肠弯曲菌属于弯曲茵属，是7 0 年代命名的一群革兰氏阴性微需氧菌，螺旋形，弯曲杆状；大小为( o 2 - 0 8 ) 啪( 0 5 - 5 ) 胁，有一个以上螺旋可长达8 阳，也可出现s形或似飞翔的海鸥形，菌体一端或二端有单根鞭毛，长度约为菌体的2 - 3 倍，有活泼的动力或不产生动力。该菌感染称为弯曲杆菌病，可引起腹泻，是人类急性胃肠炎的常见7运用寡核苷酸芯片技术鉴定检测食源性致病茼技术的研究病原菌“。耶尔森氏菌属包括1 1 个种，其中小肠耶尔森氏菌和与它关系十分密切的3 个同源群被作为耶尔森氏菌。该菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小为( i - 3 5 ) m ( 0 5 - i 0 ) p r o ,多单个散在。无荚膜，不形成芽孢，有周鞭毛。在3 0 以下有动力，而3 5 c 以上则无动力。该菌分布很广，猪的带菌率较高，日本报告检出率为4 ，加拿大为3 6 ，丹麦为1 0 一1 7 ，是导致肠胃炎的主要病原菌“。霍乱弧菌在伯杰细菌分类手册( 第8 版) 中作如下描述：该菌属革兰氏阴性、兼性厌氧杆菌、弧菌科、弧菌属中的一种，d n a 中的g + c 平均含量为4 7 9 分子，太多数菌株的值介于4 5 - 4 9 9 分子“。霍乱弧菌导致的疾病称为霍乱，是流传时间长、影响范围广的一种食源性疾病，由于该菌在繁殖过程中产生霍乱肠毒素，系外毒素，它促使肠黏膜细胞大量分泌肠液，导致严重呕吐、腹泻，严重时出现脱水、腹部痉挛甚至死亡“。肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 是1 9 8 2 年美国疾病控制中心和预防中心( c d c ) 在对密西根州和俄勒冈州因食用汉堡包快餐而暴发的两宗溶血性腹泻进行流行病学调查时分离出来的，该菌具有菌体抗原( o 抗原) 和鞭毛抗原( h 抗原) “，故称肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 。该菌属于肠杆科埃希氏菌属。革兰氏阴性，无芽孢，有鞭毛，可产生大量的v e r o 毒素( v t ) ，是主要的致病因子。肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 感染剂量低，潜伏期为3 1 0 天，病程2 - 9 天。通常是突然发生剧烈腹痛和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻，部分患者可发展为h u s 、t t p 等，严重者可导致死亡。传播途径为牛肉、生奶、鸡肉及其制品和蔬菜等，牛肉为主要的传播载体“。美国和加拿太的研究显示：肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 感染致病比志贺氏菌更普遍”“”1 。据资料显示。美国每年约有2 0 0 0 0 人染上肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 病，其中约有5 0 人死于该病“。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌中毒力最强的细菌。广泛分布于空气、土壤、水及食具。人和动物具有较高的带菌率。健康人的咽喉、鼻胜、皮肤、头发等常带有产肠毒素的菌株，故易于经手或空气污染食品“”。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0 8 岫左右，显微镜下排列成葡萄球串状，无芽孢及鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。平板菌落后、有光泽、圆形凸起，直径卜2 m m “”。金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为a 、b 、c 、d 、e 及f 五种血清型。它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。以上简单介绍了常见的九种食源性致病菌，还有一些如溶血性链球菌、腊状芽孢杆菌、肉毒梭菌等，由于本论文建立的方法所检测的致病菌中不包括这几种细菌，所以在这里就不进行介绍了。