（遗传学专业论文）rna聚合酶Ⅰ和Ⅲ在hela细胞核中转录位点的定位研究.pdf

r n a 聚合酶l 和i i i 在h c l a 细胞核中转录位点的定位研究摘要摘要真核生物细胞核中有三种r n a 聚合酶，即r n a 聚合酶i 、i i 和i i i ，它们分别转录产生不同的r n a ，其中r n a 聚合酶i 转录合成4 5 sr r n a 前体；聚合酶i i 转录合成m r n a 前体及大多数s nr n a ；聚合酶i i i 转录合成5 sr r n a 、t r n a和一些小分子r n a 。自上个世纪六十年代初期，人们相继运用细胞化学染色、电镜放射自显影等进行研究的结果表明：r n a 聚合酶i 的转录发生在核仁中，r n a 聚合酶i i i 的转录发生在核质中。但随着新的研究技术的发展和应用，人们对r n a 聚合酶i转录位点的早期的研究方法的可靠性提出质疑；同时，根据一系列间接的实验推论r n a 聚合酶i i i 的转录可能发生在核仁中。但迄今为止，有关r n a 聚合酶i 和i 的转录位点还缺乏直接的实验结果的证明。本实验采用构建的能被r n a 聚合酶i 或r n a 聚合酶i 识别的重组质粒，以人的h e l a 细胞为材料，运用电穿孔转染、荧光原位杂交并结合激光共聚焦显微镜，从d n a 、r n a 两个水平对r n a 聚合酶i 和i i i 的转录位点及其转录子的分布进行了研究。结果显示：r n a 聚合酶i 的d n a 和r n a 水平的杂交信号都出现在核仁里，信号多而且强，有力地证明了r n a 聚合酶i 的转录发生在核仁里，转录子也位于核仁内：r n a 聚合酶i i i 的d n a 水平的荧光信号大都出现在核仁里，少数出现在核仁边缘，由此推测出r n a 聚合酶i 的转录主要发生在核仁及其周边区域，可能由于运动较快，其转录子分布于核仁边缘和核质中。本实验为r n a 聚合酶i 和i 在真核生物细胞核中的转录位点提供了直接的证据，这对人们进一步了解r n a 聚合酶的转录机制、加工和运输过程及r n a 聚合酶之间的结构与功能关系等均具有重要的意义。关键词：r _ n a 聚合酶i 和；激光共聚焦显微镜；荧光原位杂交：转录位点；h c l a 细胞r n a 聚台酶1 和l i i 在h e l a 细胞核中转录位点的定位研究a b s t r a c ta b s t r a c tt h e r ea r et h r e et y p e so fr i g ap o l y m e r a s e si ne u k a r y o t i cc e l l s ：p o l y m e r a s ei 、i ia n di i i t h e yp e r f o r md i f f e r e n tf u n c t i o n si nt h ec e l l s r n ap o l y m e r a s eis y n t h e s i z e st h r e el a r g e s tr r n a s ，5 8 s ，1 8 sa n d2 8 sr r n a r n ap o l y m e r a s ei ip r o d u c e sm r n ae n c o d i n gp r o t e i n ，a n dr n ap o l y m e r a s e1 m a k e s5 sr r n aa n dt r n a ，a sw e l la saf e ws m a l ln u c l e a rr n a s t h et r a n s c r i p t i o nl o c a l i z a t i o n so ft h e s ep o l y m e r a s e sh a v eb e e ns t u d i e ds i n c ee a r l y1 9 6 0 s ，t h er e s u l t so f t h e s ee a r l yr e s e a r c hw o r k ss h o w e dt h a tt h et r a n s c r i p t i o no fr n ap o l y m e r a s e1w a sl o c a l i z e di nt h en u c l e o l iw h i l et h a to fr n ap o l y m e r a s ei i ii nt h en u c l e o p l a s m h o w e v e r , w i t ht h ed e v e l o p m e n ta n dt h ea p p l i c a t i o no f n e wt e c h n i q u e s ，t h er e l i a b i l i t yo ft h em e t h o d su s e di nt h er e s e a r c ho ft h et r a n s c r i p t i o ns i t eo fr n ap o l y m e r a s e1w a sd o u b t e d ；a n da l s o ，s o m ei n d i r