（细胞生物学专业论文）石岐杂鸡产蛋性状相关基因标记的研究.pdf

v 丑9 8 0 5 6 8 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名： 日期： 学位论文使用授权声明 盆塑盟 神b g - 。t 。 、 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索：有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名： 日期： 纽 扣b 盂? 归 南京师范大学硕士论文 石岐杂鸡产蛋性状相关基因标记的研究 摘要 本研究采用p c r r f l p 标记技术，检测了胰岛素样生长因子1 ( i n s u l i n 1 i k eg r o w t hf a c t o r 。1 ，i g f 一1 ) 基因和鸟氨酸脱羧酶( o r n i t h i n e d e c a r b o x y l a s e ，o d c ) 基因的多态性及其分布，分析了基因多态性位点的不 同基因型与鸡的产蛋性状的相关性，并以此探讨了其作为选育早熟高繁黄 鸡新品系的分子标记的可行性。 检测育种核心群c 系0 世代石岐杂鸡3 5 1 个样本，采用p c r r f l p 技 术i g f 一1 基因的5 端调控区进行遗传多态性分析，发现被p s ti 酶切后出现 3 种基因型：a a 、a b 和b b ，基因型分布符合哈代温伯格定律。采用s p s s 软件对这3 种基因型与开产日龄( a f e ) 、5 0 周龄产蛋量( e n 5 0 w ) 进行相 关性分析，得到不同i g f 1 基因型的开产日龄差异不显著( p o 0 5 ) ；在5 0 周龄产蛋量上结果显示了等位基因b 有显性效应或加性效应。 另随机取4 0 个样本的石岐杂鸡样本群，针对o d c 基因8 号外显子上 游的内含子序列和1 1 、1 2 号外显子间内含子区序列进行p c r r f l p 检测( 分 别使用m s p i r f l p 和h i n d i i i r f l p ) ，显示o d c p c r r f l p 分型有m s p i + h i n d t i i + ( a 型) 和m s p i h i n d i i i + ( c 型) ，未检测到m s p i + h i n d i i i 一( b 型) 。检测了o d c 基因8 号外显子上游的4 0 0 b p 序列，在其中发现了7 个 可能的s n p 位点。 关键词：育种，分子标记，石岐杂鸡，产蛋性状，p c r r f l p ，i g f 一1 基因 o d c 基因 南京师范大学硕士论文 石岐杂鸡产蛋性状相关基因标记的研究 r e s e a r c ho ng e n em a r k e r sa s s o c i a t e dw i t ht h ee g g p r o d u c t i o nt r a i t so fs h i q i z ac h i c k e n a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , t e c h n i q u e so fp c r r f l pw e r eu s e dt oe x p l o r ed i s t r i b u t i o na n d g e n e t i cp o l y m o r p h i s mo fm o l e c u l a rm a r k e r si ni g f - l ( i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r - 1 ) g e n ea n do d c ( o r n i t h i n ed e c a r b o x y l a s e ) g e n eo fl o c a ls h i q i z a c h i c k e nt h e nt h ee f f e c t so fg e n o t y p e so ne g gp r o d u c t i o nw e r ea n a l y s e di n o r d e rt os e l e c ta p p r o p r i a t em a r k e r sf o rt r a i t so fe a r l i e rm a t u r a t i o na n de g g p r o d u c t i o no fs h i q i z ac h i c k e n as h i q i z ac h i c k e np o p u l a t i o ni n c l u d i n g3 51h e n sw h i c hi st h eb r e e d i n g n u c l e u so ft h e0g e n e r a t i o no ft h ecb r e e dw a sd e t e c t e df o ri g f - 1g e n e p o l y m o r p h i s mb ym e a n so fp c r - r f l pa6 