（细胞生物学专业论文）柄海鞘（styela+clava）活性物质的结构解析及生物活性研究.pdf

山东帅范人学坝卜学位论文钠海鞘活性物质的结帕解析发生物活性t o j o ( 刖舀 据初步统计，在海洋罩，生长着2 0 0 0 多种海鞘；但是到目前为止，己报 道加以初步考察研究的只不过3 0 多例次。自7 0 年代从海鞘中分离到具有强抗 肿瘤的活性的五种环肽以来，对海鞘的研究迅猛发展，从中发现了许多抗肿 瘤、抗病毒、抗微生物、有免疫调节、生物催化等生物活性的物质，它们当中 除环肽、生物碱、含氮大环内酯等许多新的化合物外，还有吲哚、金属螫合 剂类物质；在生物活性上除了抗微生物、抗肿瘤和抗病毒作用以外，还显示 免疫调节作用、抑制钙调蛋白等作用或与钒等金属离子相结合等多种机能：。”。 其中尤其以抗肿瘤活性物质最为引人注目“1 。业已发现的d i d e m n i n s 、 e u d i s t o m i n s 等潜在的药用价值已引起天然产物学家、海洋生物学者、海洋药 物学者等的极大兴趣，可望开发为结构新颖药效显著的新药而应用于临床。“，其 中d i d e m n i nb 已经进入了i i 期临床试验阶段。 我国学者对柄海鞘的研究更是极为少见，有学者从青岛海域的柄海鞘中提 取到一种酚类化合物：2 - 4 二叔丁基苯酚( 但估计极可能源于与其共生的海藻) ， 其属于比较初步的试探性的研究，根本没有涉及到生理活性问题。而我国海洋 海鞘资源丰富，尤其是山东省长岛海域海鞘资源更是极其丰富，与国外相比， 不仅没有得到开发，而且还极大的困扰着渔业和航海的发展。因此，应当引起 人们极大的关注。本文从以下几个方面进行了初步的研究。 l 、采用硅胶柱层析，用氯仿作展开剂和洗脱液，对柄海鞘鞘体氯仿浸提物进行 分离、提取与纯化。 2 、气相一质谱联用( g c m s ) 技术，对fi 进行成分分析，分析和鉴定fi 的主 成分。 3 、利用细胞培养等技术进行抗肿瘤活性和免疫调节活性的研究。对迄今国内外 零星涉及的柄海鞘进行初步的研究，阐明其含有的有效活性物质结构和生理 活性，以便为我国在该领域的研究提供新的理论依据和实验依据，进一步将 其丌发为新的高效海洋药物并应用于临床奠定基础。 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注 和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研 究成果，也不包含为获得山东师范大学或其他教育机构的学位 或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：黼 签字日期：2 0 0 4 年斗月蕊日 导师签字： 签字日期：2 0 0 4 年毕月j 0 日 白匕 f_身 山东师范人学硕 ：学位论文柄海鞘活忡物质的结构解析搜生物活性研究 柄海鞘( s t y e l ac l a v a ) 活性物质的结构解析及生物活性研究 中文摘要 目前，国外对海洋被囊动物海鞘生理活性物质的研究正处于高 速发展阶段，但是关于从柄海鞘的鞘囊或鞘体中提取出高效的肿瘤 药物以及类似其他种类的海鞘提取物的研究至今尚未见报道。我国 学者对柄海鞘的研究更是极为少见，仅有比较初步的试探性的研 究，根本没有涉及到生理活性问题。而我国海洋海鞘资源丰富，尤 其是山东省长岛海域海鞘资源更是极其丰富，与国外相比，不仅没 有得到开发，而且还极大的困扰着渔业和航海的发展。因此，应当 引起人们极大的关注。本文从以下几个方面对柄海鞘生理活性物质 进行了初步的研究。 首先，将柄海鞘的鞘体和鞘囊进行精细剥离，避免了物质的相 互干扰，更好的进行物质的定位。实验中，我们单独对柄海鞘鞘体 中的化学成分进行研究。按照目前比较常用的天然产物提取分离方 法，将样品冷冻干燥后，用甲醇：甲苯( 3 ：1 ) 浸泡，收集滤液，减 压蒸馏得到的浓缩液用n a n o ：。水溶液萃取，收集水相，减压浓缩至 n a n o ：，晶体析出。用氯仿反复浸泡n a n o 。晶体，收集氯仿浸提液，减 压浓缩，得红棕色浸膏状鞘体粗提物。采用硅胶湿柱层析，用氯仿 作展开剂和洗脱液，反复硅胶层析，对柄海鞘鞘体粗提物进行分 离、提取与纯化，利用高效液相色谱检测，得到混合组分fi 。 山东师范人学坝l 学位论文柄海鞘活性物质的结构解析发生物活性圳。究 其次，采用气相一质谱联用( g c m s ) 技术，对fi 进行成分分 析和结构解析，结果表明fi 的主成分为化合物1 2 - 双( 5 甲基一2 苯并恶唑) 乙烯。 最后，利用细胞培养技术对fi 进行抗肿瘤活性和免疫调节活 性的研究。我们研究了fi 对癌细胞活性的影响，通过m t t 法初步 检验了其对癌细胞活性的抑制作用。实验结果表明，对于b e l 一7 4 0 2 肝癌细胞，fi 在不同作用时间和不同浓度对其活性均有不同程度 的抑制作用，作用时间为4 8 h ，浓度为6 0 p , g m l 时作用最为显著。 但是对于b g c 一8 2 3 胃癌细胞， fi 仅在6 0 9 9 m l 浓度下对其活性有 抑制作用。对正常小鼠脾脏细胞进行体外培养，研究fi 的免疫调 节活性，实验表明，fi 对淋巴细胞增殖和培养细胞上清液中i l 一 2 、i l 一6 的活性均无显著影响。 