e c tr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h et r a n s c r i p t i o no f r n ap o l y m e r a s ei i im i g h to c c u ri nt h en u c l e o l i b u tt h e r ei si 2 0d i r e c te x p e r i m e n t a lp r o o f i nf a c t ，a na l t e r n a t em e t h o dt oi d e n t i f y d i r e c t l yt h ep r e c i s et r a n s c r i p t i o ns i t e so f r n ap o l y m e r a s eia n dr 1w o u l da l s ob ed e s i r a b l e i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t h ep l a s m i d sb e a r i n gr n ap o l y m e r a s eia n di i ip r o m o t e rw e r et r a n s f e c t e di n t oh e l ac e l l s ，r e s p e c t i v e l y a f t e rb e i n gd e t e c t e db yf l u o r e s c e n c ei ns i t u h y b r i d i z a t i o n t o d n a a n d r n a l e v e l ，i t w 弱s h o w e d u n d e r t h e l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p yt h a tt h el o c a l i z a t i o n so f r n ap o l y m e r a s e1w e r ei nt h en u c l e o l i ；t h o s eo f r n a p o l y m e r a s e w e r e i n t h e n u c l e o l i a n d i t s p e r i p h e r yr e g i o n s b u t n o t i nt h en u c l e o p l a s m t h er e s u l t sw i l lh e l pu st oc o m p r e h e n dt h em e c h a n i s mo fr n ap o l y m e r a s et r a n s e d p t i o n ，t h ew a yo f t r a n s c r i p t i o np r o c e s s i n ga n dt r a n s p o r t a t i o n ，a n dt h es t r u c t u r a la n df u n c t i o n a lr e l a t i o n s h i pa m o n gt h r e er n ap o l y m e r a s e s k e yw o r d ：r n ap o l y m e r a s eia n d ；f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( f i s h ) ；l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y ( l s c m ) ；t r a n s c r i p t i o ns i t e s ；h e l ac e l l s3r n a 聚合酶i 和l i l 在h e l a 细施核中转录位点的定位研究前言第一章前言1 1 真核生物r n a 聚合酶概述真核生物有三种r n a 聚合酶：r n a 聚合酶i 、i i 和i i i ，它们分别负责不同类型基因的转录。分类的依据最早是根据它们从d e a e 纤维素柱上洗脱下来的先后顺序，即先洗脱下来的命名为r n a 聚合酶i ，其次洗脱下来的命名为r n a聚合酶1 i ，第三洗脱下来的命名为r n a 聚合酶i 【1 】。后来采用它们对鹅膏蕈碱的敏感度不同来分类以及区分它们的活性：r n a 聚合酶i 对a 一鹅膏蕈碱不敏感；r n a 聚合酶i i 可被低浓度的a 一鹅膏蕈碱( 1 0 - 91 0 8m o l l ) 所抑制；而r n a聚合酶1 1 1 只对高浓度的n 一鹅膏蕈碱( 1o - 5 一1 0 4m o l l ) 敏感，生物活性会被抑制。鹅膏蕈碱是一种毒蕈( 鬼笔鹅膏a m a n i t ap h a l l o i d e s ) 产生的八肽化合物【2 1 。同时了解到，r n a 聚合酶i 活性比例最大，负责r r n a ( 5 8 s ，1 8 s 和2 8 s ) 的转录；r n a 聚合酶i i 活性所占比例仅次于r n a 聚合酶i ，主要负责不均一核r n a ( h n r n a ) 和m r n a 前体的转录；r n a 聚合酶i i i 活性所占比例最小，负责一些小r n a 的转录( 觅附表) 。