i 3 食源性致病菌检测技术应用的现状目前在实际的检验检疫工作中常用于检测和鉴定食源性致病菌的方法主要有p c r 、8运用寡核苷酸芯片技术鉴定检洲食潦性致病茸技术的研究s o u t h e r nb l o t 杂交、酶联免疫吸附法( e l i s a ) 等一些简单的分子生物学和免疫学方法。质检总局动植物检疫研究所的朱水芳等运用p c r - e l i s a 亲和诱扑方法检测番茄环斑病毒 2 0 1 青岛局的寇运同等用p c r 技术检测食品中的单增李氏菌“1 ；上海局的韩伟等运用p c r和v i d a s 的方法检测食品中的弯曲菌属”；覃文等运用v i d a s 法和a p il i s t e r i a 法对食品中李斯特菌进行检测和分类；曹泽虹等用p c r 法检测肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 、沙门氏菌、肠炎弧菌、金黄色葡萄球菌“；w i l l i a mp ce ta l 和r u d o l fae ta l 运用d n a 探针杂交法检测食品中的沙门氏菌。2 ”：t o r t o r ag j 等和h a z e ld m ，k e l ld b运用细胞计量术对牛奶中的单增李氏菌进行检测”1 。周帼萍等用基因重组方法对志贺氏菌进行检测1 ；白薇等运用p c r r d b 方法以1 6 sr d n a 为引物检测空肠弯曲菌和沙门氏菌”“；谢晓红等运用p c r 技术检测食品中的副溶血性弧菌1 。由于单增李氏菌的检测周期长、菌属之间生化差别不明显等的特殊性，故对于该菌检测的研究相对比较多，d a w nm n o r t o n 等运用p c r 和d n a 足迹法检测熏鱼加工业中的单增李氏菌，检测的灵敏度达到小于3 1 0 “1 ；l 07c o n n o r 等运用快速p c r 和d n a 探针膜转移法检测食品中的单增李氏菌，将探针设计在1 6 sr d n a 上，检测的灵敏度为卜i o c f u m lc ”1 ；m m a n z a n o 等运用p c r和探针扑捉原位杂交的方法( 0 s c p h ) 检测食品中的单增李氏菌”“；g i o v a n n af r a n c i o s a等p c r 技术和足迹法对侵袭和非侵袭性李氏菌病的单增李氏菌进行定性检测“1 ；a m s e w e l l 等用酶联荧光的方法检测食品中单增李氏菌”1 。k s y e h 等以鼠伤寒沙门氏菌的，i m y 作为检测的目的基因对其进行检测，检测的灵敏度达到3 4 c f u m l ；m a r i j a 等以1 6 sr d n a 设计引物对肠炎沙门氏菌进行检测。”：k e n j ih i r o s e 等选取t y v ( r f b ) ，p r t ( r f b s ) ，v i a b 等基因，用多重p c r 技术检测肠炎沙门氏菌1 “。p i n am f r a t a m i c o 等用多重p c r 法快速检测食品中的肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ；h 7 ”；g r c a m p b e l l 等用多重p c r 技术检测水中的肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 j 。w i mj b w a n n e t 等用复合p c l i 法快速、灵敏的检测耶尔森氏菌“；k c h o w 等p c r 技术以r t z作为目的基因检测霍乱弧菌1 ；c h k i m 等以u c 为检测的目的基因，检测牛奶中的金黄色葡萄球菌“。e l i s a 技术也被广泛应用于食品检测中，a o a c 早在1 9 9 0 年就将e l i s a 作为检测沙门氏菌、单增李氏菌的官方方法1 。此外有报道称细菌的检测和鉴定还有使用物理和化学的方法，如电阻抗测量法、放射测量法、生物发光法、直接外荧光过滤技术和色谱的方法。1 4 上述的检测技术应用的不足我国目前对于食源性疾病的病原菌检测、鉴定手段仍停留在培养、血清和生化水平。检测的周期相当长，一般达到7 - i 0 天，有些难培养的致病菌如单增李氏菌的检测流程要达到2 0 天左右，在相当大的程度上限制了对食源性疾病病源食品的快速检测鉴定能力，并且在判断是否为阳性时只靠实验人员肉眼观察，没有足够可靠的依据，降低实验结果9运用寡棱苷酸芯片技术鉴定检测食源性致病菌技术的研究的准确性。一些简单的分子生物学的方法如p c r 、e l i s a 都有较高的假阳性结果出现，并且运用p c r 和e l i s a 得出的结果都不能作为最终的检测依据。