相信，通过进一步的研究，必然会推进我国在此领域天然产物 研究与开发的进度，开创海鞘生理活性物质研究的新局面。 关键词：柄海鞘抗肿瘤活性免疫调节 分离纯化 i l ，2i l 6 分类号：q 2 5 ；r 9 3 山东帅范人学坝1 学位论文 柄海耥活性物质的结构解析及生物活性 i j | 宄 r e s e a r c ho nt h es t r u c t u r ee l u c i d a t i o na n db i o a c t i v i t y o ft h ea c t i v es u b s t a n c e sf r o ms t y e l ac l a v a a b s r a c t n o w a d a y s ，r e s e a r c ho nt h ep h y s i o l o g i c a la c t i v es u b s t a n c e sf r o mt h e m a r i n et u n i c a t e si si nah i g hs p e e dp r o g r e s s b u ti ti ss t i l ln o ts e e no n p a p e r st h a ts o m et u n i c a t ee x t r a c t sw h i c hh a v eh i g he f f e c t i v ea n t i c a n c e r p o t e n t i a la r eo b t a i n e df r o ms t y e l ac l a v a st u n i c aa n db o d yo ro t h e rk i n d s o fs u b s t a n c e s a n dt h er e s e a r c hw o r kc a r r i e do ns t y e l ac l a v a i n h o m e l a n di s r a r e l yr e p o r t e d o u rc o u n t r ye s p e c i a l l yc o a s t a l a r e a si n s h a n d o n gp r o v i n c ea b o u n d st u n i c a t e s ，b u tc o m p a r i n gw i t ht h eo v e r s e a s t h er e s o u r c e sg r e a t l yd i s t u r b e dt h ec u l t i v a t i o na n ds a i l i n g ，n o tm e n t i o n t h e ya r eu t i l i z e d t h e r e f o r ew es h o u l dp a ya t t e n t i o nt ot h e m i nt h i s p a p e r ，w em a d eab a s i cr e s e a r c ho nt h ep h y s i o l o g i c a la c t i v es u b s t a n c e s f r o ms t y e l ac l a v ai nf o l l o w i n ga s p e c t ss t a t e db e l o w f i r s t ，s t y e l ac l a r a st u n i c aa n di t sb o d ya r es e p a r a t e dc a r e f u l l ys o t h a ti n t e r a c t i o na m o n gs o m es u b s t a n c e sa r ep r e v e n t e d i nt h i sp a p e r ，w e f o c u so n l yo nt h ec h e m i c a lc o m p o u df r o mt h eb o d yo fs t y e l ac l a r a a c c o r d i n gt ot h ef r e q u e n t l yu s e dm e t h o d so fe x t r a c t i o na n di s o l a t i o no f n a t u r a lp r o d u c t sf r o mo r g a n i cb o d y ，t h ef r e e z e d r i e da s c i d i a nb o d yw a s e x h a u s t i v e l y e x t r a c t e dw i t hm e t h a n o l t o l u e n e ( 3 ：1 ) a n dt h e nt h e c o m b i n e de x t r a c t sw e r ef i l t e r e da n dt h es o l v e n tw a ss e p a r a t e l y 