（遗传学专业论文）cul4b细胞周期候选靶蛋白的分析.pdf

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d e p e n d e n tk i n a s e s ( c d k s ) a n d e y c l i n - d e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o r s ( c k i s ) s t u d i e sh a v es h o w nt h a tt h es y n t h e s i s ， d e g r a d a t i o na n dp o s t - t r a n s l a t i o nm o d i f i c a t i o no ft h e s er e g u l a t o r sa r er e s p o n s i b l ef o r c e l lc y c l er e g u l a t i o n u b i q u i t i n - d e p e n d e n tp r o t e o l y s i si saf u n d a m e n t a lc e l l u l a rm e c h a n i s mf o rp r o t e i n a c t i v i t yr e g u l a t i o na n dp l a y si m p o r t a n tr o l e si nc e l lc y c l er e g u l a t i o n i ti sr e s p o n s i b l e f o rm o s tc e l lc y c l er e g u l a t o r sd e g r a d a t i o n c u i a bi sam e m b e ro fc u l l i nf a m i l yw h i c h b e l o n g s t oe 3l i g a s ef f l l z y m e f a m i l yf u n c t i o n i n g i nt h eu b i q u i t i n - d e p e n d e n t p r o t e o l y s i s f i n d i n g st h a tx c h r o m o s o m ei n a c t i v a t i o nw a se x t r e m e l ys k e w e di nt h e c a r r i e r s ，a b n o r m a l i t yi ns k e l e t o no ft h ep a t i e n t sw i ll o s so ff u n c t i o nm u t a t i o ni n c u l 4 ba n dt h esp h a s ew a sp r o l o n g e di nc u i a b - d e f e c i e n th e l ac e l l ss u g g e s tt h a t c u i a bm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nc e l lc y c l er e g u l a t i o n h o w e v e rl e s si sk n o w n a b o u tt h ee x a c tm e c h a n i s m t h e r e f o r ei ti si m p o r t a n tf o ru st oi d e n t i f yt h es u b s t r a t e s o f c u i a bi no r d e rt oi l l u s t r a t et h em e c h a n i s mo fc d lc y c l er e g u l a t i o nb yc u i a b 3 山东大学硕士学位论文 f i r s t l y , w ei n v e s t i g a t e dt h ee x p r e s s i o no fs e v e r a lc e l lc y c l er e g u l a t o r ss u c ha sp 21 ， p 2 7 ，p 5 3 ，c d t l ，c d c 6 ，c y d i nd 1 ，c h k l ，e 2 f 1 ，c d c 2 5 a ，c d c 2 5 ca n dc d k 2i n a s y n c h r o n o u sc u i a b - d e f i e i e n th e l aa n dh e k 2 9 3c e l l sa n dc o n t r o lc e l l sb yu s i n g w e s t e r nb l o t t i n g h o w e v e rw ed i dn o tf i n da n ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nt h e e x p r e s s i o no ft