（遗传学专业论文）哺乳动物双杂交分析sp1与p300的相互作用.pdf

摘要 “双杂交”或称“相互作用诱钓”，是一种以在基因水平上重建转录因子功能为基础， 利用杂交基因对报告基因的激活来检测蛋白蛋白间相互作用的一种体内分析方法。它 不仅能确定已知蛋白质之间是否存在相互作用，还能鉴定与已知蛋白相互作用的未知蛋 白。哺乳动物双杂交系统是酵母双杂交系统改进后在哺乳动物细胞中的应用。 p 1 6 “8 是细胞周期的抑制因子，可以与c d k 4 c d k 6 结合从而抑制其与c y e l i n d 结 合，使细胞周期停滞于g l 期。p j 6 懈和的突变会引发多种肿瘤的发生。p ，疗眦和基因的 启动予上存在着s p l 的经典结合位点c , - c 盒，已有研究表明，s p l 能与p ，6 “启动子 结合并调控其表达。同时，口j x 和的表达也受组蛋白乙酰化的调控。在本文中，我们 证实组蛋白乙酰转移酶p 3 0 0 与s p l 能够协同增强芦j 6 脒和启动子荧光素酶报告基因的活 性，在m r n a 及蛋白水平上也能协同上调p j 6 删“知的表达。哺乳动物双杂交结果显示， s p l 与p 3 0 0 之间的相互作用主要发生在s p l 的n 端和p 3 0 0 的q 区之间。 关键词蛋白间相互作用；组蛋白乙酰化修饰；p 3 0 0 ；s p l ：哺乳动物双杂交 a b s t r a c t t w o - h y b r i d o r “i n t e r a c t i o nt r a p ”i so n e o f t b et o o l sf o rt h er e s e a r c ho f p r o t e i n p r o t e i n i n t e r a c t i o n s nv i v ob ym e u r i n gt h ee x p r e s s i o no ft h ep e p o r t e rg e n ea c t i v a t e db y f u s e d - p r o t e i n s b a s e d o i lr e c o n s t r u c t i n gf u n c t i o n a lt m n s c t i 砸o nf a c t o r s t h i st e c h n i q u e e n a b l e sn o to n l yt h ei d e n t i f i c a t i o no fi n t e r a c t i n gp a r t n e r sb u ta l s ot h ec h a r a c t e r i z a t i o no f k n o w ni n t e r a c t i o nc o u p l e s m a m m a l i a nt w o h y b r i di st h ed e v e l o p e dt w o - h y b r i du s e di nt h e h i d e re u k a r y o t i cc e l ll i n e s p 1 6 埘k 4 af u n c t i o n sa sas u p p r e s s o ro fc e l lc y c l e ，a n di t sb i n d i n gt oc d k 4 c d k 6c a n p r e v e n tc d k 4 c d k 6f r o mb i n d i n gt oe y c l i n d ，w h i c hl e a d st og 1a r r e s t c o n s e q u e n t l y , t h e m u t a n t so fp 1 6a r ef o u n dc o m m o ni nm a n yk i n d so ft o a a l o r s t h e r ea r es e v e r a lg cb o x e s ， w h i c hi st h ec l a s s i c a ls p l b i n d i n gs i t e si nt h ep r o m o t e ro f p i d r 4 ag e n e i th a sb e e nr e p o r t e d t h a ts p li sas t r o n ga c t i v a t o ro ft h i s 瞰 m 咖m e a n w h i l e ，p i d n 拍i sa l s or e g u l a t e db y h i s t o n ea c e t y l a t i o mt h i ss t u d yd e m o n s t r a t e dt h a ta c y l t r a n s f e r a s ep 3 0 0c a r la c t i v a t ep i 8 n o np r o m o t e ra c t i v i t y , m r n al e v e la n dp r o t e i ne x p r e s s i o nw i t hs p ls y n e