山东帅范人学顺l j 学位论文 柄海鞘活性物质的结卡勾斛析技生物活盹研究 c o n c e n t r a t e du n d e rv a c u u m t h ec o n c e n t r a t et h e nw a sp a r t i t i o n e dw i t h 1nn a n 0 3 ，t h ea q u e o u sp h a s ew a sc o l l e c t e da n de x t r a c t e dw i t h c h l o r o f o t i n t h e nt h ec h l o r o f o r r ne x t a c tw a sc o n c e n t r a t e du n d e rv a c u u m t oy i e l dar e d b r o w ng u m t h i sm a t e r i a lw a sl o a d e do n t oas i l i c ag e l c o l u m na n dt h ec o l u m nw a se l u t e dw i t hc h l o r o f o r ms e v e r a lt i m e su n t i l e t h ef r a c t i o no fi n t e r e s tw a sc o l l e c t e d f i n a l l yw eo b t a i n e ds o m el i g h t y e l l o wo i n t m e n tl i q u i dw h i c hw a saa d m i x t u r ea n dw a sn a m e dfi s e c o n d ，m e t h o do fg s - m sw a su s e dt oa n a l y z ec o m p o n e n t so f fi r e s u l t ss h o w e dt h a tt h em a i nc o m p o n e n to ffi i s1 ，2 - b i s ( 5 - m e t h y l - 2 一 b e n z o x a z 0 1 ) - e t h e n e a tl a s t ，w ei n v e s t i g a t e dt h efi a n t i c a n c e ra c t i v i t yb yc u l t u r i n g c a n c e rc e l l ss u c ha sb e l 7 4 0 2l i v e rc a n c e rc e l la n db g c 8 2 3g a s t r i c c a n c e rc e l l ，a n da n t i p r o l i f e r a t i v ee f f e c t sw e r em e a s u r e db ym t ta s s a y f r o mt h ed a t ao ft h ee x p e r i m e n tw ef o u n dt h a tfic a ni n h i b i tt h e a c t i v i t yo fb e l 7 4 0 2l i v e rc a n c e rc e l l a td i f f e r e n tt i m ea n dd i f f e r e n t d o s a g e t h er e m a r k a b l ee f f e c th a p p e n e da f t e r4 8 ho fi n c u b a t i o nw i t hf iu n d e rt h ec o n c e n t r a t i o n6 0 9 9 m 1 fi c a ni n h i b i tt h ea c t i v i t yo f b g c 8 2 3g a s t r i cc a n c e rc e l ls i g n i f i c a n t l yo n l yu n d e rt h ec o n c e n t r a t i o n 6 0 9 9 m 1 i na d d i t i o n ，w ei n v e s t i g a t e dt h efi a c t i v i t yo fi m m u n e 。 