（遗传学专业论文）重金属离子处理塔胞藻的生物学效应的研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：袤) 塾鸶日期：2 鲤纽翻! 旦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：知垒j ：i导师签名：日期：硷q 生翅：萝 l z 霉硕士学位论文 中文摘要 随着科技的进步和工农业生产的迅速发展，环境污染日益严重，许多含有重 金属物质的废水、废液顺河流进入海洋，对海洋生物造成不可估量的伤害，重金 属对水环境的危害已成为人们日益关注的问题。重金属通过各种途径进入水体 后，首当其冲的受害者就是藻类生物。关于重金属对藻类的致毒效应，国内外许 多学者在这方面进行了大量的研究工作，积累了丰富的资料。本文选用海洋微藻 中的塔胞藻作为试验材料，通过单一重金属( 氯化钴、氯化汞和硝酸铅) 对藻类 的细胞密度、细胞体积的影响，细胞内含物( 主要包括可溶性糖、蛋白质和叶绿 素) 含量的变化，线粒体和叶绿体数目的变化，旨在提示重金属污染对水体危害 的严重性同时为合理利用钴和合理利用塔胞藻提供必要的科学依据。 实验结果表明：( 1 ) 低浓度的钴离子对细胞的生长和繁殖有促进作用，当 培养液中c o c h 浓度达到6 m g l 时，钴离子对细胞的生长有抑制作用，当培养液 中c o c l 2 浓度达到t o m g l 时，处理组的细胞数量明显低于对照组；前2 轮培养 时都有此现象。但是，当培养到第3 和第4 轮时，细胞的生长繁殖又逐渐恢复正 常，与对照相比无显著性差异，这说明单细胞生物对外界环境的变化有较强的适 应能力。( 2 ) 随着h 矿+ 和p b 2 + 浓度的增加，尽管有时细胞密度有较大波动，但 细胞密度总体上呈逐渐减少的趋势；而且h 矿+ 对塔胞藻的影响比p b 2 + 大。 ( 3 ) 在不同浓度的p b 2 + 和i 形+ 的培养液中，在第一轮和第二轮期间，细胞体积有较 大的变化，其长和宽有较大的波动，到第三轮时，塔胞藻细胞的大小已基本接近 对照的大小。( 4 ) 当塔胞藻培养在含有氯化钴的培养液时，细胞内含物的含量 发生改变，特别是蛋白质和叶绿素含量的变化最明显，细胞中可溶性糖含量变化 不明显。( 5 ) 受重金属离子的影响，线粒体和叶绿体的数目在不同程度上减少 前两轮线粒体和叶绿体的数目波动比较大，在第3 轮趋于稳定，不同浓度间的差 异基本消失。同时还发现，叶绿体数目和细胞大小呈正相关，而线粒体数目受细 胞大小影响不大；线粒体与叶绿体的数目呈负相关变化，即有互补现象。 关键词：塔胞藻c o c hh g c hp b ( n 0 3 h l 季硕士学位论文 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g y , i n d u s t r ya n da s r i c u l t u r e , t h e p o l l u t i o no fe n v i r o n m e n t i sb e c o m i n gm o r ea n dm o r es e r i o u s m u c hw a s t ew a t e ra n d l i q u i d sf l o wi n t ot h eo c e a n ，c a u s i n gg r e a td a m a g e st om a r i n eb e i n g s p e o p l ep a y m o r e a n dm o r ea t t e n t i o nt ot h ed a m a g e sc a u s e db yh e a v ym e t a l st ow a t e re n v i r o n m e n t w h e nh e a v ym e t a l sg oi n t ow a t e re n v i r o n m e n tt h r o u g hd i f f e r e n tc u r r i c u l u m s ，t h ea l g a i sv i c t i m i z e df i r s t l y m a n ys c h o l a r sa th o m ea n da b r o a dh a v ed o n eal o to f r e s e a r c h e s o nt h et o x i ce f f e c to fh e a v ym e t a l st ot h ea l g a , a n dh a v ea c c u m u l a t e dr i c hm a t e r i a l s i nt h i sp a p e r , p y r a m i m o n a as p i sc h a s e da se x p e r i m e n tm a t e r i a l ；s i n g l eh e a v y m e t a l c o c l 2o rh g c l 2o rp b ( n 0 