2 3 b pf r a g m e n to ft h e5 u p s t r e a m r e g u l a t i v er e g i o no ft h ei g f 一1g e n ew a sa m p l i f i e da n dt h e nd i g e s t e db yp s ti t h ed i g e s t e dp r o d u c t sw e r ef r a e t i o n a t e db y2 a g a rg e le l e c t r o p h o r e s i sa n d s h o w e dt h r e eg e n o t y p e sw h i c hw e r ed e f i n e da sa a ，a ba n db bg e n o t y p e st h e f r e q u e n c i e so ft h ei g f 一1g e n o t y p e s ( a a ，a b ，b b ) w e r e2 8 8 ，4 7 8 ，a n d2 33 ， r e s p e c t i v e l y w i t h i nt h ep o p u l a t i o n ，w h i c hw a si n a c c o r d a n c ew i t ht h e h a r d y w e i n b e r ge q u i l i b r i u m u s i n gt h es p s ss o f t w a r et h ea s s o c i a t i o nb e t w e e n t h ei g f 1g e n o t y p e sa n dt h ee g gp r o d u c t i i , i t yw a sa n a l y z e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eo ft h ea g ea tf i r s te g g ( a f e ) b e t w e e n d i f f e r e n ti g f 1g e n o t y p e s b u tt h ei g f 1g e n o t y p e ss i g n i f i c a n t l ya f f e c t e dt h e e g gp r o d u c t i o nw i t h i n5 0w k ( e n 5 0 w ) t h eba l l e l e w a sa s s o c i a t e dw i t ha h i g h e re n 5 0 w , i n d i c a t i n g ap o s i t i v ea s s o c i a t i o ni n c l u d i n gd o m i n a n ta n d a d d i t i v ee f f e c t so ft h eba l l e l e w i t he g gp r o d u c t i o ni nt h es h i q i z ac h i c k e n p o p u l a t i o n ar a n d o mp o p u l a t i o nw i t h4 0s a m p l e sw e r ed e t e c t e df o rt h ep o l y m o r p h i s m i nt h eo d eg e n e t w os i t e si nt h eo d cg e n ew e r ed e t e c t e d ，o fw h i c ho n ei s ， 壹主堑苎垄兰壁主堡查 至些垒兰生墨些! ! 苎塑苎垄旦堑堡塑! ! 墨 l o c a t e di nt h ei n t r o np r e c e d i n ge x o n8a tp o s i t i o n3 2 0 4 b p 一3 6 1 5 b pd i f f e r e n t i a t e d b yp c r m s p i r f l p a n da n o t h e rb e t w e e ne x o n11a n d12a tp o s i t i o n 6 0 8 3 b p 6 8 0 5 b p d i f f e r e n t i a t e db yp c r h i n d i i l - r f l pt h eo d c p c r r f l p r e s u l ts h o w e dt h a to n l yt w ot y p e s ( m s p i + h i n d l i l + a n dm s p i - h i n d i i l + ) w e r e d e t e c t e d ，w i t ho t h e rt w ot y p e sa b s e n t a4 0 0 b pf r a g m e n ti nt h e i n t r o np r e c e d i n g e x o n8w a s s e q u e n c e d a n d d i s p l a y e d 