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产褐藻酸酶菌株的筛选、发酵条件优化和酶学性质研究 产褐藻酸酶菌株的筛选、发酵条件优化和酶学性质研究 摘要 褐藻酸酶的研究和应用是开发海洋活性物质的重要手段之一。其降解产物褐 藻寡糖的多种生物活性功能不断被揭示，引起了人们很大的兴趣。本课题是以筛 选出一株高产褐藻酸酶菌株为基础作进一步研究，以期为海洋多糖资源的开发和 利用提供更多的资源基础。 本实验利用褐藻酸钠作为唯一的碳源从海带和裙带菜的病烂处及海带加工 厂的生产废水中筛选分离得到一株高产褐藻酸酶的菌株x 7 并对其发酵条件进行 了研究。结果表明：通过单因子和正交实验确定褐藻酸降解菌株) ( 7 较优的产酶 培养基配方为( w ) ：牛肉膏浓度为1 o 、酵母粉浓度为o 5 ，褐藻酸钠浓度为 o 6 ；氯化钠浓度为0 5 、硫酸镁浓度为0 1 、磷酸氢二钾浓度为0 5 ；硫酸 亚铁浓度为0 0 0 1 较优的发酵产酶条件为：起始p h 为7 5 ，2 5 1 2 培养4 跖经发 酵条件优化后，发酵上清液的酶活力可高达6 5 4 7 i 面i 。比发酵条件优化前的酶 活力提高了7 1 5 倍 菌株x 7 在优化后的发酵培养基中2 5 培养4 8 h 后，经离心、3 0 8 0 的 呷) 2 s 0 4 盐析分级沉淀、q s e p h a r o s ef a s tf l o w 和s e p b a 叫s - 1 0 0 柱层析对褐藻 酸酶进行纯化和精制，获得了电泳纯度的酶蛋白组分s d s p a g e 确定其分子量 为8 3 k d a , 在以报道的褐藻酸酶范围内此酶的最终回收率为4 1 5 ，酶提纯2 7 8 7 倍。褐藻酸酶的基本酶学性质研究表明：4 5 为此酶反应的最适温度，其最适 反应p h 为7 5 ；该酶的稳定温度范围在2 0 以下，该酶的稳定p h 范围为7 8 5 s m 矿、n a ? 和k + 均对酶活有促进作用，但不明显，而其余离子对酶活力均有不同 程度抑制作用，以h 矿和m 一最为明显，抑制率分别为8 5 1 7 铘8 2 - 3 。 关键词：菌株x 7 ；褐藻酸酶；培养条件优化；分离纯化；酶学性质 产褐藻酸酶菌株的筛选、发酵条件优化和酶学性质研究 i s o l a t i o no f a l g i n - d e g r a d i n gb a c t e r i a ，f e r m e n t a t i o na n d s o m e p r o p e r t i e so f a l g i n a s e a b s t r a c t t h ea l g i ni sa b u n d a n ti nb r o w na l g a ea n dac o m m o ni n t e r c e l l u l a rs u b s t a n c 七i na l l b r o w na l g a e t h ea l g i nd e g r a d a t i o np r o d u c t sw h i c hh a v em o r ea d v a n t a g e st h a na l g i n h a v ev a r i o u sp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nb i o m e d i c a l ，p h a r m a c e u t i c a l ，a g r i c u l t u r a l ，a n d f o o df i e l d t h ed e v e l o p m e n to fv i a b l ep r o c e s s e sf o rd e g r a d a t i o no fa l # ni sa n 砒位| c t i n gg r o w i n gi n m r e s t h o w e v e r , f i l i f l l e ri n v e s t i g a t i o ni sr e q u i r e af o rp r a c t i c a l a p p l i c a t i o no f t h i se n z y m e 。 i nt h i ss t u d y , 5 2s w a i n sh a v eb e e ni s o l a t e dw i t ha l g i n a s ea c t i v i t yf r o mt h e d e c a y i n gp a r t so f l a r a i n w i a j a p o n i c aa n du n d a r i a p i n n a t i f i d aa n d1 2o f t h e ms h o w h i g h e re l l z y m ea c t i v i t yt h a nt h eo t h e r s a m o n gt h e1 2s t r a i n s , t h es t r a i nx 7s h o w e d t h eh i g h