（麻醉学专业论文）脊髓背角gabab受体在糖尿病神经痛形成过程中的作用.pdf

目录 中文摘要o oooooooo oodooooo oo l 英文摘要o ooo oodoooo 4 研究论文脊髓背角g a b a b 受体在糖尿病神经痛形成过程中的作用 前言o 0 ooooo ooooooooo 7 刖吾“一一 ”一“”一”“一”“一一+ 7 材料和方法o oo oooo0ooooooooooo 8 结果1 6 附图”一“”一”“一”一一”一“”一”“”一一一1 8 附表2 5 讨论2 7 结论3 l 参考文献3 1 综述一g a b a b 受体在脊髓水平痛觉调节中的研究进展3 5 综述二g a b a b 受体与药物成瘾性的研究进展1 q l l l l oqqgoo ooo 4 1 致调十0 00000000 000 ”“”“一“”“一“一”4 8 个人简历4 9 中文摘要 脊髓背角g a b a b 受体在糖尿病神经痛形成过程中的作用 摘要 目的：糖尿病神经病变是糖尿病最常见的长期并发症之一，且发病率 逐年升高。其中以感觉神经病变即疼痛性糖尿病神经病变( p d n ) 最为常 见，约占3 0 ，其病理生理机制十分复杂且难以治疗。糖尿病神经病理性 痛等慢性疼痛状态可导致脊髓背角一系列神经递质和受体系统发生改变。 g a b a b 受体作为抑制性氨基酸受体系统的重要组成部分，其改变将影响 机体g a b a 能系统的功能，从而影响痛觉信息在脊髓背角的整合、传递 和调控。 本实验通过腹腔注射链尿佐菌素( s t z ) ，制备糖尿病神经病理性疼痛 大鼠模型，观察糖尿病大鼠( d m ) 与正常大鼠( c o n t r 0 1 ) 相比，其体重、空腹 血糖和5 0 缩足反应阈值( p w t ) 的变化，以及鞘内注射g a b a b 受体激动 剂巴氯酚( b a c l o f e n ) 对糖尿病大鼠神经病理性痛的p 、w 的影响；采用免疫 组织化学染色、r t - p c r 及w e s t e r nb l o t t i n g 方法，比较糖尿病神经痛大鼠 与正常大鼠脊髓背角g a b a b l 受体的表达变化，从而探讨g a b a b 受体在 糖尿病神经病理性痛形成中的作用，以期发现更具有针对性的疼痛治疗靶 点。 方法：健康s d 雄性大鼠1 0 0 只，实验前测定所有大鼠的体重、空腹 血糖和5 0 缩足反应阈值( p w t ) 。随机取9 0 只大鼠腹腔注射s t z ( 5 0 m g k g ) 制备实验模型。s t z 注射一周后，7 4 只大鼠测空腹血糖 1 6 7 m o l l ( 成功率为8 2 ) ，为糖尿病模型，其余1 6 只大鼠空腹血糖 1 6 7 m o l l 被剔除实验。7 4 只糖尿病大鼠继续观察l 周后( 即s t z 注射 后2 周) ，利用y o nf r e y 针测定大鼠的( p w t ) ，p w t 小于4 9 为糖尿病神 经病理性痛大鼠；其余1 0 只正常大鼠腹腔注射相同体积的生理盐水( c 组) ，用于s t z 注射的对照组实验。 第一部分：取糖尿病( d m ) 大鼠3 0 只，鞘内置管后观察两天，其 中2 3 只大鼠未出现神经症状( 置管成功率为7 7 ) ，7 只出现下肢运动异 常，被剔除实验。根据鞘内注射药物不同，选取置管成功的2 0 只d m 大 鼠随机分为两组( n = 1 0 ) ：b 组：鞘内给予1 0 山的巴氯酚( b a c l o f e n ) 0 5 9 9 ， 中文摘要 n 组：给予相同容积的生理盐水，连续7 天( 1 次天) 。于注射前、注射 后1 天、1 周、2 周及4 周，比较两组大鼠的5 0 缩足反应阈值( p w t ) 的变化。 第二部分：随机另取3 0 只糖尿病大鼠( d 组) 及1 0 只正常大鼠( c 组) 进行形态学及分子生物学实验。确定3 个测量及取材点，分别为注射s t z 后3 周、5 周、7 周。根据时间点不同，将3 0 只d m 大鼠分为3 组：d 3 、d 5 、 d 7 ，每组1 0 只。分别于注射后3 周、5 周、7 周测量各组大鼠的体重、空腹 血糖及5 0 缩足反应阈值，然后取材。d 组所取材的实验大鼠需p w t o 0 5 ) 。 2 两组大鼠体重、空腹血糖及5 0 缩足反应阈值的变化( 见附表1 3 ) ： 在腹腔注射s t z 前，c 组和d 组大鼠的体重、血糖及5 0 缩足反应阈值差异 无统计学意义( p o 0 5 ) 。在体重方面，注射后两组相比，d 组大鼠各时 间点体重比c 组明显下降( p o 0 5 ) ，d 组注射后各时间点与注射前相比， 体重也有明显降低( p o 0 5 ) ；在血糖方面，腹腔注射后，d 组各时间点较 c 组明显升高( p o 0 5 ) ，并且与d 组注射前血糖相比也明显升高( p o 0 5 ) ； 在p w t 方面，d 组自注射s t z 后3 周，各时间点p w t 较c 组下降明显 中文摘要 ( p o 0 5 ) ，与d 组注射前相比，注射后各时间点也有明显统计学差异 ( p o 0 5 ) 。