（遗传学专业论文）利用淀粉的酿酒酵母工程菌的构建.pdf

四川大学博十论文 利用淀粉的酿酒酵母工程菌的构建 遗传学专业 博士生刘增然指导教师i j a - 贵教授 摘要 以扣囊复膜胞酵母菌总d n a 、工业酿酒酵母总d n a 和毕赤酵母表达载体 p m e t u b 为模板通过p c r 扩增克隆到约15 0 0 b p 、2 9 5 0 b p 和3 0 0 b p 的0 【淀粉 酶基因( a m y ) 、a - 乙酰乳酸合成酶基因( i l z 2 ) 和a 因子分泌序列( m f a l s ) ，将 其分别插入y e p 3 5 2 和p b l u e s c r i p t m l 3 质粒获得克隆载体p l a 6 、p l y 2 和p b l a 。 克隆载体的酶切分析表明二克隆基因与g e n b a n k 的报道序列基本相同，克隆到 的。【淀粉酶基因与g e n b a n k 中报道序列的酶切位点有差异，克隆基因内有s a c i 酶切位点，大约距起始密码子1 0 0 b p ，g e n b a n k 中报道的基因序列无s a c i 酶切 位点；而报道的旺淀粉酶基因序列在距起始密码子7 2 b p 处有b g l i 酶切位点，克 隆仪淀粉酶基因无b g l i 酶切位点。克隆的乙酰乳酸合成酶基因内有一个x b a l 酶切位点，而报道的序列有两个酶切位点，其它酶切位点均相同。 以酵母菌穿梭载体y e p 3 5 2 为出发质粒，酵母磷酸甘油酸激酶基因1 ( p g k l ) 启动子和乙醇脱氢酶基因l ( a d h i ) 终止子为调控元件构建了含甜淀粉酶编码 序列的酵母菌重组表达质粒p l a 8 。用醋酸锂转化法将p l a 8 导入单倍体酿酒酵 母菌株，转化子可以在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长，并使受体菌的u r a 缺陷型得到互补。说明克隆到的淀粉酶基因可以表达有活性的淀粉酶。将p l a 8 导入工业酿酒酵母菌株s c l l ，在以淀粉为唯一碳源的y n b s 培养基上筛选阳性 转化子，转化子培养液中仪- 淀粉酶活性为1 1 u m l ，细胞破碎液的酶活性为 o 3 u m l ，淀粉水解率为3 8 。说明扣囊复膜胞酵母菌( f i b u l i g e r a ) q 一淀粉酶 四川人学博士论文 基因分泌序列不能在工业酿酒酵母菌s c 11 中有效引导a 一淀粉酶分泌至胞外， 使部分一淀粉酶滞留在胞内。转化子的遗传稳定性为7 1 。 鉴于p l a 8 的酵母转化子淀粉酶表达量低，并有部分滞留在胞内，为了有效 引导淀粉酶分泌至胞外，促进转化子的淀粉酶分泌，在a m y 编码序列起始密码 子前插入酵母一因子分泌序列构建酵母菌重组表达质粒p l a 8 a 。用醋酸锂转化 法将p l a 8 a 导入工业酿酒酵母菌，在以淀粉为唯一碳源的y n b s 培养基上筛选 阳性转化子s c 1 1 p l a 8 a ，转化子培养液中c c 一淀粉酶活性为6 3 u m l ，说明a 分 泌序列可以有效引导a 一淀粉酶分泌至胞外并促进菌体细胞生长。转化子在最佳 条件下降解8 3 的淀粉，可以用于淀粉发酵。进一步对转化子进行麦芽汁糖发 酵试验，检测了其发酵麦汁中残糖含量、乙醇含量和风味物质的含量。结果表明 残糖含量降低1 8 ，a m y 基因的引入对酵母的发酵特性未产生很大影响，可以 认为转化子的发酵特性与受体菌一致，转化子遗传稳定性为8 0 。 因为自主表达质粒在受体细胞体中表达存在不稳定现象，在工业化的长期 应用中可能丢失，使工程菌利用淀粉性状丢失。本研究采用构建整合表达工程菌 来克服遗传新性状表达不稳定性问题。考虑到酵母菌是食品级微生物，在啤酒发 酵中产生0 【乙酰乳酸，并渗透至胞外非酶转化为双已酰，影响啤酒风味，使啤酒 有几周的后熟期。本研究以0 【乙酰乳酸合成酶基因为同源整合序列构建了整合 质粒p m g l 3 。p m g l 3 经a p a i + n o t i 酶切获得约5 6 k b 含i l v 2 ：a m y 嵌合基因片 段，用于酵母转化并在y n b s 培养基上筛选阳性转化子s c t1 m g l 3 。经p c r 验证淀粉酶基因整合在受体染色体的儿圪基因上，s d s p a g e 证明在约5 5 k d a 处有一条明显的蛋白条带。转化子培养液中。【淀粉酶活性为4 3 u m l ，转化子不 仅可以利用淀粉为唯一淀粉而生长并使q 一乙酰乳酸酶活性降低3 0 ：淀粉发酵 实验表明其可降解6 5 的淀粉：麦芽汁发酵实验证明发酵液双乙酰含量和残糖 含量分别降低7 0 n1 3 ；转化子在非选择培养条件下的遗传稳定性为1 0 0 ， 而其它发酵特性与受体菌相比无很大差异。转化子不含细菌抗生素抗性基因和 酵母抗药性选择标记。 本研究证明通过p c r 扩增获得的a m y 编码基因在酵母磷酸甘油酸激酶基 因1 ( p g k l ) 启动子和乙醇脱氢酶基因1 ( a d h l ) 终止子为调控元件下表达具 生物活性的c c 一淀粉酶。所构建的酵母穿梭表达质粒p l a g a 转化子可以有效分泌 表达淀粉酶，表达量高，可用于以淀粉为原料的工业发酵制品生产；但其在工业 四川火学博士论文 应用中存在丢失现象，遗传稳定性较差。所构建的整合表达片断转化子 s c 1i - m g l 3 可以有效分泌表达淀粉酶，表达量较高，其遗传稳定性高，适于在 工业发酵生产应用，尤其适于工业啤酒生产。 