e s ta l g i n a s ea c t i v i t yd u r i n gt h es e c o n ds c r e e n i n ga n dd e m o u s t r a t e sag o o d s t a b 姆, s oi ti sc h o s e nt oi n v e s t i g a t et h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o na n d $ o n l ep r o p e r t i e s o f a l g i n a s ep r o d u c e db ys t r a i nx 7 t h e r ea r em a n yf a c t o l 暑t h a ti n f l u e n c et h ea l g i n a s ep r o d u c t i o n i tw a sf o u n dt h a t t h es t r a i nc a nn o tp r o d u c ea l g i n a s ew i t h o u t d i n na i g i n a t ea n dc a nn o tg r o ww i t h o u t n a c lt h ed i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e st e s t sa l s os h o w e dt h a tt h ea l g i n a s eo fs t r a i nx 7 w a sa ni n d u c e de n z y m e t h es w a i ng r e ws i g n i f i c a n t l yb e t t e ri no r g a n i cn i t r o g e n r c g o 嘲s u c ha sb e e fe x t l a o tt h a ni n o r g a n i cn i t r o g e n 弛s 瑚黼l i k e0 q l ) 2 s 0 4 ，8 0i t p r o d u c e dm u c hl a r g e ra m o u n to fa l g i n a s ei nf e r m e n t a t i o nm e d i u mw h i c hc o n t a i n e d o r g a n i cn i t r o g e nr e s o u r c e s w h e ni n c u b a t e da t2 5 ( 2f o r4 8 hi nt h el i q u i dm e d i u m w h i c hc o n t a i n sl gb e e f 舒：嗽o 5 9y e a s te x t r a c t , 0 6 9s o d i u ma l g i n a t e , o 5 9n a c l ， o 1 9m g s 0 4 7 h 2 0 ，0 s g 鲫0 i 0 0 0 1 9f e s 0 4 7 h 2 0a n d1 0 0m lt a gw a t e r , t h e s t r a i nx 7p r o d u c e st h eh i g h e s ta m o u n to fa l $ i n a s e t h eh i g h e s ta l g i n a s ea c t i v i t yi s 6 5 4 7 u m 1 t h e a l g i n a s e o ft h es t r a i nx 7i se x t r a c t e d b y a m m o n i u ms u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ( 3 0 8 0 s a t u r a t i o n ) , p u r i f i e db yi o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ( q - s e p k z o s ef a s tf l o wc o l u m n ) a n dg e l 蜘t r a 矗嘶( s e p h a c r y ls - 1 0 0c o l u m n ) 2 产褐藻酸酵菌株的筛选，发酵条件优化和酶学性质研究 s d s - p a g es h o w sa s i n g l eb a n df o rt h ep u r i f i e da l g i n a s ea n dt h em o l e c u l a rw e i g h ti s e s t i m a t e dt ob e8 3k d 乱f o ra l g i n a s ed e g r a d a t i 0 1 l t h ee i z y m eh a da no p f m l a lp ho f 7 5 ，a no p t i m a lt e m p e r a t u r eo f 4 5 ，t