（遗传学专业论文）喉癌中sp100表达及生物学功能研究.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语8 三、论文 论文第一部分 前言9 9月u 舌 实验材料与方法1 0 实验结果2 2 讨论2 9 结论3 0 论文第二部分 前言3 1 日u 吾 实验材料与方法3 2 实验结果4 3 讨论5 2 结论5 5 四、本研究创新性的自我评价5 6 五、参考文献5 7 六、附录 综述：6 5 在学期间科研成绩7 3 致谢7 4 个人简介7 5 中文论著摘要- 喉癌中s p l0 0 表达及生物学功能研究 月u吾 喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，发病率约占全身肿瘤的1 - 5 ，并且发病率呈 不断增长的趋势：北美每年有1 3 0 0 0 例患者被诊断为原发性喉癌；在我国，喉癌 的发病率在呼吸系统恶性肿瘤中占据第二位，华北、东北地区是喉癌的高发区。 手术是目前治疗的主要手段，尽管早期喉癌患者的生活质量由于喉部分切除术的 应用得到了较大的改善，但晚期喉癌患者的生活质量及生存率在最近的3 0 年中无 明显变化。喉癌发生的病理分子机制仍不清楚，探讨其发生、发展的分子机制无 论对喉癌的早期诊断，还是有效治疗都具有重要意义。在前期的工作中，我们发 现在喉癌组织中表达下调的s h 3 g l 2 蛋白在喉癌细胞系中可以和s p l 0 0 蛋白结合而 相互作用，提示s p l 0 0 蛋白可能与喉癌的发生和进展相关，在喉癌发生演进中发 挥一定的作用。 s p l 0 0 蛋白，全名为s p l 0 0 核抗原( s p l 0 0n u c l e a ra n t i g e n ) ，属早幼粒白 血病核小体( p r o m y e l o c y t i cl e u k a e m i an u c l e a rb o d y ，p m ln b s ) 相关蛋白家族 成员，含有s p l 0 0 i 皿i g 、s p i o o a 、s p i o o b 和s p i o o c 四种异构体。4 种s p l 0 0 蛋白 异构体在氨基端共享同源s p l 0 0 结构域，不同异构体在羧基端的s a n d 、p h d ( p l a n t h o m e o d o m a i nz i n cf i n g e r ) 、b r o m o 或h i v i g ( h i g hm o b i l i t yg r o u p ，高迁移率组) 结构域存在差别。s p l 0 0 蛋白己被证实参与病毒感染、病毒相关蛋白相互作用、 自身泛素化调节，并在干扰素、p 5 3 等多个信号通路中发挥作用。目前有关其在 人体肿瘤中的研究尚未见报道。 在本研究中，我们将明确s p l 0 0 基因在不同肿瘤细胞系及喉癌大体组织标本 中的表达方式。同时，深入研究s p i o o h m g 的生物学功能及其与s h 3 g l 2 蛋白的相 互作用方式。一方面可为阐明s p l 0 0 基因在喉癌发生和发展过程中的分子机制创 造条件并提供新的线索，另一方面为开展以s p i o o h m g 为靶点或通过蛋白相互作用 设计竞争性抑制剂的喉癌诊断和治疗奠定基础。 材料与方法 通过半定量p c r 和实时定量p c r 分别检测s h o o 基因m r n a 在人喉癌h e p 2 细 胞系、人宫颈癌h e l a 细胞系、人肝癌b e l 细胞系、人胃癌s g c 7 9 0 1 和b g c 8 2 3 细 胞系、人胚肾h e k 2 9 3 细胞系和胎儿胃上皮g e s 细胞系中的表达情况。选取2 0 0 4 年1 月一2 0 0 6 年1 2 月于中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科诊断为喉鳞状细 胞癌的病例9 6 例，收集喉癌组织及癌旁黏膜组织标本及相应病例临床资料，采用 r t p c r 、w e s t e r nb l o t 和免疫组织化学方法研究s h o o 基因在喉癌大体组织标本 中表达情况，应用统计学方法分析临床病理资料与s p l 0 0 表达间的关系。 通过r t - p c r 分析$ p i o o i - i m g 转录本在人喉癌l l e p 2 细胞系、人宫颈癌h e l a 细 胞系、人肝癌b e l 细胞系、人胃癌s g c 7 9 0 1 细胞系、b g c 8 2 3 细胞系、m k n 细胞系、 人胚肾h e k 2 9 3 细胞系和胎儿胃上皮g e s 细胞系中的表达情况；构建r f p s p i o o h m g 表达载体，转染h e p 2 细胞，通过w e s t e r nb l o t 和r t - p c r 检测h e p 2 细胞中s p i o o i n g 表达水平，同时观察转染后细胞形态学、细胞增殖能力、细胞体外侵袭能力和细 胞凋亡水平的变化，综合分析s p i o o h m g 在喉癌细胞中的生物学功能。