（生物化学与分子生物学专业论文）发酵分离耦合系统高产丁醇的工艺优化研究.pdf

发酵分离耦合系统高产丁醇的工艺优化研究 生物化学与分子生物学专业 研究生王鑫昕指导教师李维教授李寅研究员张延平博士 摘要近年来研究发现丁醇是种很有潜力的新型生物燃料，性能优于燃料乙 醇，可与汽油任意比混合，有着广阔的应用前景。丁醇可由发酵法生产，但由于高 浓度丁醇对生产菌自身产生毒害作用，导致生物法生产丁醇产量和生产率较低，生 产成本较高。解决这一问题的关键是要提高从原料到丁醇的转化率、丁醇的产量以 及生产强度。可采用的技术包括微生物耐溶剂分子机制的改造，提高菌株对高浓度 丁醇的耐受性；或者构建丁醇发酵和产物提取工艺的耦合系统，在发酵过程中g t 醇原位分离出去，以提高生产率降低生产成本。 本研究通过冷模实验、毒性实验和小瓶厌氧发酵确定了发酵- 觏耦合的主要工 艺参数：以玉米培养基为底物3 7 静置发酵7 2h ，于2 4h 、按1 ：5 相比( 有机相： 水相) j n 3 , 油- 2 0 0 , 4 癸醇为有机相的发酵参数；小试发酵将发酵萃取工艺与气提技 术耦合到_ 起，综合前述发酵条件确定了从2 4h 至发酵终i 匕持续通入流速为0 3 l d m i n 的氮气进行气提一n a r - 发酵耦联工艺。利用该工艺，发酵7 2h 丁醇和总溶剂产 量分别为1 6 3 9g t , 和2 4 4 0g t , ，比传统发酵分别提高了5 1 4 8 和3 5 7 1 ，丁醇在 总溶剂中的比例和底物转化率分别从传统发酵的6 0 1 8 和7 5 9 1 提高到6 7 1 7 和 9 1 9 3 ，丁醇萃取率也达到6 2 3 4 的较高水平。 为对发酵底物利用情况和产物生成情况进行分析建立了相应的测定方法。斐林 试剂法测定的总糖含量可用于确定发酵底物转化率，h p l c 法和生物传感器法测定 的葡萄糖含量可了解发酵动态过程中葡萄糖的代谢隋况；所建立的h p l c 法和g c 法可分别对丙酮丁醇发酵水相溶液和有机相中的产物进行分析测定，方法准确快速 操作便捷，且在国内尚无报道。 气提- 萃取- 发酵耦联工艺降低了产物丁醇对生产细胞的抑制毒害作用，一定程度 上初步解决了丁醇的低产量和生产强度及低底物转化率的问题，初步显示出在工业 化生产丁醇体系的应用潜力。 关键词：丁醇丙酮丁醇发酵产量底物转化率分离发酵耦合工艺 i i s t u d i e so f c o u p l i n gs y s t e m b e t w e e ns e p a r a t i o na n da c e t o n e b u t a n o l f e r m e n t a t i o nt oa c q u i r eh i g hy i e l do f b u t a n o l m a j o r ：m o l e c u l a rb i o l o g ya n db i o c h e m i s t r y m a s t e ro fs c o e m c ec a n d i d a t e ：w a n gx i n x i n s u p e r v f i s o r ：p r o f l iw e i ，p r o f l iy m d r z h a n gy a n p i n g t h e s ed a y s ，i th a sb e e nf o u n dt h a tb u t a n o li sap o t e n t i a lb i o l 9 9 i c a lf u e lw h i c hh a sb e t t e r p e r f o m m e et h a ne t h a n o la n dc a nb em i x e dw i t hg a s o l i n ei na n yp m p o r t i o n , s ob u t a n o l p o s s e s s e sg o o da p p l i e dp e l 删v e t h em e t h o do f b i o l o g i c a lf e r m e n t a t i o nc a l lb eu s e df o r p r o d u c t i o no fb u t a n o l , b u td u et ot h et o x i c i t yo fh i g hc o n c e n t r a t i o no fb u t a n o lt o m i e r o o r g a l a i s m s ，y i e l da n dp r o d u c t i v i t yb yb i o l o g i c a ll ：m o d u c t i o na r el o w , a n dc o s ti sh i g h t h ek e yo fr e s o l v i n gm e t h o di s 缸l c n 强s eo fc o n v e r s i o nl a t ef i o mi a wm a t