7c a n d i d a t es i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s k e yw o r d s ：m o l e c u l a rm a r k e r ；b r e e d i n g ；s h i q i z ac h i c k e n ；e g gp r o d u c t i o n t r a i t s p c r r f l p s ；i g f - ig e n e ；o d cg e n e 南京师范大学硕士论文 石岐杂鸡产蛋性状相关基因标记的研究 1 1 研究背景和进展 1 前言 1 1 1 早熟高繁黄鸡新品系的培育 随着人民生活水平从温饱向小康过渡，对黄鸡的消费需求也逐渐由数量型向质量 型转变。为适应不同区域经济发展水平和面对多样化、多层次的需要，肉用鸡品种质 量档次也应目趋优化，走多元化发展之路，以质的提高替代量的增长。质的升级能创 造出积极的空间，化肉用鸡品种资源优势为商品优势，消除目前结构比较单一、产品 原始化造成的市场相对过剩。因此，黄鸡育种的主要方向不再是生长速度和产肉性能 的提高，而鸡肉品质的改善和繁殖性能的提高则显得更为重要。 性成熟日龄是影响肉质的重要因素。肉鸡饲养至接近性成熟时不但体形外貌受消 费者喜爱，而且肉质也更好。因此，早熟能有效地降低肉鸡的生产成本，而且获得较 好的体形外貌和肉质。 优质黄鸡品系的年产蛋量大多在1 5 0 枚左右，相对于进口快大型黄鸡，其繁殖性 能较低的缺陷是阻碍优质黄鸡发展的重要因素。如何有效提高黄鸡( 尤其是地方品种) 的产蛋量，显著降低其生产成本，是目前黄鸡育种工作的重要课题。 过去家禽的遗传改良一直沿用以数量遗传学为理论基础的常规育种方法，通过个 体及其亲属的表型值，选择优秀遗传材料。经历了长期的选择，某些家禽的生产性能 已经达到相当高的水平。但有些性状以现行的育种措施很难取得突破性进展，尤其是 那些低遗传力性状。近年来实践证明，基于现代分子生物学技术的分子遗传标记技术 具有传统遗传标记技术无可比拟的优势，可广泛用于家禽遗传育种，同时作为一项间 接的基因操作手段，使用生物本身具有的基因库，而不危及基因自然组成和基因本身 的表达。 因此，依靠分子标记辅助育种技术进行早熟高繁黄鸡新品系的培育成为了我们研 究的新课题。 1 1 2 家禽分子标记辅助育利t 技术研究进展 1 1 2 1 分子遗传标记技术 d n a 分子遗传标记是2 0 世纪7 0 年代才逐渐发展起来的新型遗传标记，虽然只有 2 0 多年的时间，但其发展速度异常迅猛，目前已有2 0 余种。d n a 分子标记的共性是 能够直接在d n a 分子水平上对编码序列和非编码序列的遗传变异进行检测，不受内 外环境的影响，因而是最能够稳定遗传的，它们按简单的孟德尔方式遗传；多数分子 标记多态信息含量( p o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n t 。p i g ) 高，许多多态性标记在非编 码区，表现选择“中性”，与基因是否表达无关；它们检测迅速，无组织特异性，可 4 南京师范大学硕士论文 石岐杂鸡产蛋性状相关基因标记的研究 以早期和活体取微量血样或毛发，操作也较简便。所以d n a 分子标记是一类理想的 遗传标记。现代遗传学和分子育种学的迅速发展和需要，使d n a 分子标记被广泛应 用于禽类遗传育种研究的各个领域，如基因组分析( g e n o m ea n a l y s i s ) 、重要经济性状 座位( e c o n o m i ct r a i tl o c u s ，e t l ) 的定位、标记辅助导入( m a r k e r - a s s i s t e di n t r o g r e s s i o n ， m a i ) 、标记辅助选择( m a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n m a s ) 等。 d n a 分子标记经历了基于s o u t h e r n 杂交的第一代分子标记( r f l p 为代表) ，基于 p c r 的第二代分子标记( s s r 为代表) ，目前正在开发基于基因序列的第三代分子标 记( s n p 为代表) 。 1121 1 基于s o u t h e r n 杂交的第一代分子标记 此类技术以限制性内切酶酶切基因组d n a 产生一系列d n a 片断长度多态，经电 泳分离、特异探针杂交、放射自显影等检出。操作较繁琐、昂贵，涉及的放射剂量大。 但多为共显性标记，有相当高的等位基因多样性，结果稳定，可靠性高。 限制性片断长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，r f l p ) r f l p 技术是由g r o d z i c k e r 等于1 9 7 4 年建立的，1 9 8 0 年首次被提出可用来作为遗 传标记。r f l p 技术的原理是检测d n a 在限制性内切酶酶切后形成的特定d n a 片段 的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变( 新产生和去除酶切位点) 和一段d n a 的重新组织( 如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化) 等均可导 致r f l p 的产生。