（遗传学专业论文）蚕豆细胞核仁动态结构与rdna分布关系的研究.pdf

摘要 核仁是真核生物问期细胞核中最明显的结构和功能区域，是核糖体装配和r r n a 合 成的场所。核仁的超微结构由纤维中心( f c ) 、致密纤维组分( d f c ) 和颗粒组分( g c ) 三种基本结构区域组成。真核细胞核仁中r d n a 的分布和构型是长期以来未能解决的问 题，本文以蚕豆细胞为实验材料，利用常规电子显微镜方法和细胞化学d n a 特异染色方 法一n a m a u r 法，对核仁周期中核仁结构的变化与r d n a 分布的关系进行了研究。这个问 题的阐明对于进一步了解核仁的结构与功能的关系，及核仁中r r n a 基因的转录位点和 高效转录机制具有重要意义。研究结论如下： 一、在细胞周期中，核仁从有丝分裂末期开始出现，g 1 期早期核仁很小，形状不规则， s 期和g 2 期核仁体积变大，形状规则，多为圆球形，在有丝分裂前期核仁变形变 小，逐渐消失。 二、在整个核仁周期中，核仁的f c 和d f c 结构组分发生变化。g 1 期核仁内出现f c 和d f c 结构，数量很少，多为异质性f c 存在；s 期核仁内f c 和d f c 结构不明显， s 期的较晚时期，f c 和d f c 逐渐清晰，分散地分布：g 2 期f c 和d f c 结构变得很清 晰，数量增多，f c 变大，多以同质性f c 存在，分散地分布；前期的晚期f c 和d f c 变小，数目变少，呈区域性分布，随着核仁的解体，f c 和d f c 逐渐消失。 三、s 期细胞核仁中有核仁液泡结构，核仁相随染色质与核仁联系紧密，使核仁边缘不 平整呈毛绒状。 四、核仁中的r d n a 构型发生改变，存在集缩与解集缩之间的变化，呈连续不断运动的 过程。g 1 期r d n a 以集缩的团块状分布在f c 区域；s 期f c 和d f c 结构不明显， r d n a 以解集缩的弥散状和集缩的团块状分布；g 2 期和前期r d n a 以集缩的不规 则团块状分布在f c 的边缘和f c 与d f c 的交界处，多为环绕f c 形式排布。 关键词：核仁；动态结构；f c ；d f c ；r d n a a b s t r a c t n u c l e o l u si st h em o s tp r o m i n e n ts t r u c t u r a la n df i m c t i o n a ld o m a i ni ni n t e r p h a s en u c l e a r o fe u k a r y o t i c ，i nw h i c ha s s e m b l yo fr i b o s o m e sa n dp r o c e s s i n go fr r n at a k ep l a c e t h e n u c l e o l u si sm a d eu po ft h r e eb a s i cs t r u c t u r es u b c o m p a r t m e n t s ：f i b r i l l a rc e n t e r s ( f c s ) ，d e n s e f i b r i l l a rc o m p o n e n t s ( d f c s ) ，a n dg r a n u l a rc o m p o n e n t s ( g c s ) t h ep r o b l e mo f t h ed i s t r i b u t i o n a n dc o n f i g u r a t i o no fr d n ai nt h en u c l e o l io fe u k a r y o t i cc e i l sh a s n tr e s o l v e df o ral o n gt i m e b yc o n v e n t i o n a le l e c t r o nm i c r o s c o p ya n dc y t o c h e m i c a ls p e c i f i cs t a i nn a m a u rm e t h o di n v i c i a 力b a ，w er e s e a r c h e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec h a n g eo fn u c l e o l a rs t r u c t u r ea n d d i s t r i b u t i o no fr d n ai nn u c l e o l a rc y c l e t h ec l a r i f i c a t i o no ft h ep r o b l e mw i l lm a k eg r e a t s i g n i f i c a t i o no nl e a r n i n gf u r t h e r l yt h er e l a t i o n s h i po fn u c l e o l a rs t r u c t