3 ) 2 i su s e d ；s o m ei t e m ss u c ha sc e l ld e n s i t y , c e l l v o l u m e ，t h ec o n t a i n m e n to f s o l u b l es a c c h a r i d e ，p r o t e i na n dc h l o r o p h y l l ，t h en u m b e ro f m i t o c h o n d r i aa n dc h l o r o p l a s ta r em e a s u r e d ；t h es e r i o u s n e s so fd a m a g e sc a u s e db y h e a v ym e t a lp o l l u t i o nt ow a t e re n v i r o n m e n t i sm e n t i o n e d ；e s s e n t i a ls c i e n t i f i cp r o o f f o r r e s p o n s i b l ye x p l o i t i n gc oa n dp y r a m i m o n a $ s p i sp r o v i d e d t h ee x p e r i m e n tr e s u l td e c l a r e d ：( 1 ) l o wc o n c e n t r a t i o no fc 0 2 + p r o m o t e sc e l l s g r o w t ha n dr e p r o d u c t i o n , 6 m g lo fc 0 2 4i nc u l t u r em e d i u mi n h i b i t sc e l l sg r o w t h ， w h e nt r e a t e dw i t h1 0m g lc o c l 2 t h ec e l ln u m b e ri sa b s o l u t e l yl e s st h a nt h o s e w i t h o u tt r e a t e d t h i sp h e n o m e n o ne x i s t si nt h ef i r s t2r o u n d s i nt h e3 r da n d4 t h r o u n d s ，c e l l sg r o w t ha n dr e p r o d u c t i o nr e c o v e rt on o r m a ll e v e l t h i sm e a l 够s i n g l ec e l l b e i n g sh a v eb e t t e ra b i l i t yt oa d a p tt ot h ec h a n g eo f t h ea m b i e n tc i r c u m s t a n c e ( 2 ) w i t h t h ei n c r e a s eo ft h ec o n c e n t r a t i o no fh 9 2 + a n dp b 2 + ，c e l ld e n s i t yf l u c t u a t e ss o m e t i m e s ， b u tr e d u c e so nt h ew h o l e n l ce f f e c to f r i 9 2 + t op y r a m i m o n a s s p i sl a r g e rt h a nt h a to f p b 2 + ( 3 ) w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fp b 2 + a n dh 9 2 + , i nt h ef i r s t2r o u n d s ，c e l l v o l u m ec h a n g e dg r e a t l y i nt h e3 r dr o u n d ，t h ec e l lv o l u m er e c o v e r e dg r a d u a l l y ( 4 ) w h e nc u l t u r e dw i t hc o c l 2 ，t h ec o n t a i n m e n to fp r o t e i na n dc h l o r o p h y l lc h a n g e d g r e a t l y , w h i l et h ec o n t a i n m e n to fs o l u b l es a c c h a r i d ec h a n g e dal i t t l e ( 5 ) a f f e c t e db y h e a v ym e t a li o n s ，t h en u m b e ro fm i t o e h o n d r i aa n dc h l o r o p