h e ya l ea l li nt h er d n g go f r e p o r c e dv a l u e s i th a d r e l a t i v e l yb r o a dp ha d a p t a b i l i t ya n dd e m o n s t r a t e dt ob er e l a t i v e l yh e a tr e s i s t a n t t h e e n z y m ea c t i v i t yw a ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e db yh gm n z + a n ds l i g h t l ya c t i v a t e db y m 矿，n a + a n d k + a ti o nc o n c e n t r a t i o nb e i n g0 5m m o l l k e yw o r d s ：s t r a i nx t ；a l g i n a s e ；o p t i m i z a t i o n o ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n ； p n r i f i e a t i o n ；e n z y m ee h a r a e t e r i z a t i o n 3 产褐藻酸酶菌株的缔选、发酵条件优4 - 1 ：和酶学性质研究 0 前言 近年来随着海洋活性物质的蓬勃发展，褐藻多糖的研究日益受到重视。褐藻 酸价格低廉且其降解产物褐藻寡糖具有较强的生物活性，所以具有较大的开 发价值和较为广阔的开发前景。 目前对褐藻酸的酶解法反应条件易控制、底物特异性高，在寡糖制各的各个 方面明显优于化学和物理降解法，因此褐藻酸酶己成为目前研究的热点。 现有的褐藻酸酶的开发生产面临的主要问题是酶活力较低、酶的稳定性不 高。本课题是以筛选出一株高产褐藻酸酶菌株为基础，对其进行发酵条件的优化、 酶的分离纯化及酶学性质的研究，以期为褐藻寡糖的规模化生产和应用开发研究 提供实验依据和基础。 本课题拟从以下几个方面进行研究： 。 1 ) 从海带和裙带菜的病烂处筛选一株具有优良褐藻酸酶性状的菌株。 2 ) 通过研究不同环境因素对产酶的影响优化菌株的产酶条件，获得适于菌株产 酶的培养基组成与发酵条件，使其产酶性状得以充分表达 3 ) 对菌株所产的褐藻酸酶进行分离纯化，并对酶的基本酶学性质进行研究 产褐藻酸酶菌株的筛选发酵条件优化和酶学性质研究 i 绪论 1 1 褐藻酸 褐藻酸( a l g i n ) 是从海带、马尾藻、巨藻等褐藻中提取的多糖聚合物。1 8 8 1 年， 苏格兰的化学家s t a n f o r d 研究生长在海岸繁茂的大型藻( a s c o p h y l l u m ) 的化学成 分，用碳酸钠的水溶液提取藻体，然后用盐酸调节液体到酸性时，观察到液体出 现了纤维状的固体物质，这是最初发现的褐藻酸。褐藻酸是褐藻细胞壁和细胞间 质的主要组成部分，也是褐藻中含量较高的一种多糖，其分子是由b d - 1 ，4 - 甘露 糖醛酸( 1 3 - d - m a n n u r o n i ca d d 简称m ) 和a - l 1 争古罗糖醛酸( a - l - g u l u r o n i ea c i d ，简 称g ) 两种单体组成的嵌段式线性聚合物，其分子中存在三种嵌段：均聚甘露糖 醛酸。，均聚古罗糖醛酸( g ) n 、和m 、g 两种单体交替啉的嵌段( h a u g e ta 1 ， 1 9 6 6 ) ，其结构式如图1 1 所示。不同藻体中m 和g 比例差异较大，如我国以海 带生产的褐藻酸m g 比值在2 2 6 左右，而马尾藻褐藻酸中m g 比值在0 8 1 ，5 。 海藻的不同部位m g 也有差异，如海带，m g 大小顺序为基部 中部 尖部。褐 藻酸m g 比值不仅决定其结构的不同，也决定其物理化学性质的不同( 纪明候， 1 9 9 7 ) 。商业出售的褐藻酸主要来源于m a c r o e y s t i s , l a m i n a r i a 和a s c o p h y l l u m 三种 藻类中提取褐藻酸( s 蝎矗ke ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 褐藻酸天然聚合物亲水性极强，依据其溶解性的差异可分为水溶性的褐藻 酸，包括海藻酸的一价盐( n a + 、k ? 、n 地+ ) 、镁盐、汞盐及其它一些衍生物；水 不溶性的褐藻酸包括海藻酸及其除镁和汞之外的二价盐和三价盐。其中应用得最 广的是海藻酸钠和海藻酸钙。 褐藻酸盐在水溶液中的溶解性随p h 的增大而增加，在p h5 8 7 5 时盐溶 液星均匀透明溶液。海藻酸含有游离羧基，性质活泼，能和n a + 、k ? 、n h 4 成盐， 呈粘稠状胶液，而酸的c a z * 、越势、b a 2 + 盐不溶于水海藻酸在纯水中几乎不溶， 为无色非晶体物，也不溶于乙醇、四氯化碳等有机溶剂。海藻酸能与蛋白质、蔗 糖、甘油、淀粉、磷酸盐类共溶。粘度随p h 的变化成一倒钟形曲线。在p h 7 时 其粘度最大。 