（遗传学专业论文）硅烷偶联剂修饰的slnps作为基因转移载体的研究.pdf

摘要 目的：纳米基因载体的研制是目前国际纳米生物学与基因治疗研 究领域的重要前沿课题，二氧化硅纳米颗粒( s i l i c an a n o p a r t i c l e s ， s l n p s ) 因其良好的生物相容性，低免疫原性，易制备而展现了非病 毒基因治疗载体新的研究前景。本研究在我室前期的研究基础上【l 】， 通过不同的硅烷偶联剂对不同颗粒大小的商业化s l n p s 进行氨基化 修饰，使得s l n p s 携带正电荷，从而与带负电荷的d n a 相结合，并比 较经修饰后不同颗粒结合d n a 的能力以及运用于基因转染时的差异。 方法：购买2 0 n m 、3 0 n m 粒径的商业化s l n p s ，利用硅烷偶联剂 a e a p s 和g p t s 制备表面偶联氨基基团的二氧化硅纳米颗粒。通过电 镜测定修饰后颗粒粒径、并观察其分散性能；z e t a 电位分析仪检测各 批次纳米颗粒表面z e t a 电位值；凝胶电泳迁移率检测各批次颗粒结合 d n a 的能力，以及延缓d n a 受d n a s ei 的降解作用；选择性能较优的 颗粒转染c n e 一2 细胞和b e l 7 4 0 2 细胞，流式细胞仪检测转染效率， h o e c h s t 3 3 2 5 8 染核检测细胞凋亡水平。 结果：制备三批颗粒，分别命名为a s 2 0 ，g s 2 0 ，g s 3 0 。所有颗 粒粒径在修饰后无显著变化，且分散较均匀；g s 2 0 颗粒z e t a 电位值高 于a s 2 0 和g s 3 0 ，最高电位达+ 3 3 4 m y ，所有修饰后颗粒z e t a 电位值与 对照组均有统计学差异( p o 0 5 ) ；a s 2 0 、g s 2 0 、g s 3 0 与质粒d n a p e g f p ( 4 7 k b ) 完全结合的质量比分别为：1 0 ：1 、2 ：1 、4 ：1 ，以这种质 量比亦能与p h m g f p ( 1 2 2 k b ) 完全结合；在完全结合的情况下，有效 延缓了质粒d n a 受d n a s ei 的降解作用；g s 2 0 颗粒作为基因转移载体 能有效将外源d n a 导入真核细胞，并能正常表达，转染c n e 一2 细胞和 b e l 7 4 0 2 细胞的效率分别为3 4 2 及2 3 ，虽然其转染效率低于商业脂 质体组，但毒性作用也低于脂质体组。 结论：本研究制备得到三种均匀分散的氨基化颗粒，并通过分析 比较，确定经g p t s 修饰，粒径为2 0 n m 的颗粒( g s 2 0 ) 的各项性能均 优于其它两组颗粒，并能有效转染c n e 2 细胞和b e l 7 4 0 2 细胞，且相 对安全，符合作为非病毒基因转移载体的基本要求。 关键词硅烷偶联剂，二氧化硅，纳米颗粒，基因治疗载体 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：n a n o p a r t i c l e sa sg e n et r a n s f e rv e c t o ri sav e r yi m p o r t a n t f r o n t i e rs u b j e c t o f n a n o b i o l o g y a n d g e n et h e r a p y s i l i c a n a n o p a r t i c l e s ( s l n p s ) h a v ea ni n t e r e s t i n gp o t e n t i a l a sd n ac a r r i e s s y s t e md u e t oi t s e a s ys y n t h e s i s ，g o o db i o c o m p a t i b i l i t y a n dl o w i m m u n o g e n i c i t y b a s e do nt h ef o r m e rr e s u l t so fo u rl a b l t h es t u d yw a s c o n d u c t e dt oi d e n t i f yt h et r a n s f e c f i o ne m c e n c yo fd i f f e r e n tc o m m e r c i a l s l n p so fd i f f e r e n ts i z em o d i f i e dw i t ht w ok i n d so fs i l a n ec o u p l i n g a g e n t st oe x p l o r ei t sd n ab a n d i n ga b i l i t y m e t h o d ：c o m m e r c i a ls l n p s ( 2 0 n ma n d3 0 n mi nd i a m e t e r ) w e r e m o d i f i e dw i t hs i l a n ec o u p l i n ga