u r ea n df u n c t i o n ，r r n a g e n e st r a n s c r i p t i o ns i t e sa n de f f i c i e n tm e c h a n i s mo ft r a n s c r i p t i o n t h ec o n c l u s i o n sa r ea s f o l l o w s ： 1 i nt h ec e l lc y c l e ，t h en u c l e o l u sb e g a nt oe m e r g ei nt e l o p h a s e ，i tw a ss m a l la n dh a d i r r e g u l a rs h a p ei ne a r l yg 1p h a s e i tw a sb i g g e ra n du s u a l l yb a l l ，i th a dr e g u l a rs h a p ei ns p h a s ea n dg 2p h a s e d u r i n gp r o p h a s et h en u c l e o l u sb e c a m es m a l l e r ，h a dn or e g u l a rs h a p ea n d d i s a p p e a r e dg r a d u a l l y 2 i na l lt h en u c l e o l a rc y c l e ，n u c l e o l a rf c sa n dd f c ss t r u c t u r ec h a n g e d i ng 1p h a s ef c s a n dd f c sa p p e a r e d ，t h e yw e r ef e w ，t h e r ew e r eu s u a l l yh e t e r o g e n e o u sf c s i nsp h a s ef c s a n dd f c sw e r en o to b v i o u s i nl a t esp h a s et h e r ew e r eo b v i o u sf c sa n dd f c sd i s t r i b u t i n g d i s p e r s e l yi nt h en u c l e o l i i ng 2p h a s ef c sa n dd f c sw e r es e e nc l e a r l y , t h en u m b e r i n c r e a s e d f c sb e c a m eb i g g e r ，e x i s t e da sh o m o g e n e o u sf c sa n dd i s t r i b u t e dd i s p e r s e l y i nl a t ep r o p h a s e ， f c sa n dd f c sb e c a m es m a l l e ra n df e w e r ，f c sd i s t r i b u t e d r e g i o n a l i z e d w i t ht h e d i s i n t e g r a t i o no f n u c l e o l u s ，f c sa n dd f c sd i s a p p e a r e dg r a d u a l l y 3 i nsp h a s e ，t h e r ew a sn u c l e o a rv a c u o l ei nt h en u c l e o l u s ，t h en u c l e o l u s a s s o c i a t e d c h r o m a t i nl i n k e dc l o s e l yt ot h en u c l e o l u s ，m a k i n gt h en u c l e o l ir i m sa p p e a rh a i r y 4 t h ec o n f i g u r a t i o no fn u c l e o l a rr d n av a r i e d t h e r ew a sf r o mc o n d e n s e dt o d e c o n d e n s e d ，c o n t i n u o u sa n dd y n a m i cp r o c e s s i ng 1p h a s er d n ad i s t r i b u t e di nf c s ，i n c o n d e n s e dc l u m p s i nsp h a s e ，f c sa n dd f c sw e r en o to b v i o u s ，r d n aa r r a n g e di nd i s p e r s e d d e c o n d e n s e df o r m sa n dc o n d e n s e