褐藻酸盐在p h 5 8 以上易溶于水，在p h 5 8 以下其水溶性下降，逐渐形成凝 胶，p h 降到3 以下时，海藻酸脱水析出褐藻酸也可与多价阳离子产生凝胶 5 产褐藻酸酶菌株的筛选，发酵条件优化和酶学性质研究 褐藻酸无论是在水溶液中或是干品，都会发生不同程度的降解，其粘度不断 下降。在中性条件下，降解速率较低，p h 小于5 或大于l o 时，其降解速率明显 加快，一般而言，在6 0 c 以下比较稳定。 h w 7 聋 r l ：f 舟二羲 执，秽苹 t - ：。l 、麓一_ 蔓。：j 一羔二，j 譬曼舞 “、- 一一、， 一一，：一。 二一一一_ 一v - o 。- 图1 1a ) 叫坩露糖醛酸，b ) a l 古罗糖醛酸锄dc ) 褐藻酸的结构 f i g 1 1s t r u c t u r eo fa ) p - d - m 舢o n i ca c i d ，b ) a - l - g u l u r o n i ca c i da n dc ) a l g i n a t eo ! r t e s v a ga n d v a l e , 1 9 9 8 ) 1 2 褐藻酸的降解 褐藻酸是天然高分子化合物，应用时常常利用其降解产物。褐藻酸的降解产 物寡糖具有多种生物活性，如作为外源性的诱抗剂( e l i c i t o r ) 促进植物生长， 抑制致病性细菌的生长等活性尤其当在卡拉胶寡糖中找到了抗病毒的活性成 分，价格低廉的褐藻酸日益受到藻类学家的重视。就目前研究来看其降解方法可 归纳为：化学降解法( a s p i n a l l , 1 9 8 2 ；c h a p l i n , 1 9 8 6 ；w h i t e & k e n n e d y , 1 9 8 8 ) 、酶 解法( h e n r ye ta 1 ，1 9 6 7 ；r o m e o & p r e s t o n , 1 9 8 6 ；s h i m o k a w ac ta 1 ，1 9 9 7 ；r e l n n , 1 9 9 8 ) 和物理降解法。目前普遍采用的方法是酸降解法，这种方法的降解条件难 以控制，操作较复杂。而酶法降解褐藻酸条件温和，得率高达1 0 0 ，因而使得 褐藻酸制备寡糖更为容易，因此褐藻酸酶的研究近年来受到重视。酶降解应是一 种优先选择的降解方法，这种降解不仅提供序列信息，而且能提示异头构型的信 6 产褐藻酸酶菌株的筛选、发酵条件优化和酶学性质研究 息。 1 3 褐藻酸酶 1 3 1 褐藻酸酶的来源 + 。 1 9 3 1 年，大岛等从鲍鱼( h a l i o t u sg i g a n t e u s ) 的内脏中首次发现了可以分解褐 藻酸的酶，命名为a l g i n a s e 。 褐藻酸酶来源广泛，包括海洋藻类、海洋软体动物、棘皮动物体内和多种微 生物( 包括海洋细菌、土壤细菌和真菌) ( w o n gt ye ta 1 , 2 0 0 0 ) 。如1 9 8 4 年，朱仁 华等从三种海螺：朝鲜花冠小月螺( l u n e l l ac o r n a t a c o r e e n s i s ) 、单齿螺( m o n o d o n t a c a b z o ) 和玩荔枝螺( p u r p u r ac l a v i g e r a ) 中分离得到了褐藻酸酶。在铜绿假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sa e r u g t n o s a ) 和棕色固氮菌( a z o t o b a c t e rr i n e l a n d i 0 的噬菌体中也发 现有褐藻酸酶。s u d ak 等( 1 9 9 9 ) ：e 小球藻病毒( c h l o r e l l av i r u s ) 中也发现了褐藻酸 酶的基因。 微生物褐藻酸酶主要来源于海洋细菌，真菌等，如弧菌、黄杆菌、固氮菌、 克里伯氏菌、肠杆菌、别单胞菌和芽孢杆菌。 1 ) 来源于海洋细菌的褐藻酸酶 大多数的产褐藻酸酶的菌株是来自于或是非常接近海藻和海洋软体动物。此 类细菌以褐藻酸为碳源，有的甚至以褐藻酸为唯一碳源通常，褐藻酸酶是诱导 酶即褐藻酸的存在可以诱导细菌产生褐藻酸酶。而且大多数褐藻酸酶的最适p h 值为7 5 8 5 之间，而最适温度从2 5 5 0 c 不等。 海洋细菌产生的褐藻酸酶在分子量，底物专一性以及所需的阳离子上表现出 极大的差异，使得我们无法归纳出褐藻酸酶的典型特征。褐藻酸酶大多数是典型 的胞外酶或周质空间产生的酶( p e r i p l a s m i c ) 。虽然大多数是内切酶，但是也发现 有外切酶的存在，如从海洋细菌a 3 中发现的酶就是外切酶( d o u b e t g q u a t 僦o ， 1 9 s 2 ) 。 对于许多海洋细菌，高浓度的n a c i 可明显提高褐藻酸酶的酶活，可能是因 为高浓度的n a c l 可去除褐藻酸分子表面的水或是能够改变酶与底物结合时的电 荷，从而使酶与底物更好的结合。形成更稳定的酶与底物复合物。对于许多褐藻 产褐藻酸酶菌株的筛选、发酵条件优化和酶学性质研究 酸酶，二价阳离子的存在，有助于得到更好的酶活。