（遗传学专业论文）halobia+spaj5+bop基因克隆与表达和嗜盐古菌基因组进化分析.pdf

浙江人学博i ：学位论文摘要 摘要 本研究从h a l o b i f o r m al a c i s a l s i a j 5 菌株中成功克隆到6 叩基因全长。该 基因的获取通过六次p c r ：扩增保守序列一次，扩增5 旁侧序列两轮，扩 增3 旁侧序列两轮，拼接序列全长验证一轮。这是h a l o b i f o r m a 属中第一次 报道b o p 基因的存在，拓展了b o p 基因存在的多样性。同时这也是第一次在 嗜盐菌科的耐碱菌株中报导b o p 基因。序列比对和蛋白质疏水性分析显示 了a j 5b o p - 与其他b o p 基因相一致的功能保守位点。分子进化树揭示了a j 5 6 印的进化位置，与h a l o t e r r i g e n as p a r g 4 中6 印具有8 5 一致性。在全反式 视黄醛存在的条件下，带有a j 5b o p 基因的重组大肠杆菌细胞膜变为深紫 色，该紫膜的最大吸收峰在5 4 0a m ，区别于已报道的嗜盐古菌紫膜最大吸 收峰5 6 8a m ，以及重组大肠杆菌紫膜最大吸收峰5 5 5n m ，说明a j 5b o p 表 达产物具有作为光敏存储材料的潜力。 嗜盐古菌利用b o p 基因对日光中可见光加以利用的同时，紫外线会对 细胞形成一定的损伤。通过研究嗜盐菌科( h a l o b a c t e r i a c e a e ) 中 h a l o b a c t e r i u ms p n r c 1 和其他成员的基因组双核苷酸和蛋白质组氨基酸 组成，以及四核苷酸分布，从多角度整合分析嗜盐菌科的紫外线辐射耐受 性。较低的相邻双嘧啶使用帮助嗜盐古菌从基因组组成上降低了光产物形 成的可能性。另一方面，在嗜盐古菌蛋白质组中易受活性氧攻击的氨基酸 基团使用频率也显著降低，这也可帮助嗜盐古菌降低辐射对蛋白质造成的 伤害。利用基因组结构对可能存在的错配修复机制进行检验。结果表明 h a l o b a c t e r i u ms p n r c 一1 以及其他极端嗜盐古菌( h a l o a r c u l am a r i s m o r t u i ， h a l o q u a d r a t u mw a l s b y i ) 通过优化其基因组和蛋白质组结构来降低生境中 高u v 辐射可能形成的损伤变异。 在基因变异中移码突变使其后编码的氨基酸序列产生显著变化。为了 对嗜盐古菌中移码突变研究进行铺垫，通过将本地b l a s t x 与本研究设计 的算法结合，对8 株大肠杆菌进行比较基因组分析，找n 8 个精确的移码突 变，包括基因的融合分裂位点等。结合转录组和蛋白质组等功能研究数据， 我们对这8 个移码突变发生的位点进行深入分析，其中2 个属于毒素一抗毒素 系统，1 个位于预测的限制性内切酶，1 个在逆境响应因子，1 个与菌体生 长相关，其余3 个功能未知。e c o l i 可利用移码突变机制作为失活特定基因 或者提供新的基因序列供进化选择。通过这些移码突变事件，我们可以推 测其生境中发生的改变以及细菌是如何适应这些改变的，或者说找到更适 合自身的生态位。最为重要的是这些事件可以作为进化研究的起点，来着 重观测产生的新序列是如何演化的，包括新功能的产生、消失，亦或功能 回复性突变。本研究使用的方法可被用于分析目前日益增多的原核生物基 因组序列比较分析，包括嗜盐微生物和嗜热微生物等，从而帮助我们理解 其是如何适应生境中复杂多变的选择因子。 关键词细菌视紫红质；h a l o b 帕r m a ；极端嗜盐古菌：辐射耐受性；进 化；大肠杆菌；移码突变 浙江人学博i ：论文a b s t r a c t a b s t r a c t an o v e lb o pg e n ew a sd e s c r i b e df r o mh a l o b i f o r m al a c i s a l s is t r a i na j 5 t ，a n e x t r e m e l yh a l o p h i l i ca r c h a e o ni s o l a t e df r o ma y a k e k u ml a k e ，c h i n a f o l l o w i n g s i xr o u n d so fp c r a m p l i f i c a t i o nb a s e do nt h ec o n s e r v e df r a g m e n to ft h eb o pg e n e ， t h ec o m p l e t es e q u e n c eo ft h eb o pg e n e ，i n c l u d i n gt h e5 a n d3 f l a n k i n gr e g i o n so f t h ec o n s e r v e d f r a g m e n t ，w e r e o b t a i n e d b y t h e l i g a t i o n - m e d i a t