h e s ep r o t e i n sb e t w e e nc u l 4 b - d e f i e i e n tc e l l sa n dc o n t r o lc e l l s t h e nw et r e a t e dc e l l sw i 也s e v e r a ld r u g st os y n c h r o n i z eb o t ht h ec u i a b d e f i c i e n t c e l l sa n dc o n t r o lc e l l st od i f f e r e n tp h a s e ss u c ha sg 1 ，sa n dg 2 mp h a s e ，a n dw eu s e d f c mt oc h e c kt h ee f f i c i e n c yo fs y n c h r o n i z a t i o n a f t e rt h ep r o t o c o lw a sd e t e r m i n e d , w ei n v e s t i g a t e dt h ee x p r e s s i o no ft h o s ep r o t e i n si nt h es y n c h r o n o u sc e l l sb yu s i n g w e s t e r nb l o t t i n g w ef o u n dt h a tw h e nw eu s e dh ut os y n c h r o n i z ec e l l st osp h a s e , p 2 7 ，p 5 3a n dc h k lp r o t e i n sw e r ea c c u m u l a t e di nc u i a b - d e f i c i e n th e l ac e l l s h o w e v e r , t h e r ew a sn oo b v i o u sa c c u m u l a t i o no fp 2 7i nc u l 4 b - d e f i c i e n th e k 2 9 3 c e l l s w h i l ec h k la c c u m u l a t e di nsp h a s ei nc u l 4 b - d e f i c i e n th e k 2 9 3c e l l s ，p 5 3 p r o t e i ni n c r e a s e di ng 1 sb o u n d a r y i no r d e rt oi d e n t i f yt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f t h ea c c u m u l a t i o no fp 2 7 ，p 5 3a n dc h k li nc u l 4 b - d e f i e i e n th e l ac e l l sw h i c hw e r e s y n c h r o n i z e dt osp h a s e ，w ei n v e s t i g a t e dt h ee x p r e s s i o no fm r n a o ft h e s eg e n e sa n d f o u n dt h a tt h e r ew e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e nc u i a b - d e f i c i e n ta n dc o n t r o l c e l l s t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ea c c u m u l a t i o no ft h e s ep r o t e i n sw a sd u et ot h e p o s t - t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n ，b u tn o tt h et r a n s c r i p t i o n i na d d i t i o n , t h ei n c r e a s e d h a l f - l i f eo fp 2 7a n dc h k lp r o t e i n si nc u i a b - d e f i c i e n th e l ac e l l ss y n c h r o n i z e dt os p h a s ei n d i c a t e d t h a tt h e d o w n - r e g u l a t i o no fc u i a bl e d t ot h ed e f e c to ft h e d e g r a d a t i o no ft h e s ep r o t o n s f u r t h e rs t u d i e ss h o w e dt h a te x p r e s s i o no fe x o g e n o u s f u l ll e n g t hc