r g i s t i c a l l y t h e n , w e i n v e s t i g a t e dt h ep r e c i i n t e r a c t i o n sb g t w e e ns p la n dp 3 0 0 e x p e r i m e n t a ld a t ap r e s e n t e di n t h i st h e s i ss h o wt h a tt h en - t e r m i n a lr e g i o no fs p la n dt h eqd o m a i no fp 3 0 0p l a yi m p o r t a n t r o l e si nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns p la n dp 3 0 0 k e yw o r d s ：p r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o n s ；h i s t o n ea c e t y l a t i o n ；p 3 0 0 ；s p l ；m a m m a l i a n t w o h y b r i d 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其 他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王弛， 日期：2 2 ：! 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东：i l m i 范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复 印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东：l w j f i 范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：量拄耸， 指导教师签名： 日期：! ) l 工 e t 期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第一部分研究背景 一、p j 6 删m 基因及其转录调控机制的研究进展 ( 一) ，j 6 删m 基因的发现 早在1 9 9 2 年，美国学者b e a c h 等就注意到：在黑色素瘤患者体内存在细胞周期蛋 白依赖性激酶( e y e l i n - d e p e n d e n t k i n a s e ，c d k ) 和相应的细胞周期蛋白结合蛋白，同时 在第9 号染色体存在一个黑色素瘤易感基因( n l i n o r s i q p t i b i l i t ) ，g 朗e ) 1 】；此后又发现，许 多人类肿瘤及其细胞系中均有9 号染色体短臂2 1 2 2 区域的异常，如纯合、杂合缺失 或突变，故推测该区域内有肿瘤抑制基因存在。1 9 9 3 年，s e r r a n o 等口】克隆出此基因的 e d n a ，因其编码相对分子质量为1 6 k d 的蛋白质，故被命名为p 1 6 基因。1 9 9 4 年，美 国学者k a m b t 3 1 和圣地亚哥学者n o b o r l 等【4 】在研究中发现：在1 0 0 多株皮肤黑色素瘤细 胞株中，有超过半数的细胞株中存在9 p 2 1 标记的缺失，对缺失部分的序列分析发现其 中有两个区域与s 踟m n o 报道的p 1 6 序列相近，分别命名为多发性肿瘤抑制因子1 ( m u l t i p l et u m o rs u p p r e s s o r ，m t s l ) 和m t s 2 ，其中m t s l 和s e r r a n o 报道的p 1 6 序列 完全吻合；而m t s 2 与p 1 6 的序列有9 3 相同，命名为p 1 5 。p 1 6 基因的缺失与突变与 多种肿瘤的发生有关，在抑癌方面的重要性甚至超过p 5 3 和r b 基因，故引起了学术界 的广泛兴趣。p 1 6 蛋白可与细胞周期蛋白依赖性激酶4 ( c y e l i n - d e p e n d e n t k i n a s e 4 ，c d k 4 ) 结合，并抑制e y c l i n d c d k 4 的活性，所以也叫做c d k 4 抑制子( c d k 4 i n h i b i t o r ，c d k 4 i 或p 1 6 i n k 4 ) 【2 】。在文献中，还有人称其为c d k n 2 或p 1 6 i n k a 以便与p 1 5 i n k b 相区分。 在本论文中我们统称为p s 和。 ( 二) p 1 6 矾k 如蛋白与肿瘤发生 细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、 衰老和死亡等生理状态。若细胞周期调控异常，细胞将进入病理状态，且与肿瘤的发生 也密切相关。