dc l u m p s i ng 2p h a s ea n dp r o p h a s e ，r d n al o c a t e di nt h e b o r d e r so ff c sa n dt h ej u n c t i o n so ff c d f c ，i nc o n d e n s e di r r e g u l a rc l u m p sa n dt h ef o r m so f s u r r o u n d i n gf c s k e yw o r d s ：n u c l e o l u s ；d y n a m i cs t r u c t u r e ；f c ；d f c ；r d n a l i x1 0 1 3 0 0 0 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王一册日期：勘 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：主鼬 日 期：2 翌：! 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 磐 名期 签教导 指日 第一部分引言 细胞核是细胞内最大的细胞器，核仁是真核生物间期细胞核中最明显的结构和功能 区域，是细胞核内生产核糖体的机器【1 。核仁的大小、形状和数目随生物的种类、细胞 类型和细胞代谢状态而变化f 2 】，后经观察，在同一有机体的不同组织细胞里，核仁的大 小和数目都有很大的变化，并且发现这种变化特别与蛋白质的合成水平密切相关。在蛋 白质合成旺盛、生长活跃的细胞，如分泌细胞、卵母细胞和肿瘤细胞中，核仁很大，可 占到细胞核体积的2 5 ；在不具备蛋白质合成能力的细胞中，如肌肉细胞、淋巴细胞和 精细胞中，核仁很小甚至没有核仁。核仁是一个多功能的生命活动中心，它不仅是细胞 内通讯、核糖体r n a 合成、加工和核糖体亚单位装配的场所，而且近年来发现核仁在细 胞周期、细胞增殖和衰老中起重要调控作用，t r n a 、m r n a 和其它类型小分子r n a 的加工 也在这里进行，核仁的蛋白组学成为现在研究的热点【3 ，4 1 。关于核仁的结构与功能许多 学者做了大量的研究，但核仁中r d n a 的分布与转录位点仍存在争议。 一、核仁的结构和化学组成 核仁与真核细胞内的其他细胞器不同，它没有膜包裹，是一种非膜性的细胞器。在 光学显微镜下核仁为一匀质的球体，每个细胞中含有1 2 个，甚至多个。在2 0 世纪5 0 年代发现核仁由核仁丝和无定形结构两部分组成；6 0 年代m i1 l e r 及b e a t t y 提出染色质 铺展技术，发现r r n a 基因转录的“圣诞树”样结构，对于核仁的结构和功能的研究做 出了重要贡献。6 0 ，7 0 年代在电镜下研究核仁的结构已有很大的进展，在电子显微镜下 观察核仁的结构，可将其分成三个基本的组成区域：纤维中心( f c ) 、致密纤维组分( d f c ) 和颗粒组分( g c ) ，此外还有核仁相随染色质、核仁液泡和核仁基质等组分1 ”。 ( 一) 核仁的超微结构 1 纤维中心( f i b r i l l a rc e n t e r ，f c ) 纤维中心是在电子显微镜常规超薄切片中，可观察到的核仁中的低电子密度的圆形 区域，1 9 6 9 年r e e h e r 等首先把这种结构称为纤维中心 6 1 。纤维中心含有核糖体d n a ( r d n a ) ，r n a 聚合酶i 和结合的转录因子。根据形态相似性和嗜银蛋白的存在，通常认 为纤维中心是染色体n o r 在有丝分裂间期核的副本。根据植物细胞核仁的f c 中染色质 集缩程度和状态的不同将纤维中心分为两种：异质性纤维中心( h e t e r o g e n e o u s f i b r i l l a r ，c e n t e r s ，h e tf c ) ，其染色质集缩成浓密状；同质性纤维中心( h o m o g e n e o u s f i b r i l l a rc e n t e r s ，h of c ) ，其染色质呈弥散状 7 】。 2 致密纤维组分( d e n s ef i b r i l l a rc o m p o n e n t ，d f c ) 致密纤维组分是在电子显微镜下核仁中电子密度最高的部分，因染色深而容易被识 1 别。d f c 呈环形或半月形包围f c ，由致密的纤维组成，通常看不到颗粒。d f c 中含有 f i b r i l l a r i n 、核仁素、a g n o r 蛋白等特异性结合蛋白。 3 颗粒组分( g r a n u l a rc o m p o n e n t ，g c ) 在代谢活跃的细胞的核仁中，颗粒组分是核仁的主要结构，通常分布在核仁的边缘 部位，由直径1 5 2 0 n m 的核糖核蛋白( r n p ) 颗粒组成，可被蛋白酶和r n a s e 消化，是 f 在加工、成熟的核糖体蛋白的前体颗粒，间期核中核仁的大小差异主要由颗粒组分的 数量的差异造成。 