u i a bi nc u i a b d e f i c i e n tc e l l sc o u l dr e d u c et h ea c c u m u l a t i o no ft h e s e p r o t e i n sc a u s e db yt h er e d u c t i o no fe n d o g e n o u sc u i a b t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a t c u i a bp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei n t h ed e g r a d a t i o no f p 2 7 ，p 5 3a n dc h k l t a k e nt o g e t h e r , t h i ss t u d ye s t a b l i s h e dt h ea p p r o p r i a t em e t h o d sf o rc e l lc y c l e s y n c h r o n i z a t i o n b a s e do nt h e s em e t h o d s ，w ef o u n dt h r e ec a n d i d a t es u b s t r a t e so f c u i a b t h e s er e s u l t sh e l p e du st oa d v a n c eo b ru n d e r s t a n d i n go ft h ef u n c t i o n so f 4 山东大学硕士学位论文 c u i a bi nc e l lc y c l er e g u l a t i o n k e yw o r d s ：c u l 4 b ；c e l lc y c l er e g u l a t i o n ；p 2 7 ；p 5 3 ；c h k l ；sp h a s e 5 d n t p b s o d l b i 玎g d e p c e b d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e f e t a lb o v i n es e r u m o p t i c a ld e n s i t y l u r i a - b e t a n im e d i u m i s o p r o p y l t h i o - d - g a l a c t o s i d e d i e t h y p y r o c a r b o n a t e 一一 e t h i d i u mb r o m i d e 脱氧核苷三磷酸 胎牛血清 光密度 l b 培养基 异丙基b - d 硫代半乳 糖苷 焦碳酸二乙酯 溴化乙锭 a p sa m m o n i u m p e r s u l f a t e过硫酸铵 t e m e d n n n n - - t e t r a m e t h y l - e t h y l e n e d i a m i n e四甲基乙二胺 h r ph o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e辣根过氧化物酶 6 山东大学硕士学位论文 前言 细胞周期是细胞生命活动的基本过程，是指从细胞分裂结束开始，到下一次 分裂结束为止的过程，d n a 复制和细胞分裂是细胞周期的两个主要事件。在进 化过程中，细胞建立并发展了一系列的调控机制，以确保细胞周期严格有序地交 替和各时相依次有序变更。正常的细胞只有当组织生长受到发育或其它分裂信号 的刺激才会进行增殖，癌细胞正是由于缺乏相应的检验机制而进行恶性增殖。目 前细胞周期的主要调控机制已经研究的较为深入，一系列激酶在促进细胞周期各 时相转换中发挥作用。其中细胞周期蛋白依赖激酶( c y c l i n - d e p e n d e n tk i n a s e , c d k ) 家族蛋白对一系列蛋白的磷酸化是这一调控网络的核心1 。每一种c d k 都有对应的正调控因子( 细胞周期蛋白，c y c l i n ) 2 和负调控调节因子( 细胞周期 蛋白依赖性激酶抑制剂，c ) 对其活性进行调控。 在哺乳动物中已发现的c y c l i n 有9 大类，主要有c y c l i na 、b 、d 和e 等， c y c l i n 分子在结构上都有一个高度保守的细胞周期蛋白盒和降解盒结构。前者参 与与c d k 的结合，后者参与c y c l i n s 的自身降解。各种c y c l i n 含量在细胞周期呈 周期性的变化，与在整个细胞周期中表达比较恒定的、相应的c d k 结合，形成 复合物并激活c d k 的激酶活性。在g 1 期和g 1 s 交界处发挥作用的主要有 c y c l i n d 、e ；而c y c l i na 则在s 期发挥作用，并且同c y c l i nb 一起参与g 2 m 转 换和细胞分裂活动。