参与细胞周期调控的分子主要包括：细胞周期蛋白( e y e l i n ) 、细胞周期蛋 白依赖性激酶( c d k ) 、磷酸化酶以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白( c d k i n h i b i t o r c ) 。这些调节成分组成多条调节途径，通过使r b 蛋白磷酸化或去磷酸化构成以r b 蛋白为中心的一个复杂网络 6 1 。细胞周期蛋白：目前已发现8 个成员，分别命名为 c y e l i n a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 和h ，它们可与c d k 形成复合体，在不同的细胞周期中 发挥作用。c y e l i n a 、b 、d 均可与c d k 2 、4 、5 、6 形成复合体，调节g 1 期细胞功能， 使细胞由g l 期进入s 期，启动d n a 合成，开始细胞增殖。c y c l i n d 的过度表达可造成 细胞增殖失控，故可视其为一种癌基因1 7 j 。细胞周期蛋白依赖性激酶：目前已发现7 个成员，分别命名为c d k i 、2 、3 、4 、5 、6 、7 ，其中以c d k 2 最为重要。c d k 同时 具有与c y c l i n 和c k i 结合的活性，与前者结合会促进细胞增殖，而与后者结合后抑制 细胞周期，阻碍细胞分裂生长。细胞周期蛋白依赖性抑制因子c k i 是一类小分子蛋白 质，通过抑制c d k 活性对细胞周期起负性调节作用。根据c k i 结构特征分为两个家族： ( 1 ) c i p k i p 家族，包括p 2 1 、p 2 7 、p 5 7 ，它们抑制现已知的大多数c d k c y c l i n 的磷酸 化激酶的活性：( 2 ) i n k 4 家族，包括p 1 5 、p 1 6 、p 1 8 等，它们特异性地抑制c y c i i n c d k 4 ( c d k 6 ) 的磷酸化激酶活性嘲。目前认为c k i 是一类肿瘤抑制因子。 真核细胞分裂必须通过g 1 期- s 期的转换开始进行d n a 合成，通过1 3 2 期一m 期 转换进入有丝分裂期，这些转换过程中，c d k 起着重要作用。c d k 通过调节底物r b 蛋白的磷酸化而促使g l s 和g 2 一m 期的转换，导致细胞增殖。p 1 6 删k 4 4 蛋白与c y c l i n d 竞争结合c d k 4 ，能够特异性抑制c d k 4 的活性从而阻止细胞从g l 期进入s 期，抑制 细胞增殖【8 】；相反c y c l i n d 与c d k 4 结合时，刺激细胞生长、分裂，当p ，厅“5 和基因由于 缺失或突变不能表达时，c y c l i n d 与c d k 4 的结合占优势，过度刺激细胞分裂，使细胞 呈失控性生长而形成肿瘤【9 】。p 1 6 删k 4 。不仅可能通过p 1 6 i n k 4 a c d k 4 c y e l i n d p r b 途径， 还可能通过诱导端粒长度的改变使肿瘤细胞的无限增殖受到抑制，同时启动细胞衰老。 r b 基因也是一种抑癌基因，它决定视网膜母细胞瘤( r e = t i n o b l a s t o m a ，r b ) 的发生与否， 通常情况下r b 蛋白以去磷酸化活性形式存在，可抑制d n a 合成，对细胞生长进行负 调控，从而防止肿瘤发生。c d k 可对r b 蛋白进行磷酸化，解除r b 蛋白对d n a 合成 所必需的某些酶的表达抑制作用，促进细胞进入分裂周期。p 1 6 “8 通过与c d k 4 或 c d k 6 结合，阻碍c y c l i n d 与后者形成复合物，造成c d k 4 c y c l i n d 或c d k 6 c y c l i n d 激 酶失活，即可导致p r b 不被磷酸化，保持活性状态，使细胞周期停滞于g 1 s 期，抑制 细胞增殖。另一方面，失活或磷酸化的r b 基因可释放与p r b 结合的转录因子 ( t r a n s c r i p t i o n f a c t o r , t f ) ，游离的t f 可激活p j 6 胍妇基因转录，造成p 1 6 1 n k * a m r n a 高表 达【9 一o l ，从而限制r b 基因的过度失活。故而，p 1 6 k 抽与r b 的相互调节是保证细胞周 期正常由g 1 期进入s 期的关键因素之一，两者之间环节的破坏将直接导致细胞异常增 殖。 ( 三) p j 疗舢m 基因的结构及其转录调控 p j6 _ 眦和基因定位于人染色体9 p 2 1 ，分布在全长为8 5k b 的d n a 区段内，由3 个 外显子和其间的2 个内含子组成，3 个外显子的长度分别是1 2 6 b p 、3 0 t o p 、1 l b p 。 p j 6 眦和的表达受e t s l 和e t s2 的正调控；e t s1 和e t s2 与p j 疗眦妇启动子上的e t s 位点结合，促进p ，厅懈和的转录。r a s - - r a f - - m e k 级联放大系统可以增强这种促转录作 用，h e l i x - - l o o p - - h e l i x 蛋白i d l 则通过直接作用而抑制e t s 2 的促转录作用。