（遗传学专业论文）vtn、plau和plaur基因的功能多态性位点与心肌梗死的关联研究.pdf

北京协和医学院中国医学科学院 目录 缩略语表4 第一部分：玻连蛋白基因变异与心肌梗死风险的关联性研究6 中文摘要6 英文摘要8 前言1 0刖看1 0 研究对象与方法l l 一研究对象1 4 1 病例及对照的入选标准1 4 2 体格检查和血标本采集1 4 二实验材料1 5 1 主要试剂1 5 2 实验仪器1 5 三实验方法1 6 1 基因组d n a 的提取及浓度测定1 6 2 血生化检测1 7 3 旧基因变异位点的选择和分型1 7 4 荧光素酶活性测定实验。2 2 5 砌肠d 预测变异位点对转录因子结合能力的影响3 0 6 凝胶迁移实验3 l 四数据收集及分析统计3 8 1 数据输入和统计软件- 3 8 2 比较心肌梗死组与对照组的一般临床资料3 8 3 遗传平衡和频数统计的检验。3 8 4 变异性位点的关联分析一3 8 5 遗传标记间的连锁不平衡程度分析和单体型的关联分析一3 8 6 用荧光素酶活性的检测去观察不同基因型启动子的转录活性一3 9 实验结果4 0 1 心肌梗死组以及健康人群一般临床资料一4 0 2 所基因t a gs n pr s 2 2 2 7 7 2 8 基因型频率与心肌梗死的关联分析4 0 3 荧光素酶报告系统实验结果4 0 第l 页共l l o 页 北京协和医学院中国医学科学院博：l 学位论文 4 凝胶迁移实验结果一4 l 5 i l ls i l i c o 预测结果分析4 l 6 超迁移实验结果4 2 讨论4 8 参考文献5 l 第二部分：尿激酶型纤溶酶原激活物及其尿激酶型纤溶酶原激活物受体基因功能多 态性位点与心肌梗死风险的关联性研究5 8 中文摘要5 8 英文摘要6 0 前言6 3 研究对象与方法6 5 一实验对象6 5 1 病例及对照的入选标准6 5 2 体格检查和血标本采集6 5 二实验材料6 6 1 主要试剂6 6 2 实验仪器6 6 三实验方法6 6 1 基因组d n a 的提取及浓度测定6 6 2 血生化检测6 8 3 尸幽【，和尸j 翻獬基因s n p 位点的选择和分型6 8 四数据收集及分析统计7 6 1 数据输入和统计软件一7 6 2 比较心肌梗死组与对照组的一般临床资料7 6 3 遗传平衡和频数统计的检验一7 6 4 每个s n p 位点的关联分析7 6 5 遗传标记间的连锁不平衡程度分析和单体型的关联分析7 7 实验结果7 8 1 心肌梗死组以及健康人群一般临床资料7 8 2 尸幽u 和p “獬基因功能s n p 基因型频率与心肌梗死的关联分析7 8 讨论8 2 参考文献8 4 第2 页共l l o 页 北京协和医学院中国医学科学院 博士学位论文 综述：拷贝数变异人类基因组变异研究的新热点8 9 致 射1 0 8 个人简历1 0 9 第3 页共1 1 0 页 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 缩略语表 ( a b b r e v i a t i o n s ) 第4 页共1 1 0 页 北京协和医学院中国医兰翌堂堕 堕圭堂垡! i 蔓 m g b o d o r p b s p c r m i n o fg r 0 0 v eb i n d e r 小沟结合物 o p t i c a ld e 潞i t y o d d sr a t i o p h o s p h a t eb u 腩rs a l i n e p o l y m e m c h a i nr e a c t i o n 纠【，u r o k i n a s e - p l a s m i n o g e na c “v i t i o r u r o k i n a s e p l a s m i n o g e n a c t i v i t o r p l a u r r e c e p t o r r e s t r i c t i o n f r a g m e n t l e n 昏h i 心l p 印m s d s s n p s p l t e 嘣s u p a p o l y m o 叩h i s m r o t a t i o np e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o 印h i s m s p e c i f i c 时p r o t e i nl t r i s e d t ab u 行e r t r i h y d r o x y m e m y l a m i n o m e t i 删舱 u r i o k i n a s e p l a s m i n o g e na c t i v i t o r 光密度 优势比 磷酸缓冲液 多聚酶链式反应 尿激酶型纤溶酶原激活物的基 因缩写 尿激酶型纤溶酶原激活物受体 的基因缩写 限制性片段长度多态性 每分钟转速 十二烷基磺酸钠 单核苷酸多态性 特异性蛋白l t r i s e d l a 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 尿激酶型纤溶酶原激活物 u p a r u r o l ( i n a s e - p l a s m i n 。