通过免疫共 沉淀技术和免疫荧光技术分析s p i o o h m g 和s h 3 g l 2 蛋白结合及区域定位；通过生 物信息学技术对s p l 0 0 删g s h 3 g l 2 结合区域进行预测，构建该结合区域肽链表达 载体、通过免疫共沉淀对s p i o o h m g s h 3 g l 2 的蛋白结合区域进行验证，进一步揭 示其参与蛋白质问结合的肽链片段。 结果 1 、半定量和实时定量r t - p c r 结果表明h e p 2 、h e l a 、b e l 、s g c 7 9 0 1 、b g c 8 2 3 肿瘤细胞系中s p l 0 0m r n a 水平较黏膜上皮细胞系g e s 降低； 2 、r t p c r 和w e s t e r nb l o t 结果显示，喉癌组织中s p i o om r n a 和蛋白表达 水平均低于癌旁对照组织，蛋白表达下调水平与m r n a 表达下调水平一致； 3 、免疫组织化学分析s p l 0 0 蛋白表达位于细胞核和细胞质，蛋白表达水平 与喉癌细胞病理分化程度相关，低水平表达时s p l 0 0 蛋白从细胞核向细胞质移位； 4 、r t - p c r 结果显示在h e p 2 、h e l a 、b e l 、s g c 7 9 0 1 、b g c 8 2 3 、m k n 肿瘤细胞 系中s p i o o l i m gm r n a 水平较黏膜上皮细胞系g e s 降低； 2 5 、r f p s p l 0 0 h m g 表达质粒转染h e p 2 细胞后，细胞中s p l 0 0 蛋白表达水平显 著增加，r t p c r 显示s p i o o h m g 表达水平亦显著增加： 6 、s p i o o h m g 对人喉癌h e p 2 细胞生物学行为的影响：r f p - s p i o o h m g 表达质 粒转染h e p 2 细胞可以观察到明亮的红色荧光蛋白表达，转染细胞形态明显变圆、 边缘变钝，细胞凋亡率增高、侵袭力显著降低，细胞增殖水平较对照组细胞无明 显变化； 7 、免疫共沉淀显示s p i o o h m g 和s h 3 g l 2 在h e p 2 细胞内结合，免疫荧光显示 s p i o o h m g 定位于细胞核，s h 3 g l 2 定位于细胞核和细胞质，二种蛋白结合区域定位 于细胞核； 8 、生物信息学预测并经免疫共沉淀实验证实s p i o o h m g 蛋白与s h 3 g l 2 蛋白 结合位点位于s a n d - h m g 区域。 结论：日h二 1 、s p l 0 0m r n a 在多个恶性肿瘤细胞系中表达下调，参与肿瘤的发生发展； 2 、喉癌组织中s p l 0 0 在转录和翻译水平上表达下调，是潜在的喉癌相关的 抑癌基因； 3 、喉癌组织中s p l 0 0 蛋白表达水平、细胞内分布状况在不同分化程度癌细 胞中存在显著差异性，提示在喉癌的不同阶段可能发挥不同的作用； 4 、s p i o o h m 6 在不同肿瘤细胞系中表达水平较正常黏膜上皮细胞系表达下调， 在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥作用； 5 、s p i o o h m g 具有抑制喉癌细胞侵袭并增强细胞凋亡的能力，是喉癌相关的 重要候选肿瘤抑制基因； 6 、s p i o o h m g 通过s a n d h m g 结构域与s h 3 g l 2 在细胞核内结合，提示s p i o o h m g 和s h 3 g l 2 可能通过形成复合体方式调节下游基因转录活性。 关键词：喉癌；s p l 0 0 ：s h 3 g l 2 ；生物信息学 基金项目：国家自然科学基金( 3 0 7 0 0 9 8 0 ) 3 - 英文论著摘要 s t u d yo nt h ep r e s s i o na n db i o l o g i c a f u n c t i oofstudy 0 nt i l ee xr e s s l o na n b i o l o g i c a lf u n c t i o no l s p l 0 0i nl a r y n g e a lc a r c i n o m a i n t r o d u c t i o n l a r y n g e a lc a r c i n o m ai so n eo ft h em o s tc o m m o nh e a da n dn e c kc a n c e r s ，w h o s e i n c i d e n c er a t e s1 - 5 o fa l lh u m a nm a l i g n a n c i e s ，a n dt h ei n c i d e n c eo fl a r y n g e a lc a n c e r h a sb e e nr i s i n go v e rp a s td e c a d e s ：o v e r13 ，0 0 0n e wc a s e sw e r ed e t e c t e da n dd i a g n o s e d i n2 0 0 7i nt h eu n t i e ds t a t e s ，w h i l