在衰老细胞 中，虽然e t s 2 水平和m e k 信号降低，但e t s l 水平上升和i d l 水平下降仍使p j “的 表达显著增加【1 1 】。s p l 与p j6 _ 肿m 启动子结合并调控其表达【1 2 j ，当s p l 的结合位点突变 时，s p l 对p ，6 _ 懈和的调控作用消失 1 3 】。促有丝分裂信号的一个效果就是转录因子a p l 2 的激活，a p l 是由两部分复合物组成的，包括j u n ，f o s 和a t f 家族【1 4 】，由于p j 孑眦妇 启动子上有三个类a p l 结合位点，j u n b 就是通过这三个位点与p j 帐棚启动子的结合， 实验证明p j 疗“是j u n b 直接作用调节的基因，j u n b 是细胞周期的负调控因子【15 1 。 p j 瑚和启动子上游的g c 含量较高的一个区域被证实为表达调控的重要区域，称为转 录调控区1 1 6 1 。p j 帐柏的表达与r b 蛋白有关，c y c l i n - - c d k 复合物在人肿瘤细胞中的研 究解释另一条途径，就是p 1 6 m 与p r b 在功能上是相关的，感染了d n a 肿瘤病毒的 人细胞或缺少i 砖功能的细胞，e y l i n 不能与相应的c d k 结合【1 7 1s 1 9 】，这些细胞具有高 的p 1 6 删k “表达水平，有效地抑制c d k 4 或c d k 6 的功能 2 0 2 1 , 2 2 1 ，这说明p r b 与p 1 6 矾k 4 4 之间存在负反馈环，通过这个环p r b 负调节口j 疗愀和的表达1 2 3 。 p j “启动予富含g c 岛，在很多的肿瘤细胞中这些g c 丰富的区域常是高甲基化 状态的，用甲基化酶抑制剂5 - a z a - d c 及去乙酰化酶抑制剂t s a 共同处理细胞，可升高 p 厅懈和启动子区域的赖氨酸的乙酰化并促进p j 疗舢渤蛋白的表达 2 4 5 1 ，这说明p j 艿懈和 的表达还受组蛋白乙酰化的调节。 二、组蛋白乙酰化修饰与真核生物基因的转录调控 ( 一) 染色质重塑与转录调控 大量研究表明真核生物的染色质结构在转录调控中起重要作用。目前已发现了两类 高度保守的能改变染色质结构的复合物：( 1 ) 组蛋白修饰酶类重塑复合物和( 2 ) 依赖 a t p 的染色质重塑复合物。早在三十多年以前，人们就已经知道组蛋白赖氨酸残基的乙 酰化与转录激活有关。最近的研究表明，许多转录调控子( t m m s c r i p t i o n a lr e g u l a t o r s ) 是 组蛋白乙酰转移酶或组蛋白去乙酰化酶。与d n a 特异结合的转录因子招募组蛋白乙酰 转移酶和去乙酰化酶到启动子处，从而激活或抑制转录。这些结果有力地支持了这样的 结论，即：组蛋白乙酰化和去乙酰化在转录调控中起重要作用。最近也发现了依赖a t p 的染色质重塑复合物参与转录调控的分子机制。另外，人们已经发现一些依赖a t p 的染 色质重塑活动与组蛋白去乙酰化酶有关。在到目前为止研究过的复合物中，依赖a t p 的染色质重塑复合物增强了组蛋白去乙酰化酶的活性。这表明这两类复合物能够协同作 用来完成对转录的精确调控。染色质重塑状态的失调与一些疾病相关，要发现这些疾病 的新疗法，就必须对染色质重塑机制有全面的理解。 1 核小体结构和转录 真核生物与原核生物基因组结构的最大差别是真核生物的基因组紧密压缩和包装 在染色质结构中。染色质是真核生物遗传信息的载体，这种d n a - 蛋白的复合物具有高 度压缩和折叠的特点瞄一7 】。染色质的基本结构单位是核小体。核小体是由1 4 6 b p 的d n a 缠绕组蛋白八聚体而形成的。组蛋白八聚体包括h 2 a ，h 2 b ，h 3 和h 4 各两个分子。核小 体、连接d n a 和组蛋白h 1 组成了染色质的基本重复单位。核小体阵列( a r r a y s ) 进一步 包装成高度有序的染色质结构。染色质包装的结果之一是阻止调控转录的d n a 结合蛋白 3 与启动子接近。生化和遗传证据表明核小体通常是抑制转录的。然而，染色质结构是动 态的，它经历重塑后导致转录的激活或抑制。近年来人们发现了一类能够通过改变染色 质构型来影响( 活化或抑制) 转录的蛋白质复合因子，统称为核小体重塑复合物 ( n u d e o s o m er e m o d e l i n gc o m p l e x e s ) 。目前了解得比较清楚的染色质重塑复合物主要是 以下两大类起不同作用的蛋白质家族。 2 蛋白修饰酶类重塑复合物 组蛋白的翻译后修饰所引起的染色质结构的改变在真核生物基因表达调控中发挥 着重要的作用，这些修饰包括组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等。其中研究 得最清楚的是核心组蛋白尾部的乙酰化。早在三十多年以前，人们就把组蛋白乙酰化和 真核细胞的转录激活联系在一起。乙酰化发生在核心组蛋白氨基末端尾部保守的赖氨酸 残基上，例如h 4 的第8 位和第1 6 位赖氨酸，h 3 的第9 位和第1 4 位赖氨酸等。乙酰化 是怎样使d n a 更易于接近转录因子的目前还不十分清楚，流行的观点是组蛋白乙酰化 中和了其氨基末端赖氨酸残基的正电荷，削弱了组蛋白与d n a 的亲和力；另外，组蛋 白乙酰化也可能作为一种信号，改变相邻核小体上组蛋白与组蛋白间的作用以及组蛋白 和转录因子间的作用。