g e n a c i v i 幻r 尿激酶型纤溶酶原激活物受体 u p a r 冰镦髀型玎冶黔原诹硒切又。降 r e c e p 瞳o r u t ru n t 姗s l a t e dr e g i o n 非翻译区 y y l y i n gl 阴阳因子l 第5 页共l l o 页 北京协和医学院中国医学科学院 博士学位论文 第一部分玻连蛋白基因变异与心肌梗死风险的关联性研究 中文摘要 研究背景 心肌梗死( m i ) 是全球范围内致死和致残的主要疾病之一。经过多年的研究， 医学界依然无法真正阐明其病因，也无法准确识别高危患者。心肌梗死是一种复杂 的异质性疾病，是基因和环境因素共同作用的结果，遗传度超过5 0 。基因和环境 因素影响动脉粥样硬化的发生发展，冠状动脉斑块的形态、代谢，动脉粥样硬化斑 块的不稳定，凝血和纤溶系统的平衡，血栓的形成，乃至各种临床表现。找出与心 肌梗死易感性相关的基因变异可以增进对心肌梗死病理生理机制的了解，进而促进 心血管疾病的预防和药物治疗。目前已知的冠心病( 包括心肌梗死) 风险因素除了 1 9 8 1 年已被描述过的2 4 6 个以外，近些年来又发现了多种风险因素，如：与凝血异 常升高和纤溶能力降低有关的分子；与心血管重塑和( 或) 炎症、同型半胱氨酸相 关的分子；细胞粘附分子( 如玻连蛋白) ：以及感染标志物。玻连蛋白广泛分布在 血浆、细胞外基质和血小板a 颗粒中，是一种具有多种功能的蛋白。近来的研究表 明，玻连蛋白参与动脉粥样硬化形成和血栓形成，并在其中起重要的调节作用，而 这二者正是与心肌梗死发生密切相关的病理生理过程。因此，我们提出假设，玻连 蛋白基因变异会增加心梗的风险。 研究目的 本研究拟在中国人群中验证玻连蛋白基因变异性与心肌梗死风险的关联。 对象和方法 本研究先在一个含有7 7 8 个心肌梗死病例和4 5 6 个正常对照的人群中对 t a g s n p 塔2 2 2 7 7 2 8 ( 2 8 9 l t c ) 进行了分型，随后在一个包含3 l o 个心肌梗死病例 第6 页共l i o 页 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 和8 2 1 个正常对照以及一个包含5 6 5 个心肌梗死病例和5 6 3 个正常对照的独立人群 中进行了重复。为了研究其潜在的机制，本研究进一步运用荧光素酶分析研究启动 子区的玻连蛋白变异对基因表达的影响效应，并用凝胶迁移试验确定受其影响的转 录因子。 研究结果 本研究发现：与携带t 基因型相比，携带c 等位基因能够显著增加心肌梗死的风 险。在未校正传统危险因素前，显性模式下三个人群的优势比( o r ) 分别为1 5 4 ( 9 5 可信区问【c i 】：1 2 1 到1 9 7 ，卢o 0 0 1 ) ，1 5 6 ( 9 5 c i ：1 1 9 到2 0 4 ，卢o 0 0 1 ) 和1 4 9 ( 9 5 c i ：1 1 7 到1 8 9 ，卢0 0 0 1 ) ；加性模式下三个人群的o r 分别为1 4 2 ( 9 5 c i ：1 1 6 至l j l 7 4 ，p = o 0 0 1 ) ，1 4 7 ( 9 5 c i ：1 1 7 到1 8 4 ，p = 0 0 0 1 ) 和1 3 5 ( 9 5 c i ：1 1 l 到1 6 4 ， 尸= o 0 0 3 ) 。在校正了传统危险因素后，显性模式下三个人群的o r 分别为1 5 7 ( 9 5 c i ：1 1 8 到2 0 8 ，p = 0 0 0 2 ) ，1 4 7 ( 9 5 c i ：1 0 3 到2 1 ，尸= 0 0 3 4 ) 和1 5 2 ( 9 5 c i ： 1 0 6t 02 1 8 ，尸= 0 0 2 2 ) ；加性模式下三个人群的o r 分别为1 4 5 ( 9 5 c i ：1 1 4 到1 8 3 ， p = 0 0 0 2 ) ，1 3 7 ( 9 5 c l ：1 0 2 到1 8 3 ，仁o 0 3 6 ) 和1 3 8 ( 9 5 c i ：1 0 4 到1 8 4 ，尸i = o 0 2 7 ) 。 功能实验证明在含有r s 2 2 2 7 7 2 0 ( _ 1 4 8 t c ) a n dr s 2 2 2 7 7 2 l ( 一7 8 g d 变异位点的玻 连蛋白启动子区的转录活性升高了4 4 ，并引起了特定转录因子结合活性的差异。 