e d p c r a m p l i f i c a t i o n ( l p a ) a p p r o a c h t h ed a t ap r e s e n t e dp r o v i d e su sw i t hf u r t h e r i n s i g h ti n t ot h ed i s t r i b u t i o no fb o p l i k eg e n e si nt h ef a m i l yh a l o b a c t e r i a c e a e t h i si st h ef i r s te x a m p l eo fab o p - - l i k eg e n ei nh a l o p h i l e sf o u n di nt h eh i g h - p h e n v i r o n m e n t a l i g n m e n ta n dh y d r o p a t h ya n a l y s i so ft h ed e d u c e da m i n oa c i d s e q u e n c ei d e n t i f i e dt h ec o n s e r v e df u n c t i o n a ls i t e sa sw e l la ss o m ev a r i a t i o n s c o m p a r e dt oo t h e rb a c t e r i o o p s i n s m o l e c u l a rp h y l o g e n e t i ca n a l y s i sr e v e a l e dt h e p o s i t i o no ft h eb a c t e r i o - o p s i no f s t r a i n a j 5 ，w h i c hi s c l o s e s tt ot h a to f h a l o t e r r i g e n as p a r g - 4w i t h8 5 i d e n t i t y i nt h ep r e s e n c eo fa l l - t r a n sr e t i n a l ， r e c o m b i n a n te s c h e r i c h i ac o l ic e l l se x p r e s s i n gt h eg e n et u r n e dd a r kp u r p l e t h e p u r p l em e m b r a n ef r o mt h er e c o m b i n a n te c o l is h o w e dm a x i m a la b s o r p t i o na t 5 4 0n m t h eu l t r a v i o l e tc o u l dd oh a r mt ot h ec e l l ，w h i l et h eh a l o a r c h a e am a k eu s eo f t h ev i s a b l el i g h tb yb o pg e n e w eh a v ei n v e s t i g a t e dt h es t r a t e g yo fh a l o b a c t e r i u m s p n r c 一1a n do t h e rm e m b e r so ft h ef a m i l yh a l o b a c t e r i a c e a et os u r v i v eu v i r r a d i a t i o n ，b a s e do na l li n t e g r a t e da n a l y s i so fv a r i o u sg e n o m i ca n dp r o t e o m i c f e a t u r e ss u c ha sd i n u c l e o t i d ec o m p o s i t i o na n dd i s t r i b u t i o no ft e t r a n u c l e o t i d e si n 浙江人学博i j 学位论文a b s t r a c t t h eg e n o m ea n da m i n oa c i dc o m p o s i t i o no ft h ep r o t e i n s t h el o wd i p y r i m i d i n e c o n t e n tm a yh e l ph a l o b a c t e r i u m 。