这其中任何一种改变均可能影响核小体的结构，产生一个更加开 放的染色质环境，有利于转录因子的结合，从而促进转录。核心组蛋白n - 端尾部赖氨 酸残基的乙酰化修饰是可逆的，组蛋白去乙酰化酶( i - i d a c ) 可修饰组蛋白的去乙酰化， 导致染色质集缩，并抑制基因的转录。 3 依赖a t p 的重塑复合物 这是一类能够改变核小体结构的蛋白质复合物，它们的活性依赖于a t p 的水解。其 中有的被证实可以通过增强核小体d n a 与转录装置的可接触性而激活转录。依赖于 a t p 的重塑复合物被称为s w l 2 s n f 2 复合物。已鉴定的s w l 2 s n f 2 复合物有四类： s w i s n f ，i s w i ，c h d 和i n 0 8 0 【2 司。在s w i s n f 和i s w i 两类的s n f 2 区的c - 末端或 者有一个溴区或者有一个s a n t 区。在c h d 类复合体的n 末端有两个相邻的染色区。 i n 0 8 0 类除了s n f 2 区没有任何保守的基序，而且s n f 2 区有一个很长的插入序列。 尽管目前对依赖a t p 的重塑复合物作用的确切机制尚不完全清楚，但已获得了一 系列有意义的信息。w o r k m a n 和k i n g s t o n 2 9 1 提出了依赖a t p 的重塑复合物作用的3 种 方式：( 1 ) 重塑复合物水解a t p 产生能量使其在d n a 链上移动的同时使d n a 与核小 体产生位移( t r a n s l o c a t i o n - d e p e n d e n tr e m o d e l i n g ) ；( 2 ) 使d n a 在组蛋白核心上的缠绕 路径改变但不影响核心的构型( r e m o d e l i n g o f d n a c o n t a c t s ) ；( 3 ) 改变组蛋白核心从而 改变d n a - 组蛋白的接触方式( r e m o d e l i n g o f o c t a m e rs t r u c t u r e ) 。 ( 二) 组蛋白乙酰化修饰与转录调控 在染色质的不同修饰方式中，研究最为广泛的是对于核心组蛋白n 末端的赖氨酸残 基的乙酰化过程。乙酰转移酶( h a t ) 的催化功能使将乙酰辅酶a 的乙酰基转移到核心 4 组蛋白n 末端的赖氨酸残基上1 3 0 1 。赖氨酸的乙酰化中和了该区域的正电荷，进而减弱 了组蛋白一d n a ，核小体一核小体之间的作用，引发染色质结构的改变【3 l j ，染色质结构 的这种改变或重排有利于其他核因子，比如转录复合物，与基因区域的结合。在a l l i s 研究组的最初研究工作后，很多早已知道的转录辅激活物被发现属于组蛋白乙酰转移酶 类( h a t s ) 。相反的，许多组蛋白去乙酰化酶( h d a c s ) 则被证实为转录的辅阻遏物。 已经证明的是这种组蛋白修饰与基因表达调控之间存在着机制上的联系。组蛋白乙酰基 转移酶可以催化乙酰基转移到赖氨酸残基的氨基上，并由此介导基因的激活、沉默、 细胞程序化死亡、d n a 修复，以及可能与d n a 代谢有关的其它方面的作用。这些发现 提供给我们以必要的工具来把组蛋白乙酰化的精确作用的进一步问题定位在染色质的 功能调节之上，同时也提示我们在健康失调症的多样性问题上的一个新的治疗目标。 1 组蛋白乙酰化 人们很早就已经注意到乙酰化与基因活化有着密切的关系。h e b b e s 等人发现乙酰化 的组蛋白主要分布在对d n a s e i 敏感的染色质区。组蛋白的高乙酰化是活跃转录的标志。 组蛋白的乙酰化过程是一个与基因活性诱导和抑制密切相关的动态过程，高乙酰化标志 活跃转录而低乙酰化则与转录抑制相关。研究表明组蛋白乙酰基转移酶及其复合体除具 有调控基因转录起始的功能外，还参与了细胞周期调控、d n a 复制、修复以及染色体 组装等许多重要的生理过程。组蛋白乙酰化参与基因的转录延伸过程【3 l 】。 2 组蛋白乙酰转移酶 1 9 9 6 年，b r o w n e l l 等人首次从四膜虫核内分离提取了组蛋白乙酰转移酶g c n 5 1 3 2 1 ， 随后，研究者们从酵母【3 2 】，果蝇【3 3 1 ，玉米阴1 等生物体中分离得到了不同的乙酰转移酶。 根据组蛋白乙酰转移酶( h a t ) 的来源和功能将其分为两类：a 型和b 型h a t 。a 型h a t 位于核内，它能够催化核心组蛋白的乙酰化，与基因的转录调控相关【3 5 j ；b 型h a t 位于 细胞质内，催化的乙酰化事件与新合成的组蛋白h 4 从胞质转运到核内，并沉积在新复制 的d n a 上的过程有关【3 6 】。组蛋白乙酰转移酶按其结构特点可分为以下不同的家族： g n a t 超家族、m y s t 家族、t f u i c 、核受体共激活因子、t a f l l 2 5 0 和p 3 0 0 c b p 。 在已经鉴定和分离的组蛋白乙酰转移酶中，人们发现许多重组的组蛋白乙酰转移酶 在体外实验中只能够乙酰化游离的组蛋白，对组装在核小体中的组蛋白却没有乙酰化作 用。这些现象表明在体内还存在其他因子参与核小体组蛋白的乙酰化。