（细胞生物学专业论文）食管癌中plk1的转录调控及作用机制研究.pdf

j 北京协和医学院中围医学科学院博l ：学位论 中英文摘要 m l 一 刖吾 材料和方法 1 实验材料 2 实验方法 结果 1 p l k l 相互作用蛋白的筛选、 2 p l k l 通过泛素化降解途径调 2 1p l k l 与b c a t e n i n 蛋白存在相互作用4 7 2 2 抑制p l k l 导致b c a t e n i n 蛋白水平及其转录活性降低4 8 2 3p l k l 调节b c a t e n i n 蛋白降解过程。5 0 2 4 食管癌细胞中p l k l 通过b c a t e n i n 增强细胞恶性能力。5 3 3 p l k l 参与食管癌细胞抗失巢凋亡的分子机制分析5 7 3 1p c a t e n i n 参与调控食管癌细胞抗失巢凋亡5 7 3 2p l k l 在细胞诱导悬浮后表达上调并抑制细胞失巢凋亡5 8 3 3p l k l 对食管痛细胞中失巢凋亡相关通路的影响5 9 3 4 细胞悬浮后n f k a p p a b 调节凡k j 基凶的转录6 3 讨 仑7 1 1 p l k l 相互作用蛋白研究7 l 2 p l k l 参与调控b c a t e n i n 蛋白水平和w n t 信号通路7 2 3 p l k l 抑制细胞失巢凋亡的分子机制7 5 4 尸k j 基因的转录水平调控7 7 j 、结。8 0 文献综述。8 1 参考文献。1 0 2 附录1 1 3 致谢1 1 5 2 一 j 北京协和医学院中固医学科学院博i j 学位论文 图表索引 表1 食管癌标本病理资料及使用情况1 4 表2c o r r e l a t i o nb e t w e e np l k le x p r e s s i o na n ds u b c e u u l a rl o c a l i z a t i o n o fp c a t e n i ni n1 2 2 e s c cp a t i e n t s 5 5 图1g s t p u l l d o w n 联合蛋白组学手段研究相互作 j 蛋白实验流程4 1 图2 原核表达g s t 及p b d 结构域4 1 图3p b d 结构域及g s t 蛋白进行p u l l d o w n 实验4 2 图4 对质谱鉴定蛋白进行g o 分类后作图4 3 图5 部分质谱鉴定蛋白的w e s t e mb l o t t i n g 验证4 4 图6l q g a p l 与p l k l 蛋白免疫共沉淀结果。4 4 图7m 2 p k 、p l k l 与y t u b u l i n 蛋白免疫共沉淀结果4 5 图8k y s e4 5 0 细胞中内源性p l k l 与m 2 一p k 共定位4 5 图9 串联质谱鉴定出的位丁9 0 k d 左右的肽段序列4 7 图1 0 食管癌细胞k y s e 5 1 0 中p l k l 与仔一c a t e n i n 的相互作用4 8 图1 1k y s e 4 5 0 细胞中p l k l 与b c a t e n i n 的相互作_ j 4 8 图1 2 抑制p l k l 蛋白使d - c a t e n i n 的表达水平降低4 8 图1 3 抑制p u 富集柱：s y m m e t r yc 1 8 ，1 8 毗m x2 0 m m ，5u m 颗粒 分析柱：n a n o a c q u i t yu p l c 超高效液相色谱键合乙烷杂颗粒柱b e h c l 8 ， 7 5 u m 2 5 0 m m ，1 7u m 颗粒 柱温度：3 5 0 c 流速：2 0 0 n l 分钟 流动相a ：含0 1 甲酸的水溶液，流动相b ：含0 1 甲酸的乙氰。 梯度：5 到4 0 b6 5 分钟，到8 5 b5 分钟，8 5 b 停留1 0 分钟，平衡1 0 分钟到起始1 b 。 质谱条件： 质谱仪：s y n a p th i 曲d e f i n i t i o nm a s ss p e c t m m e t r y 质谱仪 ( w a t e r s 公司) 离子化方式：纳升电喷雾正离子 数据采集模式：d d a 方式，每次扫描中两个强度最高的离子进行串联质谱 分析 3 7 北京协和医学院中困医学科学院博i j 学位论文 毛细管电压：2 5 0 0 v 锥孔电压：3 5 v 源温：9 0 0 c 采集范围：m s ：3 5 0 1 6 0 0 ，m s m s ：5 0 2 0 0 0 数据分析软件：p l g sv 2 3 处理后通过m a s c o t 检索软件的m sm s 离子方式 检索数据库。