r e d u c ef o r m a t i o no f p h o t o p r o d u c t si n i t s g e n o m e t h eu s a g eo fr e s i d u e ss u s c e p t i b l et or e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sa t t i c ki s r e d u c e ds i g n i f i c a n t l yi nh a l o b a c t e r i u m ，w h i c hh e l p st h eo r g a n i s mt om i n i m i z e p r o t e i nd a m a g e w et h e nc o r r e l a t e dt h ee x p r e s s i o no ft h ez i mg e n ew i t ht h e g e n o m i cs t r u c t u r et or e e x a m i n et h ei m p o r t a n c eo ft h ep u t a t i v em i s m a t c hr e p a i r p a t h w a yp r o p o s e dp r e v i o u s l y o u rr e s u l t ss h o w e dt h a th a l o b a c t e r i u ms p n r c - 1 a n do t h e rh a l o a r c h a e a ( h a l o a r c u l am a r i s m o r t u i ，h a l o q u a d r a t u mw a l s b y i ) h a v e o p t i m i z e dt h e i rg e n o m i ca n dp r o t e o m i cs t r u c t u r e st or e d u c ed a m a g ei n d u c e db y u vi r r a d i a t i o n ，o f t e np r e s e n ta th i g hl e v e l si nh a b i t a t sw h e r et h e s eo r g a n i s m s t h r i v e i nt h et y p e so fm u t a t i o n s ，f r a m e s h i f ic o u l d c h a n g et h ec o d i n gs e q u e n c e d r a m a t i c a l l y b ye m p l o y i n gb l a s t xa n da na l g o r i t h md e v e l o p e db yu s ，w eh a v e d e t e c t e de i g h tf r a m e s h i f i sw i t h i ng e n o m e so fe s c h e r i c h i ac o l it of a c i l i t a t ef u r t h e r m i n i n go ft h ef r a m e s h i f ti nh a l o p h i l e s t w of r a m e s h i f i si n v o l v e dt o x i ng e n e s ，o n e o c c u r r e di nas t r e s sr e s p o n s eg e n e ，o n ei nap u t a t i v ee n d o n u c l e a s e ，o n ei nag e n e i n v o l v e di nm a i n t a i n i n gt h eg r o w t hr a t ew h e nc e l ld e n s i t yi s h i g h ，a n dt h e f u n c t i o n so ft h e r e m a i n i n gt h r e ew e r eu n k n o w n c o m b i n e dw i t hp r e v i o u s t r a n s c r i p t o m i ca n dp r o t e o m i cd a t a ，t h ef u n c t i o n so ft h eo r f si n v o l v e di n t h e f r a m e s h i f t sw e r ei n v e s t i g a t e d f r a m e s h i f im a yp r o v i d e r a p i d e v o l u t i o no f m i c r o b i a lp o p u l a t i o n s w ep o s t u l a t et h a te c o l iu s e sf r a m e s h i f ta sam e c h a n i s m f o rr a p i da d a p t a t i o n t h ea l g o r i t h m sa n d m e t h o d sd e v e l o p e di nt h i ss t u d ym a yb e a