关键词：淀粉酶基因，克隆和表达，乙酰乳酸合成酶基因，工业酿酒酵母 遗产稳定性，双乙酰 四川人学博十论文 t h ec o n s t r u c t i o no fa m y l o l y t i c i n d u s t r i a ls t r a i n so f & c e 冠e i 儡s z 4 e m a j o r ：g e n e t i c s p h d c a n d i d a t e ：l i uz e n g r a ns u p e r v i s o r ：p r o f l i us h i g u i a b s t r a c t a15 6 0 b pe c o r l k p n ig e n ef r a g m e n t ，2 9 5 0 b pb a m h l s a l ig e n ef r a g m e n ta n d 2 9 1 b p t t i n d l i i p s t l s e q u e n c e w e r e p r e p a r e db y p c rw i t h s a c c h a r o m y c o p s i s f i b u l i g e r ag e n o m i cd n a ，s a c c h a r o m y c e s c e r e v 如i a e g e n o m i cd n aa n d p i c h i a m e t h a n o l i c ae x p r e s s i o nv e c t o rp m e t o t ba st h et e m p l a t e t h e yw e r ed e s i g n a t e da m y g e n e 、儿砣g e n e a n d m f a l s ，r e s p e c t i v e l y , a n di n s e r t e di n t ov e c t o ry e p 3 5 2 o rm 1 3 一， g e n e r a t i n g t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp l a 6 ，p l v 2 a n dm 1 3 a t h er e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s ed i g e s t i o n a n a l y s i s s h o w e dt h ec l o n e da m y g e n ea n d 儿砚g e n eh a s s i m i l a rs e q u e n c ew i t ht h er e p o r t e ds e q u e n c eo fo e n b a n k o n l yaf e wd i f f e r e n c e s e x i s t t h e r ei sas a ds i t ei nt h ec l o n e da m y g e n ea ta b o u tl o o b pf r o mt h es t a r t i n g c o d o n w h i l eab g ns i t ei nt h er e p o r t e da m y g e n e a t7 2 b pa n dt h ec l o n e d 儿坨g e n e h a so n ex b a is i t el e s st h a nt h er e p o r t e ds e q u e n c e t h ea m y g e n e ，t o g e t h e rw i t hp h o s p h o g l y c e r a t ek i n a s e lp r o m o t e ra n de t h a n o l d e h y d r o g e n a s e l t e r m i n a t o rf r o msc e r e v 拈i a ew a sc l o n e di n t oay e a s te x p r e s s i o n v e c t o r ( y e p 3 5 2 ) ，g e n e r a t i n g t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p l a 8 t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp l a 8w a si n t r o d u c e di n t ol a b o r a t o r yj s _ c e r e v i s i a ew i t hl i a cm e t h o da n d t h et r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e do nt h e y n b + h i s + l e u + t r p m e d i u mt h e t r a n s f o r m a n tb e c a m eu r a a u x o t r o p h ya n d c a n g r o w o nt h em e d i u m c o n m i m n g s t a r c h a st h es o l ec a r b o ns o u r c e t h i sr e s u l ti n d i c a l e dt h a tt h ec l o n e da m yc a r l e x p r e s s b i o a c t i v ea m y l a s e t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp l a 8w a si n t r o d u c e di n t oa ni n d u s t r i a 4 四川人学博士论文 s t r a i no f c e r e v i s i a es c - 1ia n dt h et r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e do nt h es cm e d i u m i nw h i c hs t a r c hi st h es o l ec a r b o ns o u r c e t h ea v e