细菌的分型及其检测技术PPT课件.ppt

1,第四章细菌的分型及其检测技术,.,2,表型分型技术,基因分型技术,色谱与质谱技术,细菌自动化鉴定技术,血清学分型、生物化学分型、噬菌体分型、细菌素分型、耐药谱分型等,质粒图谱分析、聚合酶链式反应技术、核糖体分析、染色体酶切物脉冲场凝胶电泳分型、序列分型、多位点序列分型技术等。,细菌分型,气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳技术、飞行质谱技术等。,自动细菌鉴定和药敏分析系统。,3,主要内容,4,一、概述二、细菌噬菌体分型的一般原则三、噬菌体的分离、纯化与增殖技术四、细菌的噬菌体分型技术五、噬菌体分型优缺点（自学）,5,噬菌体(bacteriophage;phage)是一类能感染细菌、放线菌、真菌、螺旋体等微生物的病毒，属于专性细胞内寄生的微生物。自然界分布广泛，凡有细菌的场所，均可能存在相应的噬菌体。,一、概述,6,噬菌体的基本形态,7,根据与宿主菌的关系分类,8,9,液体培养基中固体培养基上噬菌体在细菌鉴定与分型方面的应用,噬菌体与宿主菌共培养,澄清,噬斑,噬菌体的作用具有种特异性，一种噬菌体只能裂解一种或与该种相近的细菌；噬菌斑的形态、大小和透亮度的不同，可用于鉴定细菌的型别。,10,(1)细菌型别与分型噬菌体裂解特异性稳定，分型结果重复性好。(2)噬菌体具有较高分型效率，能够区分菌株间的细微差别，能满足流行病学研究的需要。(3)操作方法简便易行，实验耗时短，结果记录简明。(4)方法应能标准化，以利结果的比较。(5)所用噬菌体应易于获得较高效价，能较长时间保存，噬斑清晰、大小适中，使之便于观察和准确记录。,二、细菌噬菌体分型的一般原则,11,（一）噬菌体分离,三、噬菌体的分离、纯化与增殖技术,制备菌悬液,噬菌体富集培养,制备裂解液,噬菌体确证试验,接种适量样品，12-24h,离心，上清过滤除菌，滤液无菌试验,平板均匀涂布一层菌液，干燥后，表层布5-7点，滴加滤液，一点生理盐水，培养观察噬斑,12,（二）噬菌体纯化,稀释裂解液,制备噬菌体与敏感菌混合管,培养,纯化,10-1至10-55个稀释度的噬菌体各0.1ml+0.2ml对数菌液，5min,选取噬斑较分散的平板，挑取典型噬斑，接种至含菌体培养液中过夜增殖噬菌体。分离纯化单斑3次，至平板噬斑形态大小一致,制备底层琼脂平板,制备上层琼脂平板,各稀释度混合管+3ml半固体培养基，均匀覆盖平板表层,13,（三）噬菌体的增殖、保存,1、噬菌体增殖,2、去除菌体,3、噬菌体的保存,液体增殖法：定时加入对数期菌体固体增殖法：同时加大菌体和噬菌体的浓度,细菌滤器法和三氯甲烷法,冷藏保存：无需防腐剂，分装后7d，不宜超过4w冷冻干燥：2年,14,（四）噬菌体的效价和裂解谱的测定,1、噬菌体效价的测定,噬菌体效价：是指1ml液体中所含的活噬菌体的数量。用噬斑形成单位（plaqueformingunit,PFU）表示。单位：PFU/ml;测定方法：双层琼脂平板法,15,2、常规试验稀释度测定,噬菌体的常规试验稀释度(routinetestdilution,RTD)：是将噬菌体进行10倍系列稀释，各稀释度噬菌体溶液点在宿主菌涂布的斑点上，经培养后，能产生仅次于融合性裂解（CL）的最高稀释度。RTD测定意义：高浓度噬菌体会对宿主菌产生裂解外观，为避免噬菌体对细菌这种非特异性破坏，使分型噬菌体显示最高的特异性，将噬菌体间的交叉反应降到最低，建议使用RTD或称为临界试验稀释。RTD与PFU关系，均是噬菌体效价的计量单位。受噬斑大小的影响，一般的RTD约含1X106pfu/ml,16,3、裂解谱,裂解谱是指一种噬菌体的作用范围。即确定该噬菌体在种内或属内的广谱性，在种外或属外的交叉反应性。裂解模式是指各种细菌培养物被几种噬菌体作用而出现的特殊的反应模式，不同的细菌，可呈现不同的反应模式。裂解谱和裂解模式一般用噬菌体原液进行试验，效价在103105RTD或1091011PFU/ml之间。分型试验一般用1RTD的噬菌体。