结论 本研究表明玻连蛋白基因变异可能是心肌梗死易感性的基因标记之一，并为今 后在世界上开展玻连蛋白基因变异性与心肌梗死的关联研究提供了基础。 关键词：玻连蛋白；基因变异；风险因素；心肌梗死 第7 页共l l o 页 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 g e n e t i cv a r i a n t si nt h ev i t r o n e c t i ng e n ea n dt h ei u s k0 f m y o c a r d i a li n f a r c t i o n a b s t r a c t b a c k g r o u n d m y o c 砌i a li l l f a r c t i o n ，ac o m p l e x 柚dh e t e r o g e n e o u sd i s e a s e 诵t hah e r i 协b i l i t ) ，e x c e e d i n g 5 0 ，i so n eo ft h el e a d i n gc a u s e so fm o r b i d i t ) ，a 1 1 dm o r 叫i t yb o t l l i nc h i n a 锄di i l w e s t e ms o c i e t y a r e rd e c a d e so fr e s e a r c h ，i ti ss t i l lab i gc h a l l e n g ef o rm e d i c a ls o c i e t ) rt o e l u c i d a t em ep a t h o g e n e s i s 锄dt oi d e n t i f yt h es u b j e c t sa tr i s k i i la d d i t i o nt 0t 1 1 e2 4 6 p r e v i o u sm e n t i o n e df k t o r s ，m o l e c u l e s 硒s o c i a t e dw i t ha b n o 姗a lc o a g u l a t i o n 锄dr e d u c e d f i b r i n o l y s i s ，、i t l lc 莉i o v 雒c u l a rr e m o d e l i n g 锄d o ri n f l 锄m a t i o n ，h o m o c y s t e i n e ，c e l l a d h e s i o nm o l e c u l e s ( s u c h 嬲v i t i o n e c t i n ) ，锄dm a r k e r so fi n f e c t i o nh a v eb e e nr e c e n t l y s u g g e s t e d t ob e锻s o c i a t e d诵t h c o r o n a 巧 a t h e r o s c l e r o t i cd i s e 弱e ( i n c l u d i n gm i ) i n d i v i d u a ls u s c 印t i b i l i t yt om id e p e n d so nm u l t i p l eg e n e t i c 锄de n v i r o n m e n t a if a c t o r s t h a ti n n u e n c ep 础o g e n e s i so fa t h e r o s c l e r o s i s ， c o r o n a 巧a n e 巧 l e s i o nm o r p h o l o g y ， m e t a b o l i s m ，s t a b i l i z a t i o no fa t h e r o s c l e r o t i cp l a q u e ， c o a g u l a t i o n - f i b r i n o l y s i sb a l 锄c e ， f 0 肌a t i o no ft t 啪m b i na n dt h e r e f o r ec l i n i c a l p r e s e n t a t i o n i d e n t i f i c a t i o n o fg e n e t i c v a r i 锄t sp r e d i s p o s i n gt om ii se s s e n t i a l t oi m p r 0 v eo u rl 【1 1 0 w i e d g eo ft i l em e c h 觚i s m s 1 d e r l y i n gm ia i l d ，o nab r o a d e