它们通过与组蛋 白乙酰转移酶的相互作用，来调节酶与底物的特异性识别。组蛋白乙酰基转移酶及其复 合物在真核基因的转录调控中起着重要作用，它们参与了生物体内许多与基因转录调控 相关的重要生理过程，如：d n a 复制、修复，染色体组装以及细胞周期调控等。其外， 乙酰化与肿瘤的形成特别是白血病的形成有关，对基因错误的乙酰化是导致肿瘤形成的 原因之一。 3 组蛋白乙酰转移酶的功能 虽然最初研究者发现组蛋白乙酰化与转录激活密切相关，但是最近的研究表明组蛋 5 白乙酰化以及组蛋白乙酰转移酶还有更加广泛的多种多样的功能。组蛋白乙酰转移酶复 合物参与转录激活，基因沉默、细胞周期调控、d n a 复制、修复以及染色体组装等许 多重要的生理过程。 1 ) 参与基因的转录激活 多种基本转录元件的组分，如t a f i l 2 5 0 ，t f l c 9 0 1 1 0 2 2 0 等，本身就具有组蛋白 乙酰转移酶的特性，能通过溴区结构起到将t f i i d 复合体定位到靶基因启动子上的作 用，有利于转录的起始和激活。p c a f 能在体外乙酰化组蛋白，也能乙酰化核小体内的 组蛋白，它的作用位点主要是组蛋白h 3 的1 4 位赖氨酸( k 1 4 ) ，而对组蛋白h 4 的k 8 作用较弱【3 7 1 。即生成过程中p c a f 能以h a t 依赖的形式发挥其辅激活作用【3 8 1 ，刺激转 录的进行1 3 9 1 。p 3 0 0 和c b p 是一类具有乙酰化酶活性的辅激活因子。c b p p 3 0 0 能通过直 接( 或间接) 与转录因子，如c r e b ，核激素受体，c - f o s ，c - j u n 和e - m y b 等结合诱导 特异的转录i 帅】。 除了被转录因子招募到特异基因上发挥转录辅激活作用以外，p c a f 和c b p p 3 0 0 还可以通过对特异转录因子或基本转录元件的乙酰化作用来调控它们的活性，影响基因 的转录过程【4 “4 2 1 。 2 ) 参与基因的转录延伸 e l p 3 是g n a t 家族的一员，也是r n a 聚合酶i i 紧密结合的三个转录延伸复合物中 的亚单位，作为r n a 聚合酶i i 全酶的一部分直接参与转录的延伸过程【4 3 】。重组的e l p 3 能乙酰化所有四种核心组蛋白，说明乙酰化对基因的转录延伸起到重要的作用 4 4 1 。n u a 3 复合物中的催化亚基s a s 3 能与s p t l 6 蛋白相互作用，s p t l 6 是酵母c d c 6 8 p o b 3 复合物和 哺乳动物f a c t 复合物的成员，体外实验的结果表明f a c t 能通过对组蛋白h 2 a 和h 2 b 的瞬间移动而有利于转录的延伸，暗示s a s 3 是在f a c t 与r n a 聚合酶复合物在染 色质上滑动的同时，对染色质进行乙酰化的【4 5 】。 3 ) 参与细胞周期进程 哺乳动物细胞中，t a f l l 2 5 0 是t f i i d 的最大的亚基，近来的研究表明t a f n 2 5 0 的 h a t 活性与细胞周期调控有关。温度敏感型突变小鼠细胞系t s l 3 在限定温度条件下， 细胞生长停滞在g l 期并出现细胞凋亡的现象，基因芯片技术分析结果表明t a f l l 2 5 0 的 h a t 活性参与了细胞周期调控和d n a 合成相关基因的表达【舶】。转录复合物起始模型认 为组蛋白尾部能阻碍t b p 与t a t ab o x 的结合，t a f i l 2 5 0 能乙酰化t a t ab o x 处的组蛋 白，使t b p 易于结合t a t a b o x ，从而促进转录起始复合物的形成【4 ”。 e s a l 也是细胞周期过程中必需的h a t 。体外重组的e s a l 能乙酰化组蛋白h 2 a 、h 3 和h 4 ，对h 4 的k 5 有较强的乙酰化活性【4 ”。体内实验证实缺失e s a l 能使细胞周期停 滞在g 2 m 期【4 9 】，但有关的机理尚不清楚。 4 ) 参与染色体组装 6 参与染色体组装的乙酰化酶主要是b 型h a t 蛋白h a t l 5 0 l 。h a t l 参与的是新合成的 组蛋白的加工过程，在细胞质中进行。体外实验中h a t l 可以乙酰化组蛋白h 4 的k 1 2 1 5 ”， 这是新合成的组蛋白的主要乙酰化位点【5 2 】。重组的h a t l 存在于一个多亚基复合物中。 其成员h a t 2 是r b a p 4 6 4 8 的同源物，与组蛋白h 4 紧密结合；c a f l 亚基参与染色质的 组装。近来发现h a t l 和h a t 2 也具有核内h a t 活性，可乙酰化游离的组蛋白h 4 ，推测 h a t l 和h a t 2 可能以一种更直接的方式参与染色质的组装过程郾j 。 两参与基因沉默 在酵母中，s a s 2 和s a s 3 参与转录沉默的调控。s a s 3 是与沉默相关的酵母复合物 m y s t 的成员，与s a s 2 有很高的同源性。在体外实验中s a s 3 能强乙酰化游离组蛋白 h 3 、h 4 和h 2 a 【5 4 1 ，是h 3 乙酰化复合物n u a 3 的催化亚基。