b a c l o f e n 组鞘内注射b a c l o f e n l 天后，各时间点的大鼠5 0 缩足 反应阈值较d m 组明显升高( p o 0 5 ) 。 3 大鼠脊髓背角g a b a b l 受体的表达变化( 见附表4 ) ：与c 组正常对 照组相比，d 组注射s t z 后3 周、5 周、7 周的糖尿病神经痛大鼠脊髓背角 g a b a b l 受体免疫阳性神经元细胞数明显增加( p o 0 5 ) ，在7 周时有下降 趋势；脊髓背角g a b a b l 受体的m r n a 水平于注射s t z 后逐渐降低，在7 周 时与正常组比较有统计学差异( p o 0 5 ) ；脊髓背角g a b a b l 受体的蛋白表 达量于注射s t z 后5 周、7 周，与正常对照组比较显著降低，与正常组比较 有统计学差异( p o 0 5 ) 。 结论：脊髓背角g a b a b 受体在脊髓水平参与了大鼠糖尿病神经病理 性痛的调节，鞘内注射其激动剂巴氯芬对糖尿病神经病理性痛具有镇痛作 用。 关键词：糖尿病神经病理性痛；脊髓背角；g a b a b 受体；免疫组织 化学染色；r t - p c r ；w e s t e r nb l o t t i n g 英文摘要 r o l e so fg a b a b r e c e p t o r si nt h es p i n a ld o r s a lh o r no fr a t sw i t h d i a b e t i cp a t h i cpaliae t i cn e u r oa t l a i ca l n a b s t r a c t o b j e c t i v e ：a sw ek o n w , t h en e u r o p a t h i e sa r eo n eo f t h em o s tc o m m o n l o n g t i m ec o m p l i c a t i o n so fd i a b e t e s ，a n dt h em o r b i l i t yi n c r e s e se v e r yy e a r a b o u t16 a n d2 6 o fd i a b e t i cp a t i e n t ss u f f e rc h r o n i cp a i n t h i sm a yb e r e f e r r e dt oa sd i a b e t i cn e u r o p a t h i cp a i no rp a i n f u ld i a b e t i cn e u r o p a t h y t h e m e c h a n i s m so fd i a b e t i c n e u r o p a t h i cp a i n a r e v e r yc o m p l e x a n dt h e m a n a g e m e n ti s s t i l lq u i t ed i f j f i c u l t s t u d i e so nt h et r a n s m i t t e rp h m a r a e o l o g y h a v ei n d i c a t e dt h a tt h e r ee x i s t e dc h a n g e so fn e u r o t r a n s m i t t e r sa n dr e c e p t o r si n s p i n a lc o r di n d u c e db yn e u r o p a t h i cp a i n c h a n g e so fg a b a br e c e p t o r sc o u l d a f f e c tt h ef u n c t i o no fg a b a e r g i cs y s t e ms ot h a tt oa f f e c tt h et r a n s m i s s i o na n d m o d u l a t i o no fn o c i c e p t i v em e s s a g e s t h ep e r s e n ts t u d yi st oe x p l o r ec h a n g e so fg a b a br e c e p t o r si ns p i n a l c o r dd o r s a lh o r no fr a t sw i t hd i a b e t i cn e u r o p a t h i cp a i ni n d u c e db ys t z c h a r a c t e r i s t i cb e h a v i o r a lc