rl e v e l ，t oa i l l e l i o r a t ec 删i o v 弱c u l a rd i s e 硒ep r e v e n t i o n 觚dp h 锄l a c o l o g i c a l 骶锄e n t 们n e c t i n ，am u l t i 劬c t i o n a lg l y c o p r o t e i n 嘶d e s p r e a di n p l 嬲m a 锄de x 昀c e l l u l a rm 撕x ，h 硒b e e ni d e n t i f i e d 硒am o d u l a t o ro fa t l l e r o g e n e s i s 锄d t l l f o m b o s i sw i l i c ha r ci m p o i r t a n tp r o c e s s e sd 谢n gm y o c a r d i a l i n f a r c t i o nd e v e l o p m e n t w b p r c s 啪e dt i l a t 矽7 g e n ev a r i a t i o nm i g h tc o n t r i b u t et 0t 1 1 er i s ko fm ) ，o c a r d i a ji n f a r c t o n o b j e c t i v 鹤 i nt l l ep r e s e n t 咖d y w ei n v e s t i g a t e dw h e m e rg e n e t i c 谢眦si nv i 仃o n e c 血g e n e c o n t r i b u t e dt 0t h er i s ko fm y o c a r d i a li n f a r c t i o n 第8 页共l l o 页 北京协和医学院中国医学科学院 博士学位论文 m e t h o d s 、，撕a n tr s 2 2 2 7 7 2 8w 雒s e l e c t e dt os t u d yi t sa s s 0 c i a t i o n “mm y o c a r d i a li n f a r c t i o n w e g e n o t y p e d r s 2 2 2 7 7 2 8i no n ep o p u l a t i o n i n c l u d i n g7 7 8p a t i e n t s 、v i t l lm y o c a r d i a l i n f i a r c t i o na n d4 5 6c o n 仃o is u 场e c t s ，锄dt l l e nt h er e s u l t s 舶mf i r s tp o p u l a t i o nw 弱 r e p l i c a t e di n 锄o m e r 似oi n d e p e n d e n tp o p u l a t i o 嬲t h e 劬c t i o no fl i n l ( e dv 撕a n t r s 2 2 2 7 7 2 0 卜l4 8 t c ) 觚dr s 2 2 2 7 7 2l ( _ 7 8 g dw e r es t u d i e db y 邺i n gl u c i f e r a s e r e p o n e ra s s a y s 觚de l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ) ，s h i n 硒s a y ( e m s a ) r e s u l t s w ef o u l l dt h a tr s 2 2 2 7 7 2 8ca l l e l ew 嬲s i g n i f i c 柚t l y 弱s o c i a t e d 谢t i li n c r e a s e dr i s ko f m y o c a r d i a li n f a r c t i o n u n d e rd o m i n a n tm o d e l ，t l l ec n j d eo d d sr a t i o s 【o r s 】i n3s t u d i e s w e r e1 5 4 ( 9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a l 【c i 】1 2 lt 0 1 9 7 ，尸= 0 0 0 1 ) ，1 5 6 ( 9 5 c i1 1 9t o 2 0 4 ，尸：o 0 0 1 ) a i l d1 4 9 ( 9 5 c i1 1 7t o1 8 9 ，p = 0 0 0 1 ) ，r e s p e c t i v e i y u n d