el a r y n g e a lc a n c e rh a sb e c o m et h es e c o n dm o s t c o m m o nr e s p i r a t o r ys y s t e mc a n c e ri nc h i n aa n dt h en o r t h e a s tp a r to fi st h eh i g h i n c i d e n c er e g i o no fl a r y n g e a lc a r c i n o m a d e s p i t et h eq u a l i t yo fl i f ef o re a r l ys t a g e c a n c e rp a t i e n t sh a si m p r o v e di nr e c e n ty e a r sd u et o o r g a np r e s e r v a t i o na p p r o a c h e s ， m o s tl a t es t a g ec a n c e ri ss t i l lf a t a la n dt h es u r v i v a lr a t er e m a i n su n c h a n g e di nt h ep a s t 3 0y e a r s l i k eo t h e rm a l i g n a n c i e s ，t h ei n i t i a t i o na n dp r o g r e s s i o no fl a r y n g e a lc a n c e r i n v o l v em u l t i f a c t o r sa n dm u l t i s t e p s t h u s ，s t u d yo nt h em o l e c u l a rb a s i so f t u m o r i g e n e s i sm a yg r e a t l yh e l p m a k ee a r l yd i a g n o s i s ，d e v e l o pt a r g e tt h e r a p e u t i c s t r a t e g i e s ，a n di m p r o v ec l i n i c a lo u t c o m e si n c l u d i n gb o t hs u r v i v a lr a t ea n dq u a l i t yo f l i f ei nt h ep a t i e n tp o p u l a t i o n s p10 0p r o t e i nb e l o n g st oap e r m a n e n tp r o m y e l o c y t i cl e u k a e m i a nn u c l e a rb o d i e s ( p m ln b s ) a s s o c i a t e dp r o t e i n s ，w h o s en a m ec o m e sf r o mi t ss p e c k l e da p p e a r a n c e p a t t e r ni n t h en u c l e u sw i t ha p p r o x i m a t e l ylo o k d am o l e c u l a rm a s s s p10 0p r o t e i n f a m i l yc o m p r i s eo ff o u ri s o f o r m s ：s p l 0 0 h m g , s p l 0 0 a ，s p l 0 0 ba n ds p 0 0 c s p l 0 0 p r o t e i ni sf o u n dm a i n l yl o c a t e di np m l n bd o m a i ni nt h en u c l e u s ，a n dp r o v e dt ob ea m u l t i f u n c t i o n a lp r o t e i n s p10 0p a r t i c i p a t e si nd i f f e r e n tc e l l u l a rb i o l o g i c a lp r o c e s s e s ， s u c ha sr e g u l a t i o no ft r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t y , v i r a li n f e c t i o nd e f e n s e ，a p o p t o s i s ，a n ds o o n s t u d yo np a r t i c i p a t i o no fs p 10 0i nh u m a nm a l i g n a n c i e sh a sn o tb e e nr e p o r t e d 4 b e f o r e i nt h i ss t u d y , s p