（遗传学专业论文）扇贝染色体的细胞遗传学研究.pdf

扇贝染色体的细胞遗传学研究 摘要 本研究应用染色体显带技术和荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c e ns i t u h y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 技术，对四种扇贝染色体进行了细胞遗传学分析；对栉孔扇 贝和华贵栉孔扇贝，栉孔扇贝和海湾扇贝杂交f l 进行了基因组荧光原位杂交 ( g i s h ) 分析。主要结果如下： 1 分析了c 带，a g - n o r 带，d a p i 带在扇贝染色体上的分布。c 带显示海 湾扇贝所有染色体上都存在阳性带，主要位置为着丝粒区、末端区和中间区。海 湾扇贝的d a p i 带结果与c 带结果相似，阳性带主要位于末端区和中间区。虾夷 扇贝的d a p i 阳性带位置则主要存在于着丝粒区，没有发现末端区和中间区的阳 性带。a g n o r 结果显示海湾扇贝n o r 数目为4 ，位于第3 对亚端部着丝粒染色 体的短臂端部和第1 0 对端部着丝粒染色体的短臂端部；栉孔扇贝的n o r 数目 为2 ，位于第1 0 对亚端部着丝粒染色体短臂端部；另外在栉孔扇贝中发了一个 特别的分裂相，除了第1 0 对亚端部着丝粒染色体出现银染点，第1 2 对亚端部着 丝粒染色体的短臂端部亦出现银染点。 2 研究了重复序列r d n a 的定位 ( 1 ) 1 8 s 2 8 sr d n a 在栉孔扇贝和华贵栉孔扇贝中只有一个位点，而在虾夷扇 贝和海湾扇贝中有两个位点。栉孔扇贝的l8 s 一2 8 sr d n a 定位在第1 0 对亚端部 着丝粒染色体短臂的端部，未发现额外的信号位点；华贵栉孔扇贝的1 8 s 2 8 s r d n a 定位到第1 对中部着丝粒染色体的着丝粒位置处，揭示了华贵栉孔扇贝在 进化过程中可能发生过罗伯逊融合，这条长的中部着丝粒染色体是由两条端部或 亚端部着丝粒染色体融合而成。虾夷扇贝的1 8 s 一2 8 sr d n a 定位到了第1 1 对和 第1 3 对亚端部着丝粒染色体的短臀端部，海湾扇贝的1 8 s - 2 8 sr d n a 定位到第3 对亚端部着丝粒染色体的短臂和第l o 对端部着丝粒染色体的短臂。一般认为 r d n a 的数目随着物种的进化由少变多。虾夷扇贝和海湾扇贝的两个1 8 s 2 8 s r d n a 位点可能是进化过程中发生1 8 s 一2 8 sr d n a 复制产生的。因此推测在分析 的这四种扇贝中，栉孔扇贝的进化地位是最古老的。 ( 2 ) 5 sr d n a 在栉孔扇贝和虾夷扇贝中有一个位点，在海湾扇贝中有两个邻 近的位点。栉孔扇贝中，5 sr d n a 的杂交信号位于第1 0 对亚端部着丝粒染色体 的长臂中间。虾夷扇贝的5 sr d n a 定位在第1 5 对亚端部着丝粒染色体的长臂中 洲。海湾扇贝5 sr d n a 在第l l 对端部着丝粒染色体的长臂中间有邻近的两簇信 号位点。w a n g 和g u o ( 2 0 0 4 ) 的结果显示海湾扇贝的5 sr d n a 位于一对端部 着丝粒染色体的长臂中间，有一个信号位点。本文的结果与之略有不同，5 sr d n a 在染色体上存在两个邻近的位点。推测这种差异可能是由染色体的凝缩程度不同 导致，染色体上存在两簇距离很近的5 sr d n a ，如果染色体凝缩得比较厉害，则 两簇5 sr d n a 信号靠在一起。被误认为是一个5 sr d n a 位点，这种情况在我们 的实验中也观察到。 ( 3 ) 应用顺序一荧光原为杂交将1 8 s 2 8 sr d n a 和5 sr d n a 定位到同一个染 色体分裂相，检测两种r d n a 在染色体上的位置关系。结果显示：海湾扇贝的两 种核糖体d n a 定位在3 对不同的染色体上。虾夷扇贝的1 8 s 2 8 sr d n a 和5 s r d n a 同样位于不同的染色体上。 3 脊椎动物端粒序列( t t a g g g ) 。的染色体定位 脊椎动物端粒序y l j ( t t a g g g ) 。的f i s h 信号定位到栉孔扇贝，虾夷扇贝和海 湾扇贝所有染色体的端粒区域，没有发现中问信号的存在，说明该三种扇贝近期 的染色体没有发生重排或者未端融合。另外我们发现端粒信号的强度有所差异， 这种差异既表现在同一条染色体的两条姊妹染色单体之间，也表现在不同的染色 体之间。 4 杂交扇贝予代染色体构成分析 利用g i s h 方法对栉孔扇贝早华贵栉孑l 扇贝6 子代幼虫进行了检测，结果 表明子代中超过7 4 的分裂相含有3 5 条染色体。利用华贵栉孔扇贝基因组探针 作杂交，分裂相中有1 6 条染色体被稳定地涂染成绿色，符合华贵栉孔扇贝亲本 染色体的单套数目( n = 1 6 ) ；利用栉孔扇贝基因组探针作杂交时，分裂相中有1 9 条染色体被涂染成绿色，也符合栉孔扇贝亲本染色体的单套数目( n = 1 9 ) 。实验中 我们没有发现明显的染色体丢失、断裂及重组等现象，也没有发现单倍型的染色 体分裂相( n = 1 6 或n = 1 9 ) 的出现。但我们检测到了约1 - 2 异源多倍体的分裂 相，g i s h 分析后发现这些分裂相是由单倍的华贵栉孔扇贝的染色体和多倍的栉 孔扇贝染色体组成，比如论文中图示了一个异源四倍体的分裂相，它是由单倍的 华贵栉孔扇贝的染色体( n = 1 6 ) 和三倍的栉孔扇贝染色体( 3 n = 5 7 ) 组成。 对栉孔扇贝早海湾扇贝6 子代幼虫进行g i s h 检测，6 8 的分裂相显示3 5 条染色体。