e r i a lt ob u t a n o l , y i e l da n dp r o d u c t i v i t yo f b u t a n 0 1 t h ea d o p t i v et e c h n i q u e sc o n c l u d em o l e c u l a rm e c h a n i s m a l t e r a t i o nt om a k et h eb a c t e r i u me n d t l r e 俄i c 时o fb u t a n o l , o rt oh e i 蜘t h ep r o d u c t i v i t y a n dr e d u c ec o s t s c o u p t i n gs y s t e mo f j ns i t ub u t a n o ls e p a r a t i o na tt h ef e r m e n t a t i v ep r o c e s si s f o rf e r m e n t a t i o na n dp r o d u c t se x t r a c t i o n b yt h ec o l de x p e f i m e mt o x i ct r i a la n df e n n e n t a t i o ni ns e r u mb o t t l e ，m a i nt e c h n i c s p m a m e t e r sf o rc o u p l i n gs y s t e mb e t w e e nf e r m e n t a t i o na n de x t v d c 矗o na l ee s t a b l i s h e d c o m m a s hi sf e r m e n t e da tt h et e m p e r a t u r eo f3 7 w i t h o u t a g i t a t i o nt i l l7 2l a a n da tt h el i m eo f 2 4ho l e y l - 2 0 d e c a n o la l c o h o li sa d d e da st h eo r g a n i cp h a s ea c c o r d i n gt ot h ep h a s er a t e b e t w e e np h a s ea n da q u e o u sp h a s eo f1 ：5 f e r m e n t a t i o ni nf e r m e n t o ri n t e g r a t e se x t f a c t i v e f e r m e n t a t i o nt e c h n i ca n dg a ss t r i p p i n gt e c h n i c ，a n da s c e r t a i np e r s i s t e n tf l o wr a t eo f0 3 l m i nn 2t ot h ec o i nm a s hf r o m2 4 ht o7 2ht o c a r r y o n g a s i i i s t f i p p i n g - e x t l a c t i o n - f e r m e n t a t i o n t h eg a ss t r i p p i n g - e x t r a c t i o n - f e r m e n t a t i o nt e c h n i cg e t 1 6 3 9g lo ff i n a lb u t a n o ly i e l da n d2 4 4 0 班o fs o l v e n t sy i e l d , h e i g h t e n i n g5 1 4 8 a n d 3 5 7 1 s e p a r a t e l yt h a nt h ec l a s s i c a la b ef c n 1 1 c n t a f i o n ；b u t a n o lp e r c e n t a g ei nt h et o t a l s o l v e n t sa n dc o n v e r s i o nr a t eo fr a ws e p a r a t e l ya r ep r o m o t e dt o6 7 17 a n d9 1 9 3 f r o m 6 0 1 8 a n d7 5 9 1 ，a n dt h ee x t l a c t i o nr a t ef o rb u t a n o la l s oa c h i e v e st ot h eh i g h e rl e v e lo f 6 2 3 4 t oa n a l y z et h ec o n v e r s i o nf r o ml a wt op r o d u c t s ，m e a s u r i n gm e t h o