p p l i e dt oa n a l y z ef f a m e s h i f t si nh i g ht h r o u g h p u tp r o k a r y o t i cg e n o m i cs e q u e n c e s 浙江人学博1 ：论文 a b s t r a c t a n dh e l pt ou n d e r s t a n dh o wo r g a n i s m sa d a p tt om u l t i p l ee n v i r o n m e n t a lf a c t o r s w i t h i nt h e i rh a b i t a t s k e y w o r d sb a c t e r i o r h o d o p s i n ；h a l o b i f o r m a ；h a l o p h i l e s ；r a d i a t i o nr e s i s t a n c e ； e v o l u t i o n ；e s c h e r i c h i ac o l i ；f r a m e s h i f t 浙江人学博i ：学位论文目录 第1 章绪论 1 1 第一节细菌视紫红质 1 1 1 研究背景 嗜盐古菌( h a l o a r c h a e a ) 是生存于晒盐场、盐湖、腌制品等高盐环境中 的一类微生物，其生境中盐浓度可高达4 5 m 。目前分离得到的古菌菌株基本 都属于嗜盐菌科( h a l o b a c t e r i a c e a e ) ，分布于h a l o b a c t e r i u m ，h a l o f e r a x ， h a l o a r c u l a ，h a l o r u b r u m ，h a l o b i f o r m a 等属。由于其特殊的生境，人们很早就 开始了对嗜盐古菌的研究。 19 6 6 年o e s t e r h e l t 和s t o e c k e n i u s 在研究嗜盐古菌h a l o b a c t e r i u mh a l o b i u m 时发现了一种对光敏感的膜蛋白，命名为细菌视紫红质( b a c t e r i o r h o d o p s i n ， 简写为b r ) ( o e s t e r h e l td a n ds t o e c k e n i u sw 1 9 7 1 ) 。1 9 8 1 年d u n n 报道了编 码b r 的b o p 基因的d n a 序列和b o p 附近的序# l j ( d u n nr e ta 1 1 9 8 1 ) 。b o p 基因序列的发现加速了b r 蛋白质组装、折叠和关键功能位点的研究，并在 此基础上利用定点突变等方法改造出具有新特性的b r 蛋白质。每个细菌视 紫红质单体由一分子细菌视紫蛋白质( b a c t e r i o o p s i n ，b o ，由b o p 基冈编码) 和一分子视黄醛组成。b o 是由2 4 8 个氨基酸残基组成的肽链，分子量约为 2 7 k d ，该肽链在空间卷曲折叠形成7 条跨膜螺旋柱( 分别命名为a g ) ，其 间由露在膜外的短环状部分( 亲水区) 相互连接，n 端在细胞膜外侧，c 端 在细胞膜内侧。螺旋柱基本垂直于细胞膜。整个分子排列成一个弓形结构紧 紧围着色素团视黄醛，视黄醛以席夫氏碱的形式连接在2 1 6 位赖氨酸上( 位 浙江人学博 ：学位论文：h a l o b i f o r m as p a j 5b o p 幕冈克降j 表达和嗜盐古菌肇冈纽进化分析 于螺旋g ) ，处于靠近肽链c 端细胞膜内俱u ( l u e c k eh e ta 1 1 9 9 9 ；m u k o h a t ay e ta 1 1 9 9 9 ) 。 1 1 2b r 质子转运机理及应用 b r 具有光驱动质子泵的功能，它吸收光能将h + 由胞质内泵向胞外，把 光能转变为膜两侧的电化学能，在a t p 合成酶的作用下驱动a t p 的合成。 由于质膜良好的绝缘性，多个b r 进行质子转运产生的宏观效果是细胞内外 形成3 0 0 m v 的跨膜电势。质子转运其大致过程为：在光的激发下，b r 第9 6 位上的天冬氨酸将质子传递给视黄醛的氮原子，质子化的全反式视黄醛异构 化成1 3 顺式视黄醛；l 中间体时期，通过基团的轻微运动将质子传递到第 8 5 位上的天冬氨酸；m 中间体时期，去质子化的视黄醛介导螺旋f 弯曲，与 其相连的大块侧链基团随之移开，胞内侧质子通道得以打开，第9 6 位上的天 冬氨酸利用胞质内的h + 重新质子化：在第8 2 位上的精氨酸和氢键网络的 参与下，第8 5 位上的天冬氨酸将质子释放到胞外；视黄醛由1 3 顺式异构化 为全反式形式，细菌视紫红质回复到基态( 转运过程示意图见图1 ) ( k u h l b r a n d t w 2 0 0 0 ) 。该过程中b r 的分子构型发生一系列的瞬间变化，其最大吸收峰 也相应的变化，产生不同最大吸收峰的b r 瞬间产物，称为光循环中f b j 体。 