4 核仁相随染色质( n u c l e o l u s a s s o c i a t e dc h r o m a t i n ，n a c ) 核仁相随染色质是指电镜下包围核仁的一些集缩染色质。核仁相随染色质由两部分 组成：深入到核仁内的称为核仁内染色质( i n t r n u c l e o l a rc h r o m a t i n ) ；包围在核仁周 边的染色质称为核仁周边染色质( p e r i n u c l e o l a rc h r o m a t i n ) 。 5 核仁液泡( n u c l e o l a rv a c u o l e ，n v ) 核仁液泡是指在核仁中无膜包被的较大的多少近似球形的腔隙，含有各种内容物， 通常含有松散的类似于前核糖体的颗粒和纤维成分。核仁液泡可能参与核糖体前体的贮 存与运输。 6 核仁基质( n u e l e o l a rm a t r i x ) 用d n a s e 和r n a s e 酶处理核仁，在电镜下看到的核仁的残余结构，即为核仁基质或 核仁骨架，最初核仁基质是用来描述核仁内的无定形的背景物质。纤维中心、致密纤维 组分和颗粒组分都湮没在这种无定形的核仁基质中。 ( 二) 核仁的结构模型 近些年来，一些学者结合光学显微镜下核仁的核仁线结构和电子显微镜下核仁的纤 维中心和致密纤维组分的结构，提出了三种可能的核仁的三维结构模型来说明r d n a 的 排列模型和r r n a 基因各转录单位的排列方式：l 、螺旋式排列，即相邻的转录单位螺旋 排列构成d f c ，而中间部位则形成f c ；2 、放射环式排列，即相邻的转录单位放射环式排 列于f c 周围，构成d f c ，放射环中心则为f c ；3 、螺旋和放射环共存式排列，即r d n a 围 绕f c 螺旋排列，螺旋排列的r d n a 又向外侧放射状伸出r d n a 纤维进行转录活动 8 , 9 a 0 1 。 这三种模型都是假说和推测性质的，仍需要大量的实验证据来进一步的验证。 ( 三) 核仁的化学组成 核仁的化学组成含量不很稳定，依细胞类型和生理状态而异。一般来说，核仁的化 学成分主要由d n a 、r n a 、蛋白质和酶类等组成。其中以蛋白质为主，占干重的8 0 ，包 括核糖体蛋白、组蛋白、非组蛋白、d n a 聚合酶、r n a 聚合酶、a t p 酶等多种酶系。r n a 约占干重的1 0 ，它多与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。d n a 占干重的8 ，主要是 编码r r n a 的基因。d n a 的含量在蚕豆核仁中为3 7 。核仁中脂类含量极少。 二、核仁周期 在细胞周期中，核仁是一种高度动态的结构，在形态和功能上都发生很大的变化 2 在有丝分裂期间表现出周期性的消失与重建【2 。核仁在有丝分裂前期逐渐消失，到分裂 末期，它又在核仁组织者染色体的特定区域即核仁组织区( n o r ) 重新出现。当细胞进 入有丝分裂时，染色体浓缩，含有r r n a 基因的d n a 袢环缩回至相应的染色体，此时 r r n a 合成停止，核仁的纤维成分和颗粒成分变成分散状，渐渐消失在周围的核质中， 核仁变形变小。当核膜破裂进入中期，核仁的n o r 被收缩回到相应的n o r 染色体而导 致核仁消失。在有丝分裂末期，染色体去凝集分散为染色质，处在副缢痕部位，含有r r n a 基因的d n a 袢环也呈松散状态，r r n a 合成重新开始，并生成纤维成分和颗粒成分， 核仁的重建随着核仁物质聚集成分散的前核仁体( p n b s ) 而开始，然后在n o r s 周围 融合成正在发育的核仁。在细胞周期的问期( g 【、s 、g 2 ) ，核仁的形态及其结构组分的 形态会发生高度的变化。 三、核仁中r d n a 的分布位点的研究 核仁的一个功能是r r n a 的转录合成，r e n a 的合成需要以r d n a 为模板来进行， 因此核仁的结构与功能研究的一个重要方面是阐明r d n a 在核仁中的分布位点。对于 r d n a 在核仁中的分布与定位的研究方法主要包括b r d u 引入、细胞化学染色、原位杂 交、d n a 抗体免疫标记、同位素标记等方法。早期的观点认为r d n a 存在于整个核仁 中，r i s u e r l o ( 1 9 8 2 ) 将h 3 胸腺嘧啶引入洋葱细胞，在f c 和d f c 都有标记信号，他们 认为在f c 、d f c 都有r d n a 存在 7 j 。m a r t i n ( 1 9 8 9 ) 采用d n a 抗体免疫标记和p u v i o n ( 1 9 9 1 ) 采用探针原位杂交的实验结果表明f c 、d f c 甚至g c 都有r d n a 的分布，l ”。d e r e z i n i 等( 1 9 9 3 ) 采用锇一胺d n a 特异染色方法，通过图像分析确定人淋巴细胞核仁中特异染 色的d n a 团块和纤维所占的区域大于f c 所占的区域，即d f c 中也有d n a 1 ”。