d sa r es e tu p o v e r a l l s u g a rc o n t e n tm e a s u r e dc a n b eu s e dt oa s c e r t a i nc o a v e r s i o nr a t e ，g l u c o s ec o n t e n tm e a s u r e d b ym e t h o do fh p l ca n d b i o s e n s o rw i l lh e l pt oc o m p r e h e n dm e t a b o l i s mo fg l u c o s ei nt h e d y n a m i cc o l g s eo ff e r m e n t a t i o n , a n dh p l c a n dg cm e t h o d sw h i c ha l en o tr e w r t e di n t h e p a s tw o u l dh e l pm e a s u r ep r o d u c tc o n c e n t r a t i o n si n t h ea q u e o u sa n do r g a l l i cp h a s ee x a c t l y , s w i f t l ya n dc o n v e n i e n t l y g a ss t r i p p i n g - e x - w a c t i o n - f e r m e n t a t i o nt e c h n i q u er e d u c e sf e e d b a c kt o x i c i t yr e s u l t i n gf r o m p r o d u c to f b u t a n o lt ob a c t e r i u m , a n dt oac e r t a i ne x t e n tr e s o l v e st h ep r o b l e mo fl o wy i e l d a n dp r o d u c t i v i t y , l o wc o n v e r s i o nr a t e ，a n dt h et e c h n i q u es h o w s 印p l i 谢v ep o t e n t i a l i n d u s t r i a l i z e ds y s t e mt op r o d u c eb u t a n 0 1 k e y w o r d s ：b u t a n o la c e t o n e - b u t a n o lf e r m e n t a t i o ny i e l dc o n v e r s i o nr a t eo f r a w s e p a r a t i o na n df e r m e n t a t i o nt e c h n i q u e i v 表目录 表卜1 丁醇与甲醇、乙醇及汽油的性能指标比较2 表卜2 常见的有机溶剂及其1 0 9p o w 值9 表2 1 不同发酵时间丁醇、丙酮和乙醇的产量3 7 表3 一l 不同发酵工艺下各物质产量4 5 表3 2 不同发酵工艺下丁醇在总溶剂中的比例4 7 表3 3 丁醇生产强度和总溶剂生产强度表4 7 表3 4 底物转化率4 8 表4 1 标准混合储备液及标准混合液浓度表5 1 表4 2 标准混合溶液浓度表5 2 表4 3 糖含量检索表5 3 表4 4 丁醇等6 种物质的线性回归方程5 6 表4 - 5 标准混合液样品的相对标准偏差5 6 表4 6 标准混合溶液样品的空白加标回收率5 7 表4 7 丁醇加标回收率实验结果( n = 9 ) 5 8 表4 8 丁醇、丙酮和乙醇的线性回归方程6 1 表4 - 9 发酵样品的加标回收率和相对标准偏差6 l 表4 一1 0 各方法测量糖含量结果6 3 v i l 图目录 图2 1 不同有机相对混合溶液i i 中丁醇的萃取率3 1 图2 - 2 不同有机相对混合溶液i 中丁醇的萃取率3 1 图2 - 3 不同有机相分别对混合溶液i i 中丁醇、丙酮和乙醇的萃取率3 2 图2 - 4 不同有机相分别对混合溶液i 中丁醇、丙酮和乙醇的萃取率3 3 图2 - 5 不同相比下丁醇的萃取率3 4 图2 - 6 厌氧r c m 培养基为水相的两相稳定青况瓶3 5 图2 - 7 1 0 s t r i d i 沏a c e t o b u t y y c u ms m b l 的4 8h 生长曲线3 6 图2 - 8 发酵萃取后丁醇、丙酮和乙醇的产量3 8 图2 _ 9 发酵萃取后丁醇和总溶剂的产量3 9 图2 - 1 0 发酵萃取后丁醇、丙酮和乙醇的产量4 0 图2 - 1 1 发酵萃取后丁醇和总溶剂的产量4 0 图3 - 1 不同萃取工艺下丁醇和总溶剂产量4 6 图3 - 2 不同工艺条件相对传统发酵的丁醇和总溶剂产量提高百分比4 6 图4 - 1 标准混合液的高效液相色谱图5 5 图4 _ 2 实际样品的高效液相色谱图5 7 图4 - 3 丁醇等标准品气相色谱图6 0 图4 _ 4 丁醇发黼相气相色谱图6 0 图4 - 5 单糖的旧l c 图谱6 2 v i i i 四川师范大学学位论文独创性及 使用授权声明 本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师奎箜垫撞! 