目前丹麦、澳大利亚等一些欧洲和澳洲国家食源性病原菌的检测结果综合了实时荧光p c r 和e l i s a 两种技术在d n a 和蛋白质两种水平上检测的结果进行判断，并且实验操作只有l h r 左右。因此我国有必要建立起食源性致病菌的高通量、快速、准确的监测体系，以确保在相对较短的时间内正确判定食品的安全陛，这是有效地预防和控制食源性疾病的重要前提。只有这样才能在一定程度上提前消除由于食品中的致病菌所造成的危害，提高我国食源性疾病的检测和控制能力，为加入w t o 后尽早与其他国家达成通关协议搭建雄厚的技术平台。2 基因芯片技术简介2 1 基因芯片技术的原理随着人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ) 的逐步实旋及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物和微生物基园组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。基因芯片( g e n e c h i p ) 技术就是顺应这一科学发展要求的产物，该技术是2 0 世纪9 0 年代初期发展起来的一门由分子生物学、微电子学、物理学、化学、计算机科学等多学科交叉融合而成的高新技术，被评为1 9 9 8 年度世界十大科技进展之一。基因芯片技术是继基因工程( 熏组d n a 技术) 、聚合酶链式反应( p c r ) 之后，分子生物学技术发展的又一重大突破，不仅将推动分子生物学与生命科学的迅速发展，而且也将为阐明生命的本质，揭开生命之谜发挥重要的作用“”。在h g p 计划启动后不久，美国的f o d e r 等在硅芯片表面涂布一种光敏材料，采用光蚀刻技术。在光引导下原位合成多肽链”。1 9 9 6 年底，综合应用生物科学、计算机科学、数学等多种学科领域的多种理论和技术的世界上第一块基因芯片诞生并在后来得到广泛的应用。基因芯片的原理简单地说就是核酸分子杂交( s o u t h e r nb l o t 杂交技术) ，即利用d n a双链的特性，通过判断基因芯片上固定的大量已知序列的寡核苷酸、c d n a 或基因片段的探针与未知的靶分子进行变性、杂交，杂交发生与否采用荧光标记技术检测。其突出的特点是集成化、微型化、自动化。基因芯片操作的简单步骤为支持物的处理探针的制备点样样品的制备样品的标记样品的杂交杂交结果的检测。2 2 基因芯片技术的种类2 2 1 按我体材料分类按照基因芯片所采用的载体材料将其分为硅芯片、陶瓷芯片、玻璃芯片、聚丙烯膜芯片和尼龙膜芯片等。目前，玻璃材料因易得、荧光背景低、应用方便等优点在国际上被广泛接受。通常在玻片上连接活性基团，比如氨基、醛基、巯基、氢氧基等使d n a 分子通过共价键或离子键牢固地固定在玻片上1 。1 0运用寡棱苷酸芯片技术鉴定检测食源性致病茵技术的研究2 2 2 接点样方式分类根据基因芯片点样方式的不同，可将其分为原位合成芯片、微矩阵芯片( 分喷点和针点) 和电定位芯片。2 2 2 1 原位合成法原位合成法有三种制备方法。一是a f f y m e t r i x 公司采用的方法，即显微光蚀刻法( p h o t o l i t h o g r a p h y ) ，将半导体中的光蚀刻技术运用到d n a 合成化学中，以单核苷酸或其他生物大分子为底物，在玻璃片或其他一些固相支持物上原位合成寡核苷酸，以光敏保护基保护碱基的5 羟基，合成时利用光照射使光敏保护基脱保护，然后与光敏保护基、亚磷酰氨活化的碱基单体接触。在那些脱去保护基的地方合成寡核苷酸探针。每次循环都有特定的核苷酸结合上去，直到设定的寡核苷酸长度：每个寡核营酸片段代表一种特定的基因，存在于基因芯片的特定位置上”1 ，这种芯片的集成度较高，可达l o x l 0 4 - 4 0 1 0 4 点阵c m 。但合成的寡核昔酸探针长度较短，一般为8 2 0 个核苷酸残基( 1 i t ) ，最长为5 0 个n t 。二是喷墨的原理将单核菅酸前体喷到设定的位置，i n c y t ep h a r m a c e u t i c a l s 公司最先开发了压电打印法，以类似于彩色喷墨打印机的装置进行核酸合成，用四种碱基替代墨盒中的墨汁，在计算机控制下台成试剂被喷射在预设的底物位点表面，所用合成技术也是冲洗、去保护、偶联等常规的固相原位合成技术陆0 “。