g e n ta e a p sa n dg p t st op r o d u c es i l i c a n a n o p a r t i c l e sw i t ha m i n o s i l a n e s d i a m e t e r sa n dd i s p e r s i o ne x t e n to ft h e p a r t i c l e sw e r em e a s u r e db yt r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p e z e t a p o t e n t i a lo ft h es u r f a c ew e r et e s t e db yz e t ap o t e n t i o m e t r i ca n a l y s e r g e l e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t yw a sa d a p t e dt ot e s tt h eb i n d i n ga b i l i t yo ft h e s e p a r t i c l e st od n aa n dt h e i rp r o t e c t i v ee f f e c to fd n af r o md n a s ei t h e r e s u l t sw e r ec o m p a r e df o rd i f f e r e n c eb e t w e e nd i f f e r e n tp a r t i c l e sm o d i f i e d w i t hv a r i o u ss i l a n ec o u p l i n ga g e n t s p a r t i c l e sw i t hs u p e r i o rp r o p e r t i e s w e r ea p p l i e dt ot r a n s f e c tc n e 一2c e n sa n db e l 7 4 0 2c e l l s t r a n s f e c t i o n e f l j i c i e n c yw a sa n a l y s i s e db yf l o wc y t o m e t r yf o rd i f f e r e n c e m i l e a p o p t o s i so ft h et r a n s f e c t e dc e l l sw a sa n a l y s i s e db yh o e c h s t 3 3 2 5 8t o o b s e r v et h ec y t o t o x i c i t yo ft h em o d i f i e dn a n o p a r t i c l e s r e s u l t s ：t h r e eg r o u pp a r t i c l e sw e r ep r e p a r e db ym i c r o e m u l s i o n m e t h o d ，n a m e da s 2 0 ，g s 2 0 ，g s 3 0r e s p e c t i v e l y w i t ht r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p e ，n os i g n i f i c a n tc h a n g eo ft h ed i a m e t e rh a sb e e n o b s e r v e d ，a n dt h ep a r t i c l e sd i s p e r s e de v e n l y z e t ap o t e n t i o m e t r i ca n a l y s i s s h o w e dt h em a x i m u np o t e n t i a lo fg s 2 0 ，w h i c hr e a c h e d + 3 4 2 m v p o t e n t i a lc u r v ed e m o n s t r a t e dt h et e n d e n c yo fh i g h e rp o t e n t i a lo fg s 2 0 p a r t i c l et h a nt h eo t h e r s t h e r eh a ss i g n i f i c a n c eb e t w e e na l lt h ep o t e n t i a l o fm o d i f i e dp a r i c l e sa n dc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) g e le l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t yt e s tw a si na c c o r d e n c ew i