， 2 ) 来源于海洋藻类和无脊椎动物的褐藻酸酶 虽然，在许多海洋软体动物和海藻中发现了具有褐藻酸酶的活性，据我们所 知，只有其中的一少部分做了较为深入的研究，而且，迄今为止，没有将海洋软 体动物和海藻中的褐藻酸酶克隆并测序的研究。从海洋软体动物( 如l i t t o r i n as p p h a l i o t i ss p p a n dt u r b oe o r n u t u s ) 的内脏腺体( o u tg l a n d s ) ，产卵器( s t y l e ) 或肝胰腺 ( h e p a t o p a n e r e a s ) 中分离到了褐藻酸酶。从动物中得到的褐藻酸酶性质差异很大。 通常低浓度或高浓度的n a c i 被认为对酶活有促进作用，阳离子如c a 2 + 被认为对 酶活有促进作用。阳离子被认为可以降低褐藻酸底物表面的电荷密度，使酶与褐 藻酸之间的离予作用减弱，有利于酶对底物的分解作用。 s h i m i w a ( 1 9 7 5 ) 等人报道了一系列的海藻中的褐藻酸酶，并且认为不同的季 节和不同的藻体中酶活性差异很大，推测这些酶在藻类的生活史中发挥了重要的 作用， 1 3 2 褐藻酸酶的分类及作用机嗣 褐藻酸酶按其降解褐藻酸部位与片段的不同可分为两大类：p o t y ( m ) l y a s c 【( 1 _ 4 ) - 争d - n u m u r o n a nl y a s e ( e c 4 2 2 3 ) 和p o l y ( g ) l y a s e 【( 1 _ 分a l 刚u r o n a nl y a s e ( e c 4 2 2 1 1 ) ，即专一性裂解l 4 糖苷键连接的 m 甘露糖醛酸的 酶和专一性裂解l 4 糖苷键连接的a 山古罗糖醛酸的酶( w o n gt yc t a 1 ，2 0 0 0 ；b 娼趾be ca 1 , 2 0 0 3 ) 。它们分别作用于褐藻酸的甘露糖醛酸段和古罗糖醛 酸段，在非还原末端产生c 4 s 不饱和双键并在2 3 0 2 4 0 n m 处有强吸收近年来， 又发现了对g 段和m 段两底物都有作用的双功能酶。随着研究的不断深入，还 会有一些新的褐藻酸酶类被发现。 迄今为止报道的褐藻酸酶的酶解反应都是在底物的非还原末端生成 4 - d e o x y - e r t h r o - h e x - 4 - e n o p y r a n u r o n o s y i 基的1 3 消除反应。1 9 9 2 年，g a s e e a 报道了 关于褐藻酸酶的裂解机制，褐藻酸分子中的羧基与酶分子中的阳离子性氨基酸残 基结合，c 5 位的c - h 电子对被6 位的羧基吸引，5 位的c - i - i 结合交弱，然后又 一个酶分子中的亲核性氨基酸残基与c 5 位的质子结合，电子向着生成稳定的中 何体的方向运动，最终在c 4 - c 5 问生成双键，所以褐藻酸酶酶解的寡糖均在非 还原末端产生仅5 不饱和双键，在2 3 0 2 4 0 n m 有强吸收。 0 产褐藻酸酶菌株的筛选、发酵条件优化和酶学性质研究 酶活力的测定方法主要有苔黑盼法( o r c i n da s s a y ) ，硫代巴比土酸法 ( t h i o b a r b i t u r i ca c i da s s a y ) ，紫外吸收法( u l t r a v i o l e ta b s o r p t i o na s s a y ) ，粘度法 ( v i s c o m e t r i ca s s a y ) 和还原糖法( r e d u c i n gs u g a ra s s a y ) ( p r e i 船& a s h w e l l ， 1 9 6 2 ；r i c h a r d s r l e v i n , 1 9 7 6 ) 褐藻酸酶的底物专一性是根据可降解聚甘露糖醛酸 段( m 段) 或聚古罗糖醛酸段( g 段) 的不同而定义的，研究酶对不同类型的底物专 一性时，多应n m r ( g r a s d a l e ne ta l ，1 9 8 1 ；g r a s d a l e n , 1 9 8 3 ；h e y r a u dc ta l 。，1 9 9 6 ) ， t l c ( n i b u e ta 1 ，1 9 9 5 ) ，m l c ( r o m e o & p r e s t o n , 1 9 8 6 ；p r o b ；t o l le ta i ，1 9 9 1 ；h e y r a u d e ta l ，1 9 9 6 ) 和纸色谱技术。s h i m o k a w a 等进一步研究了褐藻酸酶对寡聚底物的反 应方式，研究了一种制备褐藻衍生糖醛酸的方法，并报道了用 f a c e ( f l u o r o p h o n i c - a s s i s t e dc a r b o h y d r a t ed e c t r o p h o c s i s ) 方法分析寡聚糖醛酸 ( s h i m o k a w ae ta 1 ，1 9 9 6 ) 总之，从某些细菌或海洋动物中分离的褐藻酸酶，有的只降解甘露糖醛酸嵌 段，有的只降解古罗糖醛酸嵌段，有的二者皆可。