（遗传学专业论文）cul4b差异蛋白质组学初步研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 皇鸳曩莶 e l期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 胜导师签名： 盔蠡 日 山东大学硕士学位论文 目录 中文摘要( 1 ) 英文摘要( 4 ) 符号说明( 8 ) 论文正文 前言( 9 )日 吾( 9 ) 第一部分 材料与方法( 1 3 ) 结果( 2 6 ) 讨论( 3 2 ) 第二部分 材料与方法( 3 7 ) 结果( 4 5 ) 讨 论( 5 1 ) 结 论( 5 4 ) 附录图表( 5 5 ) 参考文献( 6 3 ) 致谢( 6 6 ) 发表文章( 6 7 ) 山东大学硕士学位论文 i n d e x c h i n e s e a b s t r a c t ( 1 ) e n g l i s ha b s t r a c t ( 4 ) a b b r e v i a t i o n ( 8 ) t e x t 蛐c t i o n ( 9 ) p a r to n e m a t e r i a la n d m e t h o d s ( 1 3 ) r e s u l t s ( 2 6 ) d i s c u s s i o n ( 3 2 ) p a r tt w o m a t e r i a la n d m e t h o d s ( 3 7 ) r e s u l t s ( 4 5 ) d i s c u s s i o n ( 5 1 ) c o n c l u s i o n ( 5 4 ) f i g u r e s & t a b l e s ( 5 5 ) r e f e r c n c e ( 6 3 ) a c k n o w l e d g m e n t s ( 6 6 ) p u b l i s h e dp a p c r s ( 6 7 ) 山东大学硕士学位论文 c u l 4 b 差异蛋白质组学初步研究 专业：遗传学 硕士生：卢德芬 导师：李曦副教授 中文摘要 2 0 0 7 年，本实验室邹永新等定位了一个x 连锁精神发育迟滞致病基因 c u l 4 b ，随后对该基因的表达模式及其转录调控、亚细胞定位和在细胞增殖中 的作用进行了分析。c u l 4 b 属于c u l l i n 基因家族，该家族成员是泛素连接酶 e 3 ( u b i q u i t i nl i g a s ee n z y m e s ) 的重要组成部分，在蛋白的泛素化过程中发挥重 要的功能。由于对c u l 4 b 基因发挥功能的作用机制知之甚少，本研究采用差 异蛋白质组学的方法分析该基因表达产物c u l 4 b 引起的蛋白表达谱的变化， 进而探索其在相关生物过程中的可能作用机制。 蛋白质组学技术由于其高通量、高灵敏度、高精度的特点在生命科学研究领 域中受到了越来越多的青睐。在常规技术的基础上，本研究对以二维电泳质谱 ( t w o - d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s - m a s ss p e c t r o m e t e r , 2d e m s ) 联用的蛋白质组 学部分流程进行了改进，包括样品的制备，凝胶染色相应的胶内酶解等。在此基 础上，通过利用c u l 4 b 稳定低表达及过表达h e k 2 9 3 体系，进行c u l 4 b 差 异蛋白质组学初步研究。 第一部分二维电泳质谱联用蛋白质组学部分流程优化 首先，本研究对二维电泳质谱联用蛋白质组学部分流程进行了优化，主要 包括样品制备的优化和胶内酶解的改进。在这一环节中，探索的条件主要包括： 洗涤液的选择，裂解缓冲液配方以及蛋白样品的纯化。本课题从以下几方面进行 了比较：在p c i 2 ( 大鼠嗜铬细胞瘤细胞系) 可溶性总蛋白二维电泳流程中，低 离子强度的缓冲液2 5 0 r a m 山梨醇l o m mt r i s - b a s e0 h 7 0 7 4 ) 和常用的样品清 洗缓冲液p b s 分别洗涤收集样品；裂解缓冲液中e d t a 和t r i s - b a s e 的添加与 山东大学硕士学位论文 否；硫脲的有无以及d t t 的浓度；蛋白样品的纯化与否以及纯化的方法，分别 比较了不纯化、t c a 丙酮沉淀法和2 dc l e a n u pk i t ( b i o r a d ) 处理的差异。结果 表明，2 5 0 r a m 山梨醇1 0 r a mt r i s - b a s e 与p b s 相比，显著地降低了样品的盐离 子浓度，使电压可顺利地上升至最大设定值，保证等电聚焦的充分进行：e d t a 和 i r i s b a s e 的添加与否对二维电泳结果没有显著影响；样品经2 m 硫脲和7 m 尿 素组合处理后的二维电泳表现优于9 m 尿素；d t t 浓度为6 5 r a m 时点在胶图上 的表现优于操作手册推荐的1 0 m m ；经2 dc l e a n u pk i t ( b i o - r a d ) 处理样品的二维 电泳表现优于另外两种，但是此法与未纯化组相比会导致部分蛋白信息在胶图上 的丢失。 在优化二维电泳条件的同时，本研究完善了一种高效的适用于银染和考染蛋 白质凝胶的胶内酶解方法。在这一环节中，通过用一维s d s - p a g e 分别分离总 量为3 0 n g 、5 0 n g 和1 0 0 n g 的b s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) ，采用银染显色；一维 s d s - p a g e 分别分离总量为1 腭、3 鹇、5 l a g 和1 0j _ t g 的b s a ，考染显色。从得到 的一维凝胶上，选取若干目标蛋白条带分别采用目前广泛使用的a n d r e j s h e v c h e n k o 等( 2 0 0 7 ) 提出的胶内酶解方法( 以下简称为a 法) 和改进的胶内 酶解方法( 以下简称为b 法) 处理，用基质辅助激光解析飞行时间质谱 ( m a l d i t o f t o fm s ) 分析，再通过m a s c o t 软件查询n c b i b o v i n e 数据库 鉴定蛋白质。这一部分结果表明b 法在匹配的肽段数、序列覆盖率和蛋白得分 值等方面都显著高于a 法。将b 法应用于酶解p c i 2 可溶性总蛋白，经二维 电泳分离后凝胶上的点，同样获得了较好的蛋白鉴定结果。 