m e d i a t eb yc u l t u r i n gt h es p l e e nc e l l so fm i c e a l lt h er e s u l t si m p l i e dt h a t t h efih a sn o ta n yr e m a r k a b l ee f f e c t so np r o l i f e r a t i o no fl y m p h o c y t e a n dp r o d u c t i o no fc y t o k i n e ss u c ha si l 一2a n di l - 6 4 山东师范人学坝i 学位论文柄海= i i j 活性物质的结构解析搜生物活p k 嘶究 w eb e l i e v et h a tt h r o u g hf u r t h e rr e s e a r c h ，t h ew o r ki nt h i sf i e l di n o u rc o u n t r yw i l lm a k ear a p i dp r o g r e s sa n dab r a n d e d n e wp r o s p e c tw i l l c o m eo u t k e yw o r d s ： s t y e l ac l a r a i s o l a t i o n p u r i f i c a t i o n a n t i c a n c e ra c t i v i t yi m m u n e - m e d i a t e i l 一2i l 一6 c a t e g o r yn u m b e r ：q 2 5 ；r 9 3 山东帅范j ( 学坝【：学位论文 柄海耥活性物质的结构解析发生物活性州宄 综述 第一部分海鞘生理活性物质的研究进展 海洋占地球表面积的7 1 ，生物量约占地球生物总量的8 7 ，生物种类 2 0 多万种，是地球上最大的资源能量宝库。海洋中蕴藏着极其丰富的天然产 物，是人类寻找新药的最大库源。海洋天然产物的特异结构和药理作用是陆源 生物所无法比拟的，海洋药物具有显著的药理稳定性和强效性，毒副作用相对 较小，对防治癌症、艾滋病、心脑血管病、老年病等疑难症具有独特效应，已 成为开发新药、特药的主要方向之一。 在海洋天然产物中，开发研究的主要对象是海绵( p o r i f e r a ) 、珊瑚 ( o c t o r a l l i a ) 、海鞘类动物( a s c i d i a c e a e ) 、苔藓( b r y o z o a ) 以及软体动物 ( m o l l u s c a ) 。海鞘类( t u n i c a t e 或a s c i d i a n ) 生物是与脊椎动物非常亲近的原索 动物，广泛分布于包括赤道在内的世界各个海域中，自沿海水域至深海海底皆有 海鞘栖患。自海鞘中分离到具有强抗癌活性的五种环肽以来，对海鞘的研究迅 猛发展，从中发现了许多抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、有免疫调节、生物催化 等生理活性的物质，其中尤其以抗肿瘤活性物质最为引人注目。业已发现的 d i d e m n i n s 、e u d i s t o m i n s 等潜在的药用价值为海洋生物学者、海洋药物学者及 生物医学者所关注，可望开发为结构新颖药效显著的新药而应用于临床。本文 拟从物质活性和化学物质结构两方面来概述海鞘中的生理活性物质的重大研究 进展”9 1 。 1 物质活性 1 1 肿瘤抑制活性物质 d i d e m n i n s 是一类来自加勒比海海鞘t r i d i d e m n n u ms p 的抗病毒和抗肿瘤缩 肽，共有3 神即：d i d e m n i na 、b 和c 。d i d e m n i n s 包含一条环状缩肽骨架。但 在线性多肽侧链( n m e t h y i l e n c i n e ) 的替代上存在差异【1 0 _ 引。研究还表明自然的环 状缩肽中心对于大多数d i d e m n i n s 是必需的结构，尤其对于其抗病毒和细胞毒活 性而言。更是如此。这种肽类的线性侧链部分可以根据生物活性的需要加以变 6 山东帅范人学坝i 一半位论义柄海鞘活。h 物质的站构解析及生物活性研究 化，脱氢d i d e m n i nb 和d i d e m n i nm 便是很好的例子【1 6 i 。d i d e m n i n s 是一类强抗 肿瘤、抗病毒、免疫抑制剂。d i d e m n i n s 对b 1 6 黑素瘤细胞以及l 1 2 l o 和 c h o 细胞有很强的抑制作用；能有效地抑制几种d n a 、r n a 病毒的复制；能够 使雌性小鼠避免感染生殖疱疹单纯病毒；能在体外很低的浓度下抑制病毒复制 和体内抑制白血病细胞p 3 8 8 。对h s v 1 和h s v 一2 作用表明，前者的i d 5 0 值小 于1 5 g m l ，后者为1 2 9 9 m l 【7j 。d i d e m n i nb 和d i d e m n i nc 是d i d e m n i na 的衍 生物，它们结构相似，但功能活性却不同。表明通过一定的修饰有望找到十分 有用的药物。d i d e m n i nb 较d i d e m n i na 的活性高很多，能更有效的作用于病原 微生物 18 - 1 9 。d i d e m n i nb 在浓度为o + 0 1 p g m l 时肿瘤集落形成单位降到3 0 以 下，亦即肿瘤细胞的生存率下降大约3 4 6 。在0 1 “g m l 的药物作用下，肿瘤 细胞对药物的敏感程度与前者类似。两者的i d 5 0 分别为4 2 1 0 。扯g m l 和4 6 1 0 g m l ，而且都有明显的剂量依赖效应。