l a s tr e d u c e do nd i f f e r e n t l e v e l s i nt h ef i r s t2r o u n d s ，t h en u m b e ro fm i t o c h o n d r i aa n dc h l o r o p l a s tf l u c t u a t e s g r e a t l y ，w h i l e t u r n st os t a b l ei nt h e3 r dr o u n d t h en u m b e ro f c h l o r o p l a s tr e l a t e st ot h e c e l lv o l u m ep o s i t i v e l y , w h i l et h en u m b e ro fm i t o c h o n d r i ah a sl i t t l er e l a t i o nw i t ht h e c e l lv o l u m e ；t h en u m b e ro fm i t o c h o n d r i ar e l a t e st ot h en u m b e ro fc h l o r o p l a s t 2 l 鼻季硕士学位论文 n e g a t i v e l y , t h a ti st os a y , i ti sr e c i p r o c a l k e yw o r d s ：p y r a m i d o m o n a sd e l i c a t u l ac , i f f c o c h h g c l 2p b ( n 0 3 ) 2 l ，；季硕士学位论文 1 前言 从2 0 世纪3 0 年代以来，工农业生产迅速发展，大量的污染物进入环境，引 起环j 毙质量严重恶化，尤其是重金属污染，极为严重。由于重金属污染的范围广， 持续时间长，又不易在生物物质循环和能量交换中分解【1 1 ，在环境中易蓄积，能 被土壤作物吸收，且性质稳定，很难降解，又能抑制作物生长发育，促进早衰， 降低产量，并通过根系进入植物体，再通过食物链的传递和富集，最终危害人体 健康吐 随着矿产资源大量开发利用，各种化学产品、农药及化肥的广泛使用以及城 市污泥、污水的农用，重金属对土壤、水体的污染越来越严重。土壤被重金属污 染后，不仅影响作物的产量和品质，并且可以通过食物链影响人类健康。 重金属污染物进入海洋后，既受到物理、化学因素的作用，又受到生物及其 活动产物的作用，因此污染物的分布和最终归宿与生物活动息息相关。各种重金 属对生物的影响又取决于该元素的化学性质和生物种类，一般来讲，各种海洋生 物对重金属的富集能力不同，但体内富集重金属含量比海水要高得多，从几倍、 几十倍甚至十几万倍。重金属达到一定含量会对海洋生物的生理产生不良影响， 产生致突变甚至导致死亡【3 1 。 有关重金属污染物对海洋生物的影响，国内外有不少学者进行了研究，并取 得了重要成果。本文选取塔胞藻为实验材料，探讨重金属离子对海洋微藻的生物 学效应。 ll 重金属污染的特点及现状 密度在5 以上的金属统称为重金属，如金、银、铜、铅、锌、镍、钴、镉、 铬和汞等4 5 种。从环境污染方面所说的重金属，实际上主要是指汞，镉、铅、 铬以及类金属砷等生物毒性显著的重金属，也指具有一定毒性的一般重金属如 锌、铜、钻、镍、锡等。目前最引起人们注意的是汞、镉、铬等。重金属随废水 排出时，即使浓度很小，也可能造成危害。由重金属造成的环境污染称为重金属 污染。 重金属污染的特点表现在以下几方面： 4 f 鼻季硕士学位论文 ( 1 ) 水体中的某些重金属可在微生物作用下转化为毒性更强的金属化合物， 如汞的甲基化作用就是其中典型例子； ( 2 ) 生物从环境中摄取重金属可以经过食物链的生物放大作用，在较高级生 物体内成千万倍地富集起来，然后通过食物进入人体，在人体的某些器官中积蓄 起来造成慢性中毒，危害人体健康； ( 3 ) 在天然水体中只要有微量重金属即可产生毒性效应，一般重金属产生毒 性的范围大约在l l o m g l 之间，毒性较强的金属如汞、镉等产生毒性的质量浓 度范围在o 0 0 1 0 0 1m g l 之间。 重金属一般以天然浓度广泛存在于自然界中，但由于人类对重金属的开采、 冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如铅、汞、镉、钴等进入 大气、水、土壤环境，引起严重的环境污染。以各种化学状态或化学形态存在的 重金属，在进入环境或生态系统后就会存留、积累和迁移，造成危害。如随废水 排出的重金属，即使浓度小，也可在藻类和底泥中积累，被鱼和贝的体表吸附， 产生食物链浓缩，从而造成公害。如日本的水俣病，就是因为烧碱制造工业排放 的废水中含有汞，在经生物作用变成有机汞后造成的；又如痛痛病，是由炼锌工 业和镉电镀工业所排放的镉所致。汽车尾气排放的铅经大气扩散等过程进入环 境，造成目前地表铅的浓度已有显著提高，致使近代人体内铅的吸收量比原始人 增加了约1 0 0 倍，损害了人体健康。 