r a g ea a m y l a s ea c t i v i t i e so ft h e t r a n s f o r m a n t si nc e l l u l a re x t r a c ta n dc u l t u r es u p e r n a t a n t sw e f e0 3 u ，m la n d1 1u m l r e s p e c t i v e l y , w h i l en o0 【一a m y l a s ea c t i v i t yw a s d e t e c t e di nt h a to ft h eh o s ts t r a i n t h e t r a n s f o r m a n t sw e r ea b l et oh y d r o l y z e3 8 s t a r c h t h i sv e r i f i e dt h a tt h ea m y l a s e s e c r e t i o n s i g n a ls e q u e n c e o fsf i b u l i g e r aw a sn o ta b l et o e f f i c i e n t l yg u i d e t h e s e c r e t i o no fa m y l a s ei nsc e r e v i s i a e 。p a r to fa m y l a s ek e p ti nt h ec e l l t h eg e n e t i c s t a b i l i t yo f t r a n s f o r m a n tw a s 7 1 u n d e rn o n s e l e c t i v ec o n d i t i o n a st h ee x p r e s s i o nl e v e lo fa m y l a s ei nt h et r a n s f o r m a n t p l a 8w a sl o wa n do n l y p a r to fi t w a ss e c r e t e di n t ot h ec u l t u r em e d i u m ，t h ey e a s ta - f a c t o rs e c r e t i o ns i g n a l s e q u e n c ew a si n s e r t e db e f o r et h e 爿删s t a r t i n gc o d o na n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d c o n t a i n i n g a f a c t o rs e c r e t i o n s i g n a ls e q u e n c ew a sc o n s t r u c t e d t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dd e s i g n a t e dp l a 8 t tw a si n t r o d u c e di n t ot h ei n d u s t r i a ls t r a i no f l s c e r e v i s i a e s c - l1a n dt r a n s f o r m a n t ss c l1 - p l a g uw e r es c r e e n e do nt h ey n b sm e d i u m t h e a c t i v i t y o ft h ea m y l a s ee n z y m ew a s6 3 u m li nt h ec u l t u r es u p e m a t a n ta n dt h e t r a n s f o r m a n t ，w i t h8 0 g e n e t i cs t a b i l i t y ，w a sa b l et oh y d r o l y z e8 3 s t a r c hu n d e r o p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n t h ew o r tf e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t su n d e rs i m u l a t i n g b r e w i n gc o n d i t i o n s w e r ec a r r i e do u ta n dt h er e s i d u e s u g a r , e t h a n o l a n df l a v o r c o m p o u n d s w e r ee x a m i n e d b yc h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s e s t h e f e r m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c so ft h ee n g i n e e r e ds t r a i nw e r es i m i l a rt ot h a to ft h ec o n t r o ls t r a i na n d o n l ym i n o rc h a n g e si nt h ec o n c e n t r a t i o no f f l a v o rc o m p o u n d sc o u l db eo b s e r v e d a sy e p - t y p ep l a s m i d sa r en o t s t a b l y m a i n t a i n e di nt h ey e a s tc e l l su n d e r n