由于其特殊的光电特性，b r 在光能利用、信息存储、医疗等方面具有广泛 的研究和应用前景，如人工视网膜构建( f r y d r y c hm e ta 1 2 0 0 0 ) ，光存储介质 ( w i s ek j e ta 1 2 0 0 2 ) ，以及光电子开光( l a n y ij k a n dp o h o r i l l ea 2 0 0 1 ； m a r g e s i nr a n ds c h i n n e rf 2 0 01 ) 。 l o 绪论 1 1 3b r 表达系统 随着傅立叶转换红外差别光谱( f t i r ) 、共振拉曼光谱( r l s ) 、固态 核磁共振( s o l i d s t a t en m r ) 等技术应用到b r 及其各突变体的结构和功能研 究上，多种表达系统被用来表达和提纯蛋白质，用以满足各种实验需要。 考虑到b r 是膜蛋白质同时表达及纯化产物活性，嗜盐古菌是其理想的 表达宿主，可以避免异种表达系统的许多缺点。1 9 9 0 年n i 等在嗜盐古菌b o p 突变体( 呈白色) 中成功表达b r ，使菌体呈紫色( n ib f e ta 1 1 9 9 0 ) ，产量为 仅为l o o m g 7 5 l ，远低于e s c h e r i c h i ac o l i ( ec o l i ) 表达系统b r 产量。至今很 多b o p 基因已经在大肠杆菌表达系统中获得了成功表达，并且经分离纯化的 b r 膜可用于后续的研究使用( f e n g j e ta 1 2 0 0 6 ；k a m on e ta 1 2 0 0 6 ) 。 此外，b o p 基因在酵母表达系统( h i l d e b r a n d tv e ta 1 1 9 8 9 ) 、体外表达系 统( s o n a rs e ta 1 1 9 9 3 ) 、爪蟾卵母细胞( n a g e lg e ta 1 1 9 9 5 ) 、s f 9 昆虫细胞和 c o s 1 哺乳细胞( h e y m a n nj e ta 1 1 9 9 7 ) q b 也得到了不同程度的表达成功，但 由于操作复杂等原因未得到广泛采用。 浙江人学博 ：学位论文：h a i o b i f o r n l as p a j 5b o p 基冈克降j 表达和嗜盐古菌皋【大i 组进化分析 ab r 基态 bl 中间体 质子化的令反式视黄醛 质子化的1 3 - 顺式视黄醛 dn 中间体c 后m 中间体 质子化的1 3 顺式视黄醛去质子的1 3 顺式视黄醛 图1b r 质子转运机理( k u h l b r a n d tw 2 0 0 0 ) ( 注：为方便观察，在b - d 中螺旋d 和e 被略去；与螺旋f 相连的椭圆形黑 体代表螺旋f 大块的侧链基团。) 1 2 绪论 1 2 第二节嗜盐古菌耐辐射机理研究 1 2 1 研究背景 嗜盐古菌通过细菌视紫红质吸收可见光中特定波段并加以利用。随着深 入研究，人们发现嗜盐古菌可通过两种主要途径获取能量，一是有氧条件下 的有氧磷酸化，二是有光条件下的光合磷酸化。当细胞处于缺氧条件时，嗜 盐古菌就会在光照条件下更多得合成b r ，b r 自发地在细胞膜上形成紫色斑 块，即紫膜。b r 在嗜盐古菌h a l o b a c t e r i u ms p n r c 1 适应多变的生境中起 着重要的作用( b a l i g an s e ta 1 2 0 0 2 ；n gw v e ta 1 2 0 0 0 ) 。但是嗜盐古菌在 利用日光中可见光部分的同时，日光中的紫外线会对细胞形成一定的损伤， 嗜盐古菌在长期适应过程中进化出的应对策略是值得深入研究的。 此外，随着大规模测序技术应用，从第一个嗜盐古菌h a l o b a c t e r i u ms p n r c - i ( a t c c7 0 0 9 2 2 ) 基因组测序的完成( n gw v e ta 1 2 0 0 0 ) ，l i a r m a r i s m o r t u i ( a t c c4 3 0 4 9 t ) 以及鳓，w a l s b y f ( d s m1 6 7 9 0 t ) 等嗜盐古菌的 基因组图谱也绘制完成( b a l i g an s e ta 1 2 0 0 4 b ；b o l h u i sh e ta 1 2 0 0 6 ) 。因此， 建立在基因组水平上的比较基因组分析将帮助我们更加深入探索高盐环境中 的生命现象。 如前所述，嗜盐菌科中的微生物通常生存与盐湖和盐田等高盐环境中， 其生境盐浓度可达4 5m 以上，生境中通常具有高太阳辐射和氧化压力。嗜盐 菌科成员适应其生存环境的各种机制被广泛研究( d a s s a r m as e ta 1 2 0 0 6 ) ， 1 9 8 0 年以后，辐射耐受性机制的研究也逐渐开展( e k e r a p m e ta 1 1 9 9 1 ；f i t tp s a n ds h a r m an 19 8 7 ；f i t tp s e ta 1 19 8 3 ；m a r t i ne l e ta 1 2 0 0 0 ；m c c r e a d y 浙江人学博i ：学位论文：h a l o b i f o r m as p a j 5b o p 基【丈l 克降。