,17,制备菌悬液,菌液涂布平板,选点滴加不同噬菌体,不能混有杂菌,直接涂布或双层琼脂平板,斑点滴定的结果记录如下:融合性溶解程度:融合性溶解(CL)、次融合性溶解(CL)、半融合性溶解(SCL)、次半融合性溶解(SCL)、融合性不透明溶解，中心混浊，菌苔厚(OL)。单个噬斑:大(L)即1.5mm、正常(N)约1.0mm、小(S)0.11.0mm、细小(m)0.1mm、微小()。细小和微小均仅能用放大镜观察。噬斑的数量:05(-)、620()、140(+)、4160(+)、61120(+)、120(+)。,四、细菌噬菌体分型技术,18,细菌素(bacteriocin)是某些细菌产生的蛋白质类抗菌物质，这种物质仅对与产生菌亲缘关系近的细菌有抗菌作用，而对产生菌本身不敏感。如大肠菌素、绿脓菌素、蜡样芽胞杆菌素等。抗生素抗菌素是细菌、真菌等微生物在生长过程中为了生存竞争需要而产生的化学物质,这种物质可保证其自身生存,同时还可杀灭或抑制其它微生物。细菌产生的有多粘菌素、抗菌肽等。,一、概述,19,细菌素特点抗菌范围很窄，在治疗上应用价值不大，但可进行细菌分型和流行病学调查。细菌素分型方法利用不同型别的细菌素产生菌测定试验菌的细菌素敏感模式（检测未知菌）利用已知对不同型别细菌素敏感的菌株作为指示菌，测定试验菌产生细菌素的模式,20,（一）待测菌对细菌素敏感模式分型试验方法（绿脓菌素为例）,绿脓菌素制备,绿脓菌素敏感试验,细菌素分型试验,有清晰抑菌圈，圈内无菌落者为完全抑菌;抑菌圈中尚有部分菌落为不完全抑菌;无抑菌圈表示该菌对此种绿脓菌素不敏感。,二、细菌素分型方法,待测菌铺满平板，干燥后加细菌素标准品，观察抑菌圈。,21,（二）平板交叉划线分型法适用于细菌素产生量不多的细菌已知细菌素产生菌划线接种培养基，培养24-48h无菌水冲洗掉菌苔，放置2cm*2cm滤纸片，滴加三氯甲烷，灭菌多种待测菌株与原产细菌素菌株成垂直交叉划线接种，培养24-48h，观察交叉点上是否有菌生长，判定待测菌菌型。,22,（三）待检菌产生细菌素对指示菌敏感模式分型方法方法同平板交叉划线分型法已知细菌素产生菌划线接种培养基，培养24-48h无菌水冲洗掉菌苔，三氯甲烷熏蒸灭菌多种细菌素敏感的指示菌依次垂直交叉划线接种，培养24-48h，观察交叉点菌生长情况，判定产生细菌素试验菌菌型。,23,一、概述二、纸片扩散法三、稀释法四、结核分枝杆菌药敏试验,24,细菌的药物敏感试验(drugsusceptibilitytest)是指在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌能力的试验，简称药敏试验。药敏试验方法纸片扩散法、稀释法、抗生素浓度梯度法（E-试验法）、联合药敏试验、自动化检测法、分子生物学方法等。,一、概述,25,（一）基本原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。,二、纸片扩散法（K-B法）,26,(二)培养基和抗菌药物纸片,1抗菌药物纸片：商品化，选择直径为6.35mm，吸水量为20l的专用药敏纸片，用逐片加样或浸泡方法使每片含药量达规定要求。含药纸片密封贮存于超低温冰箱。2培养基：水解酪蛋白（M-H）培养基是兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，4保存。,27,1.在琼脂平板上挑取形态相同的菌落45个，接种于35mLM-H肉汤中，36培养48h，与标准比浊管比较，可用肉汤或生理盐水稀释至与0.5麦氏标准比浊管浊度相同2.在15min内，用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后涂布于M-H琼脂平板上（注意：涂布要均匀、致密），待干3.镊子灭菌冷却后，夹取不同药敏纸片，按一定间隔贴在平板的不同区域，即两纸片间距不小于24mm，纸片距平板边缘不小于15mm。36温箱培养1618h观察结果。,（三）试验步骤,28,29,（四）结果判断和报告用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。根据标准，作出“敏感”、“耐药”或“中介”的判断。