o n s e l e c t i v ec o n d i t i o n s ，t h et r a n s f o r m a n tm i g h tl o s et h e a m y l a s ea c t i v i t yd u r i n g s u c c e s s i v ef e r m e n t a t i o n ，a n dt h er e c o m b i n a n ti n d u s t r i a l s t r a i n so f c e r e v i s i a e ， m a n i p u l a t e dw i t hs h u t t l ev e c t o r s ，c o n t m nb a c t e r i a la n t i b i o t i c - r e s i s t a n c em a r k e r sa n d y e a s td m g - r e s i s t a n c em a r k e r sa n d a r eg e n e r a l l yn o ts u i t a b l ef o ra p p l i c a t i o ni nf o o d i n d u s t r y t oo v e r c o m et h eg e n e t i ci n s t a b i l i t ya n dc o n s t r u c ta na m y l o l y t i cb r e w e r s y e a s t s u i t a b l ef o rc o m m e r c i a l u s e ，i n t e g r a t i n g c a s s e t t ew a sc o n s t r u c t e d d u r i n g p r i m a r yw o r tf e r m e n t a t i o n a - a c e t o l a c t a t ei sf o r m e db yb r e w e r sy e a s ta n dl e a k so u t o ft h ey e a s tc e i l si n t ot h ef e r m e n t e dw o r ta n ds l o w l yd e c a r b o x y l a t e st o d i a c e t y l 5 四川大学博士论文 n o n - e n z y m a t i c a l l y t h ed i a c e t y l i saw e l l k n o w n c o m p o n e n t o fy e a s t - d e r i v e d o f f - f l a v o ri nb e e ra n di t sr e m o v a li sl i m e c o n s u m i n ga n da d d sp r o d u c t i o nc o s t t h e i n t e g r a t i n g c a s s e t t ew a sd e v i s e dt oa c h i e v ed o u b l e c r o s s o v e r i n t e g r a t i o nb y h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o na tt h e 儿聆l o c u s o nc h r o m o s o m ex i l i w i t ht h ec o d i n g r e g i o no f i l f 2g e n ed i s r u p t e d t h ei n t e g r a t i n gc a s s e t t ew a si n t r o d u c e di n t ob r e w e r s y e a s ta n dt r a n s f o r m a n t s c l l - p m g l 3w e r es c r e e n e do ny n b s m e d i u m g e n o m i cp c r a n a l y s i sw a s c a r r i e d o u ta n dc o n f i r m e dt h a tt h e 儿您g e n eo nt h eg e n o m i cd n aw a sr e p l a c e db yt h e i l v 2 ：a m y g e n ei nt h ed i s r u p t a n tt h r o u g ho n e s t e pg e n er e p l a c e m e n ta n d o n ec o p y o ft h e 。v 2 g e n e w a s d i s r u p t e d t h e s d s p a g ei n d i c a t e dt h a ty p dc u l t u r e s u p e m a t a n to f t h et r a n s f o r m a n th a dac l e a rb a n da ta b o u t5 5k d a ，w h i l et h ec o n t r o l s t r a i ns h o w e dn ob a n da t5 5k d a t h et r a n s f o r m a n tw a sa b l et ou t i l i z e p o l y s a c c h a r i d e s ( a m y l a s ea c t i v i t y w a s4 3 u m 1 ) a n dl o wd o w n0 【一a c e t o l a c t a t e s y n t h a s ea c t i v i t yb y3 0 ，c o m p