奎塞盟宝亟垒趱谴 一指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 本人承诺：已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容致。如因不符而引起 的学术声誉上的损失由本人自负。 本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥有学 位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生必须按学校规定提交印刷版和电子 版学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库供检索：2 ) 为教学、 科研和学术交流目的，学校可以将公开的学位论文或解密后的学位论文作为资料在 图书馆、资料室等场所或在有关网络上供阅读、浏览。 本人授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数 据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作糍：王厦 签字日期：2 0 0 9 年5 月1 0 日 导师签名： 黼期7 钼徊 第一章文献综述 1 能源危机和生物丁醇 广泛使用的化石能源作为能源支柱支撑着世界经济的发展，然而，据世界能量储 量的综合估算，这经济的资源载体将在2 l 世纪匕半叶接近枯竭。化石资源日益缩减， 以石油资源为主要瓶颈的能源危机不断爆发，均对世界经济造成巨大影响；自2 0 0 7 年 下半年以来，全球能源短缺更为明显，特别是石油、煤炭、天然气、粮食等价格大幅 度飙升，推动全球生产成本大幅度e 升，最终造成全球性的通货膨胀和经济增长速度 放缓。此外，石油资源的利用对自然环境也造成不同程度的污染和破坏，温室效应、 酸雨、大气悬浮颗粒等等，都与燃料的使用不无关系。 迫于全球能源危机和保护生态环境的压力，中国为经济的健康长久发展选择走可 持续发展的道路，选择大力发展新能源作为解决出路。生物燃料作为类似于风能和太 阳能等的新能源，以其清洁、低廉的优点，成为最具潜力的石油能源的取代者，并吸 引了中国政府乃至世界各国政府政策指导下的投资开发。 生物丁醇作为种新生物燃料，与源自石油炼制的运输燃料相比具有显著的环境 突延益，能减低温室：气体的环境羽 改；生物丁醇的蒸汽压力低，与汽油混合对水的宽容 度大，适合在现有燃料供应和分销系统中使用；与现有的生物燃料相比，生物丁醇与 汽油的混合比更高，无需对车辆进行改造，而且混合燃料的经济性更高；生物丁醇原 料低廉，粮食发酵法生产丁醇的技术在石油紧缺后重显优势，因此，符合国家能源安 全的长远战略考虑。 2 丁醇的性能、用途和生产方法 正丁醇俗称1 一丁醇，分子式：c 4 n l o o ，c h 3 ( c h 2 ) a o h ，英文简写为n - b u t a n o l ， 或1 - b u t a n o l ，或n - b u t y la l c o h o l ，为无色液体，有酒精昧，相对密度0 8 1 0 99 恤，熔 点一9 0 2 c ，沸点1 1 7 7 。c ，可与乙醇、乙醚及其它多种有机溶剂混溶。蒸汽与空气 形成爆炸性混合物，爆炸极限1 4 5 1 1 2 5 ( 体积) 。 正丁醇( 以下简称丁醇) 是种重要的化工原料，主要用于制造邻苯二甲酸二 丁酯和脂肪族二元酸丁酯类增塑剂，广泛用于各种塑料和橡胶制品的生产。丁醇还 可用来生产丁醛、丁酸、丁胺和醋酸丁酯，它们可用作树脂、油漆、粘接剂的溶剂， 也可用作油脂、药物和香料的萃取剂及醇酸树脂涂料的添加剂。近年来美国科学家 的研究表明，丁醇还是一种极具潜力的新型生物燃料。与甲醇和乙醇相比，丁醇在 性能上与汽油更为接近( 如表1 所示) ，并且不会腐蚀管道，便于管道输送，蒸汽压低， 安全性高，且能与汽油以任意比混合，引起了研究者和企业的兴趣。2 0 0 6 年6 月2 3 日杜邦公司宣布，他们将与英国b p 公司合作开发燃料丁醇项目，一期工程拟建设以 甜菜为原料、年产3 万吨燃料丁醇的生产装置，并在英国市场上用丁醇来替代汽油 作为车用燃料。 表卜1 丁醇与甲醇、乙醇历铲舀曲的性能指标e 匕较 t a b 1 - 1c a p a b i l i t yc o r r 噼t f s o nb e t w e e nb u t a n o la n dm e t h a n o l , e t l m o l , g a s o l i n e 丁醇可由化学合成法和发酵法生产。化学合成法的主要路线包括两条，一是以 丙烯为原料，经羰基合成法生成正、异丁醛，加氢后分馏得到正丁醇；二是以乙醛 为原料，经醇醛缩合成丁醇醛，脱水生成丁烯醛，再经加氢后得到正丁醇。