表真核生物三种r n a 聚合酶的功能r n a 聚合酶初始转录产物成熟的终产物i4 5 sr r n a 前体5 8 s ，1 8 s 和2 8 sr r n a sl m r n a sm r n a ss n r n a ss n r n a s5 sr r n a 前体5 sr r n at r n a 前体t r n ah iu 6s n r n a ( 前体? )u 6s n r n a7 s lr n a ( 前体? )7 s l r n a腺病毒v a r n a ( 前体? )v a r n a1 2 真核生物r n a 聚合酶i 的转录及转录位点的研究概述1 2 1r n a 聚合酶i 的转录机制r n a 聚合酶i 负责r r n a 在分裂问期的连续合成。人的细胞在不同的染色体上共分布有五簇r r n a 重复基因，每簇约有4 0 个拷贝的r r n a 基因。每一r r n ar n a 聚合酶i 和l 儿在h e l a 细施棱中转录位点的定位研究前言基因由r n a 聚合酶i 转录产生一个4 5 s 的r r n a 转录物，长约1 3 0 0 0 n t ，这一转录产物随后被切成5 8 s ( 1 6 0 n t ) 、1 8 s ( 2 0 0 0 n 0 、2 8 s ( 5 0 0 0 n or r n a 各一个【3 1 。1 2 1 1 启动子被r n a 聚合酶i 识别的启动子主要由两部分组成( 参见图1 ) ：核心启动子( c o r ep r o m o t e r ) 和上游调控序列( u p s t r c 锄c o n t r o le l e m e n t ，u c e ) 。前者位于4 5至+ 2 0 的区域内，单这段序列就足以使转录起始；后者位于一1 8 0 至1 0 7 之间，可以大大提高核心启动予的转录起始效率，但很多情况下，上游调控序列并非为转录进行所必需一oj 。核心启动子包含有最保守和关键的序列元件即核糖体起始位点r i n r ( r i b o s o m a li n i t i a t o r ) ，它是一段富含a t ，类似t a t a 盒的序列，位于+ l 附近【6 1 d尽管它的序列与t a t a 盒相似，但它却不是t b p ( t a t a b i n d i n gp r o t e i n ) 的作用位点。其下游的序列起到定位核心连接因子s l l 的作用。1 2 1 2 转录的起始r n a 聚合酶i 的转录起始需要两种辅助因子u b f 和s l l 参与。u b f 由一条多肽链组成，可特异地识别核心启动子和上游调控序列中富含g c 对的区域。s l l单独没有识别特异序列的功能，在u b f 特异结合序列后才可结合。当二者均结合到序列上后，r n a 聚合酶i 才能与核心启动子结合而起始转录【”。s l l 为r n a 聚合酶i 转录所必需。s l l 结合并稳定u b f - d n a 复合物，且与核心启动子的下游部分相互作用。s l l 的结合使得r n a 聚合酶i 能与u b f 复合物结合。s l l 含有多个亚基，t b p ( t a t a - b i n d i n gp r o t e i n s ) 和三个t a f i( t b p a s s o c i a t e df a c t o r s ) 8 1 。在转录时，d n a 双螺旋结构必需打开，在起始位点+ 1 上游形成一个转录起始的泡状结构，转录开始后，一直延伸下去。在r n a 聚合酶i i 转录时，这一过程须耗a t p ，而r n a 聚合酶i 和m 的转录却不耗能归】。r n a 聚合酶i 会在起始转录前解链9b p 到l o b p ，在转录开始后泡状结构会解链1 9 b p ，而d n a r n a杂交链的长度约为9 b p 。1 2 1 3 转录的延伸r n a 聚合酶i 沿d n a 链转录时，r n a 的合成速度约为4 0 核苷酸，秒，与蛋白质合成的速度相似( 1 5 个氨基酸，秒) ，但比d n a 复制的速度( 8 0 0 b p 秒) 要慢得多。r n a 聚合酶在d n a 分予上的速度是不均一的，在经过富含g c 对的序列8 至1 0 个核昔酸后会暂停一次，这与转录的终止有关。r n a 聚合酶i 和i i i 在h e l a 细胞棱中转录位点的定位研究图1 真核生物r n a 聚合酶i 转录起始的图解模型9 j1 2 1 4 终止子r n a 聚合酶i 转录的终止子序列为1 8 b p ，需要一些辅助因子参与1 0 】。1 2 2r n a 聚合酶i 转录定位的研究进展有关r n a 聚合酶i 转录位点的研究起始于上个世纪中期，最初人们应用3 h脉冲标记4 5 sr r n a 前体，电镜放射自显影观察显示转录发生在核仁内 1 1 - 1 3 。但由于当时并不清楚r d n a 的转录速度如何，因此标记所用的时间很难控制在转录子刚刚开始合成的时候，这样所得到的结果也未必是r n a 聚合酶i 的真正转录位点【1 4 1 ；而b 粒子衰变的长度也给很多实验带来了一定的不确定；另外，也有很多作者并未考虑原初转录产物与转录位点已有一定距离这一问题【l “。