a r e dw i t ht h eh o s ts t r a i n t h es t a r c hf e r m e n t a t i o n e x p e r i m e n ts h o w e dt h a tm o r et h a n6 5 o f s t a r c hw a sh y d r o l y z e db ys o l1 - p m g l 3 a f t e r7df e r m e n t a t i o n n 妃t r a n s f o r m a n ti sf r e eo fb a c t e r i a la n t i b i o t i c r e s i s t a n c e m a r k e r sa n d y e a s td r u g - r e s i s t a n c em a r k e r s b yu s i n gt h i s s t r a i ni nb a t c hw o r tf e r m e n t a t i o nu n d e r s i m u l a t i n gb r e w i n g c o n d i t i o n s m o r et h a n13 r e s i d u a ls u g a rw a sa s s i m i l a t e da n dd l a c e t y lc o n t e n ti n p r i m a r yf e r m e n t e dw o r tw a sr e d u c e db y7 0 ，c o m p a r e dw i t ht h eh o s ts t r a i n t h e b r e w i n gt e s ti n d i c a t e dt h a tn og r e a td i f f e r e n c ei nb r e w i n gp r o p e r t i e sw a so b s e r v e d b e t w e e ns c l l - p m g l 3a n ds c l l t h eg e n e t i c s t a b i l i t yo fs c l l - p m g l 3w a s1 0 0 u n d e rn o n s e l e c t i v ec o n d i t i o n s t h i ss t u d yc o n f i r m e dt h a tt h ec l o n e da m y g e n eb yp c rw a se x p r e s s e du n d e r t h ec o n t r o lo fy e a s tp h o s p h o g l y c e r a t ek i n a s e lp r o m o t e ra n de t h a n o ld e h y d r o g e n a s e i t e r m i n a t o ra n dt h ea m y l a s eh a sb i o a c t i v i t y t h et r a n s f o r m a n ts c - 1 1 p l a 8 c tw a sa b l e t os e c r e t ea m y l a s ei n t om e d i u mm o r ee f f i c i e n t l ya n db eu s e di ni n d u s t r i a ls t a r c h u t i l i z a t i o n ，b u ti t sg e n e t i cs t a b i l i t yw a sl o w e ra n dt h eg e n e t i cc h a r a c t e rm a yl o s ei n l o n g - t e r mf e r m e n t a t i o n t h et r a n s f o r m a n ts c - 1 1 - m g l 3w a sa b l et os e c r e t ea m y l a s e i n t om e d i u me f f i c i e n t l ya n dh a dh i g h g e n e t i cs t a b i l i t y , s oi tw a sb e t t e rf i tf o r 6 四川大学博士论文 i n d u s t r i a ls t a r c hf e r m e n t a t i o n ，e s p e c i a l l yi nb e e rf c r m e n t m i o n k e y w o r d s ：q a m y l a s eg e n e ；a a c e t o l a c t a t es y n t h a s eg e n e ；c l o n ea n de x p r e s s i o n ； b r e w i n gy e a s t ； g e n e t i cs t a b i l i t y ；d i a c e t y l 7 四川人学博十论文 第一章淀粉酶基因的克隆及表达产物生物活性检验 摘要：以扣囊复膜胞酵母菌总d n a 为模扳，通过p c r 扩增克隆到约i 5 k b 的d 一 淀粉酶基因( a m y ) ，经酶切分析表明克隆基因与g e n b a n k 报道的序列酶切位 点有差异。用酵母菌穿梭表达载体y e p 3 5 2 为出发质粒、磷酸甘油酸激酶基因1 ( p g k i ) 启动子和乙醇脱氢酶基因1 ( a d h i ) 终止子为调控元件构建酵母菌 重组表达质粒p l a 8 。将p l a 8 转化单倍体酿酒酵母菌y s 5 8 ，在 y n b + h i s + l e u + t r p 培养基上筛选转化子。转化子在以淀粉为唯一碳源的培养基 上生长，质粒表达使y s 5 8 的l i r a 缺陷得到互补。