e ra d d i t i v e m o d e l ，t i l eo i bw e r e1 4 2 ( 9 5 c i1 1 6t 01 7 4 ，p = o 0 0 1 ) ，1 4 79 5 c i ( 9 5 c i1 1 7t 0 1 8 4 ，p = 0 o o1 ) 锄d1 3 5 ( 9 5 c i1 1 1t 01 6 4 ，尸= 0 0 0 3 ) ，r e s p e c t i v e l y a r e ra d j u s t m e n t f o rc o n v e n t i o n a lr i s kf - a c t o r s ，t l l ea s s o c i a t i o nr e m a i n e d u n d e rd o m i n a n tm o d e l t l l e a d j u s t e do r si n3s t u d i e sw e r e1 5 7 ( 9 5 c i1 18t o2 0 8 ，产o 0 0 2 ) ，1 4 7 ( 9 5 c i1 0 3t o 2 1 ，尸_ 0 0 3 4 ) 锄d1 5 2 ( 9 5 c i1 0 6t o2 18 ，尸= o 0 2 2 ) ，r e s p e c t i v e l y u n d e ra d d i t i v e m o d e l ，t h eo i bw e r e1 4 5 ( 9 5 c i1 1 4t 01 8 3 ，p = 0 0 0 2 ) ，1 3 7 ( 9 5 c i9 5 c i1 0 2t o 1 8 3 ，尸踟0 3 6 ) 锄d1 3 8 ( 9 5 c i1 0 4t 01 8 4 ，尸= 0 0 2 7 ) ，r e s p e c t i v e l y 1 1 1 el i n l ( e dv 撕锄t r s 2 2 2 7 7 2 0 ( - l4 8 1 c ) 觚dr s 2 2 2 7 7 2l ( - 7 8 g di i l 脚，g e n ep r o m o t e rr e s u l t e di n4 4 h i 曲e r 的n s c r i p t i o n a la c t i v i t ) ，( 尸= 1 4 6 10 - 7 ) a i l da l t e r e db i n d i n go fs p e c i f i ct m s c r i p t i o n f - a c t o rc o m p l e x e s c o n c l u s i o n s n ep r e s e n tr e s u l t si n d i c a t et t l a t 玎g e n ev 撕a t i o ni sag e n e t i cf a c t o rc o i “b u t i n gt 0 i n t e r i n d i v i d 叫d i 腩r e n c e si i lm ir i s ki nc 址n e s eh 觚p o p u l a t i o n i ( e yw o r d s ：v i t i 。o n e c t i n ；g e n e t i cv 撕觚t ；d s kf a c t o r ；m y o c 捌i a l i n f a r c t i o n 第9 页共l i o 页 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 前言 心肌梗死是在冠状动脉粥样硬化病变的基础上并发粥样斑块破裂、出血、血管 腔内血栓形成，动脉内膜下出血或动脉持续性痉挛，使管腔迅速发生持久而完全的 闭塞时，如该动脉与其它冠状动脉间侧支循环原先未充分建立，即可导致该动脉所 供应的心肌严重持久缺血，l 小时以上即致心肌坏死。心肌梗死是全球范围内危害 人类健康的主要疾病之一，是一种致死率和致残率很高的复杂疾病，在发展中国家 心肌梗死是最大的死亡原因之一。在过去3 0 年中，心肌梗死发生后3 0 日内死亡率 降低到l o ，但一年内的死亡率依然不变，约为5 0 ，仍然严重威胁人类健康。经 过多年的研究，医学界依然无法真正阐明其病因，也无法准确识别高危患者。心肌 梗死作为一种复杂的异质性疾病，是基因和环境因素共同作用的结果，遗传度超过 5 0 【l ，2 】。由于复杂疾病的遗传模式不遵循孟德尔遗传规律，难以用一种固定的遗 传模式来描述：另外，复杂疾病常具有遗传异质性，即基因组不同部位存在多个某 疾病的易感基因，并且均可能增加疾病的易感性。复杂疾病还表现为临床表型异质 性，即同一疾病具有不同的临床表现。关联研究常用病例一对照设计，其基本原理 是检验一个遗传标志物( 等位基因变异) 在病例组的频率是否高于对照组。