h a n g e sw e r eo b s e r v e dt oa f f e c th y p e r a l g e s i ao fr a t s ， a n dw ea l s oh a di n t r a t h e c a li n j e c t e db a c l o f e nt oo b s e r v et h ec h a n g eo f5 0 p a ww i t h d r a wt h r e s h o l d ( p w t ) o fr a t s w i t hd i a b e t i cn e u r o p a t h i cp a i n m e t h o d so fi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , r t - p c ra n dw e s t e r nb l o t t i n gw e r e a p p l i e dt oe x a m i n et h ee x p r e s s i o no fg a b a br e c e p t o r si ns p i n a lc o r dd o r s a l h o r n s t u d i e sa b o u tt h ec h a n g e so fg a b a br e c e p t o r s i ns p i n a lc o r dd o r s a l h o r nc o u l dh e l pf i n d i n go u tm o r es p e c i f i ct a r g e t so ft r e a t m e n tf o rd i a b e t i c n e u r o p a t h i cp a i n m e t h o d s ：10 0m a l es p r a g u e - d a w l e yr a t sw e r er a n d o m l ys e l e c t e df o rt h i s e x p e r i m e n t ，w e i g h i n g13 0 - 15 0 9 b o d yw e i g h t s ，f a s t i n gb l o o dg l u c o s el e v e l a n d5 0 p a ww i t h d r a wt h r e s h o l do fa l lt h er a t sw e r em e a s u r e db e f o r es t z i n je c t i o n 9 0r a t s w e r ei n d u c e dw i t has i n g l ei n t r a p e r i t o n e a li n je c t i o no f s t r e p t o z o c i n ( 5 0 m g k g ) a sd i a b e t e s a to n ew e e ka f t e rs t zi n j e c t i o n ，7 4r a t s w h o s ef a s t i n gb l o o dg l u c o s el e v e li n c r e a s e du pt o16 7 m m o l lw e r ec o n s i d e d 4 英文摘要 a sd i a b e t i cr a t s ，a n dt h er a t i oi s8 2 a tt w ow e e ka f t e rs t zi n je c t i o n ， r e s p o n s e st ot h em e c h a n i c a ls t i m u l u so fd i a b e t i cr a t sw e r em e a s u r e dw i t hy o n f r e yf i l a m e n t ，a n d w h o s e5 0 p a ww i t h d r a wt h r e s h o l d ( p w t ) w e r ed o w nt o 4 9w e r ec o n s i d e da sd i a b e t i cn e u r o p a t h i cp a i nm o d e l s a n o t h e r10r a t sw e r e w e r ei n t r a p e r i t o n e a li n j e c t e do fs a l i n ea sc o n t r o l s 3 0d i a b e t i cr a t sw e r er a n d o m l ys e l e c t e df o rb e h a v i o a r le x p e r i m e n t 2 3d i d n o