i0 0e x p r e s s i o nl e v e l sw e r ee x p l o r e di nd i f f e r e n tc a n c e rc e l ll i n e s a n di nl a r y n g e a lc a n c e rs a m p l e sa sw e l l t h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no fs p10 0 h m ga n di t s i n t e r a c t i o nw i t hs h 3 g l 2w e r es t u d i e d t h ea i mo ft h i ss t u d yi st oc l a r i f yt h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo fs p i0 0i nm a l i g n a n tt u m o r , a n dt oe x p l o r et h ep o t e n t i a ld i a g n o s i sa n d t r e a t m e n to fs p10 0 h m ga st a r g e ti nl a r y n g e a lc a n c e n m a t e r i a l sa n dm e t h o d s h e p 2 ，h e l a ，b e l ，s g c 7 9 01 ，b g c 8 2 3 ，k p n ，h e k 2 9 3a n dg e s 一1c e l ll i n e sw e r e u s e di nt h i ss t u d y , a n dt h es p e c i m e n sf r o m9 6p a t i e n t sw i t hl a r y n g e a lc a n c i n o m a t o g e t h e rw i t ht h ec l i n i c 叩a t h o l o g i c a ld a t aw e r ea l s oa n a l y z e d s p l 0 0g e n ee x p r e s s i o n w a sd e t e c t e du s i n gr e a l - t i m er t - p c ra n ds e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c ri nc e l ll i n e s ，a n d w a sd e t e c t e db yr t - p c r ，w e s t e r nb l o ta n di m m u n o h i s o t o l o g i c a ls t a i n i n gi nc l i n i c a l s p e c i m e n s s p io o h m gt r a n s c r i p te x p r e s s i o nw a se v a l u a t e du s i n ge m i q u a n t i t a t i v er t - p c r i nd i f f e r e n tc e l l sl i n e s t h eb i o l o g i c a lc h a n g e so fh e p 2c e l l sa f t e rt r a n s f e c t e dw i t h r f p s p10 0 h m gv e c t o rw e r ed e t e c t e db ym t t , f l o wc y t o m e t r y , t r a n s w e l l ，r t - p c r a n dw e s t e r nb l o t c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o nw a su s e dt oe x p l o r et h ei n t e r a c t i o no f s p10 0 h m ga n ds h 3 g l 2 ，a n dt h ep o s s i b l eb i n d i n gs i t eo ft w op r o t e i n sp r e d i c t e db y b i o i n f o r m a t i c ss o f t w a r ew a sc o n f i r m e db yc o i m m u n o p e c i p i t a t i o n r e s u l t 1 r e a l t i m ea n ds e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c rr e s u l t ss h o w e ds p i 0 0m r n al e v e l s w e r es i g n i f i c a n t l yl o w e ri