第二部分h e k 2 9 3 体系中c u l 4 b 差异蛋白质组学研究 通过二维电泳分别分离野生型h e k 2 9 3 和实验室已建立的利用r n a i 技术 干扰c u l 4 b 基因表达的n i i r n a - c u l 4 b h e k 2 9 3 及其对照细胞系 m i n e g h e k 2 9 3 可溶性总蛋白，银染显色，p d q u e s t 2 d 软件分析找出差异蛋白。 将这些差异点采用b 法酶解，用基质辅助激光解析飞行时间质谱 ( m a l d i t o f t o fm s l s ) 分析，再通过m a s c o t 软件查询n c b i h u m a n 数 据库鉴定蛋白质。这一部分取得研究结果：共鉴定了3 3 个差异蛋白，其中蛋白 得分值位于9 5 可信区间的共有2 1 个。 同时，构建c u l 4 b 稳定过表达细胞系p c d n a 3 1 a c u l 4 b h e k 2 9 3 及其 2 山东大学硕士学位论文 对照细胞系p c d n a 3 1 a h e k 2 9 3 ，分别通过二维电泳分离其可溶性总蛋白，银 染显色，p d q u e s t 2 d 软件分析找出差异蛋白。酶解后，用基质辅助激光解析飞 行时间质谱( m a l d i t o f t o fm s ) 分析，再通过m a s c o t 软件查询n c b i h u m a n 数据库鉴定蛋白质。这一部分取得研究结果：共鉴定了1 5 个差异蛋白， 其中蛋白得分值位于9 5 可信区间的共有9 个。对c u l 4 b 稳定低表达及过 表达体系筛选出的一些重要蛋白做了w e s t e r n b l o t t i n g 和免疫共沉淀等检测验证。 综上所述，本研究优化了适用p c i 2 和h e k 2 9 3 的二维电泳质谱联用蛋 白质组学流程；在此基础上，进一步探讨了在h e k 2 9 3 中c u l 4 b 基因低表达 和过表达分别可能引起的蛋白质组变化。这些研究结果为认识c u i , 4 b 基因的功 能以及进一步阐明c u i a b 在疾病发生中的分子机制提供了一定的线索。 关键词：差异蛋白质组学；二维电泳；胶内酶解；基质辅助激光解析飞行时间质 谱( m a l d i t o f t o fm s ) ；c u l 4 b 基因 3 山东大学硕士学位论文 r e s e a r c ho nt h ec u l 4 b b yc o m p a r a t i v ep r o t e o m i c s g r a d u a t e ：d e f e nl u s u p e r v i s o r ：x il i a b s t r a c t z o uy o n g x i nh a si d e n t i f i e dc u l 4 bg e n ec a u s e dx l m r , a n dt h e na n a l y z e dt h e e x p r e s s i o np a t t e r n , l o c a l i z a t i o no fc u i a ba n di t sr o l eo nt h ec e l lp r o l i f e r a t i o na n d c e l lc y c l er e g u l a t i o n c u l 4 ba sam e m b e ro fc u u i nf a m i l y ，w h i c hi st h es i g n i f i c a n t m o i t yo fu b i q u i t i nl i g a s ee n z y m e se 3 ，p l a y s a ni m p o r t a n tr o l ei n p r o t o n p o l y u b i q u i t i n a t e da n dd e g r a d a t i v er e g u l a t i o n b e c a u s et h e r ei sr a r ep r o g r e s si nt h e m e c h a n i s mo ft h em e n t a lr e t a r d a t i o n , w eh a v eu s e dt h ep r o t e o m i cm e t h o d st oa n a l y z e t h er o l eo fc u i a bd u r i n gt h o s eb i o l o g i c a lp r o c e s s e s b e c a u s eo ft h ec h a r a c t e r i s t i c s ，s u c ha sh i 【g h f l u x ，s e n s i t i v i t ya n dr e p e t i t i o n , p r o t e o m i ct e c h n o l o g i e sh a v eb e c o m em o r ep o p u l a ri nr e s e a r c ho nb i o s e i e n c e o nt h e b a s eo fr o u t i n et e c h n o l o g i e s ，w ee x p l o r e dt h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc o n d i t i o n so n t w o - d i m e n s i o n a lg e ld e c t r o p h o r e s i sa n dm a d et h e md ob e t t e ri no u rr e s e a r c ho n c u i a b t h o s ei m p r o v e m e n t si n c l u d es a m p l ep r e p a r a t i o n , t w o - d i m e n s i o n a lg e l d e c t r o p h o r e s i s ，t h es t a i n i n go f2 dg e l s ，i n - g e ld i g e s t i o na n ds oo n , a n df u r t h e r m