d i d e n m i nb 是一种不和d n a 结合的 蛋白质合成抑制剂，表明其生物学活性是由抑制蛋白质合成介导的，而且还能 在较低层次上抑制d n a 的合成。d i d e m n i nb 还具有效的免疫抑制活性，它与 最常见的免疫抑制剂( c s a 、c y c l o p o r i na ) 的结构类似。d i d e m n i nb 对淋巴细 胞增殖的抑制能力较c s a 强1 0 0 1 0 0 0 倍。d i d e m n i nb 是一种细胞周期非特异性 的细胞毒性物质，它可以有效的抑制诸如乳房肿瘤、肾肿瘤、卵巢肿瘤以及肉 瘤和间皮瘤。d i d e m n i n b 可连接3 6 k d 糖蛋白，它的编码基因与棕榈酰蛋白硫 酯酶( p p t ) 相似，提示d i d e m n i nb 可作为治疗基因突变引起婴儿性神经脂褐 素症的潜在药物。令人欣慰的是d i d e m n i nb 己在美国国家癌症研究所进行i i 期 临床试验，我们相信通过对这种高活性药物的结构的分析，会对其活性的分子 机制的研究提供有力的帮助【2 0 1 。 从红海紫色海鞘e u d i s t o n a 印口1 2 7 】中分离到一类生物碱，能抑制n l e 1 1 5 细胞增殖以及诱导其形态分化。各种化合物这两种作用的最适浓度是： s e g o l i n ea 为2 5 - 4 0 9 m 和1 2 - 5 2 u m ；s e g o l i n eb 为1 6 2 0 9 m 和6 - 3 2 p , m ； i s o s e g o l i n ean o r s e g o l i n ed e b r o m o s h e r m l i a m i n e 为l o 一1 5 “m 和2 - 2 4 p m e i l a t i n 最有效，为0 1 2 - 0 1 6 p m 和o 0 5 0 2 m 。这6 种化合物对细胞的形态影响是不 相同的。在有效浓度下，细胞的生长可以被完全抑制而不产生细胞死亡。当高 于这一浓度时便发生少量细胞死亡。在较低的有效浓度下细胞仍可以生长但是 速率很低。通过与毛喉素、d b c a m p ( 1 m m ，且含有t m m 的l ，3 二甲基黄喋 山东师范人学颁l j 学他论义柑海精 活性物质的结构斛析技生物活性t , ) t j f 呤) 、c p t c a m p ( 2 5 0 5 0 0 p m ) ；f l l8 - c h l o r o c a m p 等相比较，单独施用e u d i s t o m a 生物碱能够使培养的n l e 11 5 细胞获得稳定的形态分化( 没有药物依赖性) 即： s e g o l i n ea 、e i l a t i n 能够诱导一种高度的内稳态。使细胞不再增殖。这6 种生物 碱均能抑制n i l 8 细胞和n i l 一8 一h s v 细胞的生长并且有剂量依赖效应，有效浓 度范围和作用成神经细胞瘤细胞的五种生物碱相似。其中以e i l a t i o n 的作用效 果最为明显。e i l a t i o n 在o 0 5 9 m o l 时便可以降低n i l 8 一h s v 细胞增殖，但是对 于正常的n i l 一8 细胞却没有任何影响。在0 1 o 2 9 m o l 时n i l - 8 h s v 细胞的增 殖完全被阻止，而n i l 8 细胞只是增殖速度变慢。在0 5 i _ t m o l 时，e i l a t i o n 对 n i l 8 h s v 和成神经细胞瘤细胞有细胞毒性而对n i l 8 细胞却没有。通过 e u d i s t o m a 生物碱影响两类由c a m p 调节的典型代谢系统中的p k 活性和对诱导 形成p e p c k 的m r n a 的产生发现：几种e u d i s t o m a 生物碱都具有与c a m p 类 似物相似的效应。s e g o l i n ea 、d e b r o m o s h e r m l i a m i n e 和n o r s e g o l i n e 能抑制p k 的活性，在亚最大底物浓度下可使底物磷酸化的k 。升高3 倍。s e g o l i n ea 和 d e b r o m o s h e r m l i a m i n e 能够刺激诱导鼠肝细胞中p e p c k m r n a 的产生，这种作 用有剂量依赖性。由于两种作用效果均和c a m p 的类似物c p t c a m p 相似， 可以认为e u d i s t o m a 是一种新型蛋白药物，能够影响基本的细胞中的c a m p 依 赖性的磷酸化的过程 2 8 1 。 l a m e l l a r i n s 是一类多聚芳香族生物碱，从l a m e l l a r i as p 和d i d e m n u m 印中制得。抗病毒和抗肿瘤化合物l a m e l l a r i n s 中：l a m e l l a r i nd ，t r i a c e t a t e k l ，k t r i a c e t a t e ，m t r i a c e t a t e 和n t r i a c e t a t e 在所检验的细胞系中细胞毒性活 性最高。