6r n a 聚台酶i 和i i i 在h e l a 细胞核中转录位点的定位研究8 0 年代以来，人们不断尝试新的研究方法，如定位r n a 聚合酶i 本身，定位核仁d n a 、r d n a 、假定的或已知的r d n a 转录因子( 如u b f ) ，原位定位r n a 或可延伸的r n a 等。由于这些成分已被证实确实存在于转录位点，因而取得了一些较有说服力的证据【l6 ”】。不过应用这些分析方法来解释一些结论尚有不足，因为这些靶成分中的大部分可能并不与被转录的r d n a 结合，因而并不在转录位点。例如，9 9 以上的核仁d n a 并不是r d n a 2 1 1 ；大部分的r d n a 通常都是非转录的间隔区域和不活跃的基因拷贝【2 l 】；5 0 以上的r n a 聚合酶i 从来没有参与过转录的过程【2 2 1 。而这些用来定位的非活性物质的位置，也可能会因细胞种类和生长情况的不同而改变，从而与活跃转录的r d n a 并不在同一位置【2 副；由于它们可能没有活跃转录的r d n a 那么分散，所以更容易被观察到1 2 4 j 。9 0 年代人们又采用b r u t p 脉冲标记经渗透处理的细胞中的转录子，在有效地抑制聚合酶合成( 一般5 分钟) 的情况下，用抗b r u t p 的抗体检测观察1 1 4 , 1 5 , 2 5 0 6 1 。这种方法是希望通过检测原初转录产物的位置，从而定位r d n a 的转录位点。激光共聚焦显微镜和电镜观察都证实转录发生在核仁的局部区域。然而该方法依然有一定的问题。首先，标记的转录子未必都是最新合成的，5 分钟的时间太短，抑制物还未发挥很大作用，所以有些聚合酶未受抑制但转录产物已被标记，且产物很快离开了转录的位置( 研究结果也发现时间一旦延长，转录的效率会出现很大程度的降低) 。此外，渗透化处理会带来细胞中核仁的解聚印】，还可能会使聚合酶的转录起始和r n a 链的延伸受到影响【2 ”，这样观察到的结果就很难说是聚合酶确切的转录位点了。由此看来，应用新的研究手段来直接观察完整的、有活性的的细胞中r n a聚合酶i 的确切转录位点是非常必要的。1 3 真核生物r n a 聚合酶i i i 的转录及转录位点的研究概述1 - 3 1 真核生物r n a 聚合酶的转录机制1 3 1 1启动子r n a 聚合酶i 负责转录5 sr r n a 、t r n a ( v ar n a ) 、部分s n r n a ( 如u 6s n g n a ) 的基因。这三种基因的启动子是不同的，故r n a 聚合酶i i i 要想识别不同的启动子，需和其它的辅助因子共同作用。r n a 聚合酶i 的启动子分为两类，识别方式不同。5 sr r n a 和t r n a ( v a r n a ) 基因的启动子位于转录起始位点的下游，非常特别，被称为内部启动子( i n t e r n a lp r o m o t e r ) 。而第二类基因的启动子位于转录起始位点的上游，与熟知的r n a 聚合酶的启动予相似( 参见图2 ，图中t y p e i 和t y p e 是内部启动子，t y p e 是上游启动予) 。r n a 聚合酶l 和i i i 在h c l a 细胞核中转录位点的定位研究前言t y p eip r o m o t e re g x e n o p u ss o m a t i c5 sr r n ag e n e+ l+ 5 0+ 6 4+ 7 0+ 8 0+ e 7t y p ei ip r o m o t e re g s a c c h a r o m y c e ss u p 4t r n ag e n t+ 1+ e+ 1 0+ 5 2 i - b 2t y p ei i ip r o m o t e re g h u m a nu 6s n r n ag e n e一2 42 1 4- - b e ,一 t- - 3 02 5+ i图2 典型的r n a 聚合酶启动子示意图9 “。t y p ei 和t y p ei i 内部启动子类型，t y p ei 为非洲蟾蜍体细胞5 sr r n a 基因，t y p el i为酵母的s u p 4t r n a 基因( 是间隔序列，t h 是转录终止位点) ；t y p eh i 的启动子位于转录起始位点的上游，是人的u 6s n r n a 基因。8r n a 聚台酶1 和i l i 在h e l a 细胞核中转录位点的定位研究进一步研究证实，内部启动子分为两种。第一种( t r n a 和v a r n a 基因的启动子) 含a 框和b 框( 参见图3 ) ；第二种( 5 sr r n a 基因的启动子) 含a 框和c 框( 参见图4 ) 。框间由其他序列隔开，如果间隔序列过短，会影响启动子的功能。