此技术及其从中发展出来的一些变型均包括以下基本步骤：d n a 的 提取、用限制性内切酶酶切d n a 、用凝胶屯泳分开d n a 片段、把d n a 片段转移到 滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的d n a 片段( 通过s o u t h e r n 杂交) 、分析结 果。 d n a 指纹( d n af i n g e r p r i n t ) d n a 指纹分析技术是由j e f f r e y s 等人于1 9 8 5 年创立的，它是由d n a 指纹探针产 生的、具有高度变异性和个体专一性的能够稳定遗传的r f l p 图谱。一般r f l p 选择 单拷贝探针，d n a 指纹杂交图谱使用的探针是来自拷贝数可变串联重复( v a r i b l e n u m b e ro f t a n d e mr e p e a t s ，v n t r ) ，凡是引起重复单位的大小和序列不同、基因组中重 复的数目和分布不同等均可导致这种多态性的产生。 1 12 1 2 基于p c r 的第二代分子标记 此类标记以p c r 扩增和电泳检测为基础，自动化程度高，操作简便、快速、高效， 无放射性污染；但结果往往不够稳定，重复性差，可靠性不高，且多为显性遗传，不 易区分纯合子与杂台子。 随机扩增多态性d n a ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l i m o r p h i s md n a ，r a p d ) r a p d 技术是由美国杜邦公司的科学家w i l l i a m s 领导的研究小组于1 9 9 0 年创立 的，它是在p c r 的基础上发展起来的一种d n a 多态性技术，其目的是寻找基因组 d n a 中的多态性片断作为分子标记。r a p d 标记以一系列不同的碱基顺序随机排列的 寡核苷酸单链( 通常为1 0 聚体) 为引物，对靶基因组进行p c r 扩增d n a 片段，然 5 南京师范大学硕士论文 石岐杂鸡产蛋性状相关基因标记的研究 后用凝胶电泳分开扩增片段。 任意引物聚合酶链式反应( a r b i t r a r yp r i m e r - p c r a p p c r ) 该技术是由加利福尼亚生物研究所的w e l s h 和m c c l e l l a n d 于1 9 9 0 年建立的用于 基因组指纹分析的技术，其基本原理和操作步骤类似于r a p d 。但在a p p c r 分析中， 扩增分为3 个部分，各部分要求的反应条件和反应浓度存在差异；其第个p c r 循 环中所用的引物长度不定，引物浓度较高，并且常常来自于为其他目的而设计的引物， 如m 1 3 通用测序引物等。 与a p - p c r 类似的标记还有随机引物聚合酶链式反应( r a n d o mp r i m e r - p c r ， r p = p c r ) 标记。 d n a 扩增指纹( d n a a m p l i f i c a t i o nf i n g e r f r i n t i n g d a f ) d a f 标记是在r a p d 的基础上发展起来的，技术难度较低。其基本原理和操作步 骤类似于r a p d 技术，都是以随机引物p c r 扩增为基础，不同在于d a f 使用的引物 更短，一般5 - 8 个碱基，富含g c ，引物浓度更高，且在d a f 的p c r 扩增中只有两个 温度循环，扩增产物往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，银染分析观察。 在d a f 的基础上又发展出了来自扩增图像任意标记( a r b i t r a r ys i g n a t u r e sf r o m a m p l i f i c a t i o np r o f i l e s ，a s a p ) 。 简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 在人类及动植物基因组中普遍存在着由1 4 b p 组成的短串联重复序列多态性( s h o r t t a n d e m r e p e a tp o l y m o r p h i s m ，s t r ) ，又称序列标签微卫星( s e q u e n c e - t a g g e d m i c r o s a t e l l i t e ，s t m s ) 或简单重复序列( s s r ) 。s s r 标记又称简单序列长度多态性 ( s i m p l es e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，s s l p ) 或简单序列重复多态性( s i m p l e s e q u e n c er e p e a tp o l y m o r p h i s m s ，s s r p ) ，是在p c r 技术和序列示踪位点( s e q u e n c e t a g g e ds i t e ，s t s ) 技术的基础上发展起来的。