我国东南大学陆祖宏等用分子印章技术进行探针的原位合成也取得了成功“”。这种方法是根据所需的微阵列设计制备有凹凸的微印章，然后根据预先的设计在刻好的印章上涂上对应的单核苷酸，最后按照设计的顺序将涂有不同的单核苷酸的微印章逐个依次压印在同一片上。然后利用可以自动进行清洗和脱保护，氧化及封闭等化学反应的液体流动池，按照设计的序列进行原位d n a 合成，直到得到所需的序列长度“】。三是用物理方法如罩或物理障碍来限制前体物质的位置，同这种方法以复合的形式只需几步就能完成不同的，但相关的序列的复杂矩阵：用环状或菱形的反应腔将前体物逐一加到介质表面上来制备扫描状或复瓦状矩阵。这种方法已用于杂交行为的研究。2 2 2 2 微矩阵又称d n a 徽集芯片，是以斯坦福大学p a t r i c kb r o w n 研究小组为代表制备的一类芯片，是将p c r 、分子克隆、d n a 合成技术等方法得到的寡核苷酸、e d n a 片段等用针点或者喷点的方法直接排列到玻璃片等固相支持物上，从而制备成基因芯片“”。这种方法需要精密的打印装置，虽然芯片的集成度相对较低，可达l x1 0 4 - - 1 0 x1 0 点阵c m 2 ，但使用的探针组的来源比较灵活，可以是合成的寡核苷酸片段，也可以采用来自基因组的较长的d n a 片段；可以是双链，亦可采用单链d n a 或r n a 片段，且技术实现未受到严格的专利控制，因而近年来发展很快“。原位杂交法与微矩阵相比，有以下的优点：原位合成直接从c d n a 数据库中得到信运用塞核苷酸芯片技术鉴定检测食源性致病菌技术的研究患合成寡聚核苷酸，避免了e d n a 样品获得及制备过程中的不确定因素，而微矩阵法样品必须事先准备和保存。原位台成减4 t 片与片之间的差异，可保证芯片的高精密度。原位合成法制备的芯片密度高，目前最高可达4 1 0 5 个寡核苷酸1 6c m 2 。而微矩阵目前最高只有6 4 5 0 0 个基因6 6c 廿，通过技术的改进将来可达1 1 0 5 个基因6 5c m 2 。但是原位合成法与微矩阵相比，又有以下的缺点：成本高；设计和制备繁琐、耗时。正是由于微矩阵芯片成本低、容易操作、而且其点样密度通常能满足需要，因此更，。泛得到推广”1 。2 2 2 3 电定位法电定位芯片是利用静电吸附的原理将d n a 快速定位在硅基质、导电玻璃上”。“1 。美国n a n o g e n 公司和法国c i sb i o i n t e r n a t i o n a l 实验室采用此法。芯片经过氧化处理后，制成i m m x1 l 【的阵列，每个阵列含有多个微电极，在每个电极上通过氧化硅沉积和蚀刻制各出样品池，将连接链亲和素的琼脂糖覆盖在电极上，在电场作用下生物素标记的探针就可结合在特定的电极上1 。该方法的优点是在电力推动下可使杂交快速进行，但制作工艺复杂，点样密度低。2 2 3 按探针种类分类按照固相载体上所点d n a 的种类不同，芯片可分为寡核苷酸芯片和c d n a 芯片两种。2 2 3 i 寡核苷酸芯片寡核苷酸芯片一般以原位合成等方式固定到载体上，具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于d n a 序列测定、s n p 分析等。但其缺点是合成寡聚核苷酸长度有限因而特异性差，而且随长度的增加，合成错误率随之增高，寡核苷酸芯片也可通过直接点样制备，但固定率不如c d n a 芯片高。寡核苷酸芯片主要用于点突变和测序等，也可以用于表达谱研究“1 。2 2 3 2c d n a 芯片c d n a 芯片是将微量c d n a 片段在玻璃等固相载体上按矩阵密集排列并固化，基因点样密度虽不及原位合成寡聚核营酸芯片高但比用传统载体，如混合纤维滤膜或尼龙膜的点样密度要高得多，可达到每张玻璃片6 0 0 0 0 个基因。e d n a 芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好，目前许多国家实验室和大制药公司都用此类芯片”1 。2 2 4 按用途分类按照基因芯片的用途可将芯片分为表达谱芯片、序列检测芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、毒理芯片等。表达谱芯片是目前比较成熟、应用最广泛的一种基因芯片，主要用于检测基因的差异性表达、寻找新基因和研究基因功能；序列检测芯片广泛用于备种特定基因序列的检测、基因突变和单核苷酸多态性检测，也有人将其用于基因测序”“1 。