t ht h er e s u l to fz e t ap o t e n t i o m e t r i c a n a l y s i s t h em a s sr a t i oo fa s 2 0 、g s 2 0 、g s 3 0t op l a s m i dd n a p e g f p ( 4 7 k b ) f o rc o m p l e t eb i n g d i n gw e r e10 ：1 、2 ：1 、4 ：1r e s p e c t i v e l y m l e nw a s h e db yi n t e n s ea l k a l i ，p e g f pd n ab i n d i n gt oa s 2 0w a s h w a s h e do f f , w h i l ed n ab i n d i n gt og s 2 0r e m a i n e db i n d e d p l a s m i dd n a p h m g f p ( 12 2 k b ) c a na l s ob ec o m p l e t e l yb i n d e da tt h ef o r m e rb i n d i n g r a t i o 珊l e l lf u l l yc o m b i n e dw i t l ld n a ，a nt h ep a r t i c l e ss h o w e dp r o t e c t i v e e f f e c tt od n af r o md n a s ei h o wc y t o m e t r ya n a l y s i ss h o w e dt h a tg s ：2 0 w a sm o r ee f 丘c i e n tf o rc n e 2c e l la n db e l 7 4 0 2c e l lt r a n s f e c t i o nw i t ht h e t r a n s f e c t i o nr a t eo fw e r e3 4 3 a n d2 3 3 5 r e s p e c t i v e l y m l e n t r a n s f e c t e dw i t hg s 2 0a td i 毹r e n tc o n c e m t r a t i o n w ef o u n dt h a tn o r m a l d o s ed i d n tc a u s ec e l la p o p t o s i s ，w h i l et h ed o s ei n c r e a s e df o r10t i m e s ， m i l da p o p t o s i sw a so b s e r v e d c o n c l u s i o n ：i nt h i ss t u d y , 3e v e n l yd i s p e r s e dn a n o p a r t i c l e sw i t h a m i n o s i l a n e sw e r ep r e p p e d n a n o p a r t i c l eg s 2 0 ( 2 0 n mi nd i a m e t e r ) m o d i f i e dw i mg p t sw a ss u p e r i o ri na l la s p e c t sc o m p a r e dw i t ht h eo t h e r s i tw a sa ne f f i c i e n ta n ds a f ev e c t o rf o rt r a n s f e c t i o no fc n e 一2a n db e l 7 4 0 2 c e l l s k e yw o r d ss i l a n ec o u p l i n ga g e n t ，s i l i c an a n o p a r t i c l e s ，g e n e t r a n s f e rv e c t o r 中英文缩略词表 s l n p s s i l i e an a n o p a r t i c l e s n - ( 2 - a m i n o e t h y l ) 一3 一 a e a p s a m i n o p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n e g p t s 3 - g l y c i d o x y p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a u e g f pg r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n l 姒l o n gh o m o l o g o u sa l t u s h as h o r th o m o l o g o u sa r m r tr o o mt e m p e r a t u r e p b