na l lt h ec a n c e rc e l ll i n e st h a nt h o s ei nt h en o r m a lm u c o s ac e l l l i n e s 2 r t - p c ra n dw e s t e r nb l o tr e s u l t ss h o w e dt h a tb o t hs p10 0m r n aa n dp r o t e i n l e v e l sw e r ec o h e r e n t l yd o w n - r e g u l a t e di nl a r y n g e a lc a r c i n o m ac o m p a r e dt ot h o s ei nt h e a d j a c e n tm u c o s at i s s u e s 3 i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g r e s u l t ss h o w e dt h a ts p10 0 p r o t e i n w a s e x p r e s s e di nt h en u c l e u sa n dp l a s m a ，a n de x p r e s s i o nl e v e lc o r r e l a t e dw i t hc a n c e rc e l l 5 d i f f e r e n t i a t i o n s pi0 0p r o t e i nw a sp r e d o m i n a n t l yl o c a t e da tp l a s m ai nl o we x p r e s s i o n c a n c e rc e l l s 4 r t - p c rr e s u l t ss h o w e dt h a ts p io o h m gm r n al e v e l sw e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e ri na l lt h ec a n c e rc e l “i n e st h a nt h o s ei nt h en o r m a lm u c o s ac e l l l i n e s 5 w e s t e r nb l o tr e s u l t ss h o w e dt h a ts p10 0p r o t e i nl e v e li n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi n t h er f p - s p10 0 h m gt r a n s f e c t e d h e p 2c e l l s ，a n dr t - p c rr e s u l t s s h o w e dt h a t s p io o h m g e x p r e s s i o nw a su p r e g u l a t e d 6 i n f l u e n c eo fs p10 0 h m gt r a n s f e c t i o no nb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fh e p 2 c e l l s ：c o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p ，t h ea b i l i t i e so fi n v a s i v e n e s sw e r es i g n i f i c a n t l y l o w e r , a n dt h er a t eo fa p o p t o t i cc e l l sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e ri nh e p 2c e i l s 7 c o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o nr e s u l t ss h o w e dt h a t s p10 0 h m gi n t e r a c t e dw i t h s h 3 g l 2 ，a n di m m u n o f l u o r e s c e n ts t a i n i n gi n d i c a t e dt h a tt h ei n t e r a c t i o ns i t ew a s l o c a t e di nt h en u c l e u s 8 t h ed o c k i n gs i t eo fs p10 0 h m gw a sl o c a t e di nt h es a n d h m g , w h i c hw a s p r e d i c t e db yb i o i n f o r m a t i c ss o f t w a r ea n dc o n f