ta p p e a rn e r v ei n j u r ya f t e ri n t r a t h e c a li n je c t e do fp e - 10 ，a n dt h er a t i oi s 7 7 2 0d i a b e t i cr a t sw h i c hh a dn on e r v ei n j u r yw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o2 g r o u p s ( n = lo ) g r o u p bw e r ei n t r a t h e c a li n j e c t e db a c l o f e no f 0 5 鹇f o r7d a y s g r o u pn w e r ei n t r a t h e c a li n j e c t e ds a l i n ea s c o n t r o l s 5 0 p a ww i t h d r a w t h r e s h o l d ( p w t ) w a sr e c o r d e db e f o r eb a c l o f e ni n j e c t i o na n d1d a y , 1 ，2 ，4 w e e ka f t e rb a c l o f e ni n j e c t i o n a n o t h e r3 0d i a b e t i cr a t sa n d10c o n t r o lr a t sw e r eu s e dt oc o m p a r et h e e x p r e s s i o no fg a b a mr e c e p t o r si nt h es p i n a lc o r dd o r s a lh o r n 3 0d i a b e t i c r a t sw e r es e p a r a t e di n t o3g r o u p sb yd i f f e r e n tt i m ep o i n t sa t3 ，5 ，7w e e ka f t e r s t zi n j e c t i o n b o d yw e i g h t s ，f a s t i n gb l o o dg l u c o s el e v e la n dp w tw e r e m e a s u r e di nd i a b e t i ca n dc o n t r o lr a t si ne v e r yt i m ep o i n t a t3 ，5 ，7w e e ka f t e r s t zi n j e c t i o n d i a b e t i cr a t sw h i c hp w tw e r ed o w nt o4 9w e r es a c r i f i c e da n d i n t u m e s c e n c es e g m e n t so fs p i n a lc o r dw e r ec o l l e c t e df o ra n a l y s i so fg a b a b 1 r e c e p t o r si nt h es p i n a lc o r dd o r s a lh o r nf o ri m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , r t - p c r a n dw e s t e r nb l o o t i n g 10c o n t r o lr a t sw e r es a c r i f i c e df o ra n a l y s i so fg a b a m r e c e p t o r sa t7w e e ka f t e rs t zi n je c t i o n d a t aa n a l y s i sa n ds t a t i s t i c s d a t aw e r ee x p r e s s e da sm e a n + s e m t h e r e s u l t sw e r ea n a l y z e db yt - t e s ta n da n a l y s i so fv a r i a n c e ( a n o v a ) v a l u e so f p 0 0 5w e r ec o n s i d e r e da ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t r e s u l t s ：1b e f o r eb a c l o f e ni n j e c t i o n ，t h e5 0 p a ww i t h d r a wt h r e s h o l do f