j 表达和嗜盐古菌基【大1 组进化分析 s 1 9 9 6 ；s h a r m an e ta 1 1 9 8 4 ) 。近年来，嗜盐古菌辐射耐受机制的研究主要 是围绕着模式菌株h a l o b a c t e r i u ms p n r c l 开展。在辐射剂量为l1 0j m 2 的短 波紫外线( u v - c ) 处理后，h a l o b a c t e r i u ms p n r c l 存活率接近1 0 0 ，辐射引 起的损伤可被环嘧啶二聚体光解酶( f l j p h r 2 基因编码) 有效的光修复( b a l i g a n s e ta 1 2 0 0 4 a ) 。当光修复所需光缺失时，细菌型核苷切除修复( b a c t e r i a l n u c l e o t i d ee x c i s i o nr e p a i r ，n e r ) 非光依赖修复基因u v r a ， u v r b ，u v r c 可用 于修复紫外线辐射造成的损伤( c r o w l e yd j e ta 1 2 0 0 6 ) 。同时，真核n e r 同 源序列也存在于h a l o b a c t e r i u ms p n r c 一1 中，其功能尚未被鉴定( n gw v e t a 1 2 0 0 0 ) 。将h a l o b a c t e r i u ms p n r c 1 进行3 0 7 0j m 2u v - c 或2 5k g y 伽马射 线辐照处理，通过对其转录组和蛋白质组各蛋白质丰度变化研究发现，r a d a l 介导的同源重组修复在细胞对辐射做出的反应中起到了重要的作用( b a l i g an s e ta 1 2 0 0 4 a ；w h i t e h e a dk e ta 1 2 0 0 6 ) 。 1 2 2 d ( c t a g ) 甲基化指导的错配修复机制 研究表明酵母中大多数紫外线诱导的基因并没有对其辐照后的存活发挥 作用( b i r r e l lgw e ta 1 2 0 0 2 ) 。而大多数与紫外线辐射损伤修复相关的基因， 包括大部分n e r 途径中的基因等，并不是紫外线诱导的，这种情况在人类细 胞中也是如此( r i e g e rk e a n dc h ug2 0 0 4 ) 。因此在分析h a l o b a c t e r i u ms p n r c 1 辐照后基因表达谱时要谨慎，同时要辅以生理功能研究证据 ( m c c r e a d ys e ta 1 2 0 0 5 ) 。2 0 0 4 年b a l i g a 研究小组在转录组分析的基础上提 出了d ( c t a g ) q | 基化指导的错配修复机$ 1 j ( m m r ) ，其中z i m 基因根据与已知 c t a g 甲基化酶的同源性推测为c t a g 甲基化酶基因( b a l i g an s e t a 1 1 4 绪论 2 0 0 4 a ) ，但是根据该研究中的基因差异表达筛选原则，该基因并没有表现出 明显的表达差异。因此除双嘧啶和氨基酸组成分析之外，对h a l o b a c t e r i u ms p n r c 一1 中g a t c 和c t a g 分布也应该进行研究，对目i j 提出的d ( c t a g ) 甲基 化指导的错配修复机带t j ( m m r ) 进行重新审视。 1 3 第三节基因组进化中的移码突变 1 3 1 研究背景 高盐生境中不仅存在着极端嗜盐古菌，还生存着极端嗜盐细菌，如分离 自西班牙盐池的极端嗜盐细菌s a l i n i b a c t e rr u b e r ，属于c y t o p h a g a f l e x i b a c t e r b a c t e r o i d e s 分支，s a l i n i b a c t e r 属。该属的细菌可以和嗜盐古菌在高盐条件下 共存，并且占有一定的菌体密度。嗜盐古菌是如何适应高盐的环境是科学界 一直关注的问题，而嗜盐细菌的发现和相关研究更加有利于通过比较分析找 到答案。随着s a l i n i b a c t e rr u b e r 模式菌株m 3 i ( d s m1 3 8 5 5 ，c e c t5 9 4 6 ) 全基 因组测序完成，m o n g o d i n 研究小组发现耐盐基因的水平转移在s a l i n i b a c t e r r u b e r 适应高盐环境中起到了重要作用( m o n g o d i ne f e ta 1 2 0 0 5 ) 。但是，仅 仅利用基因的水平转移是不能满足其适应生境的需要，除了基因水平转移之 外，是否存在着其他的方式帮助s a l i n i b a c t e rr u b e r 适应高盐生境? 相对于非嗜盐微生物，嗜盐微生物蛋白质组偏好使用酸性氨基酸密码子， 用于稳定蛋白质的构象和功能( k e n n e d ys p e ta 1 2 0 0 1 ) 。