发酵法 则是以粮食为原料，经发酵获得丙酮、丁醇、乙醇( 质量比3 ：6 ：1 ) ，再经精馏后分 别制得丙酮、丁醇和乙醇。 3 发酵法生产丁醇的研究现状 自1 8 6 1 年巴斯德首次发现细菌能够产生丁醇、1 9 1 2 年魏兹曼_ ( w e i z m a m ) 发现 了种梭菌c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m 能够将淀粉转化为丙酮、丁醇及乙醇后【，工 业上主要用两株野生菌c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u ma t c c8 2 4 及c l o s t r i d i u mb e i j e r i n c k i i 2 n c i m b8 0 5 2 进行丙酮丁醇发酵生产丁醇。丙酮丁醇发酵法( a b e 发酵) 生产丙酮 丁醇曾经是仅次于乙醇发酵的全球第二大发酵工业。1 9 4 5 年二战末期，在美国仍有 - - 分2 _ - - 的丁醇和十分之一的丙酮是用发酵法生产的。二战后丙酮丁醇发酵逐步走 向衰落，原因主要有两方面。首先，石化工业发展迅猛，到5 0 年代后期，发酵法与 化学合成法之间的竞争已变得非常尖锐。其次，糖蜜开始大量用作家畜饲料，导致 糖蜜价格e 涨，发酵成本显著上升。2 0 世纪7 0 年代早期的能源危机和由此导致的 石油化工产品价格不断上涨，使得丙酮丁醇发酵重新获得人们的重视，激发科研领 域的研究兴趣。 丙酮丁醇工业发酵中溶剂对微生物细胞的毒性，是影响溶剂产量的个关键限 制因素。在所生产的丁醇、丙酮和乙醇三种溶剂中，丁醇是毒f 生最大的。当其浓度 达到1 3g l ，发酵就基本停止，造成低丁醇产量和低底物转化率。若继续维持发酵 就必需不断的稀释发酵液，这导致回收丁醇的成本较高。因此，为解决丁醇生产成 本的核心问题丁醇的产量、丁醇对底物的转化率、以及底物的价格，过去2 0 年 中，围绕着丁醇产生菌的筛选、丁醇合成的分子遗传机制和调控、高丁醇比菌种改 造、发酵原料的替换、发酵和提取工艺等方面，国内外学者开展了广泛、深入的研 究，为大规模实现丁醇生物制造奠定了基础。这里重点介绍丁醇的发酵和提取进展。 3 1 丁醇发酵工艺研究进展 由于丁醇的毒性，在反应器中丁醇浓度达到1 3g 几时，发酵不得不终止。此外， 发酵基质为稀淀粉液和糖液也需要较大的容器。这些问题的存在，限制了发酵法生 产丁醇的发展。在生物丁醇分批发酵过程中，般反应器中细胞浓度小于4g “1 匀， 由于极低的细胞浓度以及产物的抑制作用使反应器的生产强度很低，小于0 5 0g l h 。 例如cb e i j e r i n c k i ib a l 0 1 分批发酵7 2h ，可产生1 8 3 3g l 的总溶剂，丁醇的产量较 高约为2 0g lz 蛉1 7 j ，是报道的分批发酵最高的产量，但是生产强度很低，只有0 3 4 - 0 4 6 g i h 。高浓度的基质般会对细胞产生毒性，工业e 主要采用补料分批发酵的方法 来解决这一问题。分批补料发酵初始基质浓度较低，产物抑制减弱，使得细胞浓度 和丁醇的生产强度均有所提耐1 8 1 。目前，为了提高反应器的细胞浓度和增强反应器 生产强度，已经研究开发的发酵工艺有：连续发酵、固定化细胞连续反应器、膜细 胞循环反应器等。 3 1 1 分批、补料分批和连续发酵 以碎玉米、玉米淀粉、麦芽糊精和葡萄糖作为基质，用cb e i j e r i n c k i ib a l0 1 分 批发酵7 2h ，可产生1 8 3 3g 几的总溶剂。溶剂的总浓度虽然较高，但是生产强度很 低( 0 3 4 舶璺蚴1 ) 。高浓度基质会对细胞产生毒性，工业上采用补料分批发酵的方 法来解决这一问题。由于基质初始浓度降低，产物抑制减弱，使得细胞生长和丁醇 的生产强度均有提耐吲。丁醇连续发酵可以获得更高的生产强度，如cb e i j e r i n c k i i b a l 0 1 连续发酵生产丁醇，生产强度可达1 7 4g l h 3 。存在的问题是经过长时间发 酵后，菌株的产酸量会上升，而溶剂产量则下降。单级连续系统可以实现高生产强 度，但这是以相对于分批发酵而言的低产物浓度为代价的，因此单级连续系统不适 用于工业规模。美国一项专利u s 5 ，7 5 3 , 4 7 4 采用两级发酵生产丁醇。第级发酵罐 生产丁酸，第二级发酵罐生产丁醇。在稀释率为3 5h - 1 下，生产强度可以达到3 0 鲫j h ，对玉米原料的转化率已经接近理论值( o 3l 溶剂l 唱玉米) 。在俄罗斯，类似的 多级发酵系统( 7 11 个系列发酵罐) 己成功通过中试和大规模试验。我国华北制药厂也 采用4 级连续发酵生产丁醇。 3 1 2 固定化细胞连续反应器 反应器的高生产强度源于高细胞浓度。补料从底部进入管状反应器，产物从项 部流出，从而实现连续发酵。该类型系统通常为非混合型反应器，产物抑制显著减 弱。