检索条件：t r y p s i n 酶切，m 氧化和碘乙酰胺烷基化为可变修 饰，漏切位点为1 。m s 和m s m s 的质量误差均为o 2 d a 。 8 细胞体外实验 8 1l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 转染质粒入哺乳动物细胞 生长良好的细胞于转染前一天接种到六孔板中，经1 6 1 8 小时，细胞总面积达 到6 0 8 0 。取5 l 转染试剂加入2 5 0 lr p m j1 6 4 0 ；同时，将2 g 质粒d n a 加入另外 2 5 0 lr p m i1 6 4 0 。将两者温和混匀，室温放置2 0 分钟。细胞先用p b s 洗一至两次， 加入2m lr p m i1 6 4 0 ，然后将上述混合物轻轻加到培养细胞上。3 7 0 c 培养5 小时后， 换j 下常培养液终止转染。2 4 4 8 小时后收集细胞，检测其瞬时表达情况。如果需筛 选稳定细胞株，在4 8 小时后将细胞按1 ：1 0 传代，然后加入选择抗生素进行筛选，约 1 0 1 4 天左右有明显克隆形成，鉴定后保存。 8 2l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 转染s i r n a 入哺乳动物细胞 在2 5n m o l 的双链s i r n a 中加入1 2 5 l1 通用缓冲液，得到浓度为2 0 m o l l 的 s i r n a 母液，工作母液于9 0 。c 保温2 分钟，自然冷却至室温后置于4 0 c 过夜备用。用 0 1 的d e p c 水处理转染相关枪头和e p 管，去除r n a 酶。生长良好的细胞于转染前 一天接种到六孔板中，经1 6 1 8 小时后，细胞总面积达到5 0 6 0 。取5 l 转染试剂加 入2 5 0 lr p m i1 6 4 0 ：同时，将s i r n a 加入另外2 5 0 lr p m l l 6 4 0 。将两者温和混匀， 室温放置2 0 分钟。细胞先用p b s 洗一至两次，加入2m lr p m i1 6 4 0 。然后将上述混 合物轻轻加到培养细胞上。3 7 。c 培养5 小时后，换正常培养液终止转染。2 4 4 8 小时 后收集细胞，检测其瞬时表达情况。 8 3 细胞增殖检测 1 ) 处于对数生长期的食管癌细胞，弃去培养基，p b s 沈二次，胰酶消化细胞，加 入含1 0 f b s 的1 6 4 0 培养基终止消化。 3 8 北京协和医学院中因医学科学院博卜学位论义 2 ) 计数细胞，调节细胞密度至2 1 0 。m l ，于9 6 孔培养板内每孔加入1 0 0 脚细胞悬液， 3 7 培养箱培养。 3 ) 2 4 h 后，分别转染相应s i r n a 或d n a ，每组设3 个平行孔。 4 ) 每天取一块9 6 孔板，每孔培养基中加入1 0 l 的c c k 一8 ，继续在孵箱中培养1h 5 ) 用分光光度仪测定4 5 0n m ( o d 4 5 0 ) 外吸光值。 8 4 软琼脂集落形成实验 1 ) 制备底层琼脂：4 5 5 0 。c3 3 a g a r lm l 加入5 6m l 培养液，混匀成0 5 a g a r ， 六孔板每孔加1m l ，室温3 0 分钟凝固。 2 ) 消化计数细胞，制成2 1 0 4 个细胞m l 的细胞悬液，冰浴中备用。 3 ) 制备顶层琼脂：每孔1m l ，依次加入8 7 5 l 培养液，2 5 l 细胞悬液，1 0 0 l3 3 a g a r ，至终浓度5 0 0 细胞孔。 4 ) 2 4 小时后加1m l 培养液。 ? 5 ) 3 周后用0 2 p - i o d o n i t r o t e t r a z o l i u mv i o l e t 染色，3 7 。c 过夜，计数细胞集落。 8 5 细胞周期检测 1 ) 胰酶消化细胞，吹打成单细胞悬液，离心弃上清。 2 ) p b s 洗两次后用3 0 0 川p b s 重悬，充分吹打。 3 ) 将细胞悬液逐滴加入7 0 0 l 冷无水乙醇中，4 。c 固定3 小时以上。 4 ) 离心弃上清，p b s 洗一次，加入0 5m lp b s ，使细胞密度大于1 1 0 6 m l 。 5 ) 冰浴中加入0 3 0 5m lp i 染液( 1 5 p l ，0 1 枸橼酸钠，0 3 n p 4 0 ) ，染色3 0 分钟后流式细胞仪检测。 8 6 抑制剂处理细胞 1 ) 制备相关抑制剂的工作液工作浓度分别如下： 3 9 s t o p & g l or e a g e n t ，吹打混匀，开始测量海肾萤光素酶发光值； 9 统计学方法 使用s p s s 软件进行统计分析，尸 0 0 5 被认为有统计学意义。