移码突变 ( f r a m e s h i f i ) 可以使密码子使用频率变化，因此我们在嗜盐微生物适应进化 的各种方式中关注移码突变事件。移码突变在改变密码子使用的同时，蛋白 浙江人学博i ：学位论文：h a l o b i f o m as p a j 5b o p 基冈克降0 表达和嗜盐古菌堆组进化分析 质序列也发生较大改变，因此移码突变带来的另一个生物学问题就是新基因 的起源。 1 3 2 新基因起源机制 新基因的起源与演化作为进化研究中的一个主要分支，一直被广泛的研 究。目前已知，新基因的来源可有多种机$ 1 j ( l o n gm e ta 1 2 0 0 3 ) ： a 外显子重排( e x o ns h u f f l i n g ) ：源于不同基因的两个或多个外显子被组合 在一起，或是同一个外显子通过复制创造了一个新的外显子内含子结构 ( g i l b e r tw 1 9 7 8 ) 。目前已知有两种机制可以导致外显子的异常重组：非 法重组( i l l e g i t i m a t er e c o m b i n a t i o n ) ( a r g u e l l oj r e ta 1 2 0 0 6 ；v a nr i j ka a n db l o e m e n d a lh 2 0 0 3 ；v a nr i j ka a e ta 1 1 9 9 9 ) 和外显子的逆转座插入 ( e s n a u l tc e ta 1 2 0 0 0 ；m o r a nj v e ta 1 1 9 9 9 ) 。该机制经常会将不同蛋白 质结构域结合在一起，形成蛋白质嵌合体( d es o u z as j e ta 1 1 9 9 6 ； k a e s s m a n nh e ta 1 2 0 0 2 ；p a t t h yl 19 9 6 ) 。 b 基因复制( g e n ed u p l i c a t i o n ) ：基因复制是进化中的一种重要机制。通过 它，基因可以躲避一些有害甚至致死的突变，产生的多拷贝基凶又可以在 自然选择下向两个不同的方向进化，或保留原有功能，或进化出新的功能。 许多生物中新基因的功能来源于该机$ 1 ( k i m u r am 1 9 8 3 ；o h n os 1 9 7 0 ) 。 2 0 0 7 年l o 月份n a t u r e 上的一个例子是关于模式遗传试验材料啤酒酵 母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的研究，讲述的是半乳糖代谢及其调控通 路一个具有双重功能的基因，通过自身复制，将两个功能分割丌来。在这 条通路中的第一个酶是g a l l ，并且该通路中的关键组分之一共诱导 1 6 绪论 子g a l 3 是起源于同一个多功能基因，该基因可以起到上述两者的作用。 目前已有很多的酵母基因组测序列，通过不同酵母菌的基因组比对得知 的，在与s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 进化关系很近的酵母中发生过一次全基 因组复制，其中包括上面提到的通路中的基因，而在与s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 进化关系较远的酵母中则很多基因往往只有一份拷贝。在酵母菌 k l u y v e r o m y c e sl a c t i s 中一个单基因就可以执行上面提到的g a l l 和g a ：l 3 两个基因的功能，而且是相去较远的两个功能。c h r i s 等提出g a l l 与g a l 3 的共同祖先基因具有两种功能，一种是用于分解半乳糖酶促功能，另一种 为调控该通路的作用，当处于适应性选择时，这种多功能基因并不一定是 最优方式，因为基因中发生一些有利于其中一个功能的改变的同时这些改 变可能消弱另一个功能。但是如果在基因复制之后，基因的多拷贝就可以 承担不同的选择压，在不同的方向上进化( h i t t i n g e rc t a n dc a r r o l ls b 2 0 0 7 ) 。 c 逆转座( r e t r o p o s i t i o n ) ：通过反转录表达的亲代基因可在新的基因组位置 创造一个基因拷贝。但是该拷贝通常不会连同其亲代基因启动子区一起逆 转录转座，因此它必须招募一个新的5 端调控序列来行使其功能，否则就 会退化为一个假基因。因此一个有功能的逆转座基因呈现出一种嵌合结 构，逆转录转座的编码区域和一个新的调控序列，或逆转录转座的编码区 域和一个从整合靶位点产生的新蛋白质序列这会导致新的嵌合结构 具有和亲代基因不同的生物学功能。 d 移动元件( m o b i l ee l e m e n t s ) ：可移动元件整合到核基因从而产生新的功 能可能是一个普遍的机制。m a k a l o w s k i 等首次报道了整合在人类d a f 基因 1 7 浙江人学博- ：学位论文：h a l o b i f o 叽as p a j 5b o p 基闪克降0 表达和嗜盐古菌綦闪纽进化分析 编码区中的a l u 元件( m a k a l o w s k iw e ta 1 1 9 9 4 ) 。