s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e k + k a n a m y c i n 硭 a m p i c i l l i n d u l b e c c o s m o d i f i e de a g l e s d m 匣m m e d i u m d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e l p a l y o p r o t e c t i v ea g e n t s h s v h e r p e ss i m p l e xv i r u s f b sf e t a lb o v i n es c r a m hh o u r r a i nm i n u t e r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e v 二氧化硅纳米颗粒 n - ( t 3 氨乙基) 一y 氨丙基三乙氧基 硅烷 缩水甘油醚基丙基三甲基硅烷 绿色荧光蛋白 长同源臂 短同源臂 室温 磷酸盐缓冲液 卡那霉素 氨苄青霉素 达尔伯克( 氏) 改良伊格尔( 氏) 培养 基 二甲亚砜 冷冻干燥保护剂 单纯疱疹病毒 胎牛血清 小时 分钟 转每分钟 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名： 学位论文版权使用授权书 本入了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名： 导师签名日期：年一月一日 硕士学位论文 日吾 1 j l 刚舌 基因治疗是治疗学的巨大进步。外源d n a 由载体介导进入目的细胞后，可 修复遗传错误或产生治疗因子( 如多肽、蛋白质、抗原等) ，从而达到治疗疾病的 目的l 川。1 9 9 0 年美国的b l a e s e t j j 成功地进行了世界上首例临床基因治疗，即腺苷 脱氨酶( a d e n o s i n e d e a m i n a s e ，a d a ) 缺陷病的人体基因治疗。近年来，基因治疗的 研究对象已由原来的遗传病扩展到肿瘤1 4 j 、传染病和心血管1 ) 1 等疾病，而且研究 的重点已转移到肿瘤基因治疗方面旧j 。另外基因治疗方法还可以用于遗传免疫 方面1 ，预防病毒性疾病和肿瘤。在这一领域的研究已取得了重要进展。不言而 喻，基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段，将在一定程度上改变人类疾病治疗 的历史进程。 在基因治疗和基因转染研究中，寻找一种安全、高效的基因导入载体，仍是 目前面临的主要困难。目前，研究和应用较广泛的载体主要有病毒载体，脂质体 载体，人工重组载体等，它们各自存在优缺点( 见表1 ) j 。目前基因治疗临床 前试验中7 5 利用病毒载体例，然而病毒载体虽然高效，但是免疫反应及其安全 性问题阻碍了其规模性的临床应用。特别是近几年病毒载体在临床试验中所导致 的患难事件发生以后u j ，人们力图在非病毒载体的研究与应用中取得突破。 表i 不同载体类型问的比较 碱l b l i e f 删锄a f 删岫嘴o f 簿雠唧淄赫 自纳米技术产生以后，用纳米颗粒，包括纳米胶束、纳米脂质体作为非病毒基 因转移载体，已引起医学界广泛重视。由于纳米粒大小与病毒相仿，具有表面效 应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等特性l l ，使纳米颗粒作为基因载体成为 可能，其原理是载体将d n a ，r n a 、p n a ( 肽核苷酸) ，d s r n a ( 双链) 等基因 治疗分子包裹其中或由静电相互吸引或吸附其表面形成复合物，在细胞摄粒作 用下，纳米颗粒进入细胞内，释放基因治疗分子，发挥其治疗效能厶 1 ( 图1 ) 。目 前，众多科研人员利用纳米颗粒载体己成功地将d n a 转移到不同的细胞，如肝 细胞【1 4 1 、肠细胞【1 5 1 、肿瘤细胞【1 6 1 、有丝分裂期的细胞等【1 7 1 。 硕士学位论文 前言 、“、一o 一卜一 。f 、 矛 隅 冬飞 图1 ：纳米颗粒介导外豫d 眦穿过细胞膜的过程示意图 无机纳米材料如二氧化硅，氧化铁，金等颗粒，作为新型的非病毒载体，由 于具有易合成、生物亲和性高、毒性小、稳定性好等优点l i 引，已经越来越受到 人们的重视。而二氧化硅是一种惰性材料，生物相容性好，表面易于修饰，且在 体内几乎无毒，因此被普遍看好【i 圳。k n e u e r 等i i 训将商业化的二氧化硅纳米颗粒 用带氨基的硅烷偶联剂修饰后，发现由于表面氨基的存在使修饰后颗粒的z e t a 电位带上7 - 3 1 m v 的正电荷，并能紧密结合d n a ，同时能保护d n a 不受d n a 酶d n a s e i 的降解，并将基因有效转入c o s 一7 细胞。i n d r a j i t 等叫1 将二氧化硅纳 米颗粒用氨基化的硅烷偶联剂修饰后，电泳同样检测到d n a 和颗粒紧密结合， 并能保护其不受酶的降解。乙啡啶同型二聚体( e t h d 1 ) 分子探针标记d n a 后， 荧光共振能量转移实验进一步显示出了d n a 黏附颗粒的状态。