利用栉孔扇贝基因组探针做杂交时，分裂相中有1 9 条染色体被稳定 的涂染成黄绿色，符合栉孔扇贝亲本染色体的单套数目( n = 1 9 ) ：利用海湾扇贝 基因组作杂交时，分裂相中有1 6 条染色体被涂染成黄绿色，也符合海湾扇贝亲 本染色体的单套数目( n = 1 6 ) 。我们可以下这样的定论，大多数子代的担轮幼虫 的染色体构成仍然符合理论预期型( 2 n = 3 m + 5 s m + 1 5 s t + 1 2 t ) ，即其基因组染色体 是由亲本扇贝的单套基因组染色体构成的，子代分别继承了母本和父本各一套染 色体。 关键词：扇贝杂交核型带型荧光原位杂交 c y t o g e n e t icc h a r a c t e riz a tio no fs c aiio pc h r o m o s o m e s a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , t h et r a d i t i o n a lb a n d i n gt e c h n i q u e sa n df l u o r e s c e n c ei ns i t u h y b r i d i z a t i o n ( f i s h lw e r eu s e dt oc h a r a c t e r i z ea n di d e n t i f yt h ec h r o m o s o m e so f s c a l l o p s ，g e n o m ec o m p o n e n t so fi n t e r s p e c i f i ch y b r i d f i o fc h l a m y s 角r r e r i m i m a c h l a m y sn o b i l i sa n dc 如r r e r ixa r g o p e c t e ni i r r a d i a n sw e r ea l s oi d e n t i f i e d b yg e n o m i ci ns i t uh y b r i d i z a t i o nf g i s h ) t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ecb a n d i n g ，n o rb a n d i n ga n dd a p ib a n d i n gd i s t r i b u t i o nw e l ea n a l y z e d i ns c a l l o p sc h r o m o s o m e s cb a n d i n go fa i i r r a d i a n sm a i n l yd i s t r i b u t e da tt e l o m e r i c a n dc e n t r o m e r i cr e g i o n s ；s o m ei n t e r s t i t i a lc b a n d sw e r ea l s oo b s e r v e d t h ep a t t e r no f d a p ib a n d i n go f a ti r r a d i a n sw a sa l m o s tc o n s i s t e n tw i t ht h a to fcb a n d i n ga n da l s o m a i l yd i s t r i b u t e da tt e l o m e r i ca n di n t e r s t i t i a lr e g i o n s h o w e v e r , d a p ib a n d i n go f p a t i n o p e c t e ny e s s o e n s i sm a i l yd i s t r i b u t e da tc e n t r o m e r i cr e g i o na n d s i l v e rs t a i n i n g r e v e a l e dt h a tn o r sw e r el o c a t e do nt h es h o r ta l t o so fs u b t e l o m e r i ec h r o m o s o m e3 a n dt e l o m e r i cc h r o m o s m e10o f a ti r r a d i a n s a n do nt h es h o r ta r m so fs u b t e l o m e r i c c h r o m o s o m e1 0o f c 扣r r e r i ，h o w e v e r , i nc 街r r e r t o n em e t a p h a s es p r e a dd i s p l a y e d a na d d i t i o n a ls i l v e rs p o to nt h es h o r ta r mo fs u b t e l o c e n t r i cc h r o m o s o m e1 2 2 c h r o m o s o m a ll o c a l i z a t i o no f r e p e a t e ds e q u e n c e s r d n a 【1 、18 s 2 8 sr d n aw a sa s s i g n e dt oo n el o c u si nc 加r 诧r ia n dm n o b i l i s ，t w o l o c ii np y e s s o e n s i sa n da i i r r a d i a n s i nc 幻r r e 心18 