通过对人类等脊椎动物 基因进一步的分析，人们发现通过移动元件在核内基因的整合从而产生新 功能是一种普遍现象( l o r e n ca a n dm a k a l o w s k iw 2 0 0 3 ；n e k r u t e n k oa a n dl iw h 2 0 0 1 ) 。 e 水平基因转移( h g t ) ：在原核生物中，基因通常在生物间转移。尽管水 平转移可以导致同源基因的交换，但是有证据表明它可以招募新的基因， 从而产生新的表型。例如，通过基因的水平转移使良性细菌转变为病原体 ( o c h m a nh 2 0 0 1 ) 。携带有某些基因或基因片段的转座元件的水平转移对 受体生物新基因的形成也起了一定的作用。 f 基因融合分裂( g e n ef u s i o n f i s s i o n ) ：通过上游基因终止密码子和转录终 止信号的删除和突变造成的通读转录( r e a d t h r o u g ht r a n s c r i p t i o n ) ，两个相 邻的基因可以融合为单个基因。相反得，一个单基因也可以分裂为两个单 独的基因，基因分裂发生的分子机制如猴王基因( m o n k e yk i n gg e n e ) ( w a n gw e ta 1 2 0 0 4 ) ，许多微生物基因组的基因融合分裂事件已经被鉴 定出( b u m sd m e ta 1 1 9 9 0 ) ，在高等真核生物中也存在基因融合事件。 例如，t h o m p s o n 等发现人类基因k 删一u e 僦是通过基因哪k 洲通过 通读转录和编码区选择性剪切而融合形成的( t h o m s o nt m e ta 1 2 0 0 0 ) 。 g 从头起源( d en o v oo r i g i n a t i o n ) 。尽管真正从原先非编码序列变成新基因 的从头起源的例子很稀少，但是有些基因的部分编码序列确实是来源于这 种机制，例；1 1 d r o s o p h i l a s d i c 基因，该基因的一个外显子就是来源于之 前的内含子序列( n u r m i n s k y d i e ta 1 1 9 9 8 ) 。 h 混合机制( c o m b i n e dm e c h a n i s m s ) ：新基因既可以通过上述机制中的一种 绪论 产生，也可以通过多种机制的混合作用产生，例如，第一个被发现的年轻 基因，j i n g w e i 基i 天l ( l o n gm a n dl a n g l e yc h 1 9 9 3 ) 。它的产生经历了外 显子重排，逆转录转座和基因复制等多个过程。 。 相对于真核生物中外显子重排、逆转座等机制，原核生物的方式相对简 单，主要为基因复制、水平基因转移、基因融合分裂、从头起源以及混合机 制。有了如此多的新基因起源机制，接下来的问题就是这些进化事件的生物 学意义是什么? 它们的进化命运如何呢? 通过对基因复制研究，o h n o 模型认为随着不断的突变，重复的基因对可 使得其中一个拷贝维持原来的功能，而另一个拷贝自由的适应进化，产生新 的功能( o h n os ，i9 7 0 ，e v o l u t i o nb yg e n ed u p l i c a t i o n h e i d e l b e r g ： s p r i n g - v e r l a g ) 。基因复制对的一个成员最终失去功能，大多数基因的复制本 最终以假基因的形式消亡。但是，最近亚功能化( s u b f u c t i o n l i z a t i o n ) 的模型 为高等真核生物中编码基因组中存在的众多的基因的复制本提供了一个可能 的解释。新功能化( n e o f u n c t i o n a l i z a t i o n ) 认为，重复的基因对可使得产生新 的功能，让一个拷贝自由的适应进化，而另一个拷贝维持原来的功能也很重 要。大部分这些进化的改变是在正向达尔文选择下的适应性变化。2 0 0 5 年 h e 等提出亚新功能化( s u b n e o f u n c t i o n a l i z a t i o n ) ( h ex a n dz h a n gj 2 0 0 5 ) 。 1 3 3 移码突变 在此我们关注新基因起源机制给基因带来的影响。例如在基因融合断裂 事件中，如果不发生移码突变，演化出的基因会与祖先基因在编码的氨基酸 序列上表现出相似性。但是基因融合断裂事件中d n a 片段的插入、缺失或 1 9 浙江人学博j ：学位论艾：h a l o b i f o r m as p a j 5b o p 堆【大l 克降j 表达和嗜盐占菌皋i 大1 组进化分析 者点突变等可能引起翻译终止密码子的提前或者推后出现，以及移码突变。 再例如，由于移动元件在基因组中的移动也可能形成基因的移码突变。因此 在新基因中我们将着重寻找通过移码突变的起点，以及这些移码突变带来的 生物学功能。 1 4 本章小结 本章介绍了嗜盐古菌的生存环境以及生境中的选择因子。通过分析嗜盐 古菌功能基因b o p 的研究现状和功能