2 2 ，4 1 表达谱芯片1 2运用寡棱苷酸芯片技术鉴定检测食译性致病茸技术的研究表达谱芯片一般以e d n a 为探针，其检测原理为双色荧光探针杂交系统( t w o c o l o rf l u o r e s c e n tp r o b eh y b r i d i z a t i o n ) ，即将两个不同样品的m r n a 在反转录时用不同的荧光底物进行标记，两组样品的c d n a 混合后进行杂交。对同一个探针位点，在两组不同的激发光下进行检测，获得该位点上两个不同样品的杂交信号，其比值经阳性对照( 外参照)比值和组成型表达基因( 内参照) 比值的校正后，就是该基因在两个不同样品中差异性表达的比值。通过基因的差异性表达研究，可以迅速将某个或几个基因与特异性表型联系起来，对这些同特异性表型相关的基因表达进行综合的分析和判断，研究这些基因的功能、基因与基因间相互作用的关系，获得大量与研究领域相关的基因，使研究更具目的性和系统性”1 。s t a n f o r d 大学的m ”ks c h e n a 首先使用表达谱芯片进行基因差异性表达研究，以拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 基因组的4 5 种基因作探针，研究了拟南芥根与叶晒种组织中基因的差异表达1 。表达谱芯片研究基因表达与传统的n o r t h e r nb l o t 杂交相比有许多重要的优点：检测系统的微型化，对样品、试剂的需要量非常小；同时研究上万个基因的表达变化，研究效率明显提高：能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表达情况”“。2 2 4 2 序列检测芯片序列检测芯片的检测原理为杂交测序( s e q u e n c i n gb yh y b r i d i z a t i o n s b h ) ”8 i ，主要用于大量基因的定性检测及突变体和单核苷酸多态性( s n p ) 分析。由于跃e d n a 探针的特异性较差，一般序列检测芯片以寡核苷酸片段作为探针。进行突变体检钡4 和单核苷酸多态性( s n p ) 分析有两种方法，一是杂交方法：针对每个检测位点，通常设计四种寡核苷酸探针，四种探针同以检测位点为中心的一段靶序列同源，但针对于检测位点，四种探针分别是a ，g ，c ，t 四种碱基，探针长度一般在1 5 b p左右，太长杂交时会降低对错配的识别能力。在严谨的杂交条件下，靶序列与错配的探针杂交明显不如与匹配的探针杂交稳定，据此可测定出该碱基的种类。二是d n a 酶延伸法：设计四种探针。并同检测位点上游的一段靶序列同源，四种探针的3 端对应于检测位点的位置分别是不同的四种碱基，在严谨的条件下杂交，并洗去未结合的核酸，在芯片上加上测序酶和四种荧光标记双脱氧核糖核酸进行反应。只有37 端与待测核酸完全匹配的探针才会被测序酶延伸、标记，据此可测定出该碱基的种类。三是d n a 连接酶法：设计五种探针，并同检测位点上游或下游的一段靶序列同源，其中四种探针的3 端或57端对应予检测位点的位置分别是不同的四种碱基，另一探针带荧光分子，并在同靶序列杂交时和前四种探针首尾相接，在严谨的条件下杂交并洗去未结合的核酸，在芯片上加运用寡核苷醯芯片技术鉴定桂测食源性致病茵技术的研究上d n a 连接酶和a t p 进行反应。只有3 端或5 端与待测核酸完全匹配的探针才会被d n a连接酶连接、标记，据此可测定出该碱基的种类。基因芯片已被用于b 一地中海贫血中突变体检测”。l i p s h u t z 等采用含1 8 ，4 9 5 个寡核昔酸探针的芯片，对h i v - 1 基因组反转录酶基因和蛋白酶基因的单核苷酸多态性( s n p ) 进行了研究”。如果进行基因的定性检测，只需设计出同靶基因的特定区域同源的几套寡聚核苷酸探针即可。因为可同时检测成千上万个靶基因基因芯片已大景用于各种病原物检测。如a f f y m e t r i x 公司开发了h i v 病毒检测芯片，国内博道公司已研制了检测丙型肝炎病毒( h c v ) 的基因芯片。北京微生物研究所与哈尔滨基太生物芯片公司合作开发的细菌感染通用基因芯片诊断系统，一次杂交可鉴别引发呼吸道感染的2 0 余种常见菌。基因芯片还可用于水质监测、食品微生物检验、动植物检疫、转基因检测、遗传病检测和亲子鉴定等根多方面”1 。