g r o u pba n dn h a dn os t a t i s t i c a ld i f f e r e n c e a f t e rb a c l o f e ni n je c t i o n ，t h ep 丌 i n c r e a s e dd r a m a t i c a l l ya n dw a ss t a t i s t i c a lh i g h e rt h a ng r o u pna t1d a y , 1 w e e k , 2w e e k ，4w e e k ( p o 0 5 ) ，w h i l ei tb e g a nt od e c r e a s es i g n i f i c a n t l ya t4 w e e k a f t e rs a l i n ei n j e c t i o n ，t h ep 、wo fg r o u pn c h a n g e d l i t t l e 2b e f o r es t zi n j e c t i o n ，t h el e v e lo fb o d yw e i g h t s ，f a s t i n gb l o o dg l u c o s e 5 英文摘要 a n d5 0 p a ww i t h d r a wt h r e s h o l dh a dn os t a t i s t i c a ld i f f e r e n c eb e t w e e n d i a b e t i ca n dc o n t r o lg r o u p s t oc o m p a r ew i t hc o n t r o lg r o u p ，t h el e v e lo f f a s t i n gb l o o dg l u c o s ei nd i a b e t i cg r o u pi n c r e a s e dd r a m a t i c a l l ya t3 ，5 ，7w e e k a f t e rs t z i n j e c t i o n ( p o 0 5 ) ，w h i l ei ta s l oh a ds i g n i f i c a n ts t a t i s t i c a ld i f f e r e n c e c o m p a r e dw i t hi tw a sb e f o r es t zi n j e c t i o n ( p o 0 5 ) b o d yw e i g h t sa n d5 0 p a w w i t h d r a wt h r e s h o l dd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya f t e rs t zi n j e c t i o ni nd i a b e t i c g r o u p ( p o 0 5 ) ，a n da s l ot h e yh a ds i g n i f i c a n ts t a t i s t i c a ld i f f e r e n c ec o m p a r e d w i t ht h e yw e r eb e f o r es t z i n j e c t i o nq o 0 5 ) 3t oc o m p a r ew i t hc o n t r o l g r o u p ，i m m u n o r e a c t i v i t y f o rg a b a m r e c e p t o r si nt h es p i n a lc o r dd o r s a lh o r no fr a t sw i t hd i a b e t i cn e u r o p a t h i cp a i n s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da t3 ，5 ，7w e e ka f t e rs t zi n j e c t i o n ( p o 0 5 ) ，a n di t b e g a nt od e c r e a s ea t7w e e k , b u ti ts t i l lh a ds t a t i s t i c a ld i f f e r e n c ew i t hc o n t r o l g r o u p ( p o 0 5 ) t h em r n a l e v e lo fg a b a b , r e c e p t o r ss t a t i s t i c a ld e c r e a s e da t 7w e e ka f t e rs t zi n j e c t i o n ( p o 0 5 ) ，w h i l et h ep r o t e i nl e v e lo fg a b a m r e c e p t o r sh a ds t a t i s t i c a l d i f f e r e n c e 、历mc o n t r o lg r o u pa t5a n d7w e e k ( p 1 6 7 m o l l ( 成功率为8 2 ) ，为糖尿病模 型，其余1 6 只大鼠空腹血糖 1 6 7 m o l l 被剔除实验。