重金属系保守物质，不能降解，而且是累积性毒物。重金属及其化合物在水 体中会发生形态和价态的变化，由易溶性化合物转变为难溶性化合物，由生物可 吸态转变为生物不可利用残渣。这些转变当然也会向反方向进行1 4 1 根据对我国 七大水系中水质最好的长江的调查，其近岸水域已受到不同程度的重金属污染， 历、p b 、c d 、c u 、o r 等元素污染严重。其中p b 、c d 、c u 潜在活性大，易参与 环境中各类物质的反应。2 1 个主要沿江城市中，攀枝花、宜昌、南京、上海、 武汉、重庆6 个城市的重金属累计污染百分率已达6 5 。水体中的重金属通过 直接饮用水，食用被污染灌溉过的蔬菜和粮食等途径进入人体，威胁着城市人群 的健康御。 i t 季硕士学位论文 1 2 重金属对藻类的影响 1 2 1 重金属对藻类生长、繁殖的影响 重金属对藻类毒性大小的顺序随藻类种类和实验条件发生变化，一般来讲是 h g c d a c u z n p b c r 。h g 对藻类的毒性最大。h o p k i n 和g a i n ( 1 9 7 8 1 研究 h g 对海带不同生长阶段的影响，发现在配子体阶段最敏感。s t r o m g r e m ( 1 9 8 0 ) 发 现墨角藻在l o o 2 0 0 枷g 的介质中生长l o d ，生长速率减少5 0 。甚至在5 9 # g l h 9 2 + 浓度下也受到了抑制。 c u 和z n 是藻类生长的必需元素，但当环境中浓度过高时，就会对藻类产 生毒害。c u 的毒性大小随离子浓度变。s o r e n f i n o ( 1 9 7 9 ) 通过实验发现c u 的毒性 效应分为几个阶段：首先影响质膜的透性，导致细胞丢失k ? ，并从而引起细胞 体积发生变化；其次把c u 转移到细胞质，然后进入叶绿体使光合磷酸化解偶联， 不产生a t p ，从而抑制光合作用。s t r o m g r e m ( 1 9 7 9 ) 发现，在5 - 1 0m g l 浓度下 能使五种墨角藻生长减少5 0 t 们。 1 2 2 重金属对藻类生理、生化功能的影响 一般情况下，重金属对藻类生理、生化功能的影响主要表现在：抑制光合作 用，减少细胞色素，导致畸变以及改变天然环境中藻类的组成。此外，有关藻类 的d n a 、r n a 、蛋白质合成及酶活性等方面也有报道【”。 据报道，高浓度的z n 抑制藻类的生长，影响光合作用，使叶绿素含量下降， 以致类胡萝卜素与叶绿素的比率失调。但也有研究证明，较低浓度的z n 可使海 生浮游植物天然群落的光合能力下降。已经查明，降低普通小球藻5 0 生长率的 z n 浓度为2 4 # m l ，在2 0 # g m l 时，小球藻的生长完全停止。o 8 # g m l 浓度 的z n 可使藻类的c 0 2 吸收率下降6 9 。z n 还能导致藻类的渗透率增加，使电 介质漏失；甚至引起藻类的形态变异闱。 重金属影响酶活性主要有2 种可能：一种是由于重金属的作用使作为酶的辅 助因子的金属离子的吸收和利用受阻；另一种是由于重金属与酶蛋白的某些基团 结合形成螯合物，使酶的结构与构型发生变化而影响酶的活性川。 1 3 藻类对重金属的吸收 6 藻类对重金属的吸收包括胞外的快速吸附与胞内的缓慢富集两个阶段【9 1 ， l ；硕士学位论文 r a n g s a y a t o m 等将它们分别称为快相和慢相【埘在快相中，重金属被吸附到藻细 胞表面，该过程迅速而且可逆，吸附到藻细胞表面的重金属可被e d t a 等螯合 剂洗脱；而慢相是重金属跨膜进入胞内富集的过程。 在多数情况下，约8 0 - 9 0 的重金属被吸附到藻细胞表面【1 1 j 2 】藻类细胞 壁含有一些功能基团如羟基、羧基、氨基、巯基和磷酸根等【”1 4 】，因而细胞壁 带负电荷，通过离子交换或其它机制可以与水中的重金属离子结合。有实验表明， 莱因衣藻( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ) 的细胞壁缺失突变株较野生型对重金属 毒害更敏感旧，而绿藻s c e n e d e s m u s 口6 枷如埘能去除污染水体中的c d 和c u 1 6 1 。 许多蓝藻胞外具有多糖组成的胶鞘、胶被或粘液【”】，有些种类在培养过程中能分 泌多聚糖到培养液中。它们分泌的多糖是一些复杂的阴离子络合物，其中约8 0 含有6 1 0 种多糖，9 0 含有一种或更多的糖醛酸，而且几乎所有的都含有非糖 组分【1 8 1 。这些胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d e ；e p s ) 能与重金属结刽1 7 9 1 ，在其 它逆境条件下也可对蓝藻起一定保护作用【1 7 l 。褐藻的细胞壁含有藻酸盐和岩藻聚 糖，其中藻酸盐含羧基，岩藻聚糖含硫酸基团，它们均可与重金属络合。k u ”c a k 和v o l e s k y l 2 0 l 曾推测藻酸盐是褐藻富集重金属的主要成分，并在后来的实验中得 到了证实f 2 。这些研究结果表明，重金属能与藻类细胞的胞外成分结合，从而减 少了进入胞内的重金属离子数量，使胞内细胞器免受重金属的毒害。 