一些脊椎动物，如人的u 6s n r n a ，7 s l r n a ，h l s n r n a 基因的启动子都属于第二类基因的启动子，它与内部启动子的一个明显的区别是：该启动子位于转录起始位点的上游，包括一个t a t a 元件，一个近侧序列元件( p r o x i m a ls e q u e n c ee l e m e n t ，p s e ) 和一个远侧序列元件( d i s t a ls e q u e n c ee l e m e n t ，d s e ) 【2 ，其中t a t a 元件和p s e 元件共同决定了转录起始位点的选择和转录效率，两者之间的距离决定r n a 聚合酶转录的特异性。这类启动子需要t f i i i c 和t f i i i b 的参与。除此之外，还有一些生物的r n a 聚合酶i i i 转录基因的启动子不同于以上两类基因的启动子t 3 0 1 。如蚕的t r n a a “基因和非洲爪蟾的t r n a 鼢基因的启动子既有内部序列又有上游序列【3 1 , 3 2 。1 3 1 2转录的起始和延伸转录的起始和延伸需要转录因子的参与。r n a 聚合酶i 转录所需的转录因子主要有t f i i i a 、t f i i i b 和t f c 。由r n a 聚合酶i i i 起始t r n a 基因的转录需t f i i i b 和t f i i i c 两个转录因子参与。t f i i i b 是与r n a 聚合酶i i i 直接作用的，t f i i i c 则是为t f i i i b 定位的装配因子。由r n a 聚合酶i i i 起始5 sr r n a 基因的转录需t f i i i a 、t f i l i b 和t f i i i c 三种转录因子。5 sr r n a 启动子的c 框是一个特异结合t f i i i a 的位点，t f i i i a 与c 框结合后，t f i i i c 与5 sr r n a 启动子结合，然后t f i i i b 与复合体起作用并促使r n a 聚合酶的结合并起始转录【3 1 ( 参见图4 ) 。一当r n a 聚合酶n i 转录u 6s n r n a 等基因时，识别的上游启动予不是内部启动子。t a t a 框的识别需要t b p ( 起定位聚合酶的作用) ，同时需要其它r n a 聚合酶的辅助因子共同作用来定位聚合酶。转录起始复合物形成之后，t f i i m 的b r f 亚单位就可以识别r n a 聚合酶i i i 的c 3 4 亚基，把r n a 聚合酶i i i 募集到转录起始点的上游，开始转录。在转录起始的过程中，双链d n a 必须解旋，这主要依靠r n a 聚合酶i i i 的作用，也需要t f i i i b 的参与，因为当t f i i i b 的b r f 或b ”发生突变时。r n a 聚合酶i i i仍可以结合到转录的起始位点，但不能解开双螺旋结构【3 ”。在r n a 聚合酶i的作用下，解旋区不断前移，使转录往前进行。与r n a 聚合酶i 和r n a 聚合酶i i 不同的是，r n a 聚合酶i i i 没有延伸因子，这可能是因为r n a 聚合酶i i i 转录的基因很短，而且r n a 聚合酶i 的c l l 亚基具有与延伸因子相似的作用p 。值得注意的是，r n a 聚合酶整个转录过程的速度并不一致，如2 0 时转录9r n a 聚合酶l 和i l l 在h e l a 细胞核中转录位点豹定位研究前占图3 真核生物t r n a 和v ar n a 基因启动子转录的起始”1 0r n a 聚合酶l 和在h e l a 细胞核中转录位点的定位研究图4 真核生物5 sr r n a 基因启动子转录的起始t 3 lr n a 聚合酶l 和i 【l 在h e l a 细胞核中转录位点的定位研究前言s u p 4t r n a t ” 基因的1 7 n t 4 6 n t 的2 9 n t 需要3 秒，而转录后面的9 n t 却需要4 1秒。这种不均匀的转录速度是由于转录在内含子处暂停造成的【3 5 】。1 3 1 3转录的终止r n a 聚合酶i i i 的终止子类似于原核生物，也具有发夹结构和u 环，发夹结构中有一段富含g c 对的序列，u 环有四个，转录通常在第二个u 环处终止，也有的在第三或第四个u 环处终止【3 1 。当一轮转录完成之后，r n a 聚合酶i i i 和转录因子并没有离开模板，而是模板折叠，使得位于终止区域的r n a 聚合酶i i i与停留在转录起始位点的转录因子相互识别并结合，迅速进行下一轮的转录 拍 。1 | 3 2 r n a 聚合酶转录定位的研究进展在对r n a 聚合酶i 和i i 进行定位研究的同时，人们也用类似的方法对r n a聚合酶i i i 的转录进行了定位：用 3 h - u 、b r - u t p 或生物素c t p 等标记的前体物渗入到经过渗透化处理的活体细胞中，然后通过放射自显影或免疫标记观察r n a 聚合酶i i i 的转录位点【5 3 7 。针。另外，还有人对r n a 聚合酶i i i 及其转录因子进行了免疫标记定位【4 0 ，4 1 】。这些结果均表明：r n a 聚合酶i i i 转录发生在核质中。实际上，对r n a 聚合酶i i i 的转录进行准确定位有很大的困难 4 。