其中，c y c l i nd 与c d k 4 c d k 6 相结合，c y c l i ne 与c d k 2 相结合，c y c l i na 在s 期与c d 勉结合而在( 3 2 和m 期与c d k l 结合，c y c l i nb 则是通过与c d k l 结合来调控c d k l 的激酶活性3 。 这一调控过程可大致概括如下：( 1 ) 处于静止期的细胞在接受外界增殖信号的 刺激下激活r a s r a f - m a p k 通路，后者激活至少一种d 类c y c l i n ( c y c l i nd 1 、c y c l i n d 2 和c y d i nd 3 ) 舶的表达。c y c l i nd 的表达谱随着细胞的不同而改变，其中c y c l i n d 1 被证明是表达最广泛的c y c l i nd ，因此是人们研究的重点。表达的c y c l i nd 与 c d k 4 或者c d k 6 形成复合物，激活c d k 的激酶活性，保证细胞顺利的完成g l 期。( 2 ) 到g 1 期晚期，被激活的c d k 4 c d k 6 进一步磷酸化r b 蛋白。磷酸化的 r b 蛋白不能继续与e 2 f 1 等转录因子结合，而释放e 2 f 1 等转录因子入核激活e 7 使细胞能够完成s 期，并在g 2 期发挥功能9 ，1 0 0 ( 4 ) c y c l i nb 在s 期的晚期便开 始表达并与c d k l 结合，但是并没有激酶活性，直到g 2 晚期才被激活。c y c l i nb 与c d k l 形成的复合物作用于与执行有丝分裂事件相关的结构蛋白和控制有些 分裂时序相关的调控蛋白，保证细胞完成有丝分裂。 c k i 是c d k 的抑制物，可以阻止细胞通过检验点，具有抑癌基因的活性。 与p 5 3 这种作为一种转录因子发挥调节作用的抑癌基因不同，c k i 通过直接与 c d k c y c l i n 的复合物结合而抑制c d k 激酶活性，调节细胞周期进程。目前已经 发现了7 种c k i ，分为i n k 4 ( p 1 6 、p 1 5 、p 1 8 和p 1 9 ) 和c i p k i p ( p 2 1 、p 2 7 和 p 5 7 ) 两大家族。i n k 4 ( i n h i b i t o ro fc d k 4 ) 家族，又称p 1 6 家族，同c d k 4 和 c d k 6 相结合，能够特异性的抑制c d k 4 和c d k 6 的激酶活性。c i p k i p 家族， 又称p 2 1 家族，能够广泛的抑制c d k c y c l i n 的作用1 2 。 细胞便是以上述网络为核心对其周期进程进行调控。细胞周期中表达水平呈 周期性变化的c y c l i n s 是细胞合成和降解两个过程综合作用的结果。同样细胞要 确保正常的进行周期进程也需要在特定的时期降解c k i 以及其它的周期调控蛋 白，保证细胞周期进程不受抑制。这些降解过程均依赖于泛素化降解系统。总之， 细胞形成了三种不同水平的调控来保证细胞周期顺利进行：( 1 ) 依靠磷酸化作用 对d n a 合成和染色体复制等细胞周期事件进行监控。( 2 ) 这种监控依赖于c y c l i n s 与c k i 对c d k 激酶活性的调节。( 3 ) 对c y c l i n 及c k i 的蛋白质定量监控是通过 泛素化降解系统来实现的。 2 0 0 7 年我们实验室对邹城市的一个x 连锁精神发育迟滞大家系进行研究后 发现患者c u l 4 b 基因第9 个外显子内存在一个c 到t 的碱基改变( c 1 5 6 4 c t ) ， 该碱基的改变导致编码c u i a b 蛋白第3 8 8 位精氨酸的密码子突变成终止密码 子。综合其它方面的证据，我们认为该家系中患者出现的精神发育迟滞及多方面 的发育异常是由于c u l 4 b 基因丧失功能突变造成的1 3 。另外，英国的一个研究 8 山东大学硕士学位论文 小组通过对2 5 0 个x l m r 家系进行突变筛查后发现其中8 个x 连锁精神发育迟 滞家系的患者是由于c u i a b 基因突变所致。以上研究结果提示c u l 4 b 是一个 非常重要的x 连锁精神发育迟滞致病基因1 4 。 2 0 0 9 年b e r t r a n di s i d o r 等发现c u l 4 b 基因上另外一个新的突变。该突变位 点导致c u l 4 b 基因的移码突变被认为是一个男孩患综合征型精神发育迟滞的致 病原因1 5 。b a d u r a - s t r o n k a 等也发现了一个新的突变位点造成c u l 4 b 基因发生无 义突变，而导致一个家系中3 个波兰的兄弟患x 连锁精神发育迟滞。这些由于 c u l 4 b 基因发生突变而导致精神发育迟滞的患者，除了表现有精神发育迟滞这 一典型症状外还患有巨舌、并趾、性腺和骨骼发育异常等症状，甚至还有的患者 还具有其它综合征体征( 舒尔曼综合症) 1 5 这些结果提示c u l 4 b 在包括神经 系统在内的多个系统发育过程中都发挥着重要的作用。 c u i a b 是c u l l i n 家族的一员，属于e 3 连接酶的一种，参与泛素依赖的蛋白 质降解调控。蛋白质的泛素化主要是发生在蛋白质的赖氨酸残基的侧链，且通常 是多聚化过程。