而颗粒介导经染料 标记的d n a 以及e g f p 质粒后，荧光共聚焦显微镜下可观察到颗粒在细胞核内 的分布以及细胞质中蛋白的表达。 本室前期已经研究探讨了二氧化硅纳米颗粒作为新型基因治疗载体的可行 性，结果表明，适量s l n p s 不会影响细胞的正常生理功能，动物体内实验也显 示无生殖毒性与急性毒性反应，无不良毒理效应，并且评价了不同方法制备和修 饰s l n p s 后的生物学性能，如液相微乳法制备的_ 氧化硅纳米颗粒经高浓度 n a c ! 修饰后能结合d n a ，并能有效地将绿色荧光蛋白基因转入h t l 0 8 0 细胞中 表达，但由于自制的s l n p s 不稳定，颗粒大小不均匀，所携带的正电荷较低 2 o 、 ， 一 、 k 一 莎 一0 令 隆 画 么笈， 硕士学位论文 等不足之处，限制了进一步的应用。因此本研究拟采用商业化的二氧化硅纳米颗 粒，选用两种硅烷偶联剂a e a p s 以及g p t s 对2 0 n m 和3 0 r i m 的s l n p s 进行氨 基化修饰。并通过试验检测颗粒的粒径、分散性，z e t a 电位的大小以及结合d n a 能力，从而评价出最优的修饰方法和颗粒，并将其转染真核细胞，观察修饰后颗 粒作为基因转染载体的可能性，从而为制备合适的二氧化硅纳米颗粒应用于基因 转染打下基础。 3 硕士学位论文 实验仪器及材料 实验仪器及材料 1 、实验仪器 倒置相差显微镜 正压无菌操作系统 c 0 2 培养箱 液氮罐 z e t a 电位分析仪 透射电镜 离心机 电动移液器 移液枪 震荡器 d u6 4 0n u c l e i ca c i da n a l y z e r 真空抽气仪 恒温磁力搅拌器 4 2 0 型恒温空气摇床 恒温水浴箱 流式细胞仪 细胞计数板 恒温箱 制冰机 冷冻干燥仪 7 0 冷藏箱 超声分散仪 电泳仪 d n a 分子成像系统 2 、实验试剂及耗材 0 0 5 胰蛋白酶m 5 3m m o f le d t a 胎牛血清 新生牛血清 甲醇 冰醋酸 无水乙醇 4 z e i s s 公司 苏州康美净化空调设备公司 f o r m a 公司 f o r m a 公司 马尔文公司 日立公司 e p p e n d o f f 公司 e p p e n d o f f 公司 e p p e n d o f f 公司 e p p e n d o f f 公司 b e c k m a n 公司 l a b t e c h 公司 泰斯特仪器公司黍册行仪器公司 f o r m a 公司 t h e r m o 公司 b d 公司 上海生物仪器有限公司 上海跃进医疗器械厂 s c o t s m a n s n u d e r ss c i e n t i f i c s a y n oi t r al o w u l t r a s o n i c b i o - r a d 公司 b i o r a d 公司 g m c o 公司 杭州四季青公司 杭州四季青公司 上海陆都化学试剂厂 上海化学试剂公司 湖南师大化学试剂厂 硕士学位论文实验仪器及材料 乙二胺 乙二醇 异丙醇 d m e m d m s o a e a p s g p t s 琼脂糖( a g a r o s e ) ，低熔点琼脂糖( l m p ) 各种规格一次性吸管 各种规格一次性离心管 各种规格一次性培养瓶( 2 5 c m 2 、7 5 c m 2 、2 2 5 c m 2 ) 各种规格一次性培养孔板( 6 孔、1 2 孔、2 4 孔) 透析袋 1 5 m le p p e n d o r f 管( e p 管) 9 6 0 0p c r 管( o 2 m 1 ) 2 0 n m 3 0 n ms i l i c an a n o p a r t i c l e s 氨水 丙酮 引物 各种限制性内切酶，连接酶 质粒抽提和纯化试剂盒 入d n a h i n dmm a r k e r l o h1 , 1 0 0 u1 , 1 0 0 0 t tl t i p n a h c 0 3 ，n a c l ，k c l ，n a 2 h p 0 4 ，k h 2 p 0 4 n a o h ，h c l ， 胰化蛋白胨、酵母抽提物 h o e c h s t 3 3 2 5 8 l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 5 湖南师大化学试剂厂 湖南师大化学试剂厂 湖南师大化学试剂厂 g 毋c o 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g n m 公司 s i g m a 公司 f a l c o n 公司 f a l c o n 公司 f a l c o n 公司 f a l c o n 公司 科泰生物公司 e p p e n d o r f 公司 e p p e n d o f f 公司 万景新材料有限公司 仙桃市第一化工厂 上海化学试剂有限公司 上海生工生物技术公司 n e b 公司 q i a g e n 公司 t a k a r a 公司 e p p e n d o r f 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 凯基生物 l n v i t r o g e n 公司 硕士学位论文 第一章 第一章两种硅烷偶联剂修饰不同粒径的二氧化硅纳米颗粒 二氧化硅及其复合物在大多数系统里均表现出无毒性。