如果得 到阳性关联的结果，排除各种混杂因素后( 如人群分层) ，可以推断该标志物存在 于疾病易感基因座内或者与易感基因座连锁不平衡。基因和环境因素影响动脉粥样 硬化的发生发展，冠状动脉斑块的形态、代谢，动脉粥样硬化斑块的不稳定，凝血 和纤溶系统的平衡，血栓的形成，乃至各种临床表现。找出与心肌梗死易感性相关 的基因变异可以增进对心肌梗死病理生理机制的了解，进而促进心血管疾病的预防 和药物治疗。目前已确定的冠心病( 包括心肌梗死) 风险因素有2 4 6 个【3 】，尚有 2 0 5 0 患者没有携带已知的危险因素。近些年来又发现了多种风险因素，如： 与凝血异常升高和纤溶能力降低有关的分子；与心血管重塑和( 或) 炎症、同型半 胱氨酸相关的分子；细胞粘附分子( 如玻连蛋白) ；以及感染标志物【4 】。玻连蛋白 广泛分布在血浆、细胞外基质和血小板q 颗粒中，是一种具有多种功能的蛋白。近 第1 0 页共i l o 页 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 来的研究表明，玻连蛋白参与动脉粥样硬化形成和血栓形成，并在其中起重要的调 节作用，而这二者正是与心肌梗死发生密切相关的病理生理过程。 玻连蛋白是凝乳酶( p e x i n ) 家族的一员，分子量为7 5 i a ，以单链( 7 5 k d a ) 和还原状态的双链( 1 0 和6 5 l ( d a ) 这两种形式循环，等电点介于4 7 5 和5 2 5 之间。 在非还原状态下，n 一端6 5 l a 片段和c 一端l o l ( d a 片段以一个二硫键相连【5 】。玻连 蛋白是一种广泛存在于血浆、细胞外基质和血小板a 颗粒中的糖蛋白【6 9 】。玻连 蛋白在常人血浆的含量为2 0 0 4 0 0 鹏m l ，占血浆蛋白总量的o 2 - o 5 【6 ，l o 】，肝脏 是其主要合成场所。玻连蛋白的另一个循环库存在于血小板内，但这种能够快速释 放的胞内形式仅占循环玻连蛋白库的0 8 【l l 】。玻连蛋白的开放读码框中存在一个 带有1 9 个氨基酸构成的信号肽的4 5 9 氨基酸的蛋白，该蛋白含有三个糖基化位点， 约占其分子量的3 0 【1 2 】。玻连蛋白基因( ) 位于染色体1 7 q 1l ，长3 0 7 6 b p ， 由8 个外显子和7 个内含子组成，其转录本为1 7 k b ，无选择性剪切存在【1 3 】。 作为一种构象易变的生物分子，玻连蛋白能够与多种生物分子结合，如：肝素、 胶原蛋白、纤溶酶原、纤溶酶原激活物抑制因子1 ( p a i 1 ) 、尿激酶型纤溶酶原激 活物( u p a ) 及其受体( u p a r ) 复合物、细胞表面的一系列整合素，等等。通过与 这些生物分子的相互作用，玻连蛋白参与调节多项生理过程，如：血栓形成，止血， 纤溶，胞外蛋白裂解，补体依赖的免疫防御，血管平滑肌细胞和白细胞的粘附，细 胞增值、迁移，新内膜形成和新生血管的形成【1 3 2 6 】。 纤溶酶原转变成有纤溶活性的纤溶酶是纤溶过程决定性的一步，而p a i l 是纤 溶系统最主要的快速抑制物，在调节纤维蛋白溶解系统和细胞外重塑的生理学和病 理生理学过程中起着重要的作用。玻连蛋白与p a j 1 形成的复合体结构可以将循环 p ：a i 1 的半寿期延长2 到4 倍【2 7 】，这一复合体能够将活化的p a i 1 稳定在血管受损 位点和血小板聚集位点。通过稳定蹦1 的活性构象并与l l p a r 结合，玻连蛋白参 与纤维蛋白溶解作用的调节。玻连蛋白还能通过与肝素竞争性结合抗凝血酶i i i 进 而抑制凝血酶和x a 因子的快速失活【2 8 】。u p a 和眦除了参与细胞外蛋白水解外， 还通过与细胞外基质蛋白( 如玻连蛋白) 相互作用调节多种细胞的迁移、粘附和增 殖【2 9 】。要激活u p a r 下游通路中的细胞结构变化、迁移和信号传导，u p a r 必须与 第l i 页共1 1 0 页 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 玻连蛋白的直接作用【3 0 】。 玻连蛋白通过与特定的整合素( a v p 3 、a ，p 5 、蛳p i 、a i i b p 3 ) 以及尿激酶受体的 相互作用促进细胞粘附、伸展和迁移；在生长因子如胰岛素和碱性成纤维生长因子 存在的情况下，玻连蛋白与整合素的相互作用能够促进细胞增殖【1 3 】。玻连蛋白糖 基化能够破坏细胞粘附和伸展，从而引起内皮功能障碍f 3 1 】。玻连蛋白参与平滑肌 细胞的增殖【3 2 】、粘附【3 3 】和迁移【2 3 】，而平滑肌细胞迁移参与粥样硬化病变的内膜 增厚过程。 玻连蛋白在血栓形成中的作用仍有争议，有些认为是抑制物【3 4 】，有些认为是 支持物【3 5 】起作用目前还存在争议。玻连蛋白缺陷型小鼠实验证实玻连蛋白有稳定 血栓的作用【2 2 ，3 6 】。