对于a 5 4 9 肺癌细胞来说，d t r i a c e t a t e 和k t r i a c e t a t e 的抑制活性很 高。在不同的药物浓度的戊脉安异搏定和l a m e l l a r i ni 作用下，具有多抗药性 的p 3 8 8 s c h a b e l 细胞对阿霉素、道诺红菌素和长春碱等产生敏感性。化学敏感 检验证明l a m e l l a r i n s 可以逆转p 3 8 8 s c h a b e l 细胞对阿霉素、道诺红菌素和长春 碱的抗性，在l a m e l l a r i ni 为2 9 m o l 的情况下可以对三种药物的抗性实现完全 逆转，且不会引起大量的细胞生长抑制。在检验l a r n e l l a r i n s 对罗丹明1 2 3 在多 药物抗性细胞中的积聚的影响时，发现在2 0 l | t m o l 罗丹明1 2 3 经3 0 分钟培育的 l o v o 和口g p p o s s t i v el ov o d x 细胞中，在戊脉安异搏定和l a m e l l a r i n 存在的情 况下能够增加l ov o d x 内的罗丹明1 2 3 的浓度，并且有浓度依赖性。当戊脉 安异搏定和l a m e l l a r i n 分别为4 0 “m o l 、1 0 “m o l 时在抗性细胞中达最大值，在正 山东师范人学顾l 学位论文 l j i 海鞘活性物质的结构解析艘生物活性研究 常的l ov o 细胞中检测不到罗丹明1 2 3 。研究表明，l a m e l l a r i n s 可能在多抗药 肿瘤的治疗中发挥重大作用( 有细胞毒性可以抗肿瘤且能够增强针对m d r 细胞 的道诺红菌素的细胞毒性) 【2 9 。0 1 。 d e h y d r o d i d e m n i nb ( d d b ) 为来自地中海海鞘和l i d i u ma l b i c a n s 的缩肽。每 日注射d d b ，发现可使患e h r l i c h 癌症的动物寿命延长l 倍，整个肿瘤细胞下 降7 0 9 0 。结果分析表明，d d b 可以作为种非常有效的蛋白质合成抑制 剂，而且可以使处理后的o d c ( o m i t h i n ed e c a r b o x y l a s e ，鸟菅酸脱羧酶) 活性急 剧下降。研究发现1 0 墙m o l 的d d b 便可完全抑制细胞的生长；m t t 增殖检验 获得的i c 5 0 表明，增殖能力最强的细胞系c t 一2 对这种药物最敏感p “。研究还 发现d d b 是一种对于人结肠癌细胞有着明显细胞毒性的试剂3 2 】。 a p l i d i n e 是来自地中海海鞘a o l i d i y ma l b i c a n s 的一种抗癌缩肽，对肿瘤的 增殖有显著的抑制效应，且这种效应具有浓度依赖性：在浓度为o 0 1 p 。m o l 1 时 抑制率为3 5 ：浓度为0 0 5 肛m o l l 时有8 2 的抑制率：当浓度大于o 0 5 p m o l l 时抑制率可达1 0 0 。a p l i d i n e 在浓度大于o 0 1 m o l l 时才有活性效应。卵巢 癌、淋巴瘤和肠癌等对极低浓度的a p l i d i n e 有选择效应性。在连续暴露实验中 浓度变化从o 0 0 0 1 m o l 1 时到1 0 肿o l 1 表明也具浓度依赖性，得出其最低有效 浓度为o ，o m o l l 。而且研究还表明非小细胞肺瘤、黑色素瘤和乳房癌对长期 暴露在药物下高度敏感，说明a p l i d i n e 对肿瘤的作用既有时间依赖性又有浓度 依赖性。实验表明，它对于造血干细胞的毒性可以诱导温和的骨髓毒性【3 3 1 。 海鞘素一7 4 3 ( e t 一7 4 3 ) 是从一种加勒比海海鞘中分离出来的四环脱氢异喹诺 酮。它可以与d n a 的小沟、鸟嘌呤特异性作用。e t 7 4 3 对各种实体瘤细胞系 表现出活性，包括软组织瘤、乳房癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、黑 素瘤。在体外，也表现出广泛的抗癌活性。肉瘤细胞系对e t 一7 4 3 十分敏感， 其原因至今不太清楚吼e t 7 4 3 一般具有较好的耐受性。在临床试验中最常见 的副作用是非积累性的血液毒性和肝脏毒性。短暂而可逆的肝转氨酶升高、恶 心、呕吐、衰弱是常见的，但情况并不严重并且从来不会限制治疗。粘膜炎、 秃头症、心脏或神经毒性未观察到。在研究它的药物动力学和安全性过程中， 对患有实体瘤的2 6 位病人用该药每隔三周静脉注射- d , 时，结果发现从5 0 一 8 0 0 g m 2 之间的7 个剂量水平上充分有效1 3 5 1e t 7 4 3 是至今发展的最快的抗 癌药物，现已进入i i 期i i f i i 床的后期即将进入i i i 期临床。 山东帅 ! i ：【人学坝卜学位论文钠海鞘活性物质的结构解析及生物活忡傍f 究 1 2 免疫活性物质 e t e ( e c t e i n a s c i d i at u r b i n a t ae x t r a c t s ) 3 6 4j 为来自海鞘e c t e i n a s c m i a t u r b i n a t a 的能够抑制受有丝分裂原凝集素刺激后的人类淋巴细胞的d n a 合 成：能够抑制p h a 和c o n a 对人类淋巴细胞的有丝分裂原效应。