这些酶对褐藻酸的降解只有2 种方式；( 1 ) 糖苷键的水解( 2 ) 从降解链的非还原末端脱水生成双键。 1 3 3 褐藻酸酶的结构与功鬣关系 褐藻酸酶的克隆和测序使我们更好的研究这种酶的结构和功能的关系。基于 这些酶基因序列的信息以及分子量大小，多数的褐藻酸酶可被分为2 0 3 0 k d a , 3 0 4 0 k d a 和4 0 6 0 k d a 。通过对不同分子量组的褐藻酸酶基因序列比较 可以发现，分子量为3 0 4 0 k d a 的褐藻酸酶的同源性较高在这个分子量组的 褐藻酸酶中心有一个保守序列：n n h s y w ，并且发现这些酶的催化中心为一个 像隧道一样的裂隙，而保守序列恰恰在这个裂隙的中间，保守序列中组氨酸被替 换会导致酶的失活，因此这个保守序列对于酶的活力是十分重要的。 对于分子量为2 0 3 0 k d a 组的酶来说，在c 端有一个含有9 个氨基酸的保 守序列y f k a g v y n q 。这个分子量组的酶的底物专一性不同表明，这个保守序 列与酶的底物专一性无关，可能是保持酶结构稳定的一个基本因素 有研究表明褐藻酸酶的催化中心只能容纳5 7 个糖醛酸残基，也就是说酶 的最适底物为含有5 7 个糖醛酸残基的褐藻寡糖。在酶的裂隙双链上的带电荷 的精氨酸和赖氨酸以及带有芳香环的氨基酸被认为是决定酶的底物专一性的结 构分子甘露糖醛酸c 5 异构酶的保守序列e f n n v s y 是决定甘露糖醛酸作为底 9 产褐藻酸酶菌株的筛选、发酵条件优化和酶学性质研究 物的重要因素。通过对于保守序列i n n h s y 和e n n v s y 的比较可发现天门冬氨 酸( n ) ，丝氨酸( s ) 和酪氨酸( y ) 残基是保守序列中的基本结构。甘露糖醛酸酶中的 组氨酸0 4 ) 若被撷氨酸( v ) 或精氨酸( r ) 残基取代即为异构酶，因此组氨酸是甘露糖 醛酸酶和异构酶的最重要的差异。 通过对酶的化学修饰，蛋白序列的比较，结合位点的突变以及晶体结构的研 究表明，色氨酸、赖氨酸、组氨酸以及半光氨酸是酶的催化位点中不可或缺的氨 基酸残基。色氨酸在糖与酶分子的结合过程中起着重要的作用，而赖氨酸和组氨 酸则直接参与了酶的催化。 l 3 0 4 褐藻酸酶的分离、纯化一般方法 硫酸铵分级沉淀经常被用作分离复杂蛋白混合物的第一步( b a r o ne ta 1 ，1 9 9 4 ； b o y d & t t a v e y , 1 9 7 7 ；d u n n e & b u c k m i r e , 1 9 8 5 ；k a i s e re ta 1 ，1 9 6 8 ；k e n n e d ye ta 1 ， 1 9 9 2 ；k r a i w a t t a n a p o n ge ta l , 1 9 9 9 a ；n a k a g a w ae ta 1 ，1 9 9 8 ；n i b ue ta 1 ，1 9 9 5 ；p e c i n a & p a a e q u e , 1 9 9 4 ；) 然后，阳离子交换层析用于从粗酶中吸附碱性等电点的褐藻 酸酶( h a u g e ne ta 1 ，1 9 9 0 ；m a t s u b a r ae ta 1 ，1 9 9 8 ；n i b ue ta 1 ，1 9 9 5 ；s h i m o k a w ac ta 1 ， 1 9 9 7 a ；y o o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) ；阴离子交换层析用于从粗酶中吸附酸性等电点的褐藻酸 酶( b o y d & t u r v e y , 1 9 7 7 ；k e n n e d ye ta 1 ，1 9 9 2 ；k r a i w a t t a n a p o n ge ta 1 ，1 9 9 9 b ； m a t a l b a r ac ta 1 ，1 9 9 8 ；n a k a g a w ae ta 1 ，1 9 9 8 ；r e h m ，1 9 9 8 ；s a w a b ee ta 1 ，1 9 9 7 ； s h i m o k a w ae ta 1 1 9 9 7 a ) ；或作为一种作用相反的离子吸附作用用于从部分纯化的 酶中去除杂蛋圭l ( t s t g a a r d 眈a 1 ，1 9 9 3 ) 。凝胶过滤也可用于纯化过程( a a r o ne ta l ， 1 9 9 4 ；b r o w ne ta 1 ，1 9 9 i ；f u j i y a m ae ta i ，1 9 9 5 ；n a k a g a w a c ta 1 ，1 9 9 8 ；s h i m o k a w ae t a 1 ，1 9 9 7 b ) 。 羟基磷灰石成功的应用于海洋细菌a t c c4 3 3 3 6 9 ( m a l i s s 郜de ta 1 ，1 9 9 5 ) 中褐 藻酸酶的纯化，疏水作用层析( h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y , h i c ) 斥j 于野 生型细菌足p n e u m o n i a e ( s t g a a r de ta 1 ，1 9 9 3 ) ，从细菌互v i n e l a n d i i 的工程菌 ( e r t 峨c a 1 ，1 9 9 8 ) 以及绿脓杆菌职a e r u g i n o s a ) r p 褐藻酸酶的部分纯化。