引物根据与微卫星重复序列两翼的特定 短序列设计，用来扩增重复序列本身。由于重复的氏度变化极大，所以这是检测多态 性的一种有效方法。 与s s r 类似的标记还有s s r 锚定p c r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t a n c h o rp c r ) 标记， 它是由二碱基简单重复序列，特别是以( c a ) n 为引物来扩增产生的。 简单片断问重复( i n t e r s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) i s s r 是1 9 9 4 年z i e t k i e w i c z 等在s s r 技术的基础上建立的分子标记技术，他们用 加锚微卫星寡核苷酸( a n c h o r e dm i c r o s a t e l l i t eo l i g o n u c l e o t i d e s ) 作引物，对基因组节段 而不是重复序列本身进行扩增。在s s r 的5 端或3 端加上2 4 个随机选择的核苷酸， 这可引起特点位点退火。这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列问的基 因组节段进行p c r 扩增。这类标记又被称为a s s r ( a n c h o r e ds i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) 或a m p p c r 。 在所用的两翼引物中，可以一个是a s s r 引物，另一个是随机引物。如果一个是 5 端加锚的a s s r 引物，另一个是随机引物，则被称为随机扩增微卫星多态性( r a n d o m a m p l i f i e dm i c r o s a t e l l i t ep o l y m o r p h i s m r a m p ) 技术。 单引物扩增反应( s i n g l e p r i m e r a m p l i f i c a t i o nr e a c t i o n ，s p a r ) s p a r 技术与r a p d 技术相似的是也只用一个引物，但s p a r 分析中所用的引物 6 南京师范大学硕士论文 石岐杂鸡产蛋性状相关基因标记的研究 不是随机的，而是在s s r 的基础上设计的，例如可能的序列是( t a ) i o 或( c g a ) 6 。扩增 的是s s r 之间的d n a 序列。叉称为m p - p c r ( m i c r o s a t e l l i t e p r i m e dp c r ) 。 序列特异性扩增区( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ，s c a r ) s c a r 标记是在r a p d 技术的基础上发展起来的。其基本步骡是：先作r a p d 分 析，然后把目标r a p d 片段( 如与某目的基因连锁的r a p d 片段) 进行克隆和测序， 根据原r a p d 片段两末端的序列设计特定引物( 通常2 4 b p ，包括原来的r a p d 分析 所用的1 0 b p 加上测序得到r a p d 标记末端的1 4 b p ) ，再进行p c r 特异扩增，这样就 可把与原r a p d 片段相对应的单一位点鉴定出来。s c a r 比r a p d 和其它利用随机引 物的方法在基因定位和作图中的应用更好，因为它有更高的可重复性( 原因是使用的 引物长) ，标记是共显性遗传的。 单链构象多态性p c r ( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p b i s m p c r ，s s c p p c r ) o r i t a 等于1 9 8 9 年创立了s s c p p c r 技术，它是将p c r 扩增产物变性成为单链后， 在非变性凝胶电泳场中电泳时与参照的d n a 片断进行比较，只要有一个碱基发生变 异就会引起屯泳行为的不同而表现出多态性。通常较低的温度和p h 有利于保持构象 且使不同序列的d n a 分子容易区分。此方法的一个近期进展为在s s c p 分析中与荧 光标记和毛细管电泳结合使用。 裂解片断长度多态性( c l e a v e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 。c f l p ) 是s s c p 的一 种变通方法。他不使用非变性胶去溶解不同构象的单链d n a ，而是利用结构特殊的 热稳定核酸内切酶( 切割酶i ) ，通过识别和切割单链和双链分子区域之间的连接来 检测d n a 的二级结构。 双链构象多态性- p c r ( d o u b l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m p c r ， d s c p p c r ) d s c p p c r 标记技术的基本原理和操作类似于s s c p p c r 标记，所不同的是p c r 扩增反应结束后不进行热变性，而是直接进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在应用时， 可以将d s c p 和s s c p 相结合。 