2 3 基因芯片的应用范围及现状基因芯片作为分子生物学上的一个重要的技术突破，在许多领域内得到了应用，有些已经成熟，有些还处于探索阶段，但是可以看出随着基因芯片在生物学研究的不断深入，它将在未来的几年甚至几十年间成为研究领域的主角。2 3 1 基因芯片在微生物方面的应用2 3 1 1 微生物基因表达谱研究目前基因芯片应用到基因表达谱研究最多，也是最成熟的领域。由于在芯片上可以固定成千上万的探针，这使得众多基园的同时检测成为可能。可以对比在不同条件下一个基因组中大量的转录水平的差异，也可以对比不同基因组中对应基因的转录差异，这一点从根本上突破了以前基因研究中次只能关注一个或几个基因的瓶颈，极大地推动了微生物学相关研究的进展。2 3 1 _ 1 1 微生物应激表达谱生物在生长过程中经常会遇到一些异常情况，例如温度升高或降低、刺激物浓度升高等等，它们必须对这些异常情况作出应激反应，以避免伤害。对微生物的刺激应答进行深入研究可以揭示许多生命的奥秘。h e l m a n a 等人研究了热休克状态下枯草芽孢杆菌的表达谱，发现2 9 9 多个上调基因”：此外y erw 等研究了枯草芽孢杆菌在厌氧条件下的基因表达变化，发现几百个基因的表达水平发生变化，诱导最强烈的是硝酸盐呼吸和发酵基因”；运用基因芯片可以使在一次实验检测全部的应激表达基因，操作简便。2 3 1 1 2 毒力因子鉴定致病细菌的毒力因子表达是一个严格受控的过程，如果能够比较致病菌在接触宿主细胞后( 或者是体外模拟这一接触过程) 表达蛋白的差异，就可以为毒力因子的鉴定提供重要线索。通过表达谱分析来进行毒力因子鉴定通常有两个策略：在感染条件或模拟感染条件下特异性表达的基因是候选的毒力因子；新的毒力因子与已知的毒力因子通常1 4运用寡核苷酸芯片技术鉴定检测食滩蛀致病茼技术酌研究是共调控的，通过精确监测在特定条件下共表达的基因簇，最终鉴定出新的毒力因子”1 。2 3 1 1 ，3 微生物一宿主相互作用研究越来越多的研究表明，致病菌的致病过程是一个微生物与宿主相互作用的互动过程，在这一过程中不仅是细菌表达一些与黏附、侵入相关的蛋白以及毒力因子，宿主细胞也表达一些抗感染的蛋自，或是在病原细菌的诱导下，产生某些有助于细菌感染的蛋白；对这过程的深入研究将有助于进一步阐明宿主抗感染和致病菌致病机制。表达谱还可以在基础研究和应用研究中发挥独到的作用。例如可以研究基因的表达和调控等；在应用研究方面，可以研究工程菌株或天然发酵菌株的代谢途径，据此优化发酵过程或进行定向诱变，以提高产量1 。2 3 1 2 微生物基因组学的研究随着越来越多的细菌基因组序列的公布，比较基因组学研究逐渐成为微生物研究的热点。比较基因组学研究可以提供非常丰富的信息，指导后续的功能基因验证等工作。例如，比较同一个致病菌致病力不同菌株的基因组序列，可以推断出一些与致病力密切相关的基因；比较极端环境下生长的细菌与其近缘细菌的基因组序列，能为揭示极端微生物特殊表型的分子基础提供重要线索；而通过基因组序列比较，分析一些近缘细菌或同一细菌不同菌株间基因的缺失及获得，可以得到有益的进化信息。但是毕竟进行全基因组测序耗资巨大，利用已经公布的细菌全基因组序列，制备涵盖全部o r f 的基因芯片，可以在很大程度上满足全基因组比较的需要。这种芯片根据探针的类型可以分为p c r 产物芯片和高密度寡核苷酸芯片两种。可以看出，利用基因芯片技术进行比较基因组学研究，与测定目的细菌全基因组序列相比，大大降低了研究成本。2 3 1 3 微生物检测鉴定的研究基因芯片可以同时固定大量探针分子，是微生物通用检测方法的理想选择。利用基因芯片进行微生物通用检测的策略主要有两种，一是选择细菌种保守的1 6 sr p a n a 和2 3 sr r n a 等基因中能代表种特异性的片段作为探针，利用通用引物扩增标记待鉴定的菌株，进行杂交；另一个则是选择待检测微生物的特异性基因作为探针，利用多重p c r 扩增标记。两者都需要有目的片段的扩增过程，才能达到检测所需的灵敏度。2 3 1 3 1 基于保守序列的通用检测芯片l i u 等人将一组3 0 条1 6 sr r n a 基因寡核苷酸探针固定在凝胶衬垫上，这些探针分别为界、纲、科、属、种等分类阶元特异的探针，可以通过杂交模式来区分炭疽芽孢杆菌，腊样芽孢杆菌，蕈状芽孢杆菌，水母芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌等菌种，而前三者是非常近缘的”。n a n o g e n 公司最近推出的主动式杂交微电子芯片具有很好的特异性，利用s d a 反应扩增1 6 sr r n a 基因的可变区，可以同时检测四种病原细菌，特异性非常理想，具有很好的应用前景”。