免疫组化中蛋白表 达与病理参数的相关性分析使用非参数检验。p l k l 功能实验中两组细胞的检测结果 比较用t 检验，两组以上用a n o v a 检验。 北京协和i 廷学院中围医学科学院博i ：学位论文 结果 一、p l k l 相互作用蛋白的筛选、鉴定和验证 为了更深入的研究p l k l 在食管癌发生发展中所发挥的功能，我们首先通过 g s tp u l l d o w n 联合高效液相色谱串联质谱( l c m s m s ) 鉴定的方法筛选其在 食管癌中的相互作用蛋白( 图1 ) 。 g s t - - - - - - - - _ p u d a 帆 m a s o 哦 - - - 一 检素 t l l 盯、一 =。- s d s =一_ 。- 。1 。_ _ 。 p a g e一= 兰呈型s 莶 - - - - - - - - 一 n o 图1 g s tp u l l d o w n 联合蛋白组学手段研究相互作用蛋白实验流程。 目前研究认为p l k l 借助其c 端的p b d 结构域与靶蛋白相互作用，进而通过其 n 端激酶结构域对底物进行磷酸化( e l i ae ta 1 ，2 0 0 3 a ) 。鉴此我们首先原核表达并 纯化了g s t 和g s t p b d 融合蛋白。由图2 可见，纯化的g s t 和g s t p b d 融合蛋白 大小正确，纯度较高。 图2 原核表达g s t 及p b d 结构域后s d s p a g e 并进行考马斯亮蓝染色。 4 l 11；，l锄 。心；j一 胶密錾沁垮熙 北京协和医学院中困仄学科学院博i j 学位论文 提取处于对数生长期的食管癌k y s e 4 5 0 细胞的总蛋白，与纯化的g s t 和 g s t p b d 融合蛋白进行g s tp u l l d o w n 实验，s d s p a g e 银染后显示存在较多差 异条带( 图3 ) 。为避免包括g s t p b d 在内的高峰度蛋白干扰质谱鉴定结果，只 选择胶内小于2 4 k d 和大于5 5 k d 的部分酶切进行l c m s m s 分析。所测肽谱经过 m a s c o t 数据库比对后，共得到2 1 3 个蛋白。 图3 p b d 结构域及g s t 蛋白进行p u l l d o w n 实验，s d s p a g e 后银染。 附表列出了经质谱分析得到的相互作用蛋白质的主要信息，包括蛋白质名 称、分子量以及功能分类等，并给出了质谱鉴定获得的该分子特异肽段数。这些 分子中包含了既往研究发现的一些p l k l 直接相互作用蛋白，如与d n a 序列复制 起始相关的m c m 家族( t s v e t k o va n ds t e m2 0 0 5 a ) 、介导p l k l 核转位的g t p 酶 r a n ( j a n ge ta 1 ，2 0 0 4 ；f e n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 、肌球蛋白m y o s i n ( y 锄a s h i r oe ta 1 ，2 0 0 8 ) 以 及c c t 伴侣蛋白复合物等( l i ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。但是，细胞有丝分裂中一些受p l k l 调控的重要分子如c d c 2 5 c ，c y c l i nb l 或纺锤体检验点相关蛋白b u b 3 等，却未出 现在我们所鉴定出的分子中。其原因可能是这些蛋白与p l k l 的相互作用均只存 在于m 期，而本研究在进行g s tp u l l d o w n 实验时并未将细胞阻滞在该期，导致 这部分细胞比例减少而达不到质谱鉴定的敏感性。 我们进一步利用已知的功能注释对表2 中的蛋白进行了g o 分类 ( h t t p ：b i o i n f o c a p i t a l b i o c o m m a s l o 百n d o )( 图4 ) 。从分类结果中可以看出， 除了一些所熟知的功能，如参与细胞有丝分裂过程的调控、细胞凋亡通路抑制和 促进细胞增殖以外，p l k l 可能还参与多种其它细胞重要生命活动，如蛋白质翻 译与折叠、细胞骨架形成、细胞一细胞黏附以及r n a 转录调控等，并且可能与许 多重要信号传导通路有关。 4 2 k t a b o h ，m 1 d c d h 锄i p n d i f e r 越i o n p f k l 脚 a c 0 2 g f r t n m c r 如6 0 nr e 印i 妇n c b r l p r d 髓眦孙f 2 1 9p c 髓 k r t l m p h a t - r r g b l u 卫l bp 娅2 p e s l 。