材料化学实验已经证 实二氧化硅纳米颗粒( s l n p s ) 表面可被多种不同的表面修饰物所修饰，从而调 节其许多表面性能，如z e t a 电位，表面活性等。同时二氧化硅纳米颗粒的制各 已经相对成熟，不同粒径大小的颗粒均可通过大型材料公司购得。近年来，越来 越多的学者开始研究纳米水平的二氧化硅颗粒，有学者发现经氨基硅烷修饰的二 氧化硅纳米颗粒可用于基因转移载体的研究，并拟将其应用于基因治疗领域。本 室一直关注二氧化硅纳米颗粒作为基因转移载体的潜能，前期的研究也已表明， 制备的s l n p s 经高浓度n a c l 和a e a p s 修饰后能有效结d n a ，并有效携带绿 色荧光蛋白基因( g 】叩) 进入h t l 0 8 0 细胞表达，动物试验也表明其生物学毒性 较低u 。但自制的s l n p s 由于易发生团聚，且颗粒大小不均等原因还未能很有 效的应用于实际工作中，因此本研究在此基础上，拟采用稳定的商业化二氧化硅 纳米颗粒，通过运用报道的两种有效的硅烷偶联剂( 脚s 及g p t s ) 对小粒径 的两种二氧化硅纳米颗粒( 2 0 n m 3 0 n m ) 表面进行氨基化修饰“引，期望找到 二种有效的颗粒作为基因转移的载体。 1 1 实验技术路线 6 硕士学位论文 第一章 1 2 材料与方法 1 2 1 材料 1 2 1 1 常用试剂配制 1 2 1 24 7 k b 长的质粒载体p e g f p 以及1 2 2 1 6 k b 长的p h r n g f p 质粒载体本室 提供，能够有效地表达绿色荧光蛋白( g f p ) ；j m l 0 9 菌株本室保存。 1 2 2 方法 1 2 2 1a e a p s 修饰2 0 n m 二氧化硅纳米颗粒 基本原理：硅烷偶联剂是一类分子中同时含有两种不同化学性质基团( 有机 官能基团和可水解基团) 的硅烷，由于存在亲有机和亲无机的两种功能团，因此 可以把两种不同化学结构类型和亲和力相差很大的材料在界面连接起来。硅烷偶 7 硕士学位论文第一章 联剂在特定的化学条件下可以和无机二氧化硅材料紧密连接在一起，同时由于 a e a p s 的化学结构中本身存在带正电荷氨基( 图1 1 ) ，因此可使修饰后的二氧 化硅纳米材料表面带上正电，从而使其能通过静电作用结合带负电荷的d n a 。 l l il l 卜鼢卜隆卜o l - 陡童_ o n - si , - r i iil 图1 - 1 ：k l k p s 化学结构图 e p s 化学结构式显示每摩尔l e k p s 分子携带1 摩尔带正电荷的氨基 1 ) 透析袋预处理： 配制1 ll m m o l le d t a ，2 ( w v ) n a h c 0 3 溶液 j 将上述溶液煮沸，并将所需长度的透析袋放至溶液中，沸腾1 0 m i n 上 停止加热，溶液自然冷却，取出透析袋，蒸馏水彻底冲洗 0 再将冲洗后的透析袋放入1 m m o l le d t a 溶液中，煮沸1 0 m i n 0 停止加热，溶液自然冷却，并将透析袋存放于l m m o l le d t a 溶液中， 4 0 c 保存 占 使用前，蒸馏水反复冲洗 2 ) a e a p s 修饰2 0 n m 二氧化硅纳米颗粒制备流程如= ： 2 0 9 含3 0 二氧化硅纳米颗粒的分散液( 2 0 m m 干重6 9 ) ， r t 上 加入去离子h ：o2 0 m l 上 加入冰醋酸1 2 m l j 加入a e a p s 7 2 9 8 硕士学位论文 第一章 上 磁力搅拌1 6 h ，8 0 0 c 上 停止加热，悬液室温自然冷却 上 加入7 , - - 醇2 5 m l 上 真空搅拌2 h ，5 0 0 c 上 将产物装入预处理后的透析袋中，封1 ：3 上 每次用2 0 l 去离子水透析，透析5 次，总时间2 4 h j 将透析后的产物分装至离心管，3 7 0 c ，1 0 0 功率快速超声分散 喜 将产物用0 2 2 u m 针式过滤器过滤所需的体积量 上 并转移至灭菌的e p 管中 占 室温保存 上 颗粒批次命名为a s 2 0 1 2 2 2g p t s 修饰2 0 n m 和3 0 n m 二氧化硅纳米颗粒 基本原理：g p t s 作为一种硅烷偶联剂，同样存在亲有机和亲无机的两种功 能团。因此在特定的化学条件下也可以和无机二氧化硅材料紧密连接，但是g p t s 本身没有携带正电荷的氨基基团，因此单纯g p t s 修饰的二氧化硅纳米颗粒不能 与负电荷的d n a 相结合，故需在反应中加入含氨基较丰富的化学物质，本研究 中选用乙二胺( 图1 - 2 ) 。 