o r e , w ea p p l i e dt h e mt oo u rr e s e a r c h p a r to n et h e o p t i m i z a t i o no fp r o t e o m i cp r o c e d u r e sa b o u t t w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i sc o m b i n e dm a s s s p e c t r o m e t e r w eo p t i m i z e ds o m ef l o ws h e e to fp r o t e o m i cp r o c e s sa b o u tt w o - d i m e n s i o n a lg e l e l e c t r o p h o r e s i sc o m b i n e dm a s ss p e c t r o m e t e r t h ep r o c e d u r e so fo p t i m i z a t i o nm a i n l y c o n t e n ts a m p l ep r e p a r a t i o na n di n - g e ld i g e s t i o n s a m p l ep r e p a r a t i o ni st h ec r i t i c a l c o m p o n e n te l e m e n ti nt w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s d u r i n gt h i sp a r t ，w e 4 山东大学硕士学位论文 e x p l o r e dw a s h i n gb u f f e r , ae c o n o m i c a la n df e a s i b l em e t h o dt h a ti n c l u d e dl y s i sb u f f e r c o n t a i n i n ge d t a , t r i s - b a s e o rn o t , c o n t a i n i n gt h i o u r e ao rn o t , c o n c e n t r a t i o no fd t t i nl y s i sb u f f e r , s a m p l ep u r i f i c a t i o no rn o ta n dp u r i f i e dm e t h o d s 1 1 圮r e s u l t ss h o w e d t h a tt ot h ec e l ll i n e sp c i 2a n dh e k 2 9 3 ，t h ei s o c l c c t r i cf o c u s i n gp a t t e r no ft r e a t e d 丽m2 5 0 r a ms o r b i t o l 10 m m t r i s - b a s e ( p h 7 0 - 7 4 ) w a sb e t t e rt h a ni t sc o n t r o lg r o u p ； l y s i sb u f f e rc o n t a i n i n ge d t a a n dt r i s - b a s eo rn o t , d i dn o te f f e c ti s o e l e c t r i cf o c u s i n g i no u ts a m p l e s ；l y s i sb u f f e rc o n t a i n i n g7 mu r e aa n d2 mt h i o u r e ac o u l di m p r o v et h e s o l u b i l i t yo fb a s i cp r o t e i n se f f e c t u a l l yc o m p a r e dt oj u s to n l y8 mu r e a ；l y s i sb u f f e r c o n t a i n i n g 6 5 m md t th a da n a d v a n t a g e t o c o n t a i n i n g lo m md t tt h a t r e c o m m e n d e d ；w ea l s oc o m p a r e dt h e t r i c h l o r o a c e t i ca c i d - a c e t o n e ( t c a - a c , e t o n c ) ， 2 - dc l e a n u pk i t ( b i o g a d ) a n dn oe x t r ap u r i f i e dt r e a t m e n t , f r o mt h er e s u l t s ，w oc o u l d s t h a t2 - dc l e a n u pk i t ( b i o - r a d ) t r e a t e dc a nr e d u c et h eb a c k g r o u n do ft h eg e l ，b u ti t a l s om a k e ss o m ep r o t e i ns p o t sd i s a p p e a r e do nt h eg e l t h e n , w ea l s oc o n t r i v e dah i g h - p e r f o r m a n c 2m e t h o do fi n - g e ld i g e s t i o no nt h e b a s i so fo t h e rc o n v e n t i o n a lm e t h o d sf o rs i l v e rs t a i n i n ga n dc c o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e s t a i n i n g , w h i c hc o u l de n h a n c e dt h ea c h i e v e m e n tr a t i oo fp r o t e i ni d e n t i f i c a t i o n