主要原因有：第一，r n a 聚合酶i i i 转录的r n a 较p o l i 、p o l i i 的转录产物要小得多，如5 sr r n a 为1 2 0 1 2 1 个核苷酸，t r n a 的长度仅为7 5 9 5 个核苷酸，如此短的长度很难及时检测到：第二，由于基因较短，r n a 的转录速度又很快( 每分钟约转录1 4 0 0 个核苷酸) ，同时 3 h 】- u 和b r - u 等前体也必须穿过细胞膜转变为直接的前体，在内部贮存位点达到一定量后，才自参与r n a 的合成，所以标记的产物往往处于下游的位点或剪接加工时的位点，而不是其真正的转录位置：第三，渗透等处理也会影响核的结构，由于b r - u t p 等本身是分子量比较大的复合体，为了有助于其穿越核膜，需要对细胞核进行渗透化处理，其结果常常导致细胞核结构的改变以及合成的r n a 发生沉积，严重影响实验结果的可信度；第四，整合到r n a 中的标记很难精确定位，例如，放射自显影中的银粒离真实的标记位点可能相距几百纳米。免疫标记的金颗粒的标记误差也有二十多纳米；第五，r n a 聚合酶和其转录因子多数贮存在核内并无转录活性，因此利用免疫学的方法标记聚合酶和转录因子往往并不能获得其真正的转录位点。自上个世纪9 0 年代中后期以来，有很多实验结果暗示r n a 聚合酶i i i 转录可能发生在核仁，这些实验主要集中在r n a 聚合酶i i i 转录产物和转录涉及到的蛋白。从这些相关领域的研究工作中我们可以合理地分析预测r n a 聚合酶i i ir n a 聚台酶i 和l l i 在h c l a 细胞核中转录位点的定位研究前言的转录位点。1 3 2 1t r n a 转录在核仁中的定位t r n a 是r n a 聚合酶i n 的主要转录产物之一。最初的转录产物( p r e t r n a )也需要经过加工剪接和核苷酸修饰等过程，而r n a s ep ( 核糖核酸酶p ，r i b o n u c l e a s ep ) 则是负责这一过程的主要酶类，由r n a 和至少两种蛋白质组成1 4 2 1 。早在1 9 9 3 年，就有实验表明，在核仁内可能存在与r n a 聚合酶i i i 转录因子( t f i i ib 和t f i i ic ) 相互作用的成分 4 3 , 4 4 ，而这两种转录因子都与t r n a 的转录起始有关。1 9 9 5 年m a t e r a 等人用与h e l a 细胞的r n a s e pr n a 互补的寡核苷酸片段做探针，观察到荧光信号主要出现在核仁里 4 5 】。1 9 9 7 年j a c o b s o n 等用罗丹明标记人的r n a s e p r n a ，显微注射到小鼠肾上皮细胞和h e l a 细胞后，发现r n p a s e pr n a 最初定位于核仁中，随后才分散进入核质。1 9 9 8 年b e r t r a n d 等人利用荧光标记技术对t r n a 前体的加工途径进行了研究和探讨。他们利用与t r n a 基因( 含内含子) 同源的荧光标记探针对t r n a t 。“和t r n a 唧的转录前体进行原位检测，结果发现荧光信号绝大部分来自于酵母细胞核的核仁区域。作为对照，他们还利用与成熟t r n a 基因( 不含内含予) 同源的探针检测，结果如预期所料，荧光信号主要在胞质和核质中出现。利用同样的方法，他们还对r n a s e p 中的r n a 成分进行了检测，结果也证实该成分存在于核仁中。综合以上结果，b e r t r a n d 等人得出结论，t r n a 前体的加工过程是在核仁内完成的。最后，他们还分析提到了t r n a 基因转录发生在核仁附近的可能性。1 9 9 9 年，j a r r o u s 和w o l e n s k i 等人利用g f p 与r n a s ep 的蛋白亚基形成的融合蛋白对r n a s ep 的3 种亚基成分r p p l 4 、2 9 、3 8 进行了追踪定位，结果这3种亚基成分都在核仁内被发现。另外，生化分析还表明核仁内的r n a s e p 复合物具有着很强的催化活性f 4 6 】。综合以上结果来看，t r n a 前体出现在核仁里，而负责t r n a 前体最初加工修饰的r n a s ep 的活性复合物也出现在核仁内，故可推测t r n a 的转录过程应该是发生在核仁内。1 3 2 2r n a 聚合酶i 转录的r n a 产物的相关实验结果一u 6s n r n a ，s r pr n a ，r n a s em r p 的r n a ，端粒酶的m q au 6s n r n a 是一种参与核内剪接的小分子r n a ，是m r n a 剪接体的重要成分。它是r n a 聚合酶i i i 的转录产物。u 6s n r n a 在转录后还需要进行2 o 一甲基化和假尿苷化的核苷酸修饰。已经有实验证实，u 6s n r n a 转录后的加工修饰r n a 聚合酶i 和l i i 在h e l a 细胞核中转录位点的定位研究前言过程是在核仁内完成的 4 7 , 4 8 】。2 0 0 0 年l a n g e 和g e r b i 利用显微注射的方式将外源荧光素标记好的u 6s n r n a 注入非洲爪蟾的卵母细胞中，在核仁内立刻发现了荧光信号的存在，约4 小时后荧光信号逐步减弱并向核质方向扩散。该实验结果直观地向人们揭示u 6s n r n a 的成熟或发挥正常的生物学功能必须要经过核仁区域的加工程序，然后才被分派出去。最近，g e r b i 等人又证实u 6s n r n a 的核仁定位区段位于其3 末端【4 9 】。