s a s 2 的乙酰化活性仍未证 实，这可能是由于其催化活性需要其他的亚基的作用或需体内修饰才能发挥其催化活 性。s a s 2 对于基因沉默同时具有两种相反的调控作用，在h m l 处促进沉默，而在h m r 处抑制沉驸5 5 1 ，其双突变导致交配型的缺失。s a s 3 的突变造成h m r 位点的部分缺失， 但不影响端粒的沉默。转录沉默通常被认为与乙酰化水平的降低有关，但这两种h a t 对转录沉默是正向调控的，有关的机制还需进一步的实验依据证实。 回参与信号转导过程 甾类受体辅激活物l ( s r c 1 ) 的c 末端具有h a t 活性，可以乙酰化游离的和核小 体中的组蛋白h 3 和h 4 5 6 1 。s r c 1 可以激活核受体( 如黄体酮受体、糖皮质激素受体、 雌激素受体和甲状腺激素受体等) 的配体依赖活性【5 7 】，在信号转导过程中的作用十分重 要。s r c 1 既可与c b p p 3 0 0 又可与p c a f 相互作用，这说明多个h a t 参与了激素信 号介导的基因转录调控【5 s 】。a c t r 也是一种乙酰转移酶，它的乙酰化结构域位于蛋白的 c 末端。除可与多个核激素受体相作用外，还具有反式激活作用，说明乙酰化酶可以直 接控制信号转导过程中的关键步骤。 7 ) 参与d n a 拼接、复制和损伤后修复 免疫球蛋白和t 细胞受体( t c r ) 的产生是由于免疫球蛋白基因和t c r 基因拼接的 结果。r a g i 和r a g 2 蛋白介导了基因片段的断裂与信号序列r s s ( r c c o m b i n a t i o ns i g n a l s e q u e n c e s ) 的重组。体外实验中r s s 处核小体的组装可以阻碍r a g 介导的基因片段的断 裂，组蛋白h 3 的乙酰化修饰参与了v ( o ) j 的重组过型5 9 1 ，根据推测是通过破坏染色体 的高级结构来参与这一调控过程的。 i - i b 0 1 可乙酰化游离的组蛋白h 3 和h 4 ，能与o r c 复合物的亚基o r c l 发生相互 作用。o r c l 能结合d n a 复制原点并起始复制嗍，h b o i 可能参与了这一生理过程。 t i p 6 0 ( t a t - i n t e r a c t i v ep r o t e i n ，6 0 k d ) 是m y s t 蛋白家族的一员，可在体外乙酰化游离 的h 2 a 、h 3 和h 4 。有实验证实币p 6 0 复合物具有3 5 d n a 解旋酶活性，缺失n p 6 0h a t 活性的h e l a 细胞在1 r 射线辐射后不能进行双链d n a 的修复，目前这一调控过程的分 子机制还不十分清楚，据推测乙酰化修饰可能使d n a 修复系统更易接近修复位点，也 7 可能是t i p 6 0 对d n a 修复蛋白进行乙酰化修饰的结果陋”。 8 ) 剂量补偿 果蝇的剂量补偿实验中m o f 位点的突变会导致雄性果蝇致死，死亡的果蝇组蛋白 h 4k 1 6 不能被乙酰化。体外实验证实重组的m o f 可强烈乙酰化1 - 1 4 ，说明果蝇的剂量 补偿与m o f 的乙酰化作用有直接的关系 6 2 1 。 9 ) 基因组整体水平的乙酰化 v o g e l a u e r 等人在酵母中利用免疫共沉淀技术发现，缺失某一特定的组蛋白乙酰转移 酶或去乙酰化酶都会影响基因组中任一检测位点的乙酰化水平吲。他们认为酵母中存在 着基因组整体水平的乙酰化。b e r g e r 等人认为这种基因组整体水平的乙酰化可能基于以 下两个原因。一个是整体的乙酰化能使基因迅速的开启和关闭，使生物体对外界环境的 刺激有快速而敏感的反应；第二是基因组整体水平的乙酰化可能与d n a 的复制与修复 有关。在进行d n a 复制时需要松散的染色体结构，而这一结构的形成与基因组的整体 乙酰化水平有关嗍。 4 组蛋白乙酰转移酶p 3 0 0 p 3 0 0 是一种重要的组蛋白乙酰化酶，p 3 0 0 的基因在许多多细胞生物中都是高度保 守的。p 3 0 0 之所以引起科学界的极大注意这有两个主要原因：一、p 3 0 0 作为一特殊的 转录辅因子本身具有组蛋白乙酰化转移酶活性，所以它具有调节染色体结构的功能。二、 它是多细胞生物中特有的乙酰化酶，多细胞生物所特有的细胞分化、信号转导都与其密 切相关。p 3 0 0 参与了许多生理进程，包括增殖、分化、凋亡。同时，p 3 0 0 作为转录调 节因子，也参与了许多信号依赖的转录事件。病毒癌蛋白如腺病毒e i a ，s v 4 0 大t 抗 原，都特异的靶定p 3 0 0 。p 3 0 0 与病毒癌蛋白形成复合物后导致细胞生长失去控制，增 强d n a 合成，阻抑细胞分化。近期的研究表明，p 3 0 0 基因的改变导致许多人类癌症的 形成，因此p 3 0 0 被认为具有抑癌因子的功能。 染色质的乙酰化水平是调节转录的关键机制。尽管p 3 0 0 的组蛋白已酰化活性直接 参与染色体改构，但越来越多的证据表明其转录因子、转录机器的作用靶也受乙酰化的 调节。目前对p 3 0 0 的功能研究主要倾向于其因子乙酰化的作用，即对转录因子以及转 录机器的乙酰化。这进一步说明了p 3 0 0 的乙酰化活性的重要性。