i nt h i s p a r t , w os e p a r a t e d3 0 n g , 5 0 r i ga n d10 0 r i gb s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) b yl d s d s p a g ea n dv i s u a l i z e db ys i l v e rs t a i n i n g , a tt h es 锄et i m ew es e p a r a t e dl 川茧3 p g , 5 肛ga n dlo n gb s ab yl - ds d s - p a g ea n dv i s u a l i z e db yc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e s t a i n i n g t h eb s a f r o me v e r y1 一dg c lw e r ei ng e ld i g e s t e db yt h em e t h o da ( a n d r e j s h e v c h c n k o ，2 0 0 7 ) w h i c hi su s e dg e n e r a l l yb e f o r ea n dm e t h o dbt h a tw ec o n t r i v e d r e s p e c t i v e l t h e na n a l y s e d t h e s ep e p t i d em i x t u r e sb ym a l d i - t o f t o fm 鹪s s p e c t r o m e t e r ( m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r - d e s o r p t i o n - i o n i z a t i o n - t t m o - o f - f l i g h t - m a s s s p e c t r o m e t r y ) ；w h e r e a f l e r , w es e a r c h e dt h ep r o t e i ni n f o r m a t i o nw i t hn c b ib o v i n e d a t a b a s e ，t h e ni d e n t i f i e dt h ep r o t e i n s t h o s er e s u l t ss h o w e dt h a tm e t h o dbh a d e x c e l l e n tp e r f o r m a n c ei nn o o fq u e r i e sm a t c h e s ，s e q u e n c i n gc o v e r a g ea n dm a s c o t s c o r ec o m p a r i n gw i t hm e t h o da w ed e m o n s t r a t e dt h a tp r o t e i n so nt h e2 - d eg e l p a r e r nw e l 0i ng e ld i g e s t e db yt h em e t h o db ，h a db e t t e rp e r f o r m a n c ei nm a t c h e d p e p t i d en u m b e r , s e q u e n c ec o v e r a g ea n dp r o t e i n8 c o r o w ea l s og o ta l l - r i g h tr e s u l t s w h e nw eu s e dm e t h o dbt ot r e a tt h ep r o t e i ns p o t sf r o mt w o - d i m e n s i o n a lg e l 5 山东大学硕士学位论文 p a r tt w or e s e a r c ho nt h ec u l 4 b b yc o m p a r a t i v e p r o t e o m i c si nc e l ll i n eh e k 2 9 3 w eu s e dt w o - d i m e n s i o n a l g e le l c c t r o p h o r e s i s t o s e p a r a t er e s p e c t i v e l y t h e p r o t e i n so ft h eh e k 2 9 3c e l l sw h i c hc u l 4 b - s p e c i f i cr n a jt os t a b l yk n o c kd o w n e n d o g e n o u sc u l 4 be x p r e s s i o n ( m i c u l 4 sh e k 2 9 3 ) a n dt h ec o n t r o lc e l l l i n e m i n e g - h e k 2 9 3c e l l s ，t h e nw eh a v ev i s u a l i z e db ys i l v e rs t a i n i n ga n dg a i n e dt h e2 d p a t t e r n s ，t h eg e l sw e r ea n a l y z e db ys o f t w a r e2 - dp d q u e s tt os e a r c hf o rt h e e x p r e s s i o nl e v e ld i f f e r e n tp r o t e i ns p o t sb e t w e e ne a c ho t h e r t h o s ed i f f e r e n tp r o t e i n s p o t s w e r e i n - g e ld i g e s t i o nb ym e t h o dbr e s p e c t i v e l y , t h e na n a l y s e db y m a l d i - t o f t o fm a s ss p e c t r o m e t e ra n ds e a r c h e dt