信号识别颗粒s r p ( s i n g n a lr e c o g n i t i o np a r t i c l e ，s r p ) 是一种核糖核蛋白。其主要功能是识别并结合分泌蛋白或膜蛋白的n 末端的信号肽，使蛋白质的合成暂时中止，然后将其转运至内质网表面的，与膜表面的停泊蛋白受体结合后，信号识别颗粒才从未翻译完的肽链上释放出来，蛋白质继续合成。s r p 由r n a和6 种蛋白质组成，它的r n a 成分即s r pr n a 以前称为7 s lr n a ，是由r n a聚合酶i i i 转录的陋。1 9 9 8 年j a c k s o n 等人对s r pr n a 作了研究，将标记好的s r pr n a 经显微注射注入鼠肾上皮细胞以后，会迅速地集结到核仁区域内，然后再逐渐地转移到核质中去【5 ”。在此基础上，p o l i t z 等( 2 0 0 0 年) 运用原位杂交实验进一步表明，信号识别颗粒中的蛋白亚基成分s r p l 9 ，s r p 6 8 和s r p 7 2 也存在于核仁中。由此推出，核仁不仅是s i 冲r n a 转录的位置，也是s r pr n a 与相应的蛋白质亚基成分加工组装的场所【5 ”。r n a s em r p ( m i t o c h o n d r i a lr n a p r o c e s s i n g ) 是种与r n a s ep 功能相似的核糖核酸酶，它对进入线粒体的r r n a 前体进行加工1 5 3 1 。r n a s cm r p 也是由r n a和蛋白质组成，其r n a 也是由r n a 聚合酶i i i 转录的【5 4 1 。j a e o b s o n 等( 1 9 9 5年) 用荧光素标记r n a ，显微注射到鼠肾上皮细胞核中，立即观察到m r pr n a集中于核仁部位，其中大多数集中在核仁的致密纤维组分处垆”。端粒酶的r n a 成分，也是由r n a 聚合酶i i i 转录的，最近在核仁中发现该成分【5 6 】。虽然有关这几种小分子r n a 的转录信息知之甚少，但是它们的运动行为表明它们与核仁之间存在着密切的联系。它们在核仁内短暂停留很有可能是其成熟或发挥正常生物学功能的重要环节。既然它们与核仁之间存在着这种密切的关系，那么它们的转录又是在那儿发生的呢? 从它们发挥功能作用的位置看，分别为核质、胞质、胞质、核质，然而它们又都需要先在核仁内聚集。因此这就不能不让人们推测，其转录的位点或许可能就是在核仁或核仁的附近区域完成，并经过了核仁内的加工装配后才发育成熟。1 3 2 3l a 蛋白的研究l a 蛋白是与r n a 聚合酶i i i 转录产物发生相互作用的最初的蛋白质因子。它在这些转录产物产生以后很快与之结合，并作为分子伴侣陪伴其走完加工、折r n a 聚合璃i 和l i i 在h e l a 细胞核中转录位点的定位研究前奇叠和运输的过程【5 7 】，它可使r n a 聚合酶i i i 的转录产物免受核酸外切酶的切割。l a 蛋白对r n a 聚合酶i i i 转录产物的3 端形成的o l i g o c u t ) 具有着高度的亲和力 5 8 10 这样l a 蛋白也就成为了其转录产物产生后所结合的第一个蛋白质因子。因此l a 蛋白在细胞核中的存在位置也可以间接地反应出r n a 聚合酶i i i 的转录位点。已经证实l a 蛋白与多种r n a 聚合酶i i i 的转录产物存在着联系，如p r e t r n a 、u 6s n r n a 、r n a s epr n a 等。由于其具有分子伴侣的功能，因此它在核质内广泛分布的实验现象并不令人感到奇怪。然而目前却已经有实验证实，l a 蛋白也存在于核仁区域内盼删。这一实验结果正好与前面所提到的p r e t r n a 、r n a s epr n a 、u 6s n r n a 和s r pr n a 等在核仁出现的实验结果形成了统一。核仁内的l a 蛋白很有可能是在r n a 聚合酶i i i 的转录产物产生后与之结合，并介导其向外运输的过程。因而从l a 蛋白的研究来看，其特殊的生物学功能和其在核仁内存在的实验结果提醒我们，r n a 聚合酶i 的转录很有可能就是在核仁内进行的。综合这些实验结果，我们似乎可以认为r n a 聚合酶i 的转录是在核仁内完成的。但这一观点的提出更多的是建立在相关实验分析推理的基础上，它的正确性还缺乏足够的实验证据，尤其是直接观察到的实验结果的支持。本研究室已建立了比较完整的基因转染、原位分子杂交及激光共聚焦显微镜观察分析实验体系。前期采用被r i g a 聚合酶i i i 识别的5 s 启动子构建的质粒，转染入中国仓鼠c h o 细胞和人的h e l a 细胞后，原位杂交和激光共聚焦观察的结果显示，荧光信号位于核仁及其周边区域，为r n a 聚合酶的转录位点在核仁及其周边区域提供了最直接可靠的证据 6 1 , 6 2 。1 4 本课题的研究任务和内容当人们对r n a 聚合酶i 研究方法的可靠性和r n a 聚合酶i i i 转录定位的精确性提出异议后，接下来我们所要面临和要解决的任务就是如何取得有说服力的实验证据来证明r n a 聚合酶1 和的转录究竟是发生哪里。