宋亚军等利用1 6 sr l i n a 和2 3 sr i l n a 基因寡核苷酸芯片进行了常见病原细1 5运用寡核苷酸芯片技术鉴定检测食源性致病菌技木的研究菌通用检测的尝试，取得了比较满意的结果。7 ”。利用保守分子基因芯片进行细菌通用检测的优点是检测范围广，但是对于非常近缘的细菌而言，特异性还有待于提高”“。2 3 1 3 2 基于特异基因和多重p c r 的通用检测芯片c a l i 等人制各了包含肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 四个毒力因子寡核苷酸探针芯片，复合p c r 后进行杂交，可检测到少于1 个细胞或l f g 的基因组d n a ，这一芯片可以明确区分0 1 5 7 ：h 7 和0 9 1 ：h 2 ”。还有研究者设计了代表肠杆菌科细菌六个常见抗原决定簇或毒力因子的寡核苷酸芯片，可以同时检测大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的不同菌株”。利用这一策略可以提高芯片在细菌检测中的特异性，缺陷是多重p c r 反应体系中可以使用的引物组合是有限制的，导致了一次反应检测细菌的种类不可能太多”“。2 3 1 3 3 鉴定用基因组片段芯片细菌全染色体杂交是进行细菌鉴定的熏要手段。研究表明，随机基因组片段芯片杂交可以取代全基因组杂交进行细菌鉴定。由于芯片容量很大，可以在芯片上实现多种细菌的同时鉴定，而且易于实现标准化，这种方法可望代替传统的全染色体杂交1 。2 3 1 ，3 4 耐药性检测芯片由于滥用抗生素引起医学上出现很多抗药菌株一样，在田间长期使用杀菌剂、杀虫剂也引起病菌、害虫出现耐药性，病菌、害虫通过改变杀菌剂、杀虫剂原有代谢过程，而使药剂效果降低。因此目前致病菌的耐药性已经成了医学界十分关心的问题，通常的耐药性检测需要进行细菌的培养，耗时较长。有资料报道，利用r p o l 瑾因寡核苷酸微点阵芯片不仅可以快速地检测结核分枝杆菌，还可以根据r p o b ；l 因突变，进行快速基因分型和利福平耐药性检测3 。而舱c 属因芯片可以在z h r 内完成金黄色葡萄球菌的甲氧西林耐药性检测2 。美国能源部a r g o n n e 实验室已与俄罗斯联合开发出了用于检测耐药结核杆菌的基因芯片。不同的个体在用药过程中会对药物产生不同的药效反应，有些药甚至对用药者不产生治疗效栗。反而产生毒性和不良反应，因此用基因芯片技术对耐药性进行检测是相当重要的。2 3 2 基因芯片在其他方面的应用2 3 2 1d n a 测序早在十几年前就已经提出利用基因芯片进行d n a 测序1 。其依据是杂交测序原理，短的标记寡核苷酸探针( 一般为1 8 - 5 0 个核苷酸) 与靶d n a 杂交，计算机扫描分析杂交谱，从而重建靶d n a 序列。一般情况下，探针在0 1 “g m l 浓度下，l o m i n 就能达到最高限度的杂交率，带荧光标记的目标d n a 与芯片上的探针杂交后。经检测器及处理器分析处理就可得出靶d n h 序列，一次可测定较长片段的d n a 序列。基因芯片技术具有快速、准确等特点，应用该技术进行杂交测序有其他方法无可比拟的优越性。“。m u r kc h e e 等利用这种方法确证地对人类线粒体基因组测序，证明其准确率达到9 9 c “3 。1 6运用寡括苷酸芯片技术鉴定检测食源巨致病酋援术的研究2 3 2 2 药物筛选药物筛选是药物研究过程的一个重要环节。药物筛选是指基于一定的模型，依据一定的指标，对可能作为药用的物质进行初步药理活性的检测和实验，以期发现有活性的药物或药物前体，为发展新药提供最初始的依据和资料。药物筛选从最初的“神农尝百药”开始，经过漫长的发展过程，先后建立了以实验动物为模型的筛选方法，发现了许多有活性的药物或前体。在发现药物筛选靶标，如受体、重组受体、酶、转录因子、细胞因子、生长因子等的靶基因及其相关基因之后，再将这些基因片段集成在一块芯片上。然后与待测筛选化合物进行一次简单的杂交实验，分析它们对这些靶基因及其相关基因表达的影响，就可同时检测该化合物的多种药理活性( 如抗肿瘤、抗h i v 、抗h c v 等) ，大大提高了药物筛选的效率，克服传统药物筛选方法周期长、操作繁琐、费用巨大、效率不高等弊端。并且具有检测灵敏度高，仪器实现自动化，所需实验样品量较少，筛选样品种类多样化等优点，从而使得基因芯片技术在药物筛选中具有强大的竞争力。