9 硕士学位论文 第一章 d 珀i 嘣n b 岭、 g p t s s 技) 2p a i r l i e l e i i m 两啪瞳 l 一、n i - i 图1 - 2 ：6 p t s 修饰二氧化硅纳米颗粒反应示意图 图中可看出二氧删米颗粒经反应携带了带正电荷酶氨基基团 g p t s 修饰2 0 r i m 和3 0 n m 二氧化硅纳米颗粒制备修饰流程如f ： 8 9 含3 0 二氧化硅纳米颗粒的分散液( 2 0 n m 3 0 n m ，干重2 4 9 ) ， r t 上 加入去离子h 。o1 5 0 m 1 上 加入乙二胺1 6 6 m m o l 上 加入g p t s1 6 6 m m o l 0 磁力搅拌7 2 h ，2 2 0 c 上 加入乙二醇6 0 m l 上 真空搅拌2 h ，4 5 0 c 上 将产物装入预处理后的透析袋中，封口 上 去离子水大体积透析，直至电导率平衡 上 透析后溶液分装至离心管中，3 7 0 c ，1 0 0 功率快速超声分散 上 将产物用0 2 2 u r n 针式过滤器过滤所需的体积量 1 0 硕士学位论文 第一章 j 并转移至灭菌的e p 管中 j 室温保存 上 颗粒批次命名为g s 2 0 和g s 3 0 1 2 2 3 颗粒电镜检测 颗粒电镜检测：取2 0 r i m ，3 0 n m 未修饰颗粒各一批，氨基化修饰的颗粒a s 2 0 ， g s 2 0 ，g s 3 0 各取一批，均稀释成2 u g u l 悬液，3 7 。c ，1 0 0 功率快速超声分散，送 中南大学湘雅医学院电镜检测室检测；检测方法：取l o u l 滴至电镜检测用铜网上， 干燥3 0 m i n 后，电镜下观察颗粒大小及分散性。 1 2 2 4 颗粒z e t a 电位检测 取2 0 n m 未修饰颗粒一批，氨基化修饰的颗粒a s 2 0 ，g s 2 0 ，g s 3 0 各取一批， 均稀释成0 2 u e j u l 悬液，修饰颗粒每批均稀释9 份，每份l o m l 。调节每份p n 值至5 o 、 6 0 、7 0 、7 5 、8 0 、8 5 、9 0 、9 5 、1 0 0 。检测前，3 7 0 c ，1 0 0 功率快速超声分 散，送样至中南大学冶金工程学院z e m 电位检测室，进行z e m 电位的检测。数据 结果采用多组间的方差分析，s p s s l l 0 软件进行统计学分析。 1 2 2 5 质粒d n ap e g f p 及p h r n g f p 的转化，抽提 1 ) 感受态制备： 取一干净灭菌的5 0 i i l l 离心管，加入1 0 蚰i j b 培养基，接种1 0 0 i l ( 1 ：1 0 0 ) 初 级j m l 0 9 菌液； 上 固定于摇床上2 8 0r p m ，3 7 振荡培养约1 小时； 上 3 0 0 0r p m ，4 c 离心，1 0 分钟； 占 弃上清，在沉淀中加入1 0i n l 预冷的o 1mc a c l 2 溶液，重悬茵液，放置冰上3 0 分钟； 上 3 0 0 0r p m ，4 c 离心，1 0 分钟； 上 硕士学位论文第一章 弃上清，加入6 0 0o , 1 预冷的的0 1mc a c l 2 溶液，轻悬菌液，放置冰上备用。 2 ) 转化 将1 0 0 n g 质粒d n a1 0 0 u lj m l 0 9 感受态细菌，混匀，冰上放置3 0 分钟； 上 4 2 水浴热击1 分3 0 秒，随即放置冰上2 分钟； 上 加入l m ll b 液体培养基，在摇床上3 7 ，1 8 0 r p m 培养4 5 分钟： 上 r t ，6 0 0 0 r p m 离心2 分钟，收集底部约1 0 0 u l 培养物，打匀，均匀铺于氨苄青霉 素卡那霉素抗性的固体l b 皿上； 上 3 7 温箱培养1 2 1 6h 。 3 ) 质粒载体的手工抽提与酶切鉴定 将2 - 3 m l 含相应抗性的液体l b 加入到1 5 m l 灭菌离心管中，然后接种入一 个单克隆菌落，于3 7 剧烈摇振下培养过夜；取1 5 m l 培养物倒入e p p e n d o f f 管 中，用微量离心机于以1 3 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，将剩余培养物储存于4 c ；用力甩 去培养基；将细菌沉淀重悬于3 0 0 u l 冰预冷的含1 0 0 u g m l 灭活d n a 酶的胰r n a 酶a 的p 1 溶液中，剧烈振荡至完全分散；加入3 0 0 u lp 2 溶液，盖紧管口，迅速 温和地上下颠倒离心管5 6 次，不要振荡，在室温下放置小于5 m i n 的时间；加 入3 0 0 u l 冰预冷得p 3 溶液，盖紧管口，迅速温和地上下颠倒离心管5 6 次，不 要振荡，之后将管置于冰上5 m i r a 用微量离心机于4 以1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ， 将上清转移到另一离心管中；加入6 0 0 u l 一2 0 冰箱中预冷的异丙醇，颠倒混匀， 于4 1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 r n i n ；倒去上清，加入7 0 乙醇约l m l 洗涤双链d n a 沉 淀，弃去上清，点离后用中t i p 将残余的酒精吸净，在空气中使核酸沉淀干燥 5 m i n ；用1 0 2 0 u ld d h 2 0 溶解核酸。 