i r m e db yc o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o n c o n c l u s i o n 1 l o we x p r e s s i o no fs p10 0p a r t i c i p a t e si nt h eg e n e s i sa n dd e v e l o p m e n to f m a l i g n a n tt u m o r 2 s p1 0 0m i g h tb eap o t e n t i a ll a r y n g e a lc a n c e rr e p r e s s o r 3 s p10 0e x e r t sd i f f e r e n tb i o f u n c t i o na m o n gd i f f e r e n ts t a g e so fl a r y n g e a lc a n c e r 4 s p io o h m g p a r t i c i p a t e si nt h eg e n e s i sa n dd e v e l o p m e n to fm a l i g n a n tt u m o r 5 s p io o h m gc a ni n h i b i tt h ei n v a s i v e n e s sa n dp r o m o t et h e a p o p t o s i so f l a r y n g e a lc e l l s ，w h i c hi n d i c a t e ss p l0 0 h m gm i g h tb ea np o t e n t i a lt u m o rs u p r e s s o r g e n e 6 s p10 0 h m gb i n d sw i t hs h 3 g l 2b ys a n d h m gd o m a i n ，w h i c hs u g g e s t s t h a ts p10 0 h m g - s h 3 g l 2c o m p l e xm o d u l a t e sd o w n s t r e a mg e n ea c t i v i t y 6 k e yw o r d ：l a r y n g e a lc a r c i n o m a ；s p 10 0 ；s h 3 g l 2 ；b i o i n f o r m a t i c s s u p p o r t e db yt h en a t i o n a ln a t u r es c i e n c ef o u n d a t i o no fc h i n a ( 3 0 7 0 0 9 8 0 ) 7 - 英文缩略语- 8 - 论文一- s p i0 0 蛋白在喉癌中表达的研究 - 上i - i - 刖吾 肿瘤是严重危害人类健康的常见疾病，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋 势。世界卫生组织2 0 0 5 年报道，恶性肿瘤发病率和死亡率 l 1 9 9 5 年上升了2 2 ，今 后2 0 年还将上升大约5 0 ，加强肿瘤病因学的研究，提出有效的预防和干预措施是 长期以来肿瘤研究的重要课题。 喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤。在我国北方地区喉癌的发病率位于头颈部 恶性肿瘤的第一位，在我国南方地区，其发病率仅次于鼻咽癌居于第二位，在世 界范围内，喉癌的发病率约占全身肿瘤的i - 5 ，居于全身恶性肿瘤的第十一位瞳 3 | 。 目前，手术和放射治疗仍然是治疗喉癌的主要手段，化学治疗在国外已经从诱导 化疗结合放疗发展到以同步放、化疗为标准方案，但其对局部控制率的提高和预 后的改善作用尚需进一步的研究。在过去的几十年里，随着各种喉功能保留措施 的应用，喉全切除的应用正在逐渐减少，但是喉癌的生存率没有显著提高。早期 喉癌的治愈率在8 0 - 9 0 之间，晚期喉癌约为6 0 左右h 1 。近年来，在美国常见恶 性肿瘤流行病学统计中，喉癌和子宫颈癌是仅有的两个年生存率没有增长的癌肿 陆6 1 。因此，研究喉癌发生、发展的分子生物学机制，发现其肿瘤标志物及临床意 义，对于喉癌的预防、诊断、预后评价和化疗药物选择将有重大的意义。 我研究室喉癌课题组充分利用我国东北地区的病源优势，较早在国内开展了 喉癌遗传学研究，从细胞和分子遗传学水平研究喉癌的遗传学改变，取得了一定 的阶段性成果。我们还在国内首次应用比较基因组杂交( c g h ) 的方法分析了喉癌 染色体水平的变化，发现了大量染色体失衡区域，其中9 p 2 2 - 2 3 区域存在较高频 率的丢失，提示该区域在喉癌的基因组水平存在异常，可能含有与喉癌发生发展 相关的基因n 1 。s h 3 - d o m m ng r b 2 - 1 i k e2 ( s h 3 g l 2 ) 基因，定位于9 p 2 2 ，s h 3 g l 2 m r n a 和s h 3 g l 2 蛋白在喉癌组织中表达明显下调。