7 4 只糖尿病大鼠继续 观察1 周后( 即s t z 注射后2 周) ，利用v o nf r e y 针测定大鼠的p w t ，p w t 小于4 9 为糖尿病神经病理性痛大鼠；其余1 0 只正常大鼠腹腔注射相同体积 的生理盐水( c 组) ，用于s t z 注射的对照组实验。实验分为两部分： 第一部分( 行为学实验) ：随机取糖尿病神经痛模型( d m ) 大鼠3 0 只，鞘内置管后观察两天，其中2 3 只大鼠未出现神经症状( 置管成功率为 7 7 ) ，7 只出现下肢运动异常，被剔除实验。根据鞘内注射药物不同，2 0 只d m 大鼠随机分为两组( i l - l o ) ：b 组：给予l o 山的巴氯酚( b a c l o f e n ) o 5 肛g ；n 组：给予相同容积的生理盐水。鞘内注射连续7 天( 1 次天) ，于 注射前、注射完后1 天( s t z 注射后3 周) 、l 周( s t z 注射后4 周) 、2 周( s t z 注射后5 周) 、4 周( s t z 注射后7 周) ，分别测定两组大鼠的5 0 缩足反应 阈值( p w t ) ，并比较其变化。 第二部分：随机另取3 0 只糖尿病大鼠( d 组) 及l o 只正常大鼠( c 组) 进行形态学及分子生物学实验。确定3 个测量及取材点，分别为注射s t z 后3 周、5 周、7 周。根据时间点不同，将3 0 只d m 大鼠分为3 组：d 3 、d 5 、 d 7 ，每组l o 只。分别于注射后3 周、5 周、7 周测量各组大鼠的体重、空腹 血糖及5 0 缩足反应阈值，然后取材。d 组所取材的实验大鼠需p w t 1 6 7 m o l l t 2 】的大鼠为成功糖尿病大鼠模型。 5 行为学测定 根据c h a p l a n 等【3 119 9 4 年报道的“u p a n d d o w n ”方法，将大鼠置于金属网 上，盖以透明的有机玻璃罩。首先让大鼠适应环境1 5 m i n ，待大鼠梳理和 探究活动基本消失后，用一系列标准化的v o nf r e yh a i r s 垂直刺激大鼠后 肢足底中部，使其弯曲成s 形，持续6 8 s ，观察缩足反应，大鼠在刺激时 间内或在移开v o nf r e yh a i r s 时立即出现快速的缩足反应，记为阳性反应， 而身体活动引起的缩足反应不记做阳性，直至出现第一次阳性和阴性( 或 阴性和阳性) 反应的骑跨，再向下连续测定4 次。如测试完最小或最大力度 的v o nf r e yh a i r s 均不出现阳性反应，则大鼠的5 0 缩足反应阈值算作0 2 5 9 或1 5 9 。应用d i x o n ( 1 9 8 0 ) 【4 】报道的方法推算出5 0 缩足反应阈值。5 0 缩足 反应阈值采用下列公式计算：5 0 缩足阈值( g ) - - 1 0 【舯蚓，其中x 伪末次 应用的v o nf r e yh a i r s 的力度的l o g 值，6 为相邻y o nf r e y 探针力度l o g 值之间 差值的平均值( 即o 2 2 4 ) ，k 为阳性和阴性反应类型的查表值。1 5 9 是本法可 能达到的最大5 0 缩足反映阈值，0 2 5 9 是本法可达到的最小5 0 缩足阈 值。本研究中5 0 缩足阈值低于4 9 的大鼠列为糖尿病神经痛大鼠。 6 鞘内给药方法 大鼠s t z 注射2 周后，腹腔注射戊巴比妥钠4 0 m g k g ，无菌条件下逐层 分离皮肤及棘上和棘间韧带，暴露k 5 间隙，将p e 1 0 管置入到脊髓蛛网膜 下腔，置管长度3 5 c m ，当出现典型的鼠尾摆动或有脑脊液流出后即封住 外口，并将其在皮下固定，以防脱落。待麻醉苏醒后，观察两天后，无下 肢瘫痪或其他运动功能损害的大鼠，先用2 5 1 a 微量注射器将2 的利多卡 因2 0 1 d 沿外i z l 注射，观察对大鼠下肢运动功能的影响，若出现麻痹状态， 表示鞘内置管成功。隔日将0 5 r t g 的b a c l o f e n 溶于10 1 a l 的生理盐水中，沿外 口注射入到大鼠脊髓蛛网膜下腔，每日一次，连续注射7 天。 7 观察指标 于注射s t z 前、注射后3 周、5 周、7 周测量d m 大鼠和正常大鼠体重及 研究论文 空腹血糖，并且利用v o nf r e y 针测定大鼠5 0 缩足反应阈值( p w t ) 。