成年玻连蛋白缺陷小鼠动脉损伤后激活凝血系统，诱导形成的 血栓稳定性差且常常发生栓塞；此外，亦出现血管闭合延迟【3 7 】。然而，也有研究 认为玻连蛋白缺陷小鼠比野生型小鼠形成动脉闭塞血栓的速度更快【3 8 】。最新的研 究显示玻连蛋白稳定血栓和血管闭合，并在血小板聚集中起双重作用【3 9 】。有研究 认为玻连蛋白结合在血小板表面的糖蛋白上，可能介导血小板粘附和聚集在损伤部 位【4 0 】；也也有研究认为玻连蛋白抑制血小板聚集，并与纤维蛋白原和v w f 竞争性 结合糖蛋白i i m i i a ，并指出玻连蛋白可能抑制血小板依赖性血栓形成【4 l 】。 玻连蛋白曾被报道会积聚在动脉粥样硬化斑块内【4 2 】，也有研究观察到动脉粥 样硬化斑块处玻连蛋白分布是正常组织的1 2 倍【4 3 】，提示玻连蛋白的局部积聚可能 与动脉粥样硬化类血管病有关。人体研究表明在冠心病患者体内血浆玻连蛋白水平 升高，且与疾病的严重程度正相关，提示玻连蛋白在冠心病的发生发展过程中可能 起一定的作用 4 4 】。动物模型研究表明：内源性纤维蛋白溶解以及p a i l 在血管损 伤后的闭塞性血管血栓形成中起重要作用，玻连蛋白参与调控这一过程【4 5 】。最新 研究表明：经皮冠脉介入治疗( p c i ) 后，无论是否放入支架，玻连蛋白水平均为 早期( 3 0 天) 和晚期( 6 个月) 重要心血管不良事件的独立预测指标【4 6 】。 综上所述，玻连蛋白基因是研究心肌梗死的一个好的候选基因。而到目前为止， 玻连蛋白基因变异与心肌梗死的关联在国内外尚无研究。由于位于玻连蛋白基因的 四个变异位点：位于启动子区的璐2 2 2 7 7 2 0 ( 一1 4 8 d ) 和璐2 2 2 7 7 2 l ( 一7 8 g t ) ， 第j 2 页共l i o 页 北京协和医学院中国医学科学院 博士学位论文 以及位于e x o n 7 的r s 7 0 4 ( m e t 3 8 1 1 1 l r ) 和位于e x o n 8 的r s 2 2 2 7 7 2 8 ( a s n 4 2 9 a s n ) 是 完全连锁的( 6 0 8 5 ) ，本研究选择了门基因唯一的t a g s n pr s 2 2 2 7 7 2 8 进行了玻 连蛋白基因变异与心肌梗死的关联研究，并研究其潜在机制。 第1 3 页共l l o 页 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 研究对象与方法 一研究对象： 1 病例及对照的入选标准： 第一人群包括7 7 8 个心肌梗死患者和4 5 6 个正常对照。心肌梗死患者来自北京 市阜外心血管病医院，均经冠脉造影及左心室造影，且有一支以上的主要冠脉狭窄 程度大于5 0 。心肌梗死患者的诊断还包括心电图的典型异常改变( 明尼苏达编码 1 1 或1 2i n ) ，血清中肌钙蛋白t 、肌钙蛋白i 、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白、天冬 氨酸氨基转移酶和谷丙转氨酶的异常升高。正常对照来自阜外医院行冠状动脉造影 和左室造影证明狭窄程度小于2 0 且无任何血管疾病者。 第二人群包括3 1 0 个心肌梗死患者和8 2 1 个正常对照。心肌梗死患者来自北京 市同仁医院( 1 7 3 ，5 5 8 ) 和天津胸科医院( 1 3 7 ，4 4 2 ) ，入选标准同第一人群。 对照人群随机挑选自地域匹配的健康社区居民( n _ 7 3 8 ，8 9 9 ) 或来自医院住院部 ( n = 8 3 ，1 0 1 ) ，且均无任何血管类疾病。 第三人群包括5 6 5 个心肌梗死患者和5 6 3 个正常对照。心肌梗死患者来自武汉 同济医院，入选标准同第一人群。地域匹配的对照随机挑选自健康的社区居民，均 无任何血管类疾病。 入选病例和对照个体均经详细询问病史、体检及实验室检查排除先天性心脏 病、心脏瓣膜病、肝病、肾病和内分泌系统疾病。所有个体均为中国汉族人，彼此 无亲缘关系。本研究得到阜外心血管病医院和其他参与医院的伦理委员会的批准， 所有个体都签署了知情同意书，所有个人信息均经保密。 2 体格检查和血标本采集： 体格检查：包括体征测量、血压测量。体征测量包括身高、体重、腰围的测量。 体重指数的计算公式为：体重指数= 体重( 公斤) 身高2 ( 米2 ) 。血压取右臂两次坐位 血压测量值的平均值。血压测量用标准袖带式水银柱血压计，以k 0 0 t o k o f r 法测量右 上臂肱动脉血压，以柯氏第一相作为收缩压，柯氏第五相作为舒张压，取连续2 次 第1 4 页共l l o 页 北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文 血压( 间隔5 分钟) 的平均值。根据1 9 9 9 年世界卫生组织国际高血压联盟 ( w h o i s h ) 高血压诊断标准【4 7 】：收缩压芝1 4 0m m h g 和或舒张压9 0m m h g ， 或服用抗高血压药物。