1 4 重金属对藻类的毒性作用 一般情况下，重金属对藻类的致毒效应主要表现在：影响藻类的生长代谢、 抑制光合作用、减少细胞色素，导致细胞畸变，改变天然环境中藻类的种类组成 阱_ 3 】。重金属对藻类的毒性强弱因藻类的不同而各异。天然水体中常见的几种 重金属污染物对藻类生长代谢所构成的威胁分述如下。 1 4 1 汞 许多研究证明，h g 抑制或完全终止藻类的生长，影响光合作用的电子传递 系统，导致光合色素损害和叶绿素含量下降；h g 通过降低固n 酶的活性使蓝藻 的固n 能力下降；通过增加细胞的渗透性，使k 离子大量丧失；h g 还能诱使藻 类的细胞形态发生畸变1 2 4 。2 6 1 。 。 据报道，岐岖鱼腥藻对h g 离子十分敏感，浓度低至2 t , g a _ 。时，生长即受到 7 l 季硕士学位论文 显著抑制，0 5 a g l 的水平即能使该藻类的生长下降。使普通小球藻生长受到抑 制的h g 浓度为0 2 m g l ：l m g l 时，生长完全停止。当h g 的浓度为1 0 i a m o l 时， 杜氏藻形成巨细胞而不分裂，这可能是由于生长和分裂解偶联，抑制了蛋氨酸的 合成所致；在h g 的亚致死浓度条件下，浮游硅藻一星杆藻由正常的8 1 6 个细胞 组合的星形群体突变为由2 0 3 0 个群体堆积成的圆柱形块状物l e t 。h g 对海洋鞭 毛藻的毒理学研究结果表明，当h g 浓度 1 0 m g l 时，盐藻的生长率和最终细胞 产量明显减少，在亚致死浓度条件下，h g 引起该藻细胞体积增大，运动能力丧 失2 引。在添加h g c l 2 到藻类培养基之后，小球藻中的r n a 和d n a 以及蛋白质 的水平提高，细胞干重大大增加；相反，醋酸苯汞酯引起r n a ，d n a 和蛋白质 的水平下降。有些资料表明，甲基汞比二甲基汞对藻类的毒害作用更甚，o 1 # g l 甲基汞即可降低柔弱菱形藻的光合作用，1 , 0 熘，l 时，该藻类的1 4 c 吸收和生长 率均下降；o 6 , t g l 二甲基汞对褐指藻，小球藻和衣藻的生长均有抑制。h g 常常 由于试验瓶壁吸收等原因造成损失，一般报道中的h g 的亚致死浓度可能比实际 亚致死浓度更高。 1 4 2 镉 c d 是一种潜在危害的重金属，在水环境中非常稳定，除了直接影响藻类及 其它水生植物外，对整个水生食物链网也具有潜在的威胁。据报道，0 0 8 m g l 浓度的c d 可完全抑制羊角月牙藻的生长；0 1 5 、0 2 0 、0 2 5 m g l 的c d 浓度可使 栅藻的生长稍微下降；o 5 m g l 时，该藻类的生长受到显著影响。5 m g l 的c d ， 纤维藻和斜生栅藻的生长被抑制；小球藻仍能显示一定的生长；当浓度增加到 1 0 m g l 时，3 种绿藻均被杀死。l a s h e o n 的工作表明，0 0 5 m g l 的c d 对天然藻 类的生长无明显影响，而当浓度大于1 , 0 m g l 时，藻类的生长受到严重威胁【2 9 】。 经c d 处理后，纤细裸藻的运动力丧失，细胞变形；美丽星杆藻的色素含量显著 下降。鱼腥藻在暴露到c d9 6 h 后，细胞的光合作用和对n i - h + 的吸收受阻，细胞 内叶绿素和藻胆蛋白的含量降低，m f + 和c a 2 + 的浓度减少，细胞结构发生变化 0 0 1 。另有研究表明，大于0 0 2m g l 的c d 浓度，对岐岖鱼腥藻的生长具有显著 的抑制作用；0 0 6 m g l 时，第十二天，生长被完全中止；1m g l 时，光合作用 和乙炔还原受到明显影响，两者分别在4 和2 0 m g l 时被完全抑制p “c d 在 o 0 3 m g l 和高光强下，对天然浮游植物群落产生急性致毒；当c d 的浓度高于 o 0 5 m g l 时，小球藻的细胞分裂中断，叶绿素合成停止。k l a s s 等人用四尾栅藻 3 l 鼻季硕士学位论文 试验的结果是，6 1 p g lc d 浓度，生长率抑制为显著水平( 卢町0 5 ) ：6 1 # g lc d 浓度时，为极显著水平俨= o o d e 3 2 】，这与上述结果有一定差异。 j o s e p h 等人观察到，9 6 h 后，c d 对水华鱼腥藻的e c 5 0 值是o 1 2 1 , m o l ，当浓 度比e c 值高3 个数量级时，c d 结合到藻类的细胞质和细胞的多磷酸体中，使 多磷酸体中的镁和钙丧失，以致这些细胞内含物的元素组成发生离子变化；他们 用电子显微技术观测到，比e c 5 0 值高1 , 2 ，3 个数量级的c d 都能导致细胞类囊体 的表面体积显著减小，并引起多磷酸体、脂内含物、藻蓝素颗粒等的数目与相对 体积，以及细胞壁层的体积发生改变【3 3 】 s i l v c r b c r g 在研究c d 对几种淡水绿藻结构的影响时发现，镰形纤维藻，蛋白 核小球藻和四尾栅藻暴露到氯化镉后，细胞结构发生明显变化，线粒体内出现大 量的密集颗粒物【州。 1 4 3 铜 痕量的c u 是藻类代谢过程中所必需的，但是，高浓度的c u 对藻类具有毒 。 害作用。