,几种抗生素抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度,30,“敏感”（sensitive，S）：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制；“耐药”（resistant，R）：表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效。“中介”（intermediate，I）：表示测试菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使用高于正常给药量有疗效。,31,（五）质量控制,采用质控标准菌株和测试菌在同一条件下做药敏试验，质控菌株的抑菌圈在允许范围内，结果可信。目的：检查试验条件（如培养基、含药纸片和接种菌量）、操作技术等是否合格质控标准菌株：大肠杆菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212、金黄色葡萄球菌ATCC25923等,32,稀释法是体外定量测定抗菌药物抑制细菌生长活性的方法，所获结果比较准确，常被用作校正其他方法的标准。原理是用一系列不同浓度的药物与等量细菌作用，找出能抑制细菌生长的最低浓度或杀灭细菌的最低浓度，其结果用最小抑菌浓度(MIC)或最小杀菌浓度(MBC)表示P101。分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。,三、稀释法,33,肉汤稀释法,1234567891011,34,1234567891011,35,1234567891011,36,特殊性：结核分枝杆菌生长缓慢，在细菌生长之前药物已扩散而无法影响细菌的生长。方法：绝对浓度法、比例法、放射测量法等。绝对浓度法:是我国实验室普遍使用方法。将浓度递减的药物与等量培养基混合制成含药培养基，不含药培养基为对照，分别接种待测菌和标准菌，培养4w，菌落数多于20个为阳性（据此判定MIC）。受试菌与标准菌MIC的菌落数比值2判为敏感，8为耐药。比例法：WHO、国际防痨和肺病联合会推荐的标准方法。将不同稀释度的待测菌接种于相同浓度的含药培养基，检测耐药性。,四、结核分枝杆菌药敏试验,37,一、核糖体分型二、脉冲场凝胶电泳分型三、序列分型四、多位点序列分型技术,38,实质：核酸探针杂交分型技术。核糖体RNA（rRNA）基因最为保守，在基因组上存在多个拷贝，以rRNA基因片段为探针，检出含有rRNA基因的DNA片段，通过分型杂交后的rRNA指纹图，进行菌种分型和近源菌株的鉴定。原理：样本DNA经酶切消化，凝胶电泳分离片段，转印到膜上进行Southern印迹杂交分析。以rRNA基因片段为探针，杂交产生菌株特异性的DNA指纹图，与平行样本或数据库进行比对达到分型目的。,一、核糖体分型,39,40,实验过程探针的设计：一般以16SrRNA和23SrRNA作为探针，现已商品化菌体的分离培养与DNA提取菌体DNA酶切及电泳Southern印迹杂交,全自动微生物核糖体基因分型系统。优点是高效简便、快速、以标准化；缺点是费用高。,41,脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术是细菌分型较灵敏的方法，通过检测染色体上所有酶切位点的变化，反映全部基因的相关性，提供可靠的基因分型依据。优点：重复性好，分辨力强，是基因分型的“金标准”，在识别和追踪医院感染暴发和流行上具有实用价值。与普通凝胶电泳区别：普通电泳分离DNA分子的上限是50Kb，而PFGE能分离10-800kb的DNA片段。,二、脉冲场凝胶电泳分型,42,PFGE分型原理是将细菌包埋于凝胶块中，用溶菌酶和蛋白酶K消化菌体和蛋白质，释放完整的染色体DNA，采用稀有切点酶酶切DNA，产生有限数目的高分子量限制性片段。在特定的电泳系统中，定时改变电场方向，反复循环，使DNA在凝胶网孔中呈曲线泳动而得到分离，形成特定的电泳条带图谱。不同菌株的电泳图谱具有高度特异性，染色后目测形成的片段条带，而识别特异的菌株。