糖尿病的诊断标准为：空腹血糖水平之7 o i l u i l o l l ，或餐后2 小时血糖之1 1 1 m m o l l 【4 8 】。“曾经吸烟”定义为：有生以来吸烟多于2 0 包，或者持 续一年每天吸烟至少一支。 血标本采集：研究对象抽血前1 2 小时内禁食，采集静脉血。自动生化仪( 7 0 6 0 ， h i t a c h i ，j a p 锄) 检测相关的生化指标。 二实验材料： 1 主要试剂： 蛋白酶e ，购自上海生物工程技术有限公司；t a q 酶、d n am a r k e r ( d l 2 0 0 0 ) ， 购自t a k a r a 生物技术有限公司；d n t p ，购自北京三博远志生物技术有限公司；限 制性内切酶和高保真d n a 聚合酶，购自美国n e we n g l 觚db i o l a b s 公司；p c r 引物， 由北京奥科生物技术有限公司和上海基康生物技术有限公司合成；d n a “g a t i o n k i t ，p g l 3 报告载体，购自聊c a r a 公司；t i a n p r e pm i d i 质粒小提 中量试剂盒和t i a n g e lm i d i 琼脂糖凝胶d n a 回收试剂盒，购自北京天根生化公司； h i s p e e dp l 嬲m i dm i d i 质粒d n a 提取试剂盒和h o t s t a rh i f i d e l 时d n a 聚合酶试剂 盒，购自q i a g e n 公司；转染试剂l i p o f e c t 锄i n e2 0 0 0 ，购自i n v i n d g e n 公司；大肠 杆菌e c 0 1 d h 5 a ( 本实验室保存) ；其它试剂，包括双蒸水、无水乙醇、氯化钠、 氯仿、瞄s 、e d t a 、硼酸、氢氧化钠、甲醛、冰醋酸、溴酚蓝、甘油、氯化铵、碳 酸氢铵、醋酸钠、s d s 等，购自北京化工厂；b c a 蛋白浓度测定试剂盒和非放射性 e m s a 飚t 购自v i a g e n e 公司；t a q m 觚 s n p 基因分型试剂盒购自美国a b i 公司； s p l 、y y l 、g a l 队2 和c d p 抗体购自美国s a n t a c m z 公司。 2 实验仪器： p c r 仪：g e n e 加n pp c r5 7 0 0 ( 美国a b i 公司) ；电泳仪：美国b i o r a d 公司和 v i a g e n e 公司多用途电源p o w e r d c ；电泳槽：美国b i o r a d 公司；低温高速离心 机：s u p e r t 2 l ( 美国s o r v a l l 公司) ：低温甩板离心机：5 8 0 4 r 和5 4 0 2 r ( 德国e p p e n d o r l f 公司) ；电热恒温培养箱：中国上海跃进医疗器械厂；紫外凝胶成像系统：g e ld o c l o o o 第1 5 页共1 1 0 页 北京协和医学院中国医学科学院 博士学位论文 型( 美国b i o - m d 公司) ；电子分析天平：精度1 1 0 0 0 9 ( 中国上海天平仪器厂) ；分光 光度计：d u r6 4 0 型( 美国加利福尼亚州富尔顿市b e c l 洲a n 公司) ；d n a 自动测 序仪：m o d e l3 7 7 ( 美国a b i 公司) ；微量移液器：德国b m d 公司；超纯水净化装置： 美国m i l l i - q u 昂l 璐；电转移系统：二代转移装置( b i o r - a d 公司) ；紫外交联仪：u v s t m t a l i r 妇r 1 8 0 0 ( s t r a l 7 g e n 公司) ；成像系统：c 0 0 l h n g e r ( v i a g e n e 公司) ；7 9 0 0 型荧光定量p c r 仪：美国a b l 公司。 三实验方法： 1 基因组d n a 的提取及浓度测定：采用盐析法从白细胞中提取d n a 1 1 抽取外周静脉血，分离白细胞： ( 1 ) 取患者肘静脉血5 m l ，5 0 p le d t a ( o 5 m ) 抗凝； ( 2 ) 2 ，5 0 0 印m 离心1 0 分钟；弃上层血浆： ( 3 ) 在血细胞中加入3 倍体积l 溶血液，摇匀( 不能有血块) ，放置1 5 分钟； ( 4 ) 3 ，5 0 0 印m 离心1 0 分钟，弃上清； ( 5 ) 加入1 0 m l l 溶血液，摇匀( 动作轻缓) ，冰浴1 5 分钟； ( 6 ) 3 ，5 0 0 叩m 离心1 0 分钟，弃上清；倒置离心管，流干残液； ( 7 ) 将所得的白细胞置于8 0 冰箱冻存。 1 2 从白细胞中提取基因组d n a