b i g g o g e r a 等( 2 0 0 1 ) 用m o r i n p 8 1 5c e l l 先以h c l 处理去除r n a ，由锇一胺染色和a n t i f i b r i l l a r i n 标 记证明了n o r 有d n a 云的存在，f c 、d f c 皆有d n a ，由f c 和d f c 构成d n a 云， d f c 更松散，认为是活性d n a 进行转录的区域，f c 区域内的为非活性d n a 他们认为 f c 和d f c 都存在r d n a ，d f c 中的r d n a 具有转录活性 1 4 】。毕晓辉等( 2 0 0 1 ) 以多头 绒泡菌为材料，应用n a m a u rd n a 特异染色方法和b r u t p 免疫标记技术，发现核仁 内d n a 分散性存在，在f c 和d f c 中都有分布，核仁中d n a 的集缩程度比染色质区 域d n a 的集缩程度低【1 5 j 。 另一些学者认为r d n a 分布在核仁的f c 中。t h i r y ( 1 9 8 8 ) 将b r d u 引入e h r l i c h 肿瘤 细胞中，然后用抗b r d u 抗体来进行免疫电镜标记，发现r d n a 只存在于f c 中【l6 。j o r d a n 等( 1 9 9 0 ) 对水绵和海藻细胞连续切片，然后经d n a 荧光特异染色后，观察d n a 在 核仁中的分布，发现r d n a 分布在f c 中 1 7 。m o t t e n 等( 1 9 9 1 ) 采用这种染色技术，观 察到玉米和拟南芥细胞核仁中存在成簇的d n a 团块，在这些d n a 团块周围可看到 1 0 1 3 r i m 的d n a 纤维，他们认为这些d n a 团块及纤维分布的位置相当于f c ，进一步 用r d n a 为探针进行原位杂交，证实了r d n a 只分布于f c 中l i s i 。t e s t i l l a n o 等( 1 9 9 1 ) 用n a m a u r 特异染色法，原位直观地观察到d n a 存在于洋葱根端分生组织细胞核仁 的异质性f c 中“。 还有一些学者认为r d n a 分布在核仁的d f c 中。w a c h t l e r 等( 1 9 8 9 ) 采用生物素标 记的r d n a 片断为探针，原位杂交结果表明在人精母细胞核仁里，r d n a 仅位于d f c 中 2 。j i m e n e z 等( 1 9 9 3 ) 对鼠肝细胞核仁的原位杂交结果表明r d n a 存在于d f c 中1 2 “。 h o z a k 等( 19 9 4 ) 对h e l a 细胞的b r u t p 的免疫标记实验表明r d n a 分布在d f c 中1 2 2 j 。 k o b e r n a 等( 2 0 0 2 ) 对h e l a 细胞的原位杂交和抗体标记表明r d n a 分布在d f c 中【2 。 近些年来一些学者认为r d n a 分布在f c 和d f c 的交界处或是近f c 的d f c ，且 r d n a 在不同区域的转录活性不同。t h i r y 等( 1 9 9 0 ) 分别采用转录的r d n a 序列和非转 录的r d n a 间隔序列为探针，在e h r i l i c h 肿瘤细胞核仁上进行原位杂交实验，结果发现 非转录的r d n a 序列主要位于f c 以外的区域，而转录的r d n a 序列被定位于f c 【2 。 t e s t i l l a n o 等( 1 9 9 4 ) 以h e l a 细胞、人淋巴细胞、洋葱根端分生组织进行d n a 抗体免 疫标记，表明r d n a 分布在f c 和d f c 的交界处或近f c 的d f c 区域【2 。p u v i o n - d u t i l l e u l 等( 1 9 9 7 ) 以转录的5 e t s 引导序列为探针，在鼠3 t 3 细胞上进行原位杂交，表明标 记位置出现在d f c 与f c 的交界处和d f c 区域【2 6 】。蔡念等( 2 0 0 0 ) 以同样的方法并用 h e r e n 、c e l l 软件分析大蒜核仁中d n a 的原位位置，认为r d n a 主要位于f c 与d f c 的交界处，在f c 和d f c 中均有分布，并提出d n a 纤丝以“花瓣包迹”模式由中心向 外方向放射的模型2 ”。陶伟( 2 0 0 1 ) 以改进的n a m a u r 特异染色技术的方法研究洋葱 细胞核仁中d n a 的分布，发现r d n a 主要位于f c 与d f c 的交界处，并呈现出环绕f c 排布的构型 28 1 。张立勇等( 2 0 0 2 ) 以n a m a u r 特异染色技术对大鼠肝细胞观察，发现 核仁内r d n a 呈分散性分布，分布在f c 的边缘及靠近f c 的d f c 区域，与核仁相随染 色质相连的核仁内的r d n a 呈念珠状结构【2 9 。陶伟( 2 0 0 3 ) 又以改进的n a m a u r 和r d n a 探针原位杂交研究大蒜核仁中r d n a 的分布，结果表明核仁中d n a 是以两种形式存在 的，一种是集缩的d n a 团块，且周围有d n a 纤维，只分布在低电子密度的f c ；另一 种是解集缩的d n a 纤维，与核质里的染色质完全不同，大多分布在d f c 中，r d n a 可 能只分布在靠近f c 的d f c 区域，且这个区域只有d f c 的1 3 【3 0 j 。