为提高反应器生产强度，将cb e i j e r i n c k i i 吸附到粘土颗粒匕将细胞固定，生产 强度可达1 5 8 妍a ，表明固定化细胞连续反应器可以通过提高生产强度，增加经济 优势。 3 1 3 膜细胞循环反应器 在该类型系统中，细胞浓度可超过10 0g ，l 。然而，为保持细胞生产率，反应器 需要以小于稀释速率1 0 的速率抽出小部分培养物。生产强度n - j j 2 生6 5g l h 1 9 1 。尽 管已经开发出优质膜，发酵液引发的膜污染仍然是一个待解决的主要问题。 3 2 丁醇提取工艺研究进展 蒸馏是回收丁醇最简便的方法。从丁醇合成来看，丁醇的毒性导致产品发酵水 4 平较低，丁醇的浓度_ 般为1 3 1 89 包。再由于丁醇的沸点e 冰高( 1 1 8 0 c ) ，因此用蒸 馏法回收丁醇能耗较高，蒸汽消耗占整个生产动力成本的7 0 0 d e a ；。对蒸馏法从发 酵液中回收丁醇的经济性进行评估后发现，如果丁醇的浓度从1 0g t 提高到4 0g l ， 所耗能量可以a g d - 几个数量级。为减小丁醇回收费用，已开发出一些新的回收工艺， 如反渗透、全蒸发、膜蒸发，液液萃取、吸附及汽提等冽，各有优劣。这些技术可 以用于原位丁醇去除，以防止丁醇的浓度超过培养物对毒性的耐受度。随后，可以 通过浓缩( 气提或全蒸发) 或蒸馏翩方式，对丁醇进行回收。 3 2 1 汽提法 汽提法是在a b e 发酵中应用于丁醇原位提取的技术2 1 】。汽提法的原理是：当发 酵产生的气体( 0 晚和h 2 ) 或外界通入的n 2 经过发酵罐时，这些气体捕捉并冷却浓缩 发酵产物丁醇于另个容器后，又重新被循环利用回到发酵罐捕捉更多的丁醇，因 此，溶液组分被不断汽提到气相中，使产物抑制及时被消除。e z e j i 等利用c b e t e r i n c k i ib a l0 1 分批发酵丁醇，采用汽提法回收丁醇，比对照分批发酵中丁醇产 量提高了3 0 0 以上陧冽。采用发酵耦联汽提的方法回收丁醇较为简单，但是需要 通入外源气体和大量强冷凝水，能耗也是相当高的。 3 2 2 液液萃取法 液液萃取法就是通常将与水不互溶的有机萃取剂与发酵液混合在起。因丁醇 在有机相中l k 在_ f _ g , n 中溶解度大；因此丁醇可以有选择的浓缩在有机相中。然后将 萃取相与发酵液分离，萃取相可经精馏或反萃取使溶剂得到再生而循环使用，同时 也得到发酵的最终产物丁醇等。发酵萃取分离技术不但消除了产物对微生物的抑制 作用，还将能大大提高丁醇的产率。 萃取工艺合适的有机溶剂一定要满足以下要求：对生产的菌种尽量无毒( 生物 相容性) ；与水相不互溶；对发酵产物选择性分离，且分离系数较大；有机相总量使 用量尽量少，有机溶剂成本低廉；与发酵培养基非乳化。其中，生物相容性常成为 限制性因素。在所常用的萃取剂中油醇萃取效果最好，而且其相对低毒性使之成为 种好的萃取齐衅2 4 】。液液萃取法虽然操作简便，但是有几个问题是不容忽视的，例 如萃取剂对细胞的毒性，溶媒的损失以及微生物菌体在发酵液和萃取剂液面的聚集 a 蓝 寸o 3 2 3 渗透萃取法 为了解决液液萃取的瓶颈，些研究者研究出了种新的回收工艺一一渗透萃 取泓2 5 1 ，即采用种膜将萃取剂和发酵液分开，膜提供了一个表面区域使不相溶的 两相交换丁醇，在两相间没有直接接触，因此能显著的减少萃取剂的毒性和细胞在 水相一有机相界面的聚集等不利因素。在这种系统中，丁醇将优先通过膜扩散，而 其它成份，如醋酸和丁酸仍留在水相中圈。丁醇萃取速率主要依靠通过膜的速率。 但是由于膜本身的一些| 生质限制了丁醇提取速率。如，膜耐酸、碱、耐有机溶剂的 性能，膜的化学稳定性、膜的机械强度、膜孔径大小以及膜抗微生物污染的能力等 因素。与传统的分离技术如蒸馏、吸附、萃取等相比，膜分离技术具有高效、低能 耗、环保等优点，具有较多的优势。 3 2 4 渗透蒸发法 渗透蒸发是一种效率高、能耗低、投资少的新型膜分离技术。它是利用液体混 合物中各组分在膜中的吸附、溶解、扩散性能的不同而实现组分分离的膜过型a 7 卜2 7 】。 当发酵液流经渗透蒸发透醇膜单元时，a b e 组分优先透过膜，因此，膜透过侧为 a b e 的浓缩液，而发酵液中其余物质均保留在原发酵液中，回流到发酵体系；从渗 透蒸发透醇膜单元获得的a b e 浓缩液进入渗透蒸发透水膜单元，该单元可使a b e 浓缩液中水优先透过膜，从而在该单元的上游侧获得高浓度( 9 9 ) 的a b e 产品， 而透过膜的水进一步被循环回发酵体系再利用。此外，据报道，采用渗透蒸发技术 分离丁醇发酵液比传统的蒸馏法节能9 0 ，从而可以有效解决目前丁醇发酵生产中 产品分离能耗过大，经济性差的瓶颈性难题。此外，在发酵渗透蒸发分离耦合过程 中，渗透汽化单元仅将发酵产物和极少量水分离排出，而发酵液中的其它组分( 菌 体、培养基、供发酵用营养成分以及大部分水等) 仍留在发酵液中，并循环回发酵 体系，从而，可以提高原料利用率，并有效减少水的用量，同时降低废水的产生。 但是膜的质量、性质、价格等特点可能会成为制约其发展的瓶颈。 