进一步研究表明，s h 3 g l 2 具有阻遏 喉癌h e p 2 细胞增殖、抑制细胞侵袭、促进细胞凋亡的作用，提示其是重要的癌基 9 因。应用免疫沉淀方法分析h e p 2 细胞蛋白质，证明s p l 0 0 蛋白可以和s h 3 g l 2 蛋 白结合刳。 s p l 0 0 蛋白，全名为s p l 0 0 核抗原( s p l 0 0n u c l e a ra n t i g e n ) ，因其在细胞 核中呈现出特异性的斑片样蛋白( s p e c k l e dp r o t e i no fl o o k d a ) 而得名阳1 。编 码s p l 0 0 蛋白的s p l 0 0 基因( g e n ei d ：6 6 7 2 ) 定位于2 q 3 7 1 ，有两个转录本：其 一全长3 6 6 8 b p ，含有2 5 个外显子；其二全长5 4 5 5 b p ，含有2 9 个外显子。s p l 0 0 蛋白拥有多个结构域：位于氨基端的使s p l 0 0 定位于细胞核内的n d i o 结构域、与 异染色体蛋白结合的两个h p l 结构域，和位于羧基端的s a n d 、锌指( p l a n t h o m e o d o m a i nz i n cf i n g e r ) 、b r o m o 或h m g ( h i g hm o b i l i t yg r o u p ，高迁移率组) 结构域n 0 1 1 12 | 。s p l 0 0 已被证实参与病毒感染n 3 。2 0 | 、病毒相关蛋白相互作用 2 1 - 2 5 、 自身泛素化调节胁刮，并通过干扰素和p 5 3 等介导的信号通路中发挥作用口卜34 i 。同 时，s p l 0 0 已经在临床广泛地应用于原发性胆汁性肝硬化病人的诊断中4 3 引。目前， 关于s p l 0 0 在人体恶性肿瘤中表达的研究在国内外尚未见报道。 在本研究中，我们将以不同肿瘤细胞系、喉癌癌组织与喉正常黏膜组织为研 究对象，通过r t - p c r 和荧光定量p c r 方法检测s p l 0 0 基因m r n a 表达水平；应用 w e s t e r nb l o t 方法检测s p l 0 0 蛋白表达水平，应用免疫组织化学染色方法检测 s p l 0 0 在肿瘤细胞内的定位表达特点，并结合病例标本和临床资料分析s p l 0 0 蛋 白的生物学特性，从而明确其在细胞癌变发生发展中的作用。 实验材料和方法 一、实验材料 ( 一) 细胞系和标本 1 、细胞系 人喉癌h e p 2 细胞系、人宫颈癌h e l a 细胞系、人肝癌b e l 细胞系、人胃癌 s g c 7 9 0 1 和b g c 8 2 3 细胞系、人胚肾h e k 2 9 3 细胞系和胎儿胃上皮g e s 细胞系。 2 、标本 选取2 0 0 4 年1 月一2 0 0 6 年1 2 月于中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科诊 断为喉鳞状细胞癌的病例9 6 例，其中男8 5 例、女1 1 例。病例术前均未做过放射 1 0 治疗和化学治疗，患者签订知情同意书。术中切取喉癌原发病灶及相邻的癌旁正 常喉黏膜组织( 距癌组织l c m 以外、经术后病理证实无癌细胞的安全缘) ，每份标 本分三部分：一部分经多聚甲醛溶液中固定，冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明， 浸蜡，包埋，以备切片用于石蜡包埋，行苏木精一伊红( h e ) 和免疫组织化学染色； 另二部分放入锡箔纸中置一7 0 。c 冰箱保存，用于r t - p c r 和w e s t e r nb l o t t i n g 等检 测。 癌组织病理h e 切片由两位以上有经验的临床病理学专家复述病理组织学特 征，g 1 高分化鳞癌5 4 例，g 2 中分化鳞癌2 9 例，g 3 低分化鳞癌1 3 例。所有病例 均行颈部淋巴结廓清术，针对c n 0 以及术中淋巴结送检无淋巴结转移患者的颈廓 清标本通过透明淋巴结摘出连续切片法进行病理观察，排除隐匿性淋巴结转移。 术后病理p t n m 分期按2 0 0 2 年u i c c 标准：i 期1 7 例，i i 期3 5 例，i i i 期3 6 例， i v 期8 例。 ( 二) 相关分子生物学实验材料 ( 1 ) r p m i1 6 4 0 培养基、胎牛血清( g i b c o 公司) ( 2 ) o u a n t i m i rr tk i t ( s y s t e mb i o s c i e n c e s 公司) ( 3 ) p o w e rs y b rg r e e np c rm a s t e rm i x ( a p p l i e db i o s y s t e m s 公司) ( 4 ) 琼脂糖( t a k a r a 公司) ( 5 ) 2 4 孔板、9 6 孔板、t r a n s w e l l 小室( c o s t e r 公司) ( 6 ) w e s t e r n 细胞裂解液( 江苏碧云天公司) ( 7 ) b c a 蛋白浓度测定试剂盒( 