而龙鸿( 2 0 0 3 ，2 0 0 4 ) 用n a m a u r 的d n a 特异染色法对豌豆、蚕豆细胞核仁中的r d n a 分布进行研究，发 现r d n a 分布在f c 和d f c f c 的边缘，以环绕f c 的形式排布【3 l ，”j 。 四、核仁中r d n a 的转录位点的研究 关于r d n a 的转录位点仍有争议，许多研究者应用不同的材料与方法，结论也不同。 主要研究方法有：通过r d n a 在核仁中的分布及定位来判断；b r u t p 、酽一尿嘧啶等转录 标记物引入与追踪方法来定位r d n a 转录位点；r n a 聚合酶i 、u b f 等核仁中转录相 关的蛋白质的分析与定位：转录复合物抗体免疫标记等。m i l l e r 和b e a t t y ( 1 9 6 9 ) 以非 洲爪蟾卵母细胞为材料，采用界面铺展技术展示了核仁中存在大量的r r n a 转录单位， 即“圣诞树”结构。但是铺展技术破坏了核仁的正常生理结构，无法说明r r n a 转录发 生的具体位置，而且由于核仁中染色质的高度扭曲以及转录包装等原因，长期以来这种 4 转录的结构的形态没有原位观察到c 3 。s h e e r ( 1 9 8 4 ) 采用免疫荧光和免疫电镜技术发 现r n a 聚合酶i 特异地位于鼠肝细胞核仁的f c 中，因此认为r d l n a 转录发生在f c 中 p 4 】。t h i r y 和g o e s s e n s ( 1 9 9 1 ) 应用电镜放射自显影方法研究e n r i c h 肿瘤细胞核仁中r d n a 的转录位点，发现r d n a 的转录位点主要位于f c ，包括f c 的边缘【3 “。具有突破性的 实验是s h e e r ( 1 9 9 7 ) 以蝗虫卵母细胞为材料，在常规电镜超薄切片中观察到r d n a 的转录 单位，即类似的“圣诞树”结构，几乎均匀地分布在f c 中，他们又用原位杂交、免疫 标记等方法证明了r d n a 在f c 中进行着活跃的转录【3 6 。t h i r y ( 2 0 0 0 ) 用h e l a 细胞也 表明r d n a 的转录发生在f c 中1 3 ”。c h e u t i n ( 2 0 0 2 ) 的人a 5 4 9 、e l t 细胞的b r u t p 的免 疫标记实验，观察到b r - u t p 先在f c 掺入，然后迅速出现在d f c ，即转录在f c 起始， 迅速进入d f c ，在d f c 延长i j 。 近些年来一些学者认为r d n a 的转录发生在d f c 或者是f c d f c 的交界处。郝水 ( 1 9 9 0 ) 采用电镜放射自显影方法标记洋葱根尖分生组织细胞的核仁，认为d f c 是 r d n a 的转录位点p ”。p u v i o n ( 1 9 9 1 ) 用探针对h e l a 细胞的原位杂交实验、d u n d r ( 1 9 9 3 ) 的h e l a 细胞的b r o u t p 免疫标记实验、h o z a k ( 1 9 9 4 ) 用同样的方法的h e l a 细胞和洋葱 根端分生组织的实验、r a s k a ( 1 9 9 5 ) 的h e l a 细胞和大鼠p c i 2 细胞的转录复合物抗体免 疫标记实验都认为r d n a 的转录发生在d f c 中【1 2 , 4 0 , 4 1 , 4 2 】。c m a r k o ( 1 9 9 9 ) 对人的膀胱癌细 胞用b r u t p 微注射，结果表明d f c 是r d n a 转录的部位 4 3 1 。b a s s y ( 2 0 0 0 ) 以洋葱根 尖分生组织的原位杂交、免疫胶体金标记实验表明r d n a 的转录发生在d f c 中m 。蔡 念等( 2 0 0 0 ) 以大蒜的根尖分生组织为材料，应用改进的n a m a u r 特异染色技术并用 自动软件分析，认为转录位点在f c 与d f c 的交界处【2 ”。毕晓辉等( 2 0 0 1 ) 采用多头绒 泡菌，以改进的n a m a - u r 特异染色与免疫胶体金结合的方法的实验，结果表明r d n a 的转录位点在f c 的边缘和d f c ，f c 中的d n a 可能只是一种储备或准备转录状态，解 集缩伸入d f c 中才具有转录活性 1 扪。k o b e m a ( 2 0 0 2 ) 以h e l a 细胞利用r d n a 探针和 b r - u t p 免疫标汜实验，观察到脉冲出现在d f c 并涉及f c d f c 边界，观察到“圣诞树” 结构，认为r d n a 的转录位点在d f c 2 ”。s u ih u a n g ( 2 0 0 2 ) 在j c b 上综述了关于转录 位点的争议，并提出了核仁的r d n a 转录位点的可能模型 4 5 】。