到目前为止，已发现 p 3 0 0 与很多信号通路都有联系，因此可以认为p 3 0 0 是一个多功能的转录调节因子。许 多转录因子同时与p 3 0 0 相互作用有助于转录因子的协同，相反，竞争性的与p 3 0 0 结合 将介导某些信号转导的抑制。 c b p p 3 0 0 是高度保守的两类蛋白，所以经常写在一起，他们是具有广泛作用的通用 转录整合子【6 5 1 ，目前认为他们可通过许多机制发挥作用：其一是机器桥梁作用，r n a 聚合酶n 转录的起始需要特异的启动子，增强子结合的转录因子，也需要基本转录机器， 除非二者之间能之间相互作用，不然就需要一个桥梁来使转录因子和基本转录机器联系 起来，p 3 0 0 c b p 就具有这种功甜删；其二p 3 0 0 c b p 作为支架起作用，p 3 0 0 c b p 蛋白 r 可能将不同的辅因子蛋白组装进一个多成分的辅激活子复合物【6 7 j ，通过为转录因子组装 提供支架，可能使这些因子在局部转录环境下浓度相对升高，这样方便了蛋白一蛋白和 蛋白一d n a 间的相互作用呻】；其三依赖其乙酰化酶活性，核心组蛋白尾部的多个乙酰 化位点与转录活性有关，低乙酰化通常与转录抑制相关，而高乙酰化与转录激活相判明， 乙酰化可能具有以下作用：1 ) 由于中和了赖氨酸的正电荷而促进转录因子接近d n a 7 0 1 ， 2 ) 降低了核小体间的相互作用，使染色质高级结构变得不稳定1 7 “翻，3 ) 促进r n a 聚 合酶通过核小体序列【7 ”。 图1 1p 3 0 0 ，c b p 的蛋白结构和与其相作用的蛋白因子，引i ! l c h a n 7 4 c b p p 3 0 0 的结构有四个保守区域( 图1 1 ) 【m 】，分别是一个溴区；三个半胱氨酸 组氨酸富含区( c y s h i s 区，c h l ，2 和3 ) ；一个k i x 区和一个a d a 2 同源区。a d a 2 区与酵母转录辅激活物a d a 2 p 的蛋白结构很相似。c h l 、c h 3 和k i x 区主要起介导蛋 白质问相互结合的作用，多种蛋白在此区域都可以与c b p p 3 0 0 结合( 图1 1 ) 。溴区是 识别乙酰化氨基酸残基的区域，也可以结合一些含有溴区的蛋白因子。p 3 0 0 c b p 的n 端和c 端含有反式激活区，具有较强的转录激活能力，起乙酰化作用的h a t 区位于蛋 白的中心部分，据推测这种结构可能使p 3 0 0 成为多亚基转录辅激活复合体的骨架。 5 p 3 0 0 与s p l 关系的研究进展 p 3 0 0 c b p 作为转录辅激活子可以与多种转录因子相互作用，其中包括c r e b 7 5 】， b h l h 因子 7 6 1 ，p p 9 0 r s k 7 ，核受体【7 s 1 ，s t a t 蛋白【7 9 】，a p l ，n f 出【8 0 】以及s p l 。s p 家族转录因子通过g c b o x e s 与d n a 结合并激活转录【s ”，如s p l ，s p 2 ，s p 3 和s p 4 。目 前，关于s p l 与p 3 0 0 的相互作用研究结果并不是很一致，有的研究结果认为s p l 不与 p 3 0 0 直接相互作用【翻，但是p 3 0 0 与s p l 能共同免疫共沉淀下来说明他们形成了复合物 噼8 3 , 州，可能是z b p 8 9 在这个过程起作用【8 5 】，p 3 0 0 与s p l 具有功能上的协同作用这 点是肯定的；另有研究表明p 3 0 0 的h a t 区与s p l 的d n a 结合区相互作用，并促进其 q 与d n a 的结合【蛔。 三、s p l 的结构及其与其他蛋白的相互作用 富g 元件是一类很重要且分布广泛的启动子元件，许多基因的启动子和增强子上都 存在着g c b o x e s 或类似的序列，如g c 。b o x ( g g g g c g g g g ) 和 g t c a c c c b 刚g g l g t g g g g 等，这些元件对许多细胞中遍在的和特异的基因以及病 毒基因的正常表达都是必需的【8 7 】。此外，这些元件也参与c p g 岛甲基化的维持，如对 a p r t 基因的研究中所发现的那样【8 “。 s p l 最初是作为一个能与猴肾病毒4 0 ( s v 4 0 ) 的早期启动子例和胸苷激酶( t k ) 【则 启动予上的g c b o x e s 结合而激活转录的转录因子而被认识的。在此后的很长一段时间 里，人们都认为s p l 对那些通过g c g t - b o x e s 被调控的基因的转录调控都是必需的。但随 后与s p l 高度亲缘的s p 2 、s p 3 和s p 4 的克隆，改变了这一观念【9 “蜊。之后，s p 5 9 3 1 、s p 6 1 9 4 1 、 s p 7 1 9 5 1 和s p 8 ( p b o u w m a na n ds p h i l i p s e n , 结果未公布) 也相继发现。 s p 因子中，s p l 、s p 2 、s p 3 和s p 4 由于相似的模块结构而形成一个亚家族( 图1 2 ) 嗍。 s p l 、s p 3 和s p 4 都有两个主要的谷氨酰胺丰富的转录激活区a 和b ，a 、b 附近有丝氨酣 苏氨酸