日 e z ft f mm c c c 2 d d x 5 h 璐t i l l z j m p 3n f 3 i ，i m t 8 b p i b p 1 3 5 鼍。蔫l ， h u m a 双叮9 n g 2 2 p l 厂j 懋主fi 1 p 眦e i t f o l d h 噜 s p d lh s p b i l f t o u th 孵肚 k i a d 嗍c c r ， d n ar 印耻_ 由n 一况 一 g r p e l ih 研7 5 t f mm c m 3 m c m m c m 5 m c m 6 m c m 7 船m 0 r c 3 l c l p x 即棚 d n j c i lc c t 6 乱飘 ：八一 t r p lc c 玎 p i v t 一一繁螋t 、曩i d h a j c i ld n j c l i r p l l 7 r p l 9 沙【一叠巨三；i s i p a l t m m 如c t i o n r p l l 9r p l 2 i c 1 1 呵m i 1 h 函 矾 r p l l 3r p 辨 m r p l 4 7g f l d l e 田 lm r p l 4 7 熏习_ 下 c”oskeiecfr r p l l 0g r s flntrpl l ctnplr r a c e a d h e i i i d n mp7nr b l b ，t 岫sptbhi p r k c d n c - 【 p ikrl五c培 p d c 心pkrib0l i il 毛 b 5 b i阻n60lcb a p 1 3 5 h s p n l c r l 7 0 i 阻t 7 h s p b i k i a 0 5 6 7 g s tp u l l d o w n 从本质上讲是一种亲和纯化技术 蛋白将细胞裂解液中的靶蛋白以及与靶蛋白存在相 ，其目的在于利用特异性诱饵 互作用的蛋白质分子分离出 来。在纯化的过程中，由于提取过程中可能引入的外源蛋白质污染、反应过程中 存在的各种非特异结合，以及l c m s m s 本身的技术原因，不可避免的存在假阳 性现象，因此我们进一步对质谱鉴定结果进行了部分验证。将进行g s tp u l l d o w n 后的蛋白复合物进行w e s t e h lb i o t t i n g ，结果表明丫- c a t e n i n 与m 2 一p k 蛋白只特异地 与p b d 结构域结合，显示本实验具有一定的可重复性。 4 3 北京协和医学院中困医学科学院博l 与位论文 g s tp b d r 一一 i ，| t c a t 饥i n m 2 p k g s t p b d g s t 图5 部分质谱鉴定蛋白的w e s t e n lb l o t t i n g 验证。提取处于对数生长期的 k y s e 4 5 0 细胞的总蛋白，与纯化的g s t 和g s t p b d 融合蛋白进行g s tp u l l d o w n 后，利用丫- c a t e n i n 、m 2 一p k 和g s t 抗体进行w e s t e n lb l o t t i n g 实验。 g s tp u l l d o w n 实验的结果初步提示这些分子可能分别与p b d 结构域存在同 一个蛋白复合物中，但并不能得出其一定与p l k l 本身具有相互作用的结论。因 而我们进一步利用免疫共沉淀技术验证了m 2 p k 和i q g a p l 蛋白与p l k l 在食管 癌细胞内的相互作用。由于m 2 p k 与p l k l 均报道与微管蛋白1 ，t u b u l i n 存在关联， 我们利用1 ，m b u l i n 抗体进行i p 实验后对沉淀复合物中的分子进行了w e s t e m b l o t t i n g 鉴定，结果提示m 2 - p k 、p l k l 与丫- t u b u l i n 三者存在同一复合物中( 图7 ) 。 我们又进一步利用细胞免疫荧光技术对m 2 p k 与p l k l 的细胞定位情况进行了检 测，结果显示两者在细胞胞浆部分区域存在相同的分布( 图8 ) 。 葛 矗 四 薹量萤 ur i a掣v ；甬d 们 五罱 r ”唧_ 啊1 炳川i - - - 】 p l k l 图6 i q g a p l 与p l k l 蛋白免疫共沉淀结果。