4 ) 质粒载体的大量抽提 用q i a g e n 一卸1 0 0 或q i a g e n t i p 5 0 0 大量抽提纯化p e g f p n 1 和p h r n g f p 质粒。具体方法如下：上述鉴定正确的质粒的保存菌液取适量到1 0 0 m l 或4 0 0 m l 含5 0 u g m l 相应抗性的液体l b 培养基中，于3 7 剧烈摇振下培养1 6 h 以上，取 出1 5 m l 菌液进行少量质粒抽提，并跑胶证实质粒的产量，产量满意方开始大量 抽提。将菌液转移到离心瓶中，b e c k m a nj a 1 0 转头4 c 6 0 0 0 9 离心收集细菌； 加入4 m l 或1 0 m l 含l o o u g i n l 灭活d n a 酶的胰r n a 酶a 的p 1 溶液，剧烈摇振 使其充分重悬，转移到高速离心管中；加入4 m l 或1 0 m lp 2 溶液，快速温和地上 1 2 硕士学位论文 第一童 下颠倒混匀4 - 6 次，在室温下放置5 r a i n 加入4 m l 或1 0 m l 冰预冷的p 3 溶液， 快速温和地上下颠倒混匀4 6 次，在冰上放置2 0 m i r ab e c k m a nj a 2 0 转头于4 以1 4 0 0 0 r p m 高速离心3 0 m i n ，快速将上清转移到另一只高速离心管中，于4 以1 4 0 0 0 r p m 再离心1 5 r a i n ( 此步骤的目的是尽量除去上清中的残余沉淀，也 可作如下替代：先将纱布塞于一只1 0 m l 注射器中制成一个小型过滤器，然后将 上清用注射器推过纱布) ；加入4 m l 或l o m lq b t 缓冲液平衡q i a g e n 一卸1 0 0 或 q i a g e n 卸5 0 0 纯化柱，缓冲液过柱后，将上清过柱；加2 x1 0 m l 或2 x 3 0 m l q c 缓冲液过柱洗杂；加5 m l 或1 5 m l q f 缓冲液过柱洗脱质粒d n a ；将收集的液体 均分至e p p e n d o r f 管中，加入o 7 倍体积室温异丙醇，混匀后于4 c1 2 0 0 0 r p m 离 心3 0 m i n 沉淀质粒d n a ，小心倒弃上清；加入7 0 室温乙醇洗涤d n a 一次， 再以1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 r a i n ，小心倒弃上清；质粒d n a 空气中干燥5 1 0 r a i n ( 注 意不可过于干燥) ，视d n a 产量加入适量无菌水溶解，- 2 0 中冻存备用。 1 2 2 6 颗粒与d n a 结合能力分析 二氧化硅纳米颗粒与d n a 结合基本流程： 适量浓度的纳米颗粒悬液 上 根据结合比例加入适量d n a ，p b s 补至1 0 u l ，轻轻混匀 上 室温静置3 0 m i n 后1 2 0 0 0 r p m ，1 0 r a i n 离心 上 取全部上清，1 琼脂糖凝胶1 0 0 v ，电泳4 0 m i n 上 e b 染色1 5 r a i n 上 b i o r a dg e l x r 扫描仪扫描，q u a n t i t yo n e 软件处理成像及分析结果 ( a ) 未修饰颗粒与修饰后颗粒的结合能力比较：取未修饰的2 0 r i m 二氧化硅 纳米颗粒一批( 简称s 2 0 ) ，和三批修饰后的氨基化二氧化硅纳米颗粒a s 2 0 ， g s 2 0 ，g s 3 0 ，其中未修饰颗粒与d n a 结合质量比取2 0 ：1 ，修饰的颗粒根据z e t a 电位值及预实验结果，确定与d n a 质量结合比分别为1 0 ：1 ，2 ：1 ，4 ：1 。颗粒浓 度均为2 0 u g u l ，按照上述流程方法分别与d n a ( p e g f p ，p h r n g f p , 均为l u g & 1 ) 结合及1 琼脂糖凝胶电泳检测。 1 3 硕1 ：学位论文第一章 ( b ) 同样按( a ) 中的方法进行分组和质量比进行颗粒与d n a ( p e g f piu g u 1 ) 的结合，但孵育3 0 m i n 后悬液不离心，直接取全部悬液进行凝胶电泳检测。以观 察颗粒一d n a 的复合体凝胶迁移的情况，从而反映复合体问结合的强弱。 ( c ) a s 2 0 ，g s 2 0 ，g s 3 0 按前述质量比与d n a ( p e g f pl u g u 1 ) 结合，孵育 3 0 m i n 后，在悬液中加入强碱( 调节悬液p h 值至1 0 0 ) 作用3 0 m i n ，然后取全 部溶液进行凝胶电泳检测。以此验证颗粒d n a 复合体结合的强度，以及受环境 影响的大小，同时也可反证颗粒一d n a 之间形成复合体与否。 ( d ) 调节g s 2 0 不同p h 值至6 0 、7 0 、7 5 、8 0 ，以及在p h = 7 0 时，用 4 0 u lp b s 和d m e m 稀释g s 2 0 然后再结合d n a ，取全部溶液进行凝胶电泳检测。 以观测不同p h 值下，不同的分散相中，g s 2 0 结合d n a 的能力。 1 3