证明克隆淀粉酶基因可以在酿 酒酵母菌中进行功能表达，表达产物具淀粉酶活性。 关键词：酿酒酵母，淀粉酶，基因克隆和表达，生物活性 a b s t r a c t ：a1 5 k bg e n ew a sp r e p a r e db yp c rw i t hs a c c h a r o m y c o p s i s f i b u l i g e r a g e n o m i cd n aa st h et e m p l a t e t h ec l o n e da m yg e n ew a sp r o v e dh a v i n gs o m e d i f f e r e n c e sw i t ht h er e p o r t e da m y g e n es e q u e n c eb yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ed i g e s t i o n a n a l y s i s t h eg e n e ，t o g e t h e rw i t hp h o s p h 0 9 1 y c e r a t ek i n a s e lp r o m o t e ra n de t h a n o l d e h y d r o g e n a s e lt e r m i n a t o rf r o ms a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 随e e r e v i s i a e ) w a sc l o n e d i n t oay e a s te x p r e s s i o nv e c t o r ( y e p 3 5 2 ) ，g e n e r a t i n gar e c o m b i n a n tp l a s m i dp l a 8 t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp l a 8 w a si n t r o d u c e di n t ol a b o r a t o r ys t r a i no f xc e m v b m e a n dt h et r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e do nt h e y n b + h i s + l e u + t r pm e d i u m t h e t r a n s f o r m a n tw a sa b l et og r o wo nt h em e d i u mi nw h i c hs t a r c hi st h es o l ec a r b o n s o u s ea n dt h e e x p r e s s i o n o ft h er e c o m b i n a n t p l a s m i dc o m p l e m e n t e dt h e u r a a u x o t r o p h y ，p r o v i n gt h a tt h ea m ye x p r e s s i o np r o d u c th a sa m y l a s eb i o a c t i v i t yi ns c e l “e v i s k t e k e yw o r d s ：s a e c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ；a m y l a s e g e n ec l o n i n ga n de x p r e s s i o n ， b i o a c t i v i t y g 四川大学博士论文 1 引言 淀粉是生物高聚物，由d d 葡萄糖组成，在谷物及根类植物中以不溶性小 颗粒状态存在。淀粉有两种聚合形式：支链淀粉和直链淀粉，在谷类作物中支链 淀粉占7 0 ，直链淀粉占3 0 i l 】。淀粉是很好的乙醇生产原料，但植物所含的淀 粉类碳水化合物不能被大部分酵母利用，这些原料必须先预处理水解成低碳糖。 淀粉经c 【淀粉酶水解的主要产物是葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦 芽五糖和麦芽六糖。 a 一淀粉酶为液化型，是种单成分酶，没有辅酶成分，它能任意切开淀 粉分子n 一1 ，4 一葡萄糖苷键，将长链分裂成为长短不一的短链的糊精，以及 少量麦芽糖和葡萄糖。使淀粉粘度迅速降低，失去对碘的呈色反应。在工业上 用于生产淀粉酶的菌株有枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、马铃薯芽孢杆菌( 且 m e s e n t e r i c u s ) 、软化芽孢杆菌佴m a c e r a n s ) 、米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) 、黑曲霉 口s p e r g i l l u sn i g e r ) 、泡盛曲霉a w a m o r o ，但这些菌株都不能用于食品工业发酵 生产。有1 0 0 种酵母具有同化淀粉的能力，它们分属于4 个属：扣囊腹膜胞酵母、 糖化酵母、产脂酵母和西方许旺酵母，但它们都不适合工业酿酒生产。与酿酒酵 母有很近亲源关系的糖化酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e v 口r d i a s t a t i c u s ) 可分泌 糖化酶利用淀粉和糊精，但产生浓重的酚醛味，不适于酿造生产。结林卡油脂 酵母( l i p o m y c e sk o n o n e n k o a e ) 可以分泌a 一淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶等淀粉水解 酶，是有效的水解淀粉的酵母，但其生长缓慢，乙醇耐受力低，同样不适于酿造 生产【2j 。