目前有很多制药公司已经开始致力于这一方面的工作，建立和正在建立基因表达谱数据库，为药物筛选提供各种靶基因。相信基因芯片技术一定会在药物筛选领域作出更大的成绩1 。2 3 2 3 基因芯片在其他方面的应用在预防医学研究方面：基因芯片可以用于大靓模的毒理学和他合物的致突变的研究，疾病分子水平的病因学研究和遗传特性测定。据报道，美国国立环境卫生研究院( n i e h s )已开发出检测环境有害物质的毒理芯片。环境保护方面：基因芯片可用于快速大规模检测污染源，寻找保护基因，防治危害的基因工程药品，寻找能够治理污染源的基因产品。军事和司法方面：基因芯片可用于开发生物战病原体检测系统，研制生物战保护剂，进行血型、亲子鉴定及d n a 指纹图谱分析等。在农业方面：对具有重大经济价值的农作物来说，基因芯片可用于筛选基因突变的农作物，寻找高产、抗病、抗虫、经济价值高的作物，进行农药的筛选以及动植物疾病的快速诊断等1 。2 4 基因芯片的虎展前景综上所述，基因芯片在短短的几年发展时间中，已经渗透到了生物学的各个领域，而且在未来的发展和应用前景非常广阔。预计几年内芯片上探针点阵的空间分辨率将达到l u m 水平，人体所有基因有望集成在一块l c m 2 的芯片上。基因芯片不仅可以应用到上述领域，还可以在人口健康、优生等领域得到应用。美国是生物芯片技术研究最为领先的国家，a f f y m e t r i x 公司是基因芯片技术的开拓者，其产品有诊断用的基因芯片，如h i v 、p r t 、p 5 3 和细胞色素p 4 5 0 等，以及基因组研究用的基因芯片，如人类、酵母和小鼠的基因表达分析用的基因芯片等”1 。第一代基因芯片已进入应用化、产业化阶段，第二代基因芯片将从根本上解决生物信息检测的自动化、集成化、微量化，它代表基因芯片的发展方向。相对于国外，我国的基因芯片研究刚剐起步。生物领域的专家组于1 9 9 9 年5 月1 7运用事棱苷酸芯片技术鉴定检霜4 食；酿性致病菌技术的研究中旬分别在南京和上海召开“生物芯片技术”研讨会，已将生物芯片技术作为重点课题予以启动。我国的第一块生物芯片c d n a 于1 9 9 9 年6 月由中国科学院上海细胞生化所开发成功。近几年，我国的基因芯片技术飞速发展，已经基本上与发达国家保持一致“。目前基因芯片正朝着以下方面发展：一是提高检测的灵敏度，如检测系统的优化组合、采用高灵敏度的荧光标志或新的信号系统。二是提高检测的自动化水平，将样品制备、标记扩增、检测分析集成于一张或几张小小的芯片上，实现全过程自动化，形成所谓的“芯片上的实验室”( l a b o n c h i p ) ，从而极大地缩短检测和分析时间。现在，已经有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片问世。7 “”l 。三是方法的标准化和降低成本，这是目前推广应用的主要障碍。可以看出基因芯片技术与传统的杂交技术相比，有检测系统微型化，对样晶的需要量非常少；效率高，能同时分析数千种待测d n a 序列，更好地解释功能基因之间的相互关系及检测基因表达变化的灵敏度高等优点。基因芯片在生命科学中的应用前景一定会像p c r 技术一样必将成为生命科学研究的有力工具。3 基因芯片技术检测肠道致病菌基因芯片技术可以实现对多种目的基因平行化鉴定，正是这一高通量的特点使其适合于复杂样品( 如食物和粪便) 的检测。将基因芯片技术与致病菌检测结合在一起，会全面地提高了检测的水平，增加同时对多种致病菌鉴定的能力，这也是目前一些常规的生化鉴定和简单的分子生物学技术所无法比拟的。该技术较常规的方法大大地缩短了检测的周期，整个的操作只需3 4 h 完成，必要时进行增菌也只需1 8 h 左右，可以避免假阳性和假阴性结果的出现。并且检测的结果是通过自动化分析，避免了由于操作人员之间的差异导致结果的错误，是食品安全和临床诊断方面的重大技术突破。3 1 检测肠道致病菌的毒力因子基于基因芯片高通量筛选的特点，许多科研工作者选取各种致病菌特异性的毒力因子作为检测的靶标，通过多重p c r 的方法扩增多种致病菌，然后经基因芯片杂交进行鉴定。这种将多重p c r 技术与基因芯片相结合的方法克服了仅使用多重p c r 技术只能对少于6 种基因片段同时检测的限制，因为基因芯片的检测不仅仅是以p c r 产物的长短作为区分的标准。g u o 等首先将p c r 扩增与基因芯片检测结合起来，他们使用寡核苷酸探针对人酪胺酸酶基因的5 个s n p 位点进行鉴定。c a l l 等”“建立了一种寡核苷酸芯片