4 细菌的有机溶剂耐受机制 随着人们对环境保护和资源可持续性的高度关注，生物法生产乙醇、1 , 3 丙二醇、 6 丁醇、丙酮等大宗化学品的研究日益受到政府、学术界和产业界的重视但是工业化 生产要求的较高浓度代谢产物对生产菌株的生长和代谢具有较强的抑制作用，大大 限制了生物法生产的效率，提高了综合生产成本。而在生物法治理环境过程中，微生 物也不可避免的接触到各种有机溶剂，如何保持微生物在这些环境中的生理活性也 是首要问题。因此，研究这些有机溶剂对细胞的毒害作用机制以及细胞的耐受机制， 对于提高工业微生物尤其是溶剂生产菌和毒性有机物降解菌的工业适应性，极具必 要性。另外，在精细化工生产中，生物酶1 6 】或全细刺1 7 1 被广泛应用于日常工业、石油 处理和表面活性剂的生产中，然而，在这些生物转化过程中，有机溶剂对催化细胞或 酶的毒性成为生物催化过程中的重要障碍【1 8 - 2 4 ，并促使在有机溶剂耐受菌或溶剂耐 受酶的研究领域不断寻求新的解决途径、获得更新进展2 删。 1 9 8 9 年，关于菌种p s e u d o m o n a s p u t i c l a 的溶剂耐受现象的报遭刈，开辟了人们对 微生物有机溶利耐受机制理解的纪元。陆续发现的有机溶剂耐受菌是类能够在饱 和有机溶剂环境中、可以依赖体内的某些细胞组分和酶发挥独一无二的溶剂适应机 制而正常生存的极端微生榭”1 。有机溶剂耐受菌是菌种在长期接触毒性物质如自然 毒性物质、内生代谢终产物、或来自人类活动产生的毒| 生物质等，自然进化而成的特 殊菌群。对这些菌群的生理功能的研究成果为菌种改造提供了新的思路。国外已有关 于细菌的有机溶剂耐受机制的综趔2 弛吲，而国内的研究刚刚起兰萨7 】。在已有相关报 道的基础上以下概述了通过参数1 0 9 尸衡量有机溶剂进入并积累在细胞膜匕难易程 度的方法及不同溶剂对细胞的毒性作用机制；进而总结了细菌的溶剂耐受机制，从 细胞膜组成变化、细胞的形态变化、胞内溶剂的降解和泵出、一般的胁迫反应等辅 助机制角度进行了分析：并简要介绍本课题组利用一般胁迫反应从特定环境样品中 筛选到丁醇耐受菌和提高现有菌株溶剂耐受性方面的研究希望为提高工业菌株的 工业适应性提供借鉴。 4 1 有机溶剂对正常细胞的毒性作用机制 s i n g e r 掣3 8 1 在1 9 7 2 年提出生物膜的流动镶嵌模型结构特征是：生物膜的骨架 是磷脂双分子层，双层磷脂极i 生头部分别排列在双分子层的内、外表面与极性分子 有一定的亲和性，两层磷脂分子的尾部酰基长链分布于磷脂极性头部内侧，与非 极性分子有一定的亲和性，蛋白质分子以不同的方式镶嵌于磷脂双分子层中，细胞 7 膜的表面还有糖类分子，形成糖脂、糖蛋白；生物膜的内外表面上脂类和蛋白质的 分布不平钒反映膜两侧的功能不同；脂双层具有流动性，其脂类分子可以自由移动， 蛋白质分子也可以在脂双层中横向移动。 研究发现有机溶剂接触到细胞后，首先进入细胞膜，溶剂对细胞的毒害作用是 从溶剂结合在磷脂双分子层上开始的圈，同时，细胞膜的磷脂双分子层结构也是溶 剂毒| 生作用的主要靶点 2 2 3 2 3 5 。普遍接受的有机漪u 对细菌的毒害作用机制的观点是： 溶剂积累在细胞膜上后，使膜对质子和其他离子的渗透| 生增犬3 9 1 ，质子动力消削引， 能量传导失刘) 渊，进而，增大的细胞渗透l 生也会使细胞内p h 控制受到影响阎，胞 内大分子的渗透( 如r n a , 磷脂和蛋白质) 【3 5 1 ；插入在细胞膜匕的溶剂也会通过影响 膜的理化性质，影响膜嵌蛋白活性嗍( 如质子- k + 泵【3 5 唧，同时也可能会改变膜结构， 产生更大的膜的流动性【刎，接下来微生物代谢可能会被阻断，生长抑制，走向死 亡。总乞溶齐瞄入膜后，扰乱了膜的有序性，使膜作为渗透屏障和蛋白嵌入平台的 功能减弱，渗透| 生、流动性和无序l 生增大的细胞膜使微生物难以抵御溶剂的毒害作用 甚至走向死亡。 已有研究表明，不同有机溶剂进入并积累在细胞膜上，对细胞的临界毒性浓度 几乎是相同的，约为2 0 0m m o l 4 1 】。因此 不同溶剂对微生物的毒性作用与其进入 细胞膜的难易程度直接相关。研究表明，对于全细胞生物转化的两相系统1 4 2 j ，在 l l o gp o 啊 4 5 时，溶剂在细胞膜7 k 2 _ 间的分配系数和溶剂在辛醇水模型中的分配 系数有较好的相关性，有机溶剂从水相进入到细胞膜上的过程，可以用下面的模型 描述【4 3 1 ：l o gp 州w = 0 9 7 k 喀一0 6 4 。其中尸n 炯表示溶剂在细胞膜和水之间的分配 系数；表示溶剂在辛醇和水之间的分配系判2 3 1 ，1 0 9 即表示溶剂的疏水恺3 5 j ， s a r d e s s a i 和b h o s l e l 3 3 】总结了常见有机溶剂及相应的l o g ，如表1 所示。由此可用 有机溶剂的疏水性衡量其对细胞的毒性作用程度 3 5 3 6 1 ；而且，细胞膜上的溶剂浓度 取决于水相中的溶剂浓度和溶剂的疏水性，所以如果知道了水相中的浓度，细胞膜 中有机溶剂的浓度就可以计算了【j 2 】。 