轻基磷 灰石和疏水层析曾用于纯化a z o t o b a c t e rc h r o o c o c c u m 中重组褐藻酸酶 a i g l o e c i 矗ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 亲和层析中最常用的组氨酸标记的蛋白用于n i 2 + 胆酸盐树脂，可一步法纯 化蛋f l ( c h a v a g n a te ta 1 ，1 9 9 6 ；s u d ada 1 ，1 9 9 9 ) a l g i n a t e s c p h a m s e 亲和层析树 i o 产褐藻酸酶菌株的筛选、发酵条件优化和酶学性质研究 脂也可用于褐藻酸酶的部分纯化( b o y de ta 1 ，1 9 9 3 ；k e n n e d ye ta 1 。1 9 9 2 ) 。 a l g i n a t e - e p o x y ( 环氧) 亲和树脂和蛋白快速分析系统c a s tp r o t e i nf l o w c h r o m a t o g r a p y ) 也可用于褐藻酸酶的部分纯化。 迄今为止，大部分从野生型细菌中分离到的褐藻酸酶只得到了部分纯化，且 只得到了相对产率较低的纯酶或部分纯化的酶用于酶学性质研究，只有少数褐藻 酸酶可纯化得到产率高、纯度高的酶( m a t s u b a r ae ta l ，1 9 9 8 ；s a w a b ee ta 1 ，1 9 9 7 ； s h i m o k a w ae ta 1 ，1 9 9 7 a ；s h i m o k a w ae ta 1 。1 9 9 7 o ；t a k e s h i t ae ta 1 ，1 9 9 3 ) 。有文献报 道几种克隆的褐藻酸酶纯化后在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 不同 系统中得到了高表达( a a r o ne ta 1 ，1 9 9 4 ；c h a v a g n a te ta i ，1 9 9 6 ；f u j i y a m ae ta 1 ， 1 9 9 5 ；m a l i s s a r de ta 1 ，1 9 9 5 ；p e c i f i ae ta 1 ，1 9 9 9 ；y o o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。从大肠杆菌的不 同表达中也得到了一些部分纯化的不同基因序列的酶( c a s w e l le ta 1 。1 9 8 9 ； f u j i y a m a , 1 9 9 5 ；k r a i w a t t a a a p o n g , 1 9 9 9 a ；s v a n e me ta 1 ，1 9 9 9 ) 。而且，目前有三种 高产的褐藻酸酶晶体生长后用于x 射线衍射研究( a a r o ne ta 1 ，1 9 9 4 ；h i s a n oe ta 1 ， 1 9 9 4 ；m i k a m ie ta l ，1 9 9 4 ；y o o ne ta 1 ，2 0 0 0 ；z h a n ge ca 1 ，1 9 9 8 ) 。 1 3 5 褐藻酸酶的性质 1 ) 酶的化学性质 固氮菌、芽孢杆菌，弧菌、黄杆菌等的褐藻酸酶已经被提纯，其酶化学性质 见表o 1 。褐藻酸经酶水解出现的双键并非原样品中含有的而是酶水解在分子链 断裂处的非还原末端产生的，酸水解t b a 试验也有双键的颜色反应，但是无规 则的，其双键反应只是部分的，丽酶降解时，双键反应却是特有的 1 1 产褐藻酸酶菌株鲍糍选，发酵条件优化和酶学性质研究 2 1 金属离子对酶的作用 由于褐藻酸酶的产生菌主要从海洋中分离得到，一般n 矿会影响它的活 性1 9 9 2 年，c h a o - h u a n g t s e n g 等分离出弧菌( p 7 6 r 幻s p a j , - 1 2 8 ) ，此菌产生的酶 的专一底物是工广古罗糖醛酸，n a c i 浓度0 3 1 0m 0 1 几时，其酶活力最大且热 稳定性也明显提高。酶在p h 6 0 1 1 0 范围内稳定，最适p h7 8 。z n z + 、h g + g q - 酶 有抑制作用根据伯杰氏细菌分类法，此菌为 锄由h a r v e y i 。他们还用i r t b r i o a l g i n o l y t i c u sa t c c1 7 7 4 9 生产褐藻酸酶，经硫酸铵沉降p h e n y ls e p h a r o s ec l - 4 b ， b l u bs e p h a r o s ec l - 6 b ，s d s 聚丙稀酰胺凝胶电泳分离纯化，得到的纯酶对d - 甘露 糖醛酸有专一性。0 0 2 t o o l l 的c a c h 使酶达到最高活力，且提高酶的热稳定性。 