s 一2 8 sr d n a w a sl o c a l i z e do n t h es h o r ta r l t io fs u b t e l o c e n t r i cc h r o m o s o m e10 i nmn o b i l i s 18 s - 2 8 sr d n aw a s l o c a l i z e do nt h ec e n t r o m e r eo fm e t a c e n t r i ec h r o m o s o m e1 ，w h i c hm a yr e f l e c tt h a tt h e r o b e r t s o n i a nf u s i o nh a sh a p p e n e d i np y e s s o e n s i s ，1 8 s 2 8 sr d n aw a sl o c a l i z e do n t h es h o r ta r n lo fs u b t e l o c e n t r i cc h r o m o s o m e1 1a n d1 3 i na ti r r a d i a n s ，1 8 s - 2 8 s r d n aw e r el o c a t e do nt h es h o r ta r m so fs u b t e l o m e r i cc h r o m o s o m e3a n dt e l o m e r i c c h r o m o s m e1 0 i ng e n e r a l ，l o wr d n an u m b e rr e f l e c t so l de v o l u t i o n a r ys t a t u s t h e t w ol o c io f1 8 s 一2 8 sr d n ai npy e s s o e n s i sa n da ti r r a d i a n sm a yr e s u l tf r o m 18 s 一2 8 sr d n a r e p l i c a t i o n a sar e s u l t ，a m o n gt h e s ef o u rs c a l l o p si n t h i ss t u d y , c 如r r e r is h o w e dt h eo l d e s te v o l u t i o n a r ys t a t u s ， ( 2 ) 5 sr d n aw a sa s s i g n e dt oo n el o c u si nc 向r 憎r ia n dpy e s s o e n s i s ，t w ol o c i i na i r r a d i a n s i ncf a r r e r i 5 sr d n aw a sl o c a l i z e do nt h el o n ga r l t lo f s u b t e l o m e r i cc h r o m o s o m e1 0 i np y e s s o e n s i s 5 sr d n aw a sl o c a l i z e do nt h el o n g a r mo fs u b t e l o m e r i cc h r o m o s o m e15 ，i na ，ii r r a d i a n s ，5 sr d n aw a sm a p p e da st w o d i s t i n g u i s h a b l el o c io nt h el o n ga r mo fs u b t e l o m e r i cc h r o m o s o m e11 ，w h i c hw a s d i f f e r e n tf r o mt h ep r e v i o u sr e p o r tw h i c hs h o w e do n l yo n e5 sr d n as i t ei na i r r a d i a n s ( w a n ga n dg u o2 0 0 4 ) t h ed i f f e r e n c em a yr e s u l tf r o mt h ec o n d e n s a t i o n s t a t eo fc h r o m o s o m e s i ti sr e a s o n a b l et oc o n s i d e rt h a tt h e r ea r et w oc l u s t e r so f5 s r d n aa n dt h a tw h e nc h r o m o s o m e sa r ec o n d e n s e do n l yo n es i g n a li sd e t e c t e d ( 3 ) s e q u e n t i a lf i s ho nt h es a m em e t a p h a s ew a su s e dt oe x a m i n et h er e l a t i o n s h i p o fl8 s 2 8 sa n d5 sr d n a t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl8 s 2 8 sa n d5 sr d n aw e r e l o c a t e do nt h r e ed i f f e r e n tp a i r so fc h r o m o s o m e si naii r r a d i a n sa n dt h r e ed i f f