c u 主要抑制藻类的生长和光合作用，影响原生质膜的渗透性，使k 从 细胞内丧失；经c u 处理的谷皮菱形藻，光合作用受到的抑制比生长更厉害。c u 对镰形纤维藻光合系统的抑制作用亦十分明显，经2 u n o l 浓度的硫酸铜处理 一定时间后，黑色鞘丝藻的呼吸率增加，细胞内出现许多分散的圆形和空孢形物 体。在高浓度c u 时，小球藻和栅藻的细胞畸变成内含物颗粒粗大的细胞，当转 移到没有c u 的培养基后，大细胞分裂，恢复到正常形态【3 5 】，在c u 浓度为o 0 5 m g l 时，室内培养的栅藻品系，生长率只有对照的7 5 ；而野生种类，即使c u 浓度 升至0 4 m g l ，生长仍然正常；当c u 浓度高达1 s m g l 时，其生长率仅下降3 5 。 过量的c u 还可引起小球藻和水华束丝藻为优势种的天然浮游植物的光合色素消 失。有些资料证明，影响栅藻生长率的c u 浓度为0 2 r a g l ；0 s m g l 时，该藻类 的生长受到严重损害；在o 7 5 m g lc u 时，黄群藻和锥囊藻的生长被完全抑制； 使月牙藻和小球藻的细胞体积减少一半的c u 浓度分别为8 s p g l 和7 0 p g l 。c u 还能使小球藻和纤维藻形成巨细胞；使组囊藻形成球形个体，与正常的形态完全 两样【3 6 1 。b a l l a n 借助电子探测显微分析( e p m a ) 显示，海洋藻类( t e t r a s e l m i ss u e c i c a ) 在s 0 p g lc u 浓度中暴露5 d 之后，其代谢作用受阻，细胞内淀粉消失1 3 7 1 。许多 作者认为，c u 对藻类的毒性与总c u 无关，而与游离c u 离子的浓度关系密切3 ”。 1 4 4 铅 9 d - l 鼻季硕士学位论文 p b 可在藻体内积累并产生毒害作用已被许多学者所验证i 昭4 3 】。在 0 0 5 1 0 m g , lp b 中生长的骨条藻，其生长率、最高产量和细胞呼吸作用均有不同 程度的下降，相反，细胞体积和每个细胞的光合作用强度增加。p b 对单独或混 合培养的三角褐指藻和亚心形扁藻的毒性影响是：在有三角褐指藻的情况下，p b 对亚心形扁藻的毒性极小；对数生长期的亚心形扁藻比静止期的细胞对p b 更敏 感，高浓度的p b 可使该藻类丧失运动能力，最终鞭毛不是变形就是脱落。另有 资料表明，野生型细胞比鞭毛少或无鞭毛的突变型细胞对p b 的忍耐力更强，因 此认为，细胞对p b 的吸收与鞭毛无关。 在有些研究中，藻类显示了对较高p b 浓度的忍耐力，在3 0 m g l p b 浓度时， 9 6 1 1 内栅藻的生长保持良好，随后仅显示生长率的缓慢下降，当p b 的浓度高达 1 0 0m g l 时，藻类仍能正常细胞分裂；但也有作者证明，3 2 m g l 浓度的p b 可 使藻类细胞的叶绿素含量下降1 8 1 。藻类对p b 的高忍耐力，可能是由于p b 离 子容易从细胞壁排出或是高浓度的p b 易于从溶液中沉淀所致。 1 4 5 镍 n i 同样能为藻类积累并抑制藻类的生长。在0 0 0 2 1 0 m g ln i 浓度的实验河 流中，藻类的种类组成发生变化，硅藻种类的多样性和丰度减少，绿藻和蓝藻的 丰度增加；在0 0 5 0 7 m g l 范围内，n i 抑制尖胞栅藻、小球藻、血球藻和卵配 衣藻等的生长】。有人在实验室条件下测定到，降低淡水硅藻5 0 的n i 浓度为 o 1 m g l ，偏缝硅藻在o 1 m g ln i 中，1 4 d 的生物量降到只有对照的1 8 1 在 o 6 m g l 时，水华鱼腥藻的生长也受到抑制。有些藻类对n i 具有较大的忍耐力， o 5 m g l 的n i 对三角褐指藻的生长不发生影响；l m g l 时，生长仅有轻度下降； 念珠藻和组囊藻能忍耐高达1 0 m g l 的总n i ；在1 0 m g ln i 中的小球藻、斜生栅 藻和纤维藻，除生长率有所下降外，无其它任何影响。藻类对n i 的高忍耐力可 能是由于培养基中有降低n i 毒性的鳌合因子存在所致 1 4 6 锌 z n 也是藻类生长代谢必需的微量元素，在保持蛋白核的完整中起着重要作 用。在缺z n 的条件下，裸藻中的蛋白核消失，当添加z n 之后，蛋白核又恢复。 但是过量的z n 对藻类的生长不利，据报道，高浓度的z n 抑制藻类的生长，影 响光合作用，使叶绿素含量下降，以致类胡萝卜素与叶绿素的比率失调。但也有 研究证明，较低浓度的z n 可使海生浮游植物天然群落的光合能力下降【4 5 1 。已经 l o f 弗季硕士学位论文 查明，降低普通小球藻5 0 生长率的z n 浓度为2 4 m g l ，在2 0 m g l 时，小球藻 的生长完全停止。0 8 # g m l 浓度的z n 可使藻类的1 4 c 0 2 吸收率下降6 9 。办 还能导致藻类的渗透性增加，使电介质漏失；甚至引起藻类的形态变异 4 6 1 。 1 5 藻类对重金属的耐性与解毒机理 在长期进化过程中，生物形成了许多调节机制以适应环境中的重金属。