提取k y s e 4 5 0 细胞总蛋白，用 i q g a p l 单克隆抗体沉淀内源性与i q g a p l 相互作用的蛋白，鼠源i g g 为阴性对 照，免疫沉淀复合物分别用i q g a p l 与p l k l 抗体进行w e s t e mb l o t t i n g 检测。 北京协和医学院中困医学科学院博i j 学位论义 m 2 - p k i p c o三 旦 暑 至k p l k l a c t i n l m m u n o p r e c l p n 甜e s up e m 甜a n t 图7 m 2 p k 、p l k l 与丫- n l b u l i n 蛋白免疫共沉淀结果。提取k y s e 4 5 0 细胞总蛋 白，用丫- n i b u l i n 单克隆抗体沉淀内源性与丫一讪u l i n 相互作用的蛋白，鼠源i g g 为 阴性对照，免疫沉淀复合物分别用m 2 - p k 、p l k l 与丫t l l b u l i n 抗体进行w e s t 锄 b l o t t i n g 检测。 图8 k y s e4 5 0 细胞中内源性p l k l 与m 2 p k 共定位。用4 多聚甲醛固定细胞， 0 5 t t o nx 1 0 0 通透，山羊血清封闭，分别与兔抗m 2 p k 和鼠抗p l k l 反应。 再用f i t c 标记的羊抗兔i g g 和c y 3 标记的羊抗鼠i g g 检测m 2 p k 和p l k l 的 4 5 北京协和医学院中困医学科学院博i j 学位论文 表达。细胞核用d a p i 复染。 北京协和医学院中困医学科学院博l ：学位论文 二、p l k l 通过泛素化降解途径调节p c a t e n i n 蛋白表达 2 1p l k l 与p c a t e n i n 蛋白存在相互作用 经过m a s c o t 数据库比对计算，质谱鉴定结果中的两条位于9 0 l 左右的肽段 s a h l 玳y q d d a e l a t r 和n e g t a t y a a a v l f r 分别对应于人源p - c a t e n i n 蛋 白的1 3 4 1 5 1 和6 4 8 6 6 1 处氨基酸序列，提示p c a t e i l i n 可能与p b d 结构域结合( 图 9 ) 。 图9 串联质谱鉴定出的位于9 0 k d 左右的肽段序列。经比对后与p c a t i n 蛋白的 1 3 4 1 5 l 和6 4 8 6 6 1 处氨基酸序列一致。 利用p l k l 单克隆抗体对细胞内p l k l 蛋白复合物进行免疫共沉淀，随后通 过w e s t 咖b l o t t i n g 检测到沉淀物中存在p c a t e m n 蛋白，分子量位置与k y s e 5 1 0 细胞裂解液中内源性p c a t e n i n 一致，而阴性对照小鼠i g g 沉淀物中则检测不到 b c a t e i l i n 表达( 图1 0 ) 。在k y s e 4 5 0 细胞中，p l k l 的单克隆抗体也可以将 d c a t e n i n 蛋白沉淀下来( 图1 1 ) 。 基 量圣要 暑 墨号三 量芷定 b 瑚t e n i n 巴= = 习l p 。c a t e n ，”一i | 咪， l 刊l n o c o d a z o l e l m m u n o p r e c i p i t a t e 董三；习l s u p e r n a t a n t 萤一- i j u p e r n a i a n i k 。，d 4 7 北京阱和医学院中因医学科学院博i j 学位论文 图1 0 食管癌细胞中p l k l 与d c a t e n i n 的相瓦作用。分别提取n o c o d a z o l e 处理 前后的k y s e 5 1 0 细胞总蛋白，用p l k l 单克隆抗体沉淀内源性与p l k l 相互作 用的蛋白，鼠源i g g 为阴性对照，免疫沉淀复合物分别用p l k l 与p c a t e n i n 抗体 进行w e s t 哪b l o t t i n g 检测。细胞裂解液作为蛋白阳性对照。 i p 哩 王 旦 3 一 乏正 d 础n nf 鼍习 咪，e 誓一 l m m u n o p 陀c i p j t a t e 图1 1 k y s e 4 5 0 细胞中也存在p l k l 与p c a t e n i n 的相互作用。p l k l 的复合物中 可以检测到p l k l 与p c a t e i l i n 共沉淀，而阴性对照鼠i g g 中无该现象。 