扩增片断长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) a f l p 是瑞士k e yg e n e 公司z a b e a u 和v o s 于1 9 9 3 年发明的一种把r f l p 和p c r 结合起来的遗传标记技术。其基本步骤是：把d n a 进行限制性内切酶酶切，然后选 择特定的片段进行p c r 扩增( 在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”， 用与接头互补的但3 端有几个随机选择的核菅酸的引物进行特异p c r 扩增，只有那 些与3 端严格配对的片段才能得到扩增) ，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增 产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。这种技术又称为“选择性限制 性片段扩增”。 a r e n c i b i a 等于1 9 9 8 年在a f l p 的基础上发展出a f r p 技术( a m p l i f i e df r a g m e n t r a n d o mp o l y m o r p h i s m ) ，加的p c r 引物中一侧为a f l p 引物，一侧为随机引物。 酶切扩增多态性序列( c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e ，c a p s ) c a p s 技术又可称为p c r r f l p ，是由a k o p y a n z 等于1 9 9 3 年提出。其原理是用 针对特定的位点而设计的p c r 引物对基因组d n a 进行扩增，然后再用多种限制性内 切酶酶解扩增产物。其基本步骤是：先进行p c r 扩增，然后将p c r 扩增产物用限制 南京师范大学硕士论文石岐杂鸡产蛋性状相关基因标记的研究 性内切酶酶切，再用琼脂糖凝胶电泳将d n a 片段分开。与r f l p 技术一样，c a p s 技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。c a p s 标记是将r f l p 分析中的探钳 转换成p c r 特异性扩增，兼备了r f l p 和p c r 的双重优点，既简便快捷，又可靠， 为共显性标记。 在酶切前进行p c r 产物检测，其多态性称为a l p ( a m p l i f i e dl e n g t hp o l y m o r p h i c ) 。 n e f f 等于1 9 9 8 年又发展出d c a p s 技术( d e r i v e dc a p s ) ，这是检测单核苷酸多态性的 一种良好方法。 上述的s s r ，1 s s r ，s p a r ，s c a r ，c a p s 等都是由其特定引物序列所界定的一 类标记，统称特定序列位点, ( s e q u e n c e - t a g g e ds i t e ，s t s ) 。与r a p d 、a f l p 和利用随机 探针产生的r f l p 相比，利用特异p c r 技术的最大优点是它产生的信息非常可靠，而 不存在某种模糊性( 如难以鉴别片段的来源) 。 2 】3 基于基因序列的第三代分子标记 d n a 测序工作的自动化使d n a 序列分析越来越普遍地应用于各种遗传研究。以 d n a 序列为核心的第三代分子标记新近发展起来。 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) s n p 是1 9 9 6 年美国麻省理工学院的人类基因组研究中心负责人esl a n d e r 提山的 一类新的标记。它是指基因组中因单个核苷酸变异即点突变引起的d n a 序列多态性， 包括碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式，是典型的双等位基因标记。s n p 的核心 技术为应用分子杂交、凝胶测序或d n a 芯片技术等来检测单个核苷酸的变异。最新 报道的微芯片电泳( m i c r o c h i pe ! e c t r o p h o r e s i s ) ，可以高速度地检测临床样品的s n p ， 它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高1 0 倍和5 0 倍，解决了大规模检测的技术 需求，使s n p 检测的自动化程度不断提高。此方法的最大优势是可以得到d n a 多态 性所产生的完整信息，但困难是必须知道所研究的d n a 片断的准确序列，d n a 芯片 造价昂贵，还需要贵重设备和分析数据。 表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，e s t ) a d a m s 等于1 9 9 1 年首次提出表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，e s t ) 概念。 