对于 藻类而言，主要有以下几方面： 1 5 1 金属结合蛋白( 或多肽) 与藻类重金属耐逆性 1 5 1 1 植物络合素 植物络合素( p h y t o c h e l a t i n s ；p c s ) 是一类由重金属离子诱导的、酶促合成的富 含半胱氨酸的小分子多肽，结构式为的o g l u - c y 啦- g l y ，其中n = 2 1 1 ( 通常为 2 5 ) 。p c s 有许多结构变体，如件g l u c y s ) i i 一卢一舢a ( 也称h o m o - p c ) 、( t g l u c y 一s c r ( 也称h y d r o x y m e t h y l p c ) 、( 3 t g i u - c y s ) n - g i u ( 也称i s o - p c ) 和卜g l u c y s ) t l ( 也称 d e s g i y - p c ) ，人们已相继在一些植物中发现它们的存在 4 7 - 4 9 。p c s 广泛分布于单 子叶植物、双子叶植物、藻类及真菌中h 9 】，尚未见报道动物能合成p c s ，但研究 者已在线虫c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s 和c b r i g g s a e 中发现了与植物和酵母中类似的 编码植物络合素合酶的基因刚。 p c s 在结构上与谷胱甘肽( 7 - g l u - c y s - g l y ；g s h ) 相似，生理、生化和遗传学 研究已证实g s h 是合成p c s 的底物。p c s 由，卜谷氨酰半胱氨酸二肽基转移酶 ( t g l u t a m y l c y s t e i n ed i p e p t i d y lt r a n s p e p t i d a s e ，e c 2 3 2 1 5 ) 即植物络合素合酶 ( p h y t o e h e l a t i ns y n t h a s e ：p c s ) 以g s h 为底物催化合成，而p c s 受重金属离子激 活f 4 7 - 4 9 1 。 到目前为止，尚未见报道表明重金属能诱导原核藻类合成p c s ，诱导真核藻 类产生p c s 的重金属有c d 、c u 、踟、p b 、h g 、n i 和a g 等。在高等植物中， c d 诱导p c s 合成的效应强于其它重金属 4 s l ，但h i r r a t a 等5 1 1 研究发现，z n 诱导 绿藻d u n a l i e l l at e r t i o l e c t a 合成p c s 的能力强于c d 。t s u j i 等僻1 发现，经孙预处 理的d u n a l i e l l at e r t i o l e c t a 对其它重金属( 如c d 、h g 、c u 、p b 和a s ) 的耐性增强， 对过氧化氢和甲基紫精引起的氧化胁迫的耐受能力亦得到提高。有离体实验结果 表明，p c 可作为过氧化氢和超氧阴离子自由基的清除剂，能减轻氧化胁迫阻1 。 1 只季硕士学位论文 重金属与藻类p c s 的研究主要集中于二者的剂量关系。近年来，关于藻类重 金属p c s 复合物的研究引起了一些研究者的兴趣。h u 等1 5 3 佣c d 处理 c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ，经纯化得到两种类型的c d p c s 复合物，即低分子量 ( 1 0 w m o l e c u l a r w e i g h t ，l m w ) 复合物和高分子量( u g h m o l e c u l a r w e i g h t ，h m w ) 复合物，二者的分子量分别为3 2k d a 和5 0k d a ，s 2 - c d 比分别为0 0 1 和0 2 2 。 h m w 复合物由l m w 复合物结合s 厶转化而来，由于l m w 复合物能很快转化为 洲复合物，因此首先检测到h m w 复合物。若初期l m w 复合物富集，则可 作为金属毒害的一个信号。与s 2 。的结合不但使得h m w 复合物能结合更多c d ， 且增加了h m w 复合物的稳定性，而h m w 复合物的形成可能与c y s 的合成和 周转有关。m o r e l l i 等【5 4 悃排斥色谱( s e c ) 、原子吸收光谱( a a s ) 及高效液 相色谱( h p l c ) 研究海洋硅藻p h a e o d a c c y l u mt r i c o r n u t u m 的c d - p c s 复合物， 发现该藻中存在两类c d p c i l 复合物，一类是特定链长的肽与c d 形成的复合物 ( c d p c ，n = 2 - - 6 ) ，另一类是具有酸活性的s 2 结合到c d p c 复合物形成的含 c d s 微晶( e r y s t a l f i t e s ) 的p c 复合物，其分子量大于前者，为8 1 2k d a ，s e - c d 比为0 4 ，均高于h u 等 5 3 】的实验结果。