陶伟( 2 0 0 0 ，2 0 0 3 分别 以鼠肝和大蒜根端分生组织为材料，用改进的n a m a u r 特异染色与抗r n a d n a 杂和 抗体免疫标记结合的方法，结果表明r d n a 的转录位点位于f c 的边缘和d f c 区域，但 并不是所有的d f c 区域r d n a 都含有转录活性，在远离f c 的d f c 区域和f c 内部的 区域是没有转录活动的1 4 6 , 3 0 。p l i s s 等( 2 0 0 5 ) h e l a 细胞的免疫标记实验认为转录发生 在f c 的边缘和d f c 中【4 “。 五、d n a 特异染色方法n a m 卜ur 法的优点 在b r d u 引入、细胞化学染色、原位杂交、d n a 抗体免疫标记、同位素标记等研究 核仁中r d n a 的定位的方法中，相对于其他技术来说，细胞化学技术的优势在于不仅可 以确定某个重要分子的存在，而且可以对于它们的结构组织特点提供一些信息，能够原 位直观地观察d n a 在核仁中的分布及位点。一些研究者试图采用这种方法来阐明核仁 中d n a 的分布状况。锇一胺d n a 特异染色是早期应用的一种染色方法【4 8 j ，它可以特异 的对d n a 进行染色，而和d n a 结合的蛋白质不被着色，它能在超微结构水平直接对 核仁中d n a 进行原位观察，更具直观性，尽管特异性很好，但是锇胺复合物的合成是 一个复杂的过程，且染色结果在很多情况下不是很稳定 4 9 。因此，一些研究者开始采用 新的d n a 特异染色方法即n a m a u r 法来研究核仁中d n a 的位置。n a m a u r 特异染 色法是t e s t i l l a n o 等1 9 9 1 年首次利用的 1 9 1 ，比其他的细胞化学染色法操作简单，特异性 强。其原理是以弱碱水解作用( n a ) 抽提去除r n a 和蛋白质而得到磷酸基团，然后利 用乙酰基化( m a ) 阻断氨基酸残基的碳基团。经醋酸铀染色，铀与d n a 结合，d n a 被特异染色，使核仁中除d n a 成分被特异染色外其余部分皆被完全漂白，使核仁内部 呈现出很清晰的低电子密度区域，而细胞内的细胞质不被染色，核仁外部可以观察到电 子密度很高的集缩染色质块和染色质纤维，可以直观地看到核仁中的d n a 成分，但不 能精确地判断出核仁中d n a 的原位位置。因此，本实验用改进后的n a _ m a u r 法【2 ， 使核仁中的d n a 成分由于具有高电子密度而被识别，同时f c 和d f c 成分作为弱背景 被保留下来，这样我们能够对核仁中d n a 的分布位置进行直接的原位水平观察，在电 子显微水平上对r d n a 在核仁结构中不同时期的分布做动态观察。 上述关于核仁中r d n a 的定位和转录位点的实验以各种不同实验材料，应用各种不 同的方法取得的结果也不完全相同，可能是由于材料与方法的不同，而且这些实验材料 都是处于细胞周期的某一个时期的细胞，每个结果都有其合理性和片面性。而在细胞周 期中核仁是一个高度动态的结构，是一个立体的功能结构1 50 ，”】。但大多数研究者都是对 静态的核仁进行结构的研究，大多是光学显微水平的研究。因此本文以蚕豆的根尖分生 组织为材料，利用常规电子显微技术和d n a 特异染色技术，对核仁周期内各个时期核 仁的结构和核糖体基因r d n a 在核仁内的分布进行研究，在电子显微水平上研究核仁结 构的动态变化，探讨r d n a 在不同时期核仁结构中的分布，试图阐明核仁周期内核仁形 态和结构组分的变化，及r d n a 在核仁周期内的原位分布和结构构型的变化，有助于解 决核仁中r d n a 的分布和转录位点问题的分歧，对于了解核仁的结构与功能的关系，以 及核仁中r r n a 基因的转录位点和高效转录机制具有重要意义。 第二部分实验材料与方法 一、实验材料 高等植物蚕豆( 盯。岿疡如) 种子，于2 4 。c 培养发根，当其根尖长至1 5 2 厘米时， 每隔2 小时切取根端分生组织做为实验材料。 二、实验方法 ( 一) 常规电子显微镜样品的制备 l 取材：当蚕豆发根至1 5 2 厘米时，用刀片切取生长旺盛的2 毫米长根尖分生组织。 2 前固定：将取下的植物根尖组织迅速放入2 5 戊二醛固定液( o 1m o l lp b s 缓 冲液配置，p h - 7 2 ) 中，固定5 小时。 3 漂洗：经戊二醛固定后的组织块用缓冲液漂洗1 小时，将组织表面的戊二醛洗净， 在此期间更换2 3 次缓冲液。 4 后固定：将洗好的组织块放入1 锇酸( o 1m o l l p b s 缓冲液配置) 中固定2 小时。 5 漂洗：从锇酸固定液中取出的组织块用蒸馏水清洗5 分钟，洗净样品表面的锇酸。 6 脱水：洗净的样品用乙醇一丙酮梯度脱水。 7 包埋：将样品用e p o n 8 1 2 环氧树脂包埋然后放入恒温箱内加温聚合。 8 切片：在l k b 一5 型超薄切片机切片，切片厚度为6 0 8 0 n m ，切片用有支持膜的铜网捞 取。 9 染色：醋酸双氧铀柠檬酸铅常规染色。 以上超薄切片全部于h i t a c h i 一6 0 0 b 型透射电子显微镜下观察并照相，加速电压 7 5 k v 。 ( 二) d n a 特异染色电子显微镜样品的制备一一改进的n a m a u r 特异染色法 1 取材：当蚕豆发根至1 5 2 厘米时，用刀片切取生长旺盛的2 毫米长的根尖分生 组织。 2 前固定：将取下的植物根尖迅速放入3 戊二醛和4 多聚甲醛固定液中( 0 1 m o l p b s 缓冲液配置) ，4 。c 下固定2 小时。 3 漂洗：经固定后的组织块用0 1m o l l 缓冲液漂洗3 次，每次3 0 分钟，将组织表面 的固定液洗净。 d 后固定：将洗好的组织块放入n a ( 4 多聚甲醛和0 5 m o l ln a o t i ) 过夜。 5 漂洗：从固定液中取出的组织块用双蒸水清洗3 次每次1 0 分钟，1 冰醋酸洗涤3 次，每次1 0 分钟，再用双蒸水清洗3 次每次1 0 分钟，洗净样品表面的固定 液。 6 漂白：将样品放入】i l a ( 甲醇：醋酸酐= 1 ：5 ) 2 5 。c 漂白1 8 2 4 小时，直至样品适度漂 白。 7 脱水：洗净的样品用甲醇一乙醇系列脱水。 8 包埋：将样品用e p o n 8 1 2 环氧树脂包埋然后放入恒温箱内加温聚合。 9 切片并染色：将样品在l k b 一5 型超薄切片机切片，切片厚度为8 0 一l o o n m ，切片用有 支持膜的铜网捞取。将切片用5 水溶醋酸铀，在6 0 。c 染色7 0 分钟，双蒸水 洗涤后2 5 。c 烘干。 以上超薄切片全部于h i t a c h i 一6 0 0 b 型透射电子显微镜下观察并照相，加速电压 7 5 k v 。 第三部分结果与分析 一、蚕豆细胞核仁的动态结构 用电子显微镜观察蚕豆根端分生组织细胞常规超薄切片显示，核仁有三个基本结构 区域：低电子密度区域的纤维中心( f c ) ，f c 染色比较浅，在不同时期f c 的大小和数量 不同，f c 的内部结构也不同，以同质性f c 和异质性f c 存在。环绕f c 的高电子密度区 域即致密纤维组分( d f c ) ，其染色比较深，d f c 呈环形或半月形包围f c ，由致密的纤维 组成，通常看不到颗粒。位于核仁边缘和d f c 之间的颗粒组分( g c ) ，由核糖体前体颗 粒组成，但d f c 与g c 的分界不明显。此外，还可观察到s 期核仁中央有一个大的电子 密度很低染色很浅的空腔称为核仁液泡( n v ) ，核仁液泡比纤维中心区域大，而且周围 没有d f c 。但这些结构随细胞周期进程发生高度变化。 g l 期的早期细胞核形状不规则，核仁开始形成，较小，形状不规则，f c 很少( 如 图1 a ) ；核仁内有较清晰的f c 和d f c 结构，但数量很少，f c 很小，分散地分布在核仁 内( 如图1 b ) ；核仁形状逐渐变得规则，核仁内有很少的f c 和d f c ( 如图1 c ) ：随着核 仁的增大，核仁中f c 和d f c 数目增多，f c 很大( 如图1 d ) ，核仁内多数f c 中存在着集 缩的染色质块，此f c 为异质性f c ( 如图1 b 、c 、d ) 。 s 期是d n a 的复制合成时期，细胞核内染色质解集缩，核内染色质形状不规则，染 色质纤维呈松散状，核仁相随染色质与核仁联系紧密，致使核仁边缘不整齐呈毛绒状， 核仁变大，形状逐渐变得规则( 如图2 ) ，可能由于核仁内的d n a 复制，发生改构，此时 核仁内f c 和d f c 结构不十分明显，f c 很小，分散地分布( 如图2a ) ；f c 很少，很小， 不清晰( 如图2 b ) ；有的核仁中f c 很少，区域性分布在核仁中( 如图2 c ) ，到s 期的较 晚时期( 如图2 d ) ，可看到逐渐清晰的f c 和d f c ，数量较多，一般分布在核仁液泡的周 围，有异质性f c 存在；s 期的多数细胞中，可观察到核仁中央有一个大的称为核仁液泡 的空腔结构( 如图2 a 、c 、d ) 。 g 2 期是d n a 复制合成完成后期，细胞核内染色质集缩，且形状逐渐很规则，核仁相 随染色质与核仁联系较s 期少，核仁边缘平整。图3 a 为s 期到g 2 期过度时期的细胞， f c 和d f c 数目增多，f c 很小，分散地分布在核仁内。g 2 期核仁内的f c 和d f c 结构很清 晰，f c 很大，大小差不多，多为同质性f c ，分散地分布在核仁中( 如图3 b ) ；有的核仁 中f c 大小不同，数量增多，多以同质性f c 存在( 如图3 c ) ；同质性f c 数目很多，周围 有清晰的d f c 环绕，f c 和d f c 分散地分布在核仁中( 如图3 d ) 。 有丝分裂前期，细胞核内染色质集缩程度加深，逐渐集缩为块状，核仁形状不规则， 但f c 和d f c 仍清晰可见( 如图4 ) ，核仁内有很多同质性f c ，f c 很大，周围有d f c 环绕， 9 分散地分布在核仁内( 如图4a ) ；f c 很多，大小不同，分散在核仁内( 如图4 b ) ；前期 的较晚时期核内染色质高度集缩，核仁形状不规则，变形变小，核内f c 和d f c 变少， 区域性地分布在一起( 如图4 c ) ；核内f c 变小，f c 和d f c 逐渐消失，核仁逐渐解体( 如 图4 d ) 。 二、核仁中r d n a 的动态分布