e s t 是从一个随机选择的c d n a 克隆进行5 端和3 端单一次测序获得的短的c d n a 部分序列，代表一个完整基因的- - 4 , 部分，在数据库中其| 夤度一般从2 0 到7 0 0 0 b p 不等 平均长度为3 6 0 1 2 0 b p 。e s t 来源于一定环境下一个组织总m r n a 所构建的 c d n a 文库因此e s t 也能说明该组织中各基因的表达水平。 e s t 作为表达基因所在区域的分子标签因编码d n a 序列高度保守而具有自身的 特殊性质，与来自非表达序列的标记( 如a f l p 、r a p d 、s s r 等) 相比更可能穿越家系 与种的限制，因此e s t 标记在亲缘关系较远的物种问比较基因组连锁图和比较质量性 状信息是特别有用。同样，对于一个d n a 序列缺乏的目标物种，来源于其他物种的e s t 也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速物种间相关信息的迅速转化。 i t s ( i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r s ) i t s r d n a 基因序列 核糖体核糖核酸( r r n a ) 基因及其相邻的间隔区合称为r d n a 。真核细胞r d n a 南京师范大学硕士论文 石岐杂鸡产蛋性状相关基因标记的研咒 有几十甚至数千个拷贝，其中两个内部编码区i t s 1 、i t s 一2 将1 8 s 、5 8 s 和2 8 s 分隔 开：一个外部编码区e t s 位于1 8 s 上游。i t s 进化速度较快，适合于被用作种群和同 届种类的系统发育分析。i t s 区段的p c r 扩增已普遍用来分析近缘种和种群的系统发 育关系，其原因是位于i t s 两侧的编码区便于设计通用引物。p c r 产物直接测序以及 克隆测序都可用作i t s 的分析，但它们的不同应用取决于问题的阶次。直接测序能产 生一致的序列用于系统分析，而对于种群问题，为了获得单个重复序列之间的信息， 往往需要克隆测序。一个克隆就是r d n a 的一个拷贝，拷贝之间可能存在序列差异。 理想的分子标记必须达到以下几个要求：f 1 ) 具有高的多态性；( 2 ) 共显性遗传，即 利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型：f 3 ) 能明确辨别等位基因：( 4 ) 遍布整 个基因组：( 5 ) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；( 6 ) 选择中 性( 即无基因多效性? ) ；( 7 ) 检测手段简单、快速( 如实验程序易自动化) ：( 8 ) 开发成 本和使用成本尽量低廉；( 9 ) 在实验室内和实验室问重复性好( 便于数据交换) 。目前 开发的各种分子标记技术虽然具有了以上多种优点，但是任何一种分子标记技术均不 能同时满足以上所有要求。 1 1 2 2 家禽功能基因组与基因定位研究 2 0 0 4 年3 月1 日科学家宣布绘出鸡的基因组序列草图和遗传差异图谱。家禽基因 组研究是未来家禽育种的基石。随着基因组测序工作的成熟完善，研究热点从“结构 基因组”向“功能基因组”转变成为大势所趋。家禽功能基因组研究的问题包括家禽 经济性状和疾病相关基因的识别、鉴定和克隆，经济性状和疾病相关基因的结构和功 能，以及经济性状相关基因表达的调控，最终目标是要在基因组水平上，确定控制重 要经济性状的基因座位以及性状形成的分子机理。 从1 9 9 3 年起，我国开始对鸡的性连锁矮小型、鸡“乌骨”和肉质等我国畜禽所表 现出的优良性状的基因进行定位研究：同年，当时国际上第一张鸡随机扩增多态标记 遗传图谱；2 0 0 0 年我国开始对家禽功能基因组进行研究，随后又与国外合作开展了鸡 的全基因组测序工作。近年来，在家禽经济性状主基因( 或q t l ) 连锁标记、人与鸡 等物种比较基因组研究等方面取得一些新的发现。 目前估计家禽基因组中约有2 1 0 9 b p ，5 万1 0 万个基因，其中1 万个基因与生 产性状有关，但影响主要生产性状的主效基因数量不会超过10 0 0 个。这是家禽遗传 育种工作者研究的重点，也是国际上基因知识产权争夺的焦点。按照发达国家现在的 开发水平，每年大约能定位4 0 5 0 个基因或与此连锁的d n a 标记，随着基金的进一 步投入和基因工程技术的提高，这一过程还会加快，估计再需要1 0 年左右的时间就 能将大部分主效基因定位并被专利保护。目前，在鸡育种与生产中至少有6 种基因诊 断盒在进行商业化应用。 美国农业部禽病与肿瘤研究所和密歇根州立大学利用已建立的由马立克氏病易感 和抗性极端差异的两个品系杂交群组成的资源群体，检测到对马立克氏病( m d ) 的易 感性有显著影响的5 个q t l ，分别位于c h 2 ，c h 4 ，c h 7 ，c h 8 和e 1 6 连锁群上；进 一步研究又发现了多个新的q t l 与马立克氏病有关，分别位于c h l ，c h 2 ，c h 4 ，c h 7 ， c h 8 和e 4 1 连锁群上。