酵母对碳源的利用主要受两个因素的限制：一个是其乙醇耐受力，另一 个是自身酶系。鉴于酿酒酵母生长快、发酵度高、乙醇耐受力较强。几个世纪 以来，一直被用于食品发酵生产，但其不能发酵利用淀粉。发酵行业一直借助 淀粉酶来应用淀粉，但外加酶对啤酒风味产生不利影响。 用基因重组技术构建能利用淀粉的酿酒酵母工程菌是解决酵母不能直接利 用淀粉的最有效的方法。本研究选用扣囊复膜胞酵母2 1 1 4 5 ，2 1 1 5 3 ，2 1 6 2 6 三 株菌作为淀粉酶基因供体菌，通过p c r 扩增获得淀粉酶基因。 2 材料与方法 2 1材料 2 1 1 菌株和质粒 四川大学博士论文 本研究所有菌株和质粒分别见表l 一1 和表1 2 。 表1 1 实验所用菌株 y e p 3 5 2 p v c 7 2 7 ： 7 8 p g k ln p e a - 1 p l a 6 p l a 8 a m p 伍c o i l ) u r a f s c e r e v i s i a e ) a m d ru r a 5 7 6 a m p 。 6 7 a m p 9i a m p 高拷贝的y e a s t - e c o l i 穿 梭载体，l a c z 插入失活 含磷酸甘油酸激酶基因 p g k i 启动子的酵母质粒 y e p 3 5 2 ： a d h l t y e p 3 5 2 ：a m y y e p 3 5 2 ：a m y ：p g k l p ：a d h i t 本实验室保存 本实验室保存 本实验室保存 本研究构建 本研究构建 2 1 2 培养基 l b 培养基( 每升) - 蛋白胨1 0 9 ，酵母粉5 昏氯化钠1 0 9 溶于1 0 0 0 m l 蒸馏水，p h7 0 。固体培 养基加8 9 琼脂粉。8 磅，3 0 m i n 湿热灭菌。筛选和培养转化子时加入氨苄青霉 o 四川人学博十论文 素，液体培养基中浓度为5 0 p g m l ，固体培养基中浓度为1 0 0 p g m l 。通过a 互补 原理筛选白色重组子时，在含氨苄青霉素的平板上均匀涂布x g a l 及i p t g 溶 液，用量均为0 8 m g 平皿，黄于3 7 培养箱中2 h 后使用。 y p d 培养基： 葡萄糖2 0 9 ，蛋白胨2 0 9 ，酵母粉1 0 9 。溶于蒸馏水，定容至1 0 0 0 m l ，自然 p h 。固体培养基加8 9 琼脂粉，8 磅3 0 m i n 湿热灭菌。 s c ( y n b ) 培养基( 每升) ：1 3 1 大量元素：k h z p 0 4o 8 5 9 ，k 2 h p 0 40 1 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 9 ，n a c lo 1 9 ， c a c l 2 2 h 2 0 1 9 微量元素：h 3 8 0 3 ：5 0 0 p g ，c u s 0 4 5 h 2 0 ：4 0 l a g ，k i ：1 0 0 p g ，f e c l 3 t 6 h 2 0 ： 2 0 0 9 9 ，m n s 0 4 h 2 0 ：4 0 0 l a g ，n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 ：2 0 0 p g ，z n s 0 4 + 7 h 2 0 ：4 0 0 9 9 维生素：生长素2 p g ，泛酸钙4 0 0 p _ g ，肌醇2 0 0 0 t a ，烟酸4 0 0 b t g ，对氨基苯甲 酸2 0 0 1 a g ，硫胺素4 0 0 p g ，核黄素2 0 0 t t g ，吡哆醇4 0 0 9 9 大量元素、微量元素和维生素分别配成1 0 0 倍贮液、2 5 0 倍贮液和2 5 0 倍贮 液，灭菌后4 。c 冰箱保存备用。配制培养基时按比例加入上述贮液，同时加入2 葡萄糖和o 5 硫酸铵，自然p h 。配制固体培养基时，加入1o a 琼脂粉。在筛 选和培养转化子时可加入必需的氨基酸和或尿嘧啶至终浓度为5 0 i t g m l 。8 磅 3 0 m i n 湿热灭菌。 生孢培养基( m c c l a r y ) ( 每升) ： 葡萄糖1 9 ，酵母粉2 5 9 ，醋酸钾9 8 9 。 y p s 培养基( 每升) ： 蛋白胨2 0 9 ，淀粉2 0 9 ，酵母粉1 0 9 。用于酵母转化子保存及平板检测。 y p g s 培养基( 每升) ： 蛋白胨2 0 9 ，淀粉1 5 9 ，葡萄糖5 9 ，酵母粉1 0 9 。用于酵母转化子培养。 2 1 3 酶和抗生素及其它 四川大学搏士论文 限制性内切酶b a m h l 、e c o r l 、s a l i 、b g l l 、e c o r v 、k p n i 、s a c i 、p f ud n a 聚合酶、t 4 d n a 连接酶为宝生物工程( 大连) 有限公司产品。x g a l ( 5 - 溴4 - 氯3 吲哚d 半乳糖苷) 、i p t g ( 异丙基一硫代半乳糖苷) 、蜗牛酶、蛋白酶k 为s i g m a 公司产品。d n t p 购自鼎国生物技术中心。氨苄青霉素购自华北制药厂， 储存浓度为5 0 m g m l 。x g a l 和i p t g 使用浓度为4 0 ug m l 。引物由上海生工生 物技术服务有限公司合成。核酸分子量标准：h i n d l l i 酶切) 。d n a 分子量标准 ( k b ) 2 3 1 3 ，9 4 1 6 ，6 5 5 7 ，4 3 6 1 ，23 2 2 ，2 0 2 7 ，0 5 6 4 ，0 1 2 5 。 2 1 4 缓冲液与试剂 大肠杆菌质粒提取试剂 溶液i ：5 0 m m 葡萄糖，2 5 r a mt “s c j ( p n s o ) ， 10 r a m e d t a ( p h 8 0 ) 8 磅，3 0 m i n 湿热灭菌，4 c 保存。 溶液i i ：0 2 m