h ep r o t e i ni n f o r m a t i o n 、析m h u m a n - o w nd a t a b a s eu s i n gm a s c o t , a n dt h e ni d e n t i f i e dt h ep r o t e i n s i nt h i ss e c t i o n , w ec h o s e dd i f f e r e n te x p r e s s i o nl e v e lp r o t e i ns p o t sb e t w e e nm i c u l 4 bh e k 2 9 3a n d m i n o gh e k 2 9 3c e l l s ；d u r i n gt h o s es p o t s ，i d e n t i f i e ds u c c 髓f u l l yw a s2 3 ，w h o s e p r o t e i n8 0 0 r el i e di n9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a l ，b i o i n f o r m a t i o nl i k ei s o c l e e t r i cp o i n t a n dm o l e c u l a rw e i g h tw e r es u i t a b l ef o ri t sp o s i t i o no nt h eg e l s t oc h e c kt h er e s u l t sd u r i n gc u l 4 b s t a b l yd o w ne x p r e s s i o nh e k 2 9 3c e u sa n d m i n c gh e k 2 9 3c e l l s ，w ec o n s t r u c t e dc u l 4 bs t a b l yo v e re x p r e s s i o nc e l ll i n e p c d n a 3 1 a c u l 4 b - h e k 2 9 3a n dt h ec o n t r o lc e l ll i n ep c d n a 3 1 a - h e k 2 9 3 w e g a i n e d t h et w o - d i m e n s i o n a l g e le l e c t r o p h o r e t o g r a m s o fc e l ll i n e p c d n a 3 1 a - c u l 4 b - h e k 2 9 3 ，p c d n a 3 1 a h e k 2 9 3a n dw i l dt y p eh e k 2 9 3w i t l l s i l v e rs t a i n i n g t h eg e l sw e r ea n a l y z e db ys o f t w a r e2 - dp d q u e s t a f t e rt h ei n - g e l d i g e s t i o nw i t ht r y p s i n , t h ep e p t i d em a s sa n a l y s i sw a sp e r f o r m e du s i n ga b 4 8 0 0 m a l d i - t o f t o fm a s ss p e c t r o m e t e r m a s ss p e c t r aw e r ee x t e r n a l l yc a l i b r a t e dw i t h p e p t i d es t a n d a r da n ds e a r c h e dt h ep r o t e i ni n f o r m a t i o nw i 廿lh u m a n - o w nd a t a b a s e u s i n gm a s c o t , t h e ni d e n t i f i e dt h ep r o t e i n s i nt h i ss e c t i o n ，i ts h o w e d15d i f f e r e n t p r o t e i ns p o t s ；d u r i n gt h o s es p o t s ，i d e n t i f i e ds u c c e s f u l l yw a s9 ，w h o s ep r o t e i ns c o r e l i e di n9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a l ，a n db i o i n f o i t f l a t i o nl i k ei s o e l e c t r i c p o i n ta n d 6 山东大学硕士学位论文 m o l e c u l a rw e i g h tw e r es u i t a b l ef o ri t sp o s i t i o no nt h eg e l s s o m eo ft h o s ep r o t e i n s w o r os e l e c t e df o rv a l i d a t i o nb yw e s t e r nb l o t t i n ga n dr e a lt i m e - p c ri nt h o s ec e l l s t a k e nt o g e t h e r , t h i ss t u d ye s t a b l i s h e dan e wp r o t e o m i cp r o t o c o lw h i c hw a s s u i t a b l ef o rt h ec e l ll i i l 懿( p c i 2c e u sa n dh e k 2 9 3c e l l s ) u s e di no b rr e s e a r c h i n a d d i t i o n , w ei n v e s t i g a t e dt h ed i v e r s i t yo fp r o t e o m ew h e nc u l 4 bg e n es t a b l yd o w n e x p r e s s i o na n ds t a b l yo v e re