分别 于注射s t z 后3 周、5 周、7 n ，取相应时间点糖尿病大鼠组p w t 4 9 的大鼠 及正常组大鼠各6 只，3 只用于免疫组织化学染色，另3 只用于r t - p c r 及 w e s t e r nb l o t t i n g 法，检测大鼠脊髓背角g a b a b l 受体的免疫阳性神经元细胞 数和m r n a 水平及蛋白含量。 8 实验方法 8 1 免疫组织化学染色 8 1 1 标本取材 大鼠腹腔注射l 戊巴比妥钠4 0 m g k g ，麻醉后迅速开胸经左心室至升 主动脉插管，先以1 0 0 m l 生理盐水洗去血液，随后用含4 多聚甲醛的磷酸 缓冲液( o 1 m o l l ，p h 7 4 ) 先快后慢灌注固定1 h ，然后取胸腰段膨大处脊髓， 于4 多聚甲醛固定液中固定1 周，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡 包埋，切片厚5 岬。 8 1 2 实验步骤 1 ) 切片脱蜡至水( - - 甲苯5 m i n x 2 次，无水酒精1 m i n ，9 5 酒精l m i n ) 2 ) 磷酸盐缓冲液( p b s ) 5 m i n x 3 次 3 ) 擦干切片，滴，j 1 1 3 的h 2 0 2 封闭内源性过氧化物酶，3 7 。c 孵育15 m i n 4 ) p b s 液洗5 m i n x 3 次 5 ) 滴加一抗g a b a b r l ，1 ：3 0 0 稀释，4 。c 孵育过夜 6 ) 次日，p b s 液洗5 m i n x 3 次 7 ) 滴加二抗为非生物素化的羊抗兔血清3 7 c 孵育4 0 m i n 8 ) 蒸馏水洗5 m i n x 3 次 9 ) 滴加新鲜配置的d a b 液，镜下控制显色 1 0 ) 自来水冲洗终止显色 1 1 ) 苏木素复染细胞核2 m i n 1 2 ) 梯度酒精脱水，二甲苯透明2 m i n x 2 次 1 3 ) 中性树脂封片 为保证免疫组化染色的特异性，以p b s 代替一抗溶液作为阴性对照实 验，其余染色步骤( 包括滴加二抗溶液) 完全相同。 8 2i m p c r 实验 8 2 1 标本取材 研究论文 取材前手术器械高压消毒。大鼠1 戊巴比妥钠4 0 m g k g 麻醉后，冰上 操作，快速胸腰段膨大处脊髓，液氮充分研磨后，5 0 1 0 0 m g 组织加入 t r n z o l 总r n a 提取试剂l m l ，吸入冻存管中，置于8 0 冰箱中保存。 8 2 2 实验步骤 8 2 2 1 样品r n a 的抽提 1 ) 取冻存脊髓组织，室温放置5 分钟使其完全溶解。 2 ) 两相分离：每l m l 的t r i z o l 试剂裂解的样品中加入0 2 m l 的氯仿，手动 剧烈振荡管体1 5 秒，呈乳糜状在冰上静置1 5 m i n 。4 0 c 下1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟。r n a 全部被分配于无色上层水相中。 3 ) r n a 沉淀：将水相上层转移到无r n a 酶的离心管中，加等体积异丙醇 混合以沉淀其中的r n a ，混匀后置于2 0 。c 冰箱2 h ，4 0 c 下1 2 0 0 0 r p m 离心 l5 分钟。r n a 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 4 ) r n a 清洗：移去上清液，每1m 1 t 砌z o l 试剂裂解样品中加入至少l m l 的7 5 乙醇，清洗r n a 沉淀。混匀后，4 0 c 下1 2 0 0 0 r p m 离一i 二, 1 0 分钟。 5 ) r n a 干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使r n a 沉淀在室温空气中干燥 5 1 0 分钟。 6 ) 溶解r n a 沉淀：溶解r n a 时，先加入无r n a 酶的水1 0 9 l 用枪反复吹打 几次，使其完全溶解，获得的r n a 溶液待用。 8 2 2 2 r n a 质量检测 1 ) 紫外吸收法测定浓度测定及纯度：先用蒸馏水将分光光度计调零， r n a 溶于1 0 9 ld e p c 水中，取2 u l 上样，点击软件按钮，显示样品的浓度。 i 斟a 溶液的a 2 6 0 a 2 8 0 的比值即为r n a 纯度，比值范围1 8 n 2 1 。 2 ) 变性琼脂糖凝胶电泳测定：1g 琼脂糖溶于10 0 m l d e p c 水配置的i * t a e 溶液制胶；取l u l r n a ，与l u l 上样b u f f e r 缓冲液充分混合，上样前凝胶须 预电泳5 m i n 。1 0 0 v 电压下2 5 m i n 。 8 2 2 3 样品c d n a 合成 1 ) 反应体系 序号反应物剂量 1r n a 模版 1 - 5 u g ( r n a 浓度) 2 o l i g o ( d t )2 1 x l 3d n t p 2 1 x l 研究论文 4m d t t l u l 5r n a 酶抑制剂0 5 u l 6逆转录 4 山 7 s c r i p tm m l v l u l d e p c 水补足至总体积2 0 9 l ，6 0 0 0 r p m 短暂离心。 