由于p l k l 在细胞有丝分裂过程中的g 2 m 期发挥重要功能，且其激酶活性也 在g 2 m 期达到峰值，我们进而利用n o c o d a z 0 1 e 将细胞阻滞在g 2 m 期并进行免疫 共沉淀检测。图1 0 表明p l k l 与p c a t e n i n 的相互作用在g 2 m 期显著增强。 2 2 抑制p l k l 导致p c a t e n i n 蛋白水平及其转录活性降低 由于在g 2 m 期p l k l 与b c a t e n i n 的相互作用显著增强，我们进一步利用 r n a i 手段检测了g 2 m 期p l k l 与p c a t e n i n 之问的关系。n o c o d a z o l e 处理食管 癌k y s e 4 5 0 和k y s e 5 1 0 细胞后，与n o n s i l e n c i n gs i r n a 和亲本细胞相比较， p l k ls i r n a 转染组的p c a t e i l i n 蛋白表达均显著下调。而且，转染p l k l 激酶显 性负突变体p l k l 依8 2 m 也导致p c a t e n i n 蛋白表达下调，提示以上现象可能与 p l k l 的激酶活性有关( 图1 2 ) 。 a b 矿。 脚山- 一一习 p l k l 一一 j 争- c t i n - _ ，- _ 。芦， t n 卜”良1 l_ m l 一一i ：l 一一- ： 争蛐b 刊 图1 2 抑制p l k l 蛋白使p - c a t e n i n 的表达水平降低。a k y s e 5 l o 细胞中，瞬时 转染p l k ls i r n a 和n o n - s i l e n c i n gs i r n a ，2 4 小时后在培养基中加入 n o c o d a z o l e ，4 8 小时收获细胞。w e s t e mb l o t t i n g 检测p l k l 和p - c a t e n i n 的表达， 4 8 北京协和医学院中国医学科学院博i j 学位论文 p a c t i n 作为内对照。p l k ls i r n a 细胞中，p c a t e n i n 的表达显著低于n o n - s i l e i l c i n g s i r n a 和亲本k y s e 5 1 0 细胞。b 在k y s e 4 5 0 细胞中，p l k ls i r n a 组与正义 转染p l k l k 8 2 m 组p c a t e n i n 表达均低于n o n s i l e n c i n gs i r n a 和亲本细胞。 为避免s i r n a 可能存在的脱靶效应，我们选择了两个独立高效的s i r n a 靶 点进行了重复实验( 图1 3 ) 。 b ，i 脚m n 7 一一 p l k l 卜一q d m y c p - - 气肛删n 图1 3 抑制p l k l 下调p c a t e n i n 的蛋白表达水平。k y s e 5 1 0 细胞中，瞬时转染 针对p l k l 不同靶点的s i r n a ，p l k l 一k d l 、p l k l k d 2 和n o n s i l e n c i n gs i r n a ， 2 4 小时后在培养基中加入n o c o d a z o l e ，4 8 小时收获细胞。w e s t e n lb l o t t i n g 检测 p l k l 、p c a t e n i n 、磷酸化p c a t e n i n 和c m y c 的表达，p a c t i n 作为内对照。 随后我们又研究了g 1 s 期敲降p l k l 对d c a t e n i n 蛋白表达的影响，利用含 羞草素将细胞阻滞于g l s 期后，表明p l k l 对b c a t e i l i n 蛋白表达的调控与细胞 周期相关，且只存在于细胞分裂期。但当外源表达p l k l 基因时却未观察到 p c a t e n i n 蛋白改变( 图1 4 ) 。提示p l k l 高表达为调节p c a t e n i n 蛋白水平必要但 非充分条件。 a 阳t e 咖黪铡 p l k l - j 脚锄，- i b 扩多扩 阳酬nf 一。 “一 &i g f pl 一叫 c 铲 卜一叫脚t e 咖 薤、- i ! ：g f p 删“k 一：，叫，巴脚n 图1 4 j 下义转染p l k l 对d c a t e n i n 表达无影响。a k y s e 5 1 0 细胞中瞬时转染 p l k ls i r n a 和n o n s i l e n c i n gs i r n a ，2 4 小时后在培养基中加入含羞草素，4 8 小时收获细胞，w