表1 - 2 常见的有机溶剂及其l o g 艮值嘲 t a b 1 - 2o r g a n i cs o l v e n t sa n d t h e i r 崦v a l u e s 换算可知，能够致使全部生物活性丧失的水相中溶剂的临界浓度嘞蚴可以表 示为：l o gs d v o g 勤h 明广o 9 7 1 0 9 ，旬6 4 。其中，勤帕，绷为溶剂在细胞膜中的临界 浓度，约为2 0 0m m o l l 【4 1 1 。由此l o g 值在1 到4 5 间的有机溶剂，1 0 9 值越小， 其对应的水溶液中的浓度越大就越容易达到临界浓庞因而，体现此溶剂毒性较大 【3 3 】。而l o g 大于4 5 的物质水溶性非常差在细胞环境中溶解度很小，很难引起毒 性。 另外，溶剂依赖自身的疏水性进入并结合在双分子层不同位点。溶剂在细胞膜 上结合的不同位置对膜结构的影响是不同的o 种溶剂在临近极性头部附近结合时， 产生膜的无序性效果将会大于深深结合于磷脂脂肪链中心的溶剂产生的膜的无序性 效果p 卅。烷醇( 了1 哮、辛醇、十二烷醇、十四烷醇) 和烷烃在细胞膜匕的结合位置已分 别由w e s t e r m a n 等1 4 4 】和p o p e 等1 4 5 】通过潮寸线、核磁共振技术( 1 虾很，e p r ) 得到证实。 结果表明，两性分子如烷醇将其水合部分靠近磷脂分子极性头部，脂肪链部分插入 在磷脂脂肪链之间，且也确实观察到4 种烷醇中丁醇造成了最严重的细胞膜脂甘油 骨架无序性的现剩删。非两性化合物如烷烃不与极| 生头部结合只深嵌入磷脂双分 9 子层内，将自身与磷脂脂肪长链平行排彳锎。而一些对微生物有高毒性的芳香化合 物，如4 氯代甲苯也已经通过卜心偶证实是结合在靠近极| 生头部的脂肪链蚓。 4 2 细菌对有机溶剂的耐受机制 溶剂是否对某种微生物产生毒害作用，不仅取决于此溶剂的内在毒性，也取决 于遗传决定的菌种自身对此溶剂的耐受作用刚。甲苯是非常强的生物毒性有机溶齐i j ， 可以杀死大多数微生物，然而，1 9 8 9 年，发现p s e u d o m o n a sp u t i d a 可以在含有高达 s o ( v t o 的甲苯或更高浓度的环己胺、二甲苯、苯乙烯和庚醇培养基中存洱捌。同 时，i n o u e 等捌首次提出了以疏水性量化参数l o g 来，艟p p u t h a 溶剂耐受菌的临 界点位p u m a 能耐受的最大极| 生的溶剂l o g 值为2 3 2 4 ) ，从而确定菌种的溶剂 耐受性。由此每一种微生物的耐受水平都可以由2 个术语定义：指示溶剂 鲥v 删( 即微生物所能耐受的毒性最大的溶剂) 和指示溶剂值( 指示溶剂的l o g 偷【3 3 】。 a k i r a 之后，许多研究开始致力于揭示溶剂耐受菌的独特性质。耐受菌的适应性 定义为自身不经过遗传改造而在细胞的生理或构成上进行改变，使菌体达到与环境 相适应的性厨3 2 】。这种能使菌种在一定溶剂中存活的可能适应机制主要有：1 ) 细胞膜 的变化：耐受菌中细胞蒯i i 页反异构酶催化的顺反异构反应( 快速机制) 和长期驯化过 程导致的饱和脂肪酸比重及磷脂头部变化( 长期耐受机制) ，这两种机制在细胞膜层 次上为细胞的耐受机制发挥了基础性的作用；2 ) 细胞内的溶剂降解和泵出机制也为 细菌抵御溶剂胁迫作出进一步的贡献；3 ) 细胞外膜和细胞形态的变化所进行的补充 作用，以及细菌般的胁迫反应也发挥着重要的作用。微生物可能通过采取以上若干 种机制的结合实现在有机溶剂存在条件下的生存。 4 2 1 细胞膜的有机溶剂耐受机制 微生物的细胞膜，不仅形成了调节细胞与外环境间物质进入通道的渗透屏酣3 2 】， 对细胞内能量传导有着特殊的意义i 翻，而且不同的细胞膜结构直接影响到微生物的 溶剂耐受| 生。细菌接触有机溶剂后，应对于环境的物理化学胁迫可在细胞膜匕进行 调节的可能耐受适应机制主要有：细胞膜不饱和脂肪酸的顺一反异构化和增大的饱和 不饱和脂肪酸的比率，及磷脂极i 生头部的变化。其中，顺反异构作为一个短时反应 1 0 为细胞膜匕其余2 个长期机制赢得了时间，共同抵消了由于溶剂毒害作用造成的膜 的流动性和渗透性，增强了细胞膜的坚固性【镐】。 4 2 1 1 不，饱和脂肪酸的顺一反异构化 对于细胞膜脂肪酸来说顺式不饱和脂肪酸酰基链在双键位置上的角度约为3 0 0 使空间原子间形成阻碍，膜脂难以紧密排列；相比之下，与饱和脂肪酸有相似的原 子效应的反式脂肪酸在双键位置上的角度约为醴可以使脂肪酸链构象延展细胞 膜包裹更加紧密、有序增大了细胞膜的密度，减，j , - - c 细胞膜的流动性刚。 正常条件下，顺式构象在不饱和脂肪酸的构象中占大多数，许多反式构象的不 饱和脂肪酸是在菌体遭遇有机溶剂后，体内本身存在的顺式脂肪酸的一部分，经由 顺反异构酶c 垃催化为反式结构【5 1 】。已证实顺式不饱和脂肪酸异构化为反式构象的 反应是不需要耗能的、独立于细胞生长的、无需从头合成的过程因此，顺反脂肪 酸异构化非常快捷，在甚至不允许细胞生长的环境条件下，都可以即时发生i 刈。 与没有溶剂存在相比接触有机溶剂厩多种p s e t 砌m o n a s 础f f 如中，都发现了 j 恻i 回反脂肪酸比例增大的现象这些有机溶剂主要包括苯酚、4 一氯苯酚、甲苯、二 甲苯等 铖受捌。加入甲苯后，溶剂耐受菌p 蚴