x p r e s s i o n t h e s er e s u l t sa d v a n c e do u ru n d e r s t a n d i n go ft h e e t i o l o g yo fx l m r , t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fc u l 4 bi nt h em e n t a lr e t a r d a t i o n ， t h ef u n c t i o n so fc u l 4 bg e n ea n dt h eo t h e rr e l e v a n tb i o l o g i c a lp r o c e s s e s k e yw o r d s ：c o m p a r a t i v ep r o t e o m i c s ；t w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ；i n - g e l d i g e s t i o n ；m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o n - t i m eo ff l i g h t i m eo ff l i g h t m a s ss p e c t r o m e t r y ；c u l 4 bg e n e 7 山东大学硕士学位论文 一一 2 d e m a i d i t o f ， t o i - m s e d t a p b s r p m r c f d m s o t f a a c n i e f 蹦s h s f b s b s a l c l u 垤 符号说明 t w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s m a t r i x - a s s i s t e d - l a s e r - d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n - t i m e - o f - f l i g h t - m a s s s p e c t r o m e t r y e t h y l e n ed i a m i n et e t r aa c e t i ca c i d p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n r o t a t i o np e rm i n u t e r e l a t i v ec e n t r i f u g a lf o r c e d i m e t h y l s u l f o x i d e t h f l u o r o a c e f l ca c i d a c e t o n i t r i l e s i s o e l e c t r i cf o e u s t r i h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e h o m es e r u m f e t a lb o v i n es e r u m b o v i n es e r u n la l b u m i n l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y l o d o a e e t a m i d e 二维电泳 基质辅助极光解析电 离飞行时间质谱 乙二胺四乙酸 磷酸盐缓冲液 每分钟转速 相对离心力 二甲基亚砜 三氟乙酸 乙腈 等点聚焦 三羟甲基氨基甲烷 马血清 胎牛血清 牛血清白蛋白 液相色谱 碘乙酰胺 a p s a m m o n i u mp e r s u l f a t e 过硫酸铵 t e m e d d t t p m f c h c a n n n , n - t e t r a m e t h y l - e t h y l e n e d l a m i n 四甲基乙二胺 e d i t h i o t h r e i t o i p e p t i d em a s sf i n g e r a - c y a n o - 4 - h y d r o x yc i n n a m i ca c i d 二硫苏糖醇 肽指纹图谱 a 氰基- 4 羟基肉桂酸 8 山东大学硕士学位论文 - _ o ! ! ， 嗣罱 2 0 0 7 年，本实验室邹永新等定位了一个x 连锁精神发育迟滞致病基因 c o l 4 # 1 1 。c u l 4 b 基因位于x q 2 3 ，有2 0 个外显子，可表达产生两种转录本， 编码蛋白分别含有8 9 5 和9 1 3 个氨基酸。c u l 4 b 属于c u l l i n 基因家族，该家 族成员是泛素- 蛋白酶体途径中的泛素连接酶e 3 ( u b i q 谳nl i g a s ee n z y m e s ) 重 要组成部分，在蛋白的泛素化过程中发挥重要的功斛2 1 。泛素蛋白酶体途径被 认为是体内最主要的蛋白质质控系统，参与调控包括细胞周期、生长发育、信号 转导、d n a 复制和修复、病毒感染等几乎所有的生命过程【3 1 。该途径作为蛋白 质功能的主要调节者和终结者，包括两个过程：泛素分子与靶蛋白的选择性结合 即泛素化过程以及携带有泛素标签的靶蛋白被2 6 8 蛋白酶体识别并降解的过程 【4 】。泛素分子与靶蛋白的特异性结合有赖于三种酶：泛素激活酶e 1 ( u b i q u i t i n a c t i v a t i n ge n z y m e ) ，泛素结合酶e 2 ( u b i q u i t i nc o n j u g a t i n ge n z y m e ) 和泛素连接 酶e 3 ( u b i q u i t i nl i g a s ee n z y m e s ) 。其中，泛素激活酶e 1 人类只有2 种，泛素 结合酶e 2 人类约有3 0 种，而泛素连接酶e 3 人类有5 0 0 多种，因此e 3 酶决 定了底物泛素化的时间性和特异性。通过多次的泛素化反应，靶蛋白可能被标记 有单泛素分子、寡泛素链或者多泛素链。不同的泛素化方式决定了蛋白命运的不 同 5 1 ，其中携带有k 4 8 g 7 6 硫酯键的多泛素链靶蛋白能够被细胞内的2 6 s 蛋白 酶体识别并以依赖a t p 的方式被降解【6 】，而单