具有酸活性的s 2 结合到c d - p c s 复合物 使得c d s c y s 比从0 6 上升到1 6 ，这表明该复合物结合了更多c d 。镉能与g s h 形成c d - - g s h 复合物，它可转移到y - - ( g l u - c y s ) n g l y 或在p c s 的催化下转移到 c d p c n 复合物形成更稳定的c d - p c u + l 复合物。m o r e l l i 和s c a r a n o 5 5 i 用c d 和p b 处理p t r i c o r n u t u m ，后转入无c d 和p b 的培养基，结果发现p c 含量下降，g s h 含量上升，说明该条件下重金属- - p c s 复合物发生降解。 需要指出的是，并非所有的真核藻类都能合成p c s 。s a t o h 等【5 6 悃h g c h 处 理绿藻t e t r a s e l m i st e t r a t h e l e ，结果没有检测到p c s ，但发现另一种三肽 a r g - a r g g l u ，它能结合h 矿，于是认为它在该藻耐受重金属方面可能起到一定 作用，但它的解毒机理不明。 1 5 i 2 金属硫蛋白 金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n s ；m t s ) 是一类基因编码的低分子量富含半胱 氨酸的金属结合蛋白【5 7 i 。m t 和编码m t 的基因已在动物、植物和蓝藻 s y n c c h o c o c c u s 中发现【矧。m t 具有c y s c y s 、c y s x - c y s 、c y s x x c y s ( x 表示 任何氨基酸) 基序的富含c y s 的结构域，哺乳动物m t 的6 1 个氨基酸中，含有 2 0 个半胱氨酸残基【5 盯。根据m t 中半胱氨酸的排列，将m t 分为三类：c l a s s i m t s l 鼻暮硕士学位论文 含有2 0 个高度保守的半胱氨酸残基，广泛分布于脊椎动物中；c l a s s m t s 中 半胱氨酸没有严格的排列，真菌、植物和无脊椎动物中的m t 均属于此类；c l a s s h im t s 即前述p c s 。最近，c o b b c t t 和g o l d s b r o u g h 【删又将m t s 分为四类。 在蓝藻聚球藻属( s y n e c h o c o c c u a ) 的一些种类中已证实m t s 的存在，由s m t a 基因编码【5 9 1 ，真核藻类只在褐藻f u e u av e s i c u l o c u a 中分离到编码m t 的基卧叫。 目前，有关藻类m t 的研究主要集中于s y n e c h o c o c c u a 。m t 能通过巯基与重金属 离子结合，从而降低重金属的毒性。在高等植物中，许多实验表明m t s 与c u 耐性和稳态有关 s o l ，而蓝藻m t s 可能与z i l 稳态有关，t u m e r 等【6 1 1 证实缺失m t 基因的s y n e c h o c o c c u sp c c7 9 4 2 突变株对z n 高度敏感。t u r n e r 和r o b i n s o n l 6 2 1 用c d 2 + 、z n 2 + 、c u 2 + 、h 矿、c 0 2 + 或n i 2 + 处理s y n c c h o c o c c u sp c c6 3 0 1 ，发现只 有办能显著诱导报告基因的表达。在蓝藻中，由于m t 基因表达效率不高，结 合重金属的能力有刚6 3 1 ，c h e r t 等【6 3 】将哺乳动物的m t - - i 基因导入蓝藻，转基 因藻在6 0 # m c d c h 条件下仍能生长，且m t 蛋白表达效率大大提高，达到每克 鲜藻1 0 4 5 # g ，蓝藻重金属耐受能力得到提高。关于m t s 的确切功能尚不清楚， 一种假说认为m t s 可能作为细胞内重金属离子的贮存库或隔离重金属，另一种 假说认为m t s 作为转运蛋白，能把细胞内某一位点过多的重金属转移到另一需 要重金属或不会引起毒性的位点。最近的研究表明，颤藻o s c i l l a t o r i ab r e v i s 利用 重金属转运体b x a l 将过多的金属离子快速输出细胞作为第一道防线，利用金属 硫蛋白b m t a 螯合重金属作为第二道防线，以缓冲并贮存过多的熏金属，从而提 高重金属耐性【6 4 1 。另外，m t s 也富含巯基，是否具有清除细胞内自由基的作用 也有待探讨。因此，要真正阐明m t s 在蓝藻重金属耐性方面的作用还需进行深 入细致的研究。 1 5 1 3 谷胱甘肽 谷胱甘肽( g s h ) 是机体内非蛋白硫醇的主要来源，含有巯基，能与重金属直 接结合，同时g s h 又是合成p c s 的底物。b s o ( b u t h i o n i n es u l f o x i m i n e ) 是 p e c s 的抑制剂，能抑制p c s 合成。r e d d y 和p r a s a d 6 5 用c d