以色列的研究小组发现2 号染色体上的a d l 0 1 4 6 与s r b c 和n d v 的抗体量有关，3 i 连锁群上的a d l 0 2 9 0 影响抗n d v 的抗体量，3 4 连锁 9 南京师范大学硕士论文石岐杂鸡产蛋性状相关基因标记的研究 群的a d l 0 2 9 8 与抗大肠杆菌的抗体和生活力有关。通过区间定位，进一步证实了这 种显著效应和q t l 的存在，以及免疫抗性和疾病抗性的相关。 g r o e n e n 领导的研究小组正在大规模开展鸡的q t l 定位研究，通过全基因组扫描 法对一些早期生长性状、饲料转化率和屠宰性状的q t l 定位分析结果如下：检测位 于2 4 个常染色体连锁群上3 6 8 个标记，发现影响体重晟可能的q t l 在1 号染色体 的2 4c m 处。用全同胞区间定位的方法对2 7 个常染色体上的4 2 0 个标记检测基因 型，发现4 个q t l ，分别是位于l 号染色体2 3 5c m 处的2 3 4 8 臼龄采食量的q r l ( 进一步研究发现该q t l 影响2 3 4 8 日龄的生长速度及4 8 日龄体重) ，位于w a u 2 6 的1 6c m 处潜在的与2 3 4 8 目龄采食量的q t l ，位于4 号染色体1 4 7c m 处的影响 两种采食精的q t l ，位于2 号染色体4 1c m 处随体重调挫的采食量的q t l ，另外还 检测到影响屠宰率的q t l 在i 号染色体的4 6 6c m 处，影响肉色的q t l 在2 号染 色体的3 l5 3 6 1c m 处。 中国农业大学在建立资源家系的基础上用3 5 2 对微卫星标记分成了4 4 组进行多 重p c r 的基因组扫描，f o 代、f 1 代个体的标记基因分型工作已经完成，f 2 个体也 正在进行全基因纽扫描：采用候选基因的方法发现细胞外脂肪酸结合蛋白基因为控制 鸡1 2 周龄腹脂重、腹脂率的主基因。哈尔滨工业大学分子与细胞发育生物学实验室 对鸡的m y o s t a t i n 基因5 和37 侧翼序列的s n p 分析发现了两种基因型间胸肌和胸 肌率具有显著的差异。东北农业大学通过对鸡p p a r 、u c p 、o b r 基因多态性的研究， 发现3 个突变位点对腹脂重和腹脂率有显著的影响。 1 1 2 3 分子标记辅助育种技术在家禽育种中的应用 分子标记辅助育种的核心是借助与目标基因紧密连锁的分子标记，直接选择目标 基因型个体，培育优良品种。传统育种方法是通过表现型间接对基因型进行选择，这 种选择方法存在周期长、效率低等许多缺点。最有效的选择方法应是直接依据个体基 因型进行选择，分子标记的出现为这种直接选择提供了可能。借助分子标记达到对目 标性状基因型选择的方法称为分子标记辅助选择( m o l e c u l a r - a s s i s t e ds e l e c t i o n ，m a s ) ， 包括对目标基因跟踪即前景选择( f o r e g r o u n ds e l e c t i o n ) 或正向选择，和对遗传背景选 择( b a c k g r o u n ds e l e c t i o n ) ，也称负向选择。背景选择可加快遗传背景恢复速度，缩短 育种年限和减轻连锁累赘的作i f | 。在我国，鸡的矮小基因已在配套系选育过程中发挥 作用，鸡肉质性状相关基因、鸡的抑肌素基因或其分子标记也被应用于育种中。 动物育种追求的目标是使具有经济重要性的性状达到最大的长期和短期选择反 应。选择反应的大小取决于4 个因素：选择强度；选择的准确性；遗传变异的 大小；有效群体大小。m as 分别在这4 个方面发挥其作用。 f 1 ) 选择强度 对于某些性状而言，成本限制了可测定动物的数量，如肉鸡母系的产蛋量等，在 这些情况下，如果能将分子遗传标记与多阶段选择相结合就可以提高选择差。只要能 认定某个或某些遗传标记与重要的数量性状座位( q u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s ，q t l ) 相连 锁，那么就可以使用m a s 方法在一个大的群体里进行早期第1 阶段选择，以后则只 需对第1 次选择中选的个体进行测定。多阶段选择还可避免公鸡失去选择强度。由于 受成本的限制，通常只能从每个全同胞家系中随机选择1 2 只公鸡。利用分子遗传 的手段，就可以在第1 阶段在所有全同胞兄弟中进行选择。然后在有了姐妹的全部记 0 南京师范大学硕士论文 石岐杂鸡产蛋性状相关基因标记的研究 录后，在第2 阶段对留下的公鸡进行最后的选择。如果没有分子遗传手段，就将失去 额外的选择差，也就意味着失去一些选择的机会。 r 2 ) 选择的准确性 选择的准确性取决于：性状遗传力的大小：从个体和亲属获得的信息量。利 用来自不同亲属的信息，使选择的准确性达到最大，是b l u p 作为数量遗传的一个：c 具提高选择反应的主要优势。而分子遗传可以从2 条途径辅助b l up 选择。首先是 提高系潜信息的准确性，以d n a 为基础的技术如d n a 指纹技术可以作为防止或纠 正系谱错误的有效工具。第2 条途径是提高性状的遗传力。分子遗传的应用使性状遗 传力提高，从而可以在不受环境干扰情况下直接评定基因型。同时，分子信息可以与 表型信息结合产生一