在e t e 为 1 0 0 “g m l ，p h a p1 ：2 0 0 ( 终浓度) 或c o n a5 p g m l 连续孵育人的淋巴细胞1 小 时，结果发现解除e r e 2 4 小时后d n a 合成的抑制仍达1 0 0 ；甚至4 8 小时之 后仍有抑制作用。e t e 存在的情况下，完全抑制细胞对胸腺嘧啶的吸收，并且 无细胞毒性存在。据推测e t e 的这种作用可能是由于它能结合外源凝集素或者 可以清除促有丝分裂有关信息。另外还发现e t e 抑制小鼠体内抗羊红细胞抗体 的产生，并且能够抑制移植体对宿主和宿主对移植体的反应。另外，最近还发 现该提取物能够抑制人和小鼠的淋巴细胞在有丝分裂原和抗原刺激下形成的母 细胞转化【4 2 1 。 具同种异体细胞毒性的血细胞：单生u r o c h o r d a t es t y e l ac l a r a 的血细胞能 够在体外产生同种异体的细胞毒性作用。实验表明，与自身来源的血细胞对照 相比较，有同种异体血细胞的培养基中培养的细胞死亡率大大增加。这种细胞 毒性有以下特点：尽管连续性的特异性杀伤作用可能被细胞的自然凋亡所掩 盖，瞬间的特异性的细胞毒性行为在培养4 小时后便可以检测出来；细胞间的 相互作用要求细胞之间必须互相接触才能引起相应的同种异体的细胞毒性作 用：效应细胞能够杀伤多重目标，主要由于反应的水平很高所致；对于温度转 变不敏感；在缺少自身血浆的情况下可以增加这种细胞毒性；缺少异源相互作 用；存在低中高三个水平的反应。数据表明，导致特异细胞毒性的同种异体细 胞决定簇识别行为要受免疫活性细胞的影响。这种细胞毒性识别和细胞毒性反 应是一种适应性反应，主要由单生海鞘的组织相容性引起。由此可以看出：异 己排斥可以发生在许多系统发育水平。在无脊椎动物中也存在着特殊的免疫识 别行为。无脊椎动物的这种组织相容性系统反映了在进化上的连续性。即由此 产生了脊椎动物的免疫识别。通过分析海鞘的免疫反应可以进一步确证这种进 化趋势。 通过从柄海鞘( s t y e l ac l a r a ) 的咽部e d n a 文库里克隆出三种新型的抗菌 肽类的前体：s t y e l i n sc ，d ，e 。前体s t y e l i n s 类似双翅目( d i p t e r a n ) 的f ：杀菌肽 ( p r e p r o c e c r o p i n s ) 。但是自然界占大多数的s t y e l i n sc 却类似从猪小肠内纯化的 0 山东师范人学嘲卜学位论义 1 1 j 海鞘活性物质的结构衅析发生物活眺研冗 一种抗菌肽：杀菌肽( c e c r o p i n ) p l 。s t y e l i n sc 和c e c r o p i n l 均以最初的6 个氨基 酸残基作为其信号序列。雄果蝇( d r o s o p h i av i r i l i s ) 的s t y e l i n sc 和c e c r o p i n l 有 7 2 7 的相同氨基酸。s t y e l i n s 包含有一个保守的多带负电荷的氨基酸的延长的 碳端。并且这些碳端在前杀菌肽中不存在。对于这种存在于原索动物中的类杀 菌肽的抗菌肽的研究和分析使人们相信这个家族的祖先可以作为一种在动物体 内的初级免疫效应因子。而且吸引人们去从原索动物向脊椎动物进化的动物中 发现更多的类杀菌肽的活性物质1 。 s t y e l i n s 为从单体柄海鞘血细胞中提取到的一类广谱抗菌肽，有s t y e l i na 和s t y e l i nb 两种化合物。这两种s t y e l i n s 对可以导致人类疾病的革氏阴性或阳 性菌都有明显的抑制作用，最低有效抑制药物浓度低于0 5 9 m 。也可以杀伤海 洋细菌p s y c h r o b a c t e ri m m o b i l i a 和p l a n o c o c c u sc i t r e u s ( 在含n a c l 为0 4 m o l 的介 质中) 。海鞘的血细胞中出现这种抗菌肽说明，这类分子是存在于脊椎动物的 一种古老的防御介质【4 ”。 1 3 其它生理活性物质 在0 ，5 m g m le c t e i n a s c i d i at u r b i n a t ae x t r a c t ( e t e ) 的作用下，人类成纤维细胞 生长被抑制达9 1 ，d n a 合成抑制率达9 8 ( 2 0 小时之后) ：在3 o m g m l 的 e t e 的作用下，受2 5 4 n m 紫外线照射的成纤维细胞的d n a 切除修复在6 小时 修复) 内降低4 4 ，2 4 小时降低2 6 ，4 8 小时则降低1 5 。同时修复抑制还 伴随着单链d n a 裂解的积累( 这种作用通过加入2 m m o l 的羟基脲加强) 4 6 1 。 t u n i c h r o m eb i ( 被囊色素b i ) 为来自于a s c i d i a nn i g r a 的一种血液色素。 