江苏碧云天公司) ( 8 ) 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺( b i o r a d 公司) ( 9 ) 羊抗人s p l 0 0 多克隆抗体( s a n t ac r u z e 公司) ( 1 0 ) h r p 标记的兔抗山羊二抗( 中山公司) ( 1 1 ) e c l 化学发光试剂( 江苏碧云天公司) ( 1 2 ) s p a b c 试剂盒( 北京中衫金桥生物技术有限公司产品) ( 1 3 ) d a b 显色剂( 北京中衫金桥生物技术有限公司产品) ( 三) 主要仪器 ( 1 ) 超净工作台( 上海医用仪器厂) ( 2 ) p c r 扩增仪( 4 8 0 0 ，2 4 0 0 ，9 6 0 0 型，p e 公司) ( 3 ) 紫外检测仪( 上海生物仪器厂) ( 4 ) 凝胶自动成像仪g d s 8 0 0 0 ( u v p ，美国b i o - r a d 公司) ( 5 ) h e i d o l p hd l a x 6 0 0 匀浆器( 德国f l u k o 公司) ( 6 ) x w - 8 0 a 涡旋混合器( 上海医科大学仪器厂) ( 7 )台式高速离心机( t g l 一1 6 g 型，上海生物仪器厂) ( 8 ) h e r m l e z 3 2 3 k 台式低温超速离心机( 美国s i g m a 公司) ( 9 ) 紫外分光光度仪( 日本b i o c h r o m 公司) ( i 0 ) 荧光定量p c r 仪( 7 5 0 0 h t ，美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司) ( 1 1 ) 恒温振荡器( t h z - 9 5 型北京四环科学仪器厂) ( 1 2 ) 切片机( 英国山顿，f i n e s s e 3 2 5 ) ( 1 3 )电热恒温培养箱( 天津市泰斯特仪器公司，d h 3 6 0 0 a 型) ( 1 4 )电热恒温干燥箱( 天津市泰斯特仪器公司，2 0 2 a 型) ( 1 5 )电热恒温水箱( 河北省黄骅市航天仪器厂，删w 2 1 6 0 0 型) ( 1 6 ) 垂直电泳仪及电转移槽( 美国b i o - r a d 公司) ( 1 7 ) 光学显微镜( 日本o l y m p u s 公司) ( 四) 国际生物学信息途径和计算机分析软件包 ( 1 ) 基因组数据库 h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v g e n o m e g u i d e h u m a n ( 2 ) 引物设计 h t t p ：w w w b a s i c n v r t l e d u b i o t o o l s p r i m e r 3 ( 3 ) r e a l - t i m ep c r 结果分析软件 r o t o r g e n er e a l t i m ea n a l y s i ss o f t w a r e ( 4 ) 凝胶成像及扫描分析软件 g r a b i t2 1 j v pg e lw o r k si da d v a n c e dv e r sj0 1 32 5 1 2 ( 5 ) 统计学软件 s p s s l 2 0 二、实验方法 ( 一) s p l 0 0m r n a 在不同细胞系中的表达 1 细胞培养 细胞系用含1 0 胎牛血清、l o o u m l 链霉素、l o o g g m l 青霉素的r p m l l 6 4 0 培 养基于3 7 c 、5 c o 。饱和湿度条件下培养，取指数生长期的细胞进行后继实验。 2 细胞系总r n a 的提取 ( 1 ) 取细胞培养瓶中贴壁培养细胞，3 6 消化3 0 秒，2 m l1 x p b s 混悬细胞； ( 2 ) 将细胞混悬液移入无菌e p p e n d o r f 管中离心，弃上清后加入l m lt r i z o l 放于冰水中裂解细胞； ( 3 ) 将细胞裂解液在1 5 一- 3 0 c 放置5 分钟，使核酸蛋白复合物完全分离； ( 4 ) 加入0 2 m l 氯仿涡旋振荡1 5 秒形成粉红乳状液，室温放置3 分钟； ( 5 ) 4 。c 、1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，样品分成三层：黄色的有机相、中间层 和无色的水相，r n a 主要在水相中，把水相转移到一个新的d e p c 处理的无r n a s e 的离心管中； ( 6 ) 加入0 5 m l 异丙醇混匀，室温静置1 0 分钟； ( 7 ) 4 。c 、1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟，此时管底的沉淀即是r n a ； ( 8 ) 弃上清，加入7 5 乙醇，涡旋漂洗一次； ( 9 ) 4 。c 、7 5 0 0 r p m 离心5 分钟； ( 1 0 ) 弃上清，空气干燥1 5 分钟，沉淀溶于d e p c 水中； ( 1 1 ) 取少量r n a 用于含量及纯度测定