被多泛素化修饰的蛋白质会被蛋白酶体( p r o t e a s o m e ) 识别进而 被降解三种关键的酶共同介导了这一多泛素化过程，包括泛素活化酶e 1 ( u b i q u i t i na c t i v a t i n ge n z y m e ) 、泛素结合酶e 2 ( u b i q u i t i nc o n j u g a t i n ge n z y m e ) 和泛素连接酶e 3 ( u b i q u i t i n - p r o t e i nl i g a s ee n z y m e ) 1 6 首先由e 1 通过其活性中心 的c y s 残基与泛素的c 末端形成硫酯键活化单个游离的泛素( 此步骤需要a t p ) ， 然后e 1 将活化的泛素递交给e 2 ，最后由e 3 募集特异的底物和e 2 ，并介导泛素从 e 2 转移到靶蛋白1 7 , 目前仅发现两种e 1 、少数几种e 2 和5 0 0 多种e 3 连接酶，并且 蛋白酶体识别泛素化的蛋白并将其降解是一个非特异性的进程，因此，e 3 在整 个蛋白质泛素化降解过程中起到了重要的作用，也决定了反应的特异性。 人类c u l l i n 家族共有七个成员：c u l l 、c u l 2 、c u l 3 、c u i a a 、c u l 4 b 、 c u l 5 和c u l 7 ，这些蛋白因都具有c u l l i n - r e p e a t 结构而得名1 8 ，1 9 。c u l 4 在 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 中不存在，而在较高等的s c h i z o s a c c a r o m y c e sp o m b e 、 x e n o p u sl a e v i s 、c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s 、d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 和a r a b i d o p s i s t h a l i a n a 中均有表达。c u l 4 r e s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e 、ce l e g a n s 、d r o s o p h i l a 和a r a b i d o p s i s d p 仅存在一种类型，而在哺乳动物细胞中则存在两种紧密相关的同 系物：c u i a a 和c u i a b 。这两种同系物也存在于斑马鱼中，说明c u i a 的两种同 9 山东大学硕士学位论文 系物可能特异性的存在于脊椎动物细胞中。 c u l l i n s 的作用类似活性e 3 组装的“支架 ，c 末端通过结合r b x ( e 2b m d m g r i n gf i n g e rp r o t e i n ) 蛋白与e 2 相连，n 端则与底物受体相连。在已发现的c u l l i n 中， c u l l 和c u l 7 通过与s k p l 和不同的f - b o xp r o t e i n 结合来招募特异性底物2 毗；c u l 2 和c u l 5 通过结合e l o n g i n b c 以及v h l - b o x 和s o c s - b o x 来捕获特异性底物2 3 ，2 4 ； c u b 则通过b t b 结构域与底物结合2 5 ；c u l 4 a 与c u l 4 b 则通过d d b l 和不同的 d c a f s ( d d b l c u l 4a s s o c i a t e df a c t o r s ) 分子相互作用来招募特异性底物，而且 这些d c a f s 大多通过w d 4 唧嘞t 结构域与d d b l 结合砌。w d 4 0 重复蛋白是一 个具有高度保守基序但具有多种功能的大家族。w d 4 0 重复结构是一段4 4 6 卟氨 基酸残基的序列，在距n 端1 1 2 4 个残基，存在一个甘氨酸组氨酸( g h ) 的二肽， 而在c 末端存在一个酪氨酸天冬氨酸( w d ) 的二肽2 9 。w d 4 0 重复蛋白形成一个 类似于螺旋桨结构，比较典型的具有七个螺旋片，每个螺旋片包含了4 个反向平 行的p 片层。研究发现w d 4 0 重复蛋白在细胞周期、信号转导和系统发育等多个 生理过程中发挥重要作用。 细胞内泛素化系统的异常会导致严重的细胞周期失调。人们首次对c u l l i n 家族e 3 连接酶的认识始于c u l l 对细胞周期调控方面的相关研究，m a t h i a s 等发 现c u l l 基因的突变可以导致出芽酵母不能顺利地从g 1 期向s 期转换3 0 ，同时 与g l 期相关的周期蛋白也有一定程度的积累3 1 。随着研究的深入，人们发现在 细胞周期调控中起到重要作用的主要有两种复合体，s c f ( s k p l c u l l f - b o x ) 3 2 和后期促进复合体周期小体( a p c c ) 3 3s c f 复合体包括了3 种不变组分 ( i m x l 、c u l l 和s k p l ) 和一个可变组分( f - b o x 蛋白) 。f - b o x 蛋白通过f b o x 基序与s k p l 结合并决定了对底物蛋白的识别。