2 ) 混合液在加入逆转录酶m m l 之前先7 0 干浴5 分钟，冰水浴至管内外 温度一致，然后加4 7 号反应物，4 2 水浴5 0 m i n 。 3 ) 取出后9 5 干浴3 分钟，逆转录终溶液即为c d n a 溶液，一8 0 0 c 保存。 8 2 2 4 样品的管家基因( g a d p h ) p c r 1 ) 管家基因反应体系： 序号反应物剂量 1 2 * t a qm a s t e r m i x5 山 2 内参照上游引物f 0 5 1 x l 3内参照下游引物r 0 5 “1 4阳性模板d n a 1 山 5d d h 2 0 3 “l 总体积为1 0 9 l ，6 0 0 0 r p m 短暂离心。r e a l t i m ep c r 仪上进行p c r 扩增反应。 反应条件为：9 5 5 m i n 预变性，3 1 个p c r 循环( 9 4 3 0 s ；5 8 3 0 s ； 7 2 3 0 s ) ；7 2 延4 申5 m i n 。 2 ) p c r 产物与d n a l a d d e r 在l 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测 p c r 产物是否为单一特异性扩增条带。 8 2 2 5 样品的g a b a b 基因p c r 1 ) 所有c d n a 样品分别配置实时定量p c r 反应体系 序号反应物剂量 1 2 * t a qm a s t e r m i x5 m 2 阳性模板上游引物f0 5 山 3 阳性模板下游引物ro 5 山 4阳性模板d n a 1 “1 5d d h 2 0 3 b t l 总体积为1 0 山。轻弹管底将溶液混合，6 0 0 0 r p m 短暂离心。 2 ) 将配制好的p c r 反应溶液置于r e a l t i m ep c r 仪上进行p c r 扩增反应。反 研究论文 应条件为：9 5 5 m i n 预变性，3 1 d p c r 循环( 9 4 c3 0 s ；5 8 。c3 0 s ；7 2 3 0 s ) ；7 2 延伸5 分钟。 3 ) p c r 产物与d n al a d d e r 凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测p c r 产物是否 为单一特异性扩增条带。 8 2 2 6 胙p c r 使用引物列表 引物设计软件：p r i m e rp r e m i e r 5 0 ，并遵循以下原则：引物与模板的 序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物 不在模板的非目的位点引发d n a 聚合反应( 即错配) 。 g a d p h ( 3 3 0 b p ) 上游引物：5 - g a t g g g t g t g a a c c a c g a g a a a t - 3 ； 下游引物：5 - a c g g a t a c a t i g g g g g t a g g a a 3 ； g a b a b l ( 2 5 4 b p ) f o r w a r d ：5 - a g c t g a c c a g a c c t t g g t c a r _ 3 ； r e v e r s e ：5 a a c t g g c t t c t c c c t a t g t g g 3 。 8 2 2 7 电泳 各样品的目的基因和管家基因分别进行r e a l t i m ep c r 反应。p c r 产物 与d n al a d d e r 凝胶电泳，e b 染色，检测p c r 产物是否为单一特异性扩增 条带。 9w e s t e r nb l o t t i n g 实验 9 1 标本取材 大鼠腹腔注射1 戊巴比妥钠4 0 m g k g ，麻醉后直接迅速提取胸腰段膨 大处脊髓，置于相应标记的冻存管中投入液氮中快速制冷，用消毒过的手 术刀片沿脊髓正中线小心地将脊髓背角切下，然后放8 0 低温冰箱中保 存。 9 2w e s t e r nb l o t t i n g 法实验步骤 9 2 1 总蛋白提取 1 ) 将大鼠脊髓背角置入遇冷的r i p a 裂解液中，加入蛋白酶抑制剂p m s f ， 在冰水混合物条件下研磨匀浆。 2 ) 4 c 下1 2 0 0 0 9 离。t , 5 m i n 。 3 ) 离心后取上清液，即得组织总蛋白溶解液，在8 0 条件下分装保存。 9 2 2 总蛋白浓度测定( b c a 法) 研究论文 1 ) 蛋白分析液a 液与b 液按体积以5 0 ：1 混合为c 液。 2 ) 用p b s 将试剂盒中标准浓度蛋白( 2 m