,43,44,操作步骤,细菌菌株的培养,结果处理,凝胶块制备,菌体裂解,胶块洗涤,脉冲式电泳,酶切,45,46,47,原理：通对待测菌的全基因序列进行分析，与GENEBANK中的已知序列进行比较，实现分型。方法：Sanger双脱氧链终止法、化学修饰法、自动测序技术,三、序列分型,48,定义：是高通量测序技术和群体遗传学结合的产物，通过测序技术揭示保守基因的等位基因突变，实现对病原菌的分型与鉴定。特点：简便易行，重复性好，且可通过网络实现实验室间数据共享和比较。,多位点序列分型技术（MLST）,49,原理,50,分析方法,51,步骤,52,MLST和PFGE分型技术比较,53,色谱法或称层析法是一种物理或物理化学的分离分析方法，是多组分混合物分离分析的最重要分析方法。在所有色谱体系中都包含两大部分，即流动相和固定相，以液体为流动相者称为液相色谱(LC)，以气体为流动相者称为气相色谱(GC)。色谱和质谱通过对细菌代谢组和蛋白质组分析，进行细菌鉴定。,54,气相色谱法可分为气-液色谱(GLC)和气-固色谱(GSC)。前者是分配色谱，后者是吸附色谱。特点：高分离效能（短时间同时分离测定复杂组分混合物）高选择性（能分离分析性能极为相似的物质）高灵敏度（痕量分析10-11-10-13g，甚至一个细菌代谢物）高分离速度（一个分析周期几分钟至十几分钟）定量结果准确易于自动化应用范围广,一、气相色谱法在细菌学研究中的应用,55,气相色谱法与传统实验方法区别：不需细菌分离培养过程，通过对细菌组成成分和分解代谢产物分析，鉴定细菌科、属、种、株。鉴定时不需活菌。,56,气相色谱法鉴定细菌的途径：分析细菌细胞裂解产物分析细菌细胞的酸性或碱性条件下的水解物分析培养物中的挥发性产物，如气体、酸、醇分析培养物中的代谢产物分析细菌培养基质降解代谢产物分析细菌在血清、临床标本或生物制品中的活力,57,气相色谱法在细菌学检验中的应用：分析细菌细胞成分（如分析菌体脂肪酸，鉴定菌体亲缘关系）分析细菌在体外培养物中的代谢产物（如厌氧菌产生的短链脂肪酸色谱图、需氧菌的有机酸色谱图等）临床标本中检出和鉴定细菌（如检测脑脊液中的乳酸，对细菌性脑膜炎做出明确诊断等）热裂解气相色谱法鉴定细菌（将样品干燥高温裂解，碎片色谱图鉴定微生物，如沙门菌属十种血清型鉴别）高分辨气相色谱法分析冷冻条件下细菌的挥发性有机产物（鉴定引起冷冻品腐败的微生物）,58,液相色谱法基于混合物中各组分对固定相和流动相亲和力的差异分离组分的。,二、液相色谱法在细菌学研究中的应用,59,60,分类,1、按吸附力分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶渗透色谱和离子色谱等2、按固定相分液固色谱、液液色谱和键合相色谱（正常相色谱法和反相液相色谱）。,61,反相高效色谱法根据菌种间某些特征大分子的结构、大小、电荷分布等方面存在的固有差异对菌体进行快速鉴别（如对分枝杆菌细胞壁脂质中分枝菌酸进行分析，根据色谱图鉴别菌种）。变性高效液相色谱技术（DHPLC）：近年来发展起来的一种快速、灵敏、准确、高通量筛选DNA序列变异的基因检测技术，被广泛应用于临床基因诊断、突变检测、分型鉴别等诊断检测中，也适合于大批量检测环境或食品样品中的致病微生物的靶基因。,62,毛细管电泳(CE)，又叫高效毛细管电泳或毛细管分离法，是八十年代问世的一种高效的液相分离方法，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。即以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，根据样品各组分迁移速度和分配上的差异而进行分离。,三、毛细管电泳在细菌学研究中的应用,63,传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：1、采用了内径在25100m，外径300400m的毛细管，使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高2、采用了高达数千伏的电压，电场推动力大，使柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，,1、CE技术要点,64,2