目前在人体中已经找到大约7 0 种f - b o x 蛋白，可以分为三大类：具有w d 4 0 重复结构的蛋白( f b x w ) 、富含 亮氨酸重复的蛋白( f b x l ) 和含有其他结构域的蛋白( f b x o ) 3 4 。a p c c 在结 构上与s c f 相似，包含了不可变核心组分一a p c i l ( r b x l 相关的r i n g f i n g e r 蛋白) 、a p c 2 ( 支架蛋白) 和至少1 1 种其他的组分，还有两种可变组分一d c 2 0 和c d h l ，如同f b o x 蛋白，它们构成了a p c c 特异性识别底物的结构基础3 3 。 另外在有丝分裂期和非分裂细胞中还有一些其他的激活因子用来调节a p c c 复 合物的生物学功能3 5 。 1 0 山东大学硕士学位论文 虽然s c f 与a p c c 两种复合物在结构和生化特点上有相似之处，但是它们在 细胞中的功能却有很大差异。最显著的差异在于两种复合物有着不同的作用时 相。a p c c 的激活是从有丝分裂后期直到g 1 期结束，而s c f 主要是从g 1 的晚期 开始激活直到m 期的早期。它们在细胞周期调控中相互补充，形成了一个调控的 环路3 8 。 已有研究表明，c u l 4 在细胞周期调控中也发挥了至关重要的作用。在& 印m 抛中国群的突变将导致染色质不能正常浓缩而造成多种染色质缺陷3 9 ，4 0 。而 c u l 4 低表达导致c o l e g a n s 细胞c d t l 在细胞完成s 期后不能被及时降解而造成 发育停滞并且引起d n a 重复复制出现多倍体现象4 1 c u l 4 a 在肺癌和肝癌细胞中 表达增高4 2 m 。另外，最近一项研究表明在肺癌患者中c u i a a 的高表达预示着较 差的预后4 5 。在哺乳动物中，敲除第一个外显子的c u l 4 a 敲除小鼠出现早期胚胎死 亡4 6 。2 0 0 9 年，k o p a n j a 等通过敲除tc u l 4 a 第4 8 个外显子构建了另外一种c u l 4 a 的敲除小鼠。该小鼠所编码的c u l 4 a 由于缺乏与d d b l 相结合的序列而不能正常 行使其生物学功能。研究发现该c u l 4 a 敲除小鼠的胚胎成纤维细胞表现出严重的 增殖缺陷。同样，在肝脏中条件性敲除c u l 4 a 后发现其肝细胞出现细胞周期进程 缓慢，并且经四氯化碳处理后肝细胞再生时增殖减缓4 7 。然而，第三种c u l 4 a 敲 除小鼠的出现改变了之前人们对c u l 4 a 基因功能看法。l i u 等认为第一种c u l 4 a 敲 除小鼠由于在敲除c u l 4 a 的同时也破坏了它l 临近的另一个基因( p c i d 2 ) 的表达， 因此敲除小鼠的早期胚胎致死可能是由于p c i d 2 的缺乏所致。该工作小组敲除了 c u l 4 a1 7 1 9 夕1 显子序列，使剩下的c u l 4 a 序列不能与r o c l 和n e d d 8 相结合，从而 使c u l 4 a 失去活性。结果发现该突变小鼠不仅可以存活，并没有出现其它明显的 表型，甚至还发现c u l 4 a 的突变可以加强细胞对d n a 损伤的反应和保护皮肤癌变 等与预期相反的实验现象铝。因此，c u l 4 a 在发育过程中的作用机制目前还有一 定的争论，需要进一步研究。 目前还没有c u l 4 b 的突变小鼠的相关报道，然而根据c u l 4 a 突变小鼠细胞出现 的细胞周期调控异常以及c u l 4 b 突变而导致的x 连锁精神发育迟滞的患者出现 骨骼发育和造血系统异常，家系中女性携带者出现x 染色体失活偏移的现象，此 外我们实验室的前期工作发现c u i a b 在h e l a , 和h e k 2 9 3 细胞中的表达下调导致 c y c l i ne 的积累并引起s 期停滞4 9 ，提示c u i a b 可能在细胞周期的调控中发挥重要 山东大学硕士学位论文 的作用。目前在寻找c u i a b 细胞周期靶蛋白方面的研究还比较少，仅发现c d t l 、 p 2 1 和c y c l i ne 能被c u i a b 复合物所降解，而已知有多种细胞周期调控相关的蛋白 被证明是c i 1 4 a 在细胞周期调控中的靶蛋白，如c d t l 、p 2 1 、p 2 7 、p 5 3 、c - j u n 、 h o x a 9 y g c f i k l 4 9 ，为了进一步研究c u l 4 b 调控细胞周期的分子机制，在本实验 中，我们对c u l 4 b 细胞周期靶蛋白进行了筛选和分析。 1 2 山东大学硕士学位论文 材料与方法 1 材料： 1 1 细胞株： 人胎肾细胞株h e k 2 9 3 、人宫颈癌细胞株h e l a 、c u l 4 b 低表达的n e l a 和 h e k 2 9 3 细胞以及相应的对照细胞均由本实验室邹永新博士构建。 1 2 主要仪器设备： 1 ) 倒置相差显微镜( m 型) ：日本o l y m p u s 公司 2 ) 血球计数板：新亚诊查器械厂 3 ) h e r a c e l lc 0 2 培养箱：德国h e r a e u s 公司 4 ) 常规用正置显微镜b x 4 1 型：日本o l y m p u s 公司 5 ) b i o - r a dm i i l