t o m o os a w a b e 等用a l t e r o m o n a ss p h - 4 生产褐藻酸酶经超滤、阴离子交换色谱纯 化s d s - p a g e 电泳测得分子量为3 2 0 0 0 ，最适p h 为7 5 ，最适温度3 0 1 2 酶在酸性溶 液中不稳定，0 0 5m o l lm g c h 和m g s 0 4 , 0 5t o o l ln a c l , 0 2m o l lk c l 使酶 达到最高活力。 3 ) 微生物褐藻酸酶的产生菌及其酶系 文献报道的产酶微生物主要是细菌和真菌，7 0 9 0 年代，微生物褐藻酸酶 的研究受到广泛重视d a v i d s o ni 等报道了固氮菌产生的褐藻酸酶降解褐藻酸钠 产生了一系列含有4 - d e o x y - a - l - e r y t h r o - h e x - 4 - e n o p y r a n u r o n o s y l 残基的寡聚糖醛 酸，分析这些寡聚糖醛酸得出此酶对聚甘露糖醛酸有专一性，可用于分析大分子 的结构通过凝胶色谱、电泳等技术分离纯化酶，得出此酶的最适p h 为7 7 ，分 产褐藻酸酶菌株的筛选、发酵条件优化和醺学性质研究 子量3 5 0 0 0 k d a 左右。k y u n g - h e em i l l 等，用假单胞菌生产内切聚古罗糖醛酸酶， 经s e p h a d e xg 1 5 0 分离得至0 的3 组酶都只降解聚古罗糖醛酸、褐藻酸钠，而不 降解聚古露糖醛酸。j o n a t h a nb o y d 等用k l e b s i e l l aa e r o g e n e 、生产聚古罗糖醛酸 酶。1 9 8 2 年，s c o t t d o u b e t 等用褐藻酸作为唯一碳源，培养可产生褐藻酸酶的细 菌该酶既可降解甘露糖醛酸又可降解古罗糖醛酸，发酵液酶活力为1 4 6u ， m l ( t b a 法) 。1 9 8 4 年，j e 缶e yb 等以褐藻酸钠为唯一碳源从土壤和海水中分离 出产生褐藻酸酶的芽孢杆菌，菌体细胞0 8 2 5 肛m 具有侧生或周生鞭毛革兰 氏阴性，在孢子形成培养基形成芽孢，产生胞外酶，表现出明显的内切甘露糖醛 酸酶的性质，酶的分子量约4 0 0 0 0 k d a ；1 9 8 6 年，t o n y r o m e o 等报道了细菌生产 的胞外褐藻酸酶，用凝胶色谱、电泳，h p l c 等方法分离纯化酶研究酶的底物专 一性，此酶催化降解聚甘露糖醛，酶分子量为2 9 0 0 0 k d a ，p i 在4 2 5 0 之问。 m a n a b uk i t a m i k a d o 等从海水中通过厌氧培养的方法分离出2 6 株菌，这些菌在淡 水中都不生长，比较这些菌的活力得到a 1 9 和a i 1 2 8 两株高产酶菌株。a 1 9 菌株在无褐藻酸钠的培养基中可以生长并产生胞外酶，相反a 1 1 2 8 菌株只能在 褐藻酸钠培养基上生长。a 1 9 菌株产生的酶降解褐藻酸使还原糖含量明显增加， 而a 1 - 1 2 8 菌株产生的酶使底物粘度明显下降。0 3m o l l 的n a c i 使两种酶的活 力提高，且都表现出褐藻酸酶的性质。经分类鉴定这两株菌均是弧菌( i 冶b r i os p ) 。 9 0 年代多集中在对专一性酶一一古罗糖醛酸酶和甘露糖醛酸酶( a - 1 , 4 - 咖o n a nl y a s e ，8 1 , 4 - m a n n u r o n a nl y a s e ) 的研究。1 9 9 2 年，c h a o h u a n gt s e n g 等培养海洋细菌h b r i os p a 1 9 ，产生2 种类型的褐藻酸酶，分别裂解b 古罗糖 醛酸和d - 甘露糖醛酸，经s e p h a d e xg 一1 0 0 ，s e p h a r o s ec l - 6 1 3 聚丙稀酰胺凝胶电 泳纯化，它们的分子量分别为2 5 0 0 0 k d a 和3 1 0 0 0 k d a ，经分类鉴定此菌为f b r i o a l g i n o l y t i c u s 。1 9 9 2 年，t o m o os a w a b e 等从腐烂的海带中分离出h - 4 菌，此菌为 革兰氏阴性菌，初步鉴定为a l t e r o m o n a ss p h _ 4 ，其最适液体摇瓶培养基为：海水 7 5 ，酪胨0 5 ，褐藻酸钠o 1 ，2 5 摇瓶培养9 6 h ，此菌生产的酶可降解 褐藻酸钠1 9 9 3 年，k os t g a 雒d 等以褐藻酸钠为唯一碳源，用k l e b s i e l l a 。 - p n e w n o n i a e 发酵培养一种胞外古罗糖醛酸酶，不同的褐藻酸钠底物，菌体的生 长和酶的产量不同古罗糖醛酸含量低的褐藻酸钠产生较少的生物量但有利于酶 !的生产，低分子量的褐藻酸钠也有利于酶的生产加热灭菌会产生一些降解底物， 产褐藻酸酵菌株的筛选、发酵条件优化和酶学性质研究 对酶的生产有影响。c a 2 + 不仅影响酶动力学，而且影响最终的转化程度，酶的最 适p h 为7 左右。1 9 9 3 年，a j o i nl a r