它与这种动物不可逆的对钒的富集积累作用有关。它对于水和氧气非常的敏 感。这对分离该物质造成相当的困难。作为这种海鞘的血液色素成分之一，其 具体的作用方式和生物学功能还不是很清楚。这种色素原与钒共存，在维持海 鞘体内的钒细胞中的还原状态方面担当重要角色。在生命的代谢过程中，正是 由于该色素的强烈的还原性和复杂的特性使得还原性的钒能稳定存在。搞清楚 钒细胞的功能和海鞘色素的生物学功能对了解钒、钼、镍等痕量元素在动物体 内的作用十分重要【4 “。 a l p h a - h y d r o p a r a x yd i e t h y ip e r o x i d e ( c 一h d p ) 为从海鞘p h a l l u s i am a m m i l l a t a 鞘囊中分离的一种天然化合物。d d y 小鼠腹腔投药，发现六天的l d 5 0 为 1 9 9 m g k g ，其置信界限为9 5 ( 1 2 6 3 1 4 m g k g ) 浼明其对这类小鼠有剧毒。男 山东师范人学坝卜学位论义柄海鞘活性物厦的结构解析硬生物活忡研究 外还发现，当直接暴露在该药物下时，包括肝细胞，胰实质细胞和脂肪细胞在 内的细胞出现坏死，直接接触这些化合物可能导致各种器官的白细胞死亡。这 种特殊的毒性可能由不同的暴露而不同1 4 8 1 。 p a t e l l a m i d ef 为来自l i s s o c l i n u m 口d 把，肠海鞘的- - 1 十新型细胞毒性环状八 肽。目前鉴定出浚类化合物有三种：p a t e l l a m i db 、u l t h i a c y c l a m i d e 和 l i s s o c l i n a m i d e 。并且它们的立体化学结构也已鉴定出来。但是关于其活性的工 作目前还未见报道【删。 处理c i o n ai n t e s t i n a t i s 的血液得u n i v a c u a rr e f r a c t i c e h e m o c y t e s ( u r h u r g ， 4 3 煳，另外的成分则是b 型桑葚胚性细胞( 5 7 ) 。研究发现，对羊红血球来 说，当u r g s ：s e ( 羊红细胞) 达0 9 1 0 6 个m 1 ：2 2 5 1 0 6 个m l ( 1 ：2 4 ) 开始表现毒性 作用，当比值达到1 ：3 时达到最高毒性8 0 ( 以溶解率计) ；当u r g s ：s e 为2 2 1 0 5 个m 1 ：2 2 5 1 0 6 个m l 即1 ：9 6 时开始表现明显溶血现象，到1 ：2 4 时达最高 值。鞘磷脂在2 5 9 9 m l 时，对溶血抑制达到最佳效果。空斑形成检验中 2 5 h g m l 同样能抑制空斑的形成。在u r g s s e 时出现空斑，u r g s r e 则没有空 斑，说明红细胞细胞膜的组成不同可能影响溶血。对于参与溶血的分子机制有 待于进一步研究【”】。 从海鞘s t y e l ap l i c a t a 的血液中可以分离并收集到一些颗粒型的叫做桑葚胚 性细胞的血细胞。实验表明，这种血细胞对兔红细胞和入k 5 6 2 肿瘤细胞有细 胞毒作用。可以把酚转化成醌启动黑素原途径。实验表咀，用可以解毒的超氧 化物歧化酶和裂解酶处理血细胞，能清除与红细胞裂解相应的黑素原途径产生 的自由基( 黑素原途径来源的醌类化合物可能是细胞毒分子) 。这种酚依赖性的 抗兔红细胞行为在空斑形成检验中也可以显示出来，其中含有聚酚和酚氧化酶 的桑葚胚性细胞被认为具有细胞毒性5 1 1 。 c l a v a n i n s 是来自柄海鞘血细胞的a 一螺旋抗菌肽类，目前共提纯出四种物 质：c l a v a n i n sa 、b 、c 、d 。它们在抗菌性上类似爪蟾抗菌肽。人工合成的 c l a v a n i na 的抗菌功能和爪蟾抗菌肽以及杀菌肽相当。尾索动物血细胞中的c 【一 螺旋抗菌肽的出现预示这些多肽是脊椎动物先天免疫的最初效应因子【5 2 】。另一 类c l a v a n i n s 是来自柄海鞘白细胞的多肽。c l a v a n i n a 氨基化合物和c l a v a n i n a 酸对于大肠杆菌( 叵c o l i ) 、l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s 和c a n d i d aa l b i c a n s 有抗菌 作用。c l a v a n i n s 能够广泛有效地作用于包括对二甲氧基苯青霉素有抗性的黄化 山东师范大学颅i ：学位论文 l l i 海鞘活悱物质的结构解析发生物活性研究 植物葡萄状球菌在内的革氏阳性细菌。同时对革氏阴性菌也起作用；c l a v a n i n s 在0 1 一o 3 m 的n a c i 溶液环境中表现强烈的抑菌作用，在p h 值为5 4 时的作用 性能较p h 值为7 4 时强很多倍：由以上可以看出，c l a v a n i n s 为人们设计一种 能够在酸性环境下( 如：胃腔和溶酶体里) 选择性起作用的抗菌试剂提供了前景。 同时可以设计一种在正常或高浓度n a c i 下起作用的广谱抗菌药物。 来自s t y e l ap l i c