我们选取具有被r n a 聚合酶i 或i i i 识别的启动子的外源质粒为实验的研究材料展开了对r n a 聚合酶i 和i i i 转录定位的工作。质粒经电穿孔转染入h e l a细胞后，将会在启动予的引导下到达r n a 聚合酶的转录活性区并为r n a 聚合酶所识别而启动质粒的转录。因此细胞固定以后，利用与质粒同源的荧光探针分别进行d n a 水平和r n a 水平上的原位杂交检测。获取杂交后的荧光信号结果。d n a 水平的探针杂交信号可表明该质粒在细胞中所处的位点进而可以表明r n a 聚合酶转录活性位点的位置：鼢队水平的探针杂交结果则可以表明其转录r n a 聚合酶i 和i i l 在h e l a 细胞核中转录位点的定位研究前音子所在的位置，为判断r n a 聚合酶的转录活性位点提供佐证。该实验将设计并构建好的可以为r n a 聚合酶i 所识别并启动转录的一2 3 0 + 9质粒( 带有小鼠的r d n a 基因的启动子) 、为r n a 聚合酶i i i 所识别并启动转录的v a t k 质粒( 带有腺病毒v a 基因的启动子) 和5 sm a x i 质粒( 带有小鼠的5 s基因的启动子) 转入细胞，除非细胞会以带有启动子的外源质粒为模板进行转录，否则活细胞正常的排异反应会将其排出细胞，故实验结果的确是r n a 聚合酶的活性转录位点：同时将外源质粒导入动物细胞体内还可以获得较正常活体细胞更多和更强的杂交信号，便于转录位点的定位以及信号图象的采集：此外对于r n a聚合酶i i i 的研究，由于大大延长了聚合酶所需转录的长度，克服了r n a 聚合酶i 定位工作长期以来的缺陷，故定位更准确。1 5 研究意义纵观整个实验的过程，我们的主要目的就是要利用荧光原位杂交的方法获取r n a 聚合酶i 和i h 在细胞核中的转录位点，并通过激光共聚焦显微镜获得直观可靠的实验结果。这一结果将会为我们进一步认清r n a 聚合酶的真实的转录位点提供强有力的证据支持。从理论意义上来说，该实验的结果将有助于人们进一步认识和理解r n a 聚合酶的转录机制、其转录产物的加工运输途径、以及真核细胞当中不同的r n a聚合酶问的组织和调控关系，使人们对于细胞核的组织和功能有一个全面正确的了解和认识。从现实意义上来说，本实验不仅可以帮助人们进一步明确认识r n a 聚合酶i 和i i i 在动物细胞中转录位点的确切位置，而且实验中采用的研究策略还可以为人们进行基因转录定位的工作提供方法上的指导和借鉴。1 6r n a 聚台酶i 和在h e l a 细胞拔中转录位点的定位研究材料与方法2 1 实验材料第二章材料与方法本实验主要采用三种重组质粒：2 3 0 + 9 ，v a t k ，5 sm a x i ( 如下三张图所示) 。他们都是在p b r 3 2 2 质粒的基础上构建而来，主要由可被特定r n a 聚合酶识别的启动子( 斜线框所示) 与p b r 3 2 2 片断( 白方框所示) 构成。1 1 带有可被r n a 聚合酶i 识别的启动子的质粒带有小鼠的r d n a 基因的启动子的质粒：一2 3 0 + 92 3 0 + 9p 1a s m idl| + q黝2 a g b pr d l i c mp r o m o t i l l , -2 1 带有可被r n a 聚合酶识别的启动子的质粒a )带有腺病毒v a 基因的启动子的质粒：v a t kv a t kp l a s m i db l d i翦腻搬n 缸2 5 6 n pl l o o b pv a n p z * o m o t e rt xr n a 聚合酶1 和l i i 在h e l a 细胞核中转录位点的定位研究材料与方法b ) 带有小鼠的5 s 基因启动子的质粒：5 sm a x i5 s m a x ip l a s m i dl卜s黝1 6 3 b p5 se ，r 口m 口t r以上三种质粒所对应的制备d n a 和r n a 水平的探针用质粒：p b r 3 2 2 质粒质粒由美 虱j o h n sh o p k i n su n i v e r s i t y 的b a r b a r as o l l n e r w e b b 教授赠送。2 1 2 细胞株人的h e l a 细胞2 1 3 试剂盒( 由军事医学科学院赠送)质粒大量提取纯化试剂盒( 购自p r o m e g a 公司)地高辛标记缺口翻译系统d i g - n i c kt r a n s i t i o n( 购自r o c h e 公司)2 1 4d n a 工具酶b 盎l hi 、p v ui i 、h i n d m( 购自大连宝生物工程公司)2 1 5 细胞培养用品d m e m ( 高糖) 、胰蛋白酶胎牛血清( f e t a lc a l f s e r u m )谷氨酰胺青霉素、链霉素2 1 6 细胞固定用品多聚甲醛( p a r a f o r m a l d e h y d e )曲拉通x - 1 0 0 ( t r i t o nx 1 0 0 )( 购自华美公司)( 购自北京元亨圣马生物技术研究所)( 购自华美公司)( 购自鼎国公司)( 购自华美公司)( 购自华美公司)r n a 聚合酶l 和l i i 在h e l a 细胞棱中转录位点的定位研究材料与方法2 1 7 原位杂交用染料、抗体及试剂