e r e n t p a i r so f c h r o m o s o m e si n 尹y e s s o e n s i s 3 c h r o m o s o m a ll o c a l i z a t i o no fv e r t e b r a t et e l o m e r i cs e q u e n c e s ( t t a g g g ) n v e r t e b r a t et e l o m e r i cs e q u e n c e s ，d e t e c t e db yf i s h ，w e r el o c a t e do nb o t he n d so f e a c hc h r o m o s o m eo fc f a m r f py e s s o e m i sa n da i i r r a d i a n s n oi n t e r s t i t i a ls i g n a l w a so b s e r v e do na n yc h r o m o s o m e s ，w h i c hm a yr e f l e c tt h a tt h e r e rw e r en o c h r o m o s o m a lr e a r r a n g e m e n t si nt h e s et h r e es c a l l o p s ，t h es i g n a li n t e n s i t yv a r i e d a m o n gd i f f e r e n tc h r o m o s o m e s 4 c h r o m o s o m ec o m p o n e n t sa n a l y s i so f h y b r i ds c a l l o p s g i s hw a se m p l o y e dt od e t e c td i f f e r e n tc h r o m o s o m ec o m p o n e n t sa n di d e n t i f y d o n o rc h r o m a t i ni nh y b r i d sb e t w e e ncf a r r e r i 膨n o b i l i s6 r e s u l t ss h o w e dt h a t m o r et h a n7 4p e r c e n t a g e so f h y b r i d sc o n m i n3 5c h r o m o s o m e s 1 6c h r o m o s o m e sw e r e d e t e c t e dw i t hg r e e ns i g n a l sb ymn o b i l i s g e n o m ed n aa sp r o b e s ；1 9c h r o m o s o m e s w e r ed e t e c t e dw i t hg r e e ns i g n a l sb ycf a r r e r i g e n o m ed n aa sp r o b e sc o r r e s p o n d i n g t ot h es u mo fc h r o m o s o m e sf r o mt h eh a p l o i dg e n o m e so fmn o b i l i s ( n - 16 ) a n dc 向p r f ( n = i9 ) i nt h i ss t u d y ，t h e r ew a sn o ta n ya b n o r m a lb e h a v i o u ro fc h r o m o s o m e s s u c ha sd e l e t i o n ，b r e a k a g e ，r e c o m b i n a t i o na n ds oo nw a sd e t e c t e d t h e r ew a sa l s on o t a n yh a p l o i dm e t a p h a s e s ( n 2 16o r19 ) w a sd e t e c t e di nh y b r i d s h o w e v e r ，a b o u t1 - 2 m e t a p h a s e so b s e r v e di n t h i ss t u d yw a sa l l o p o l y p l o i dg i s hp r o v e dt h a tt h e yw a s m a d eu po fh a p l o i dg e n o m e so fmn o b i l i s ( n 216 ) a n dt r i p l o i dg e n o m e so fc f a r r e r i f n = 5 7 ) g i s hw a sa l s oe m p l o y e dt od e t e c td i f f e r e n tc h r o m o s o m ec o m p o n e n t sa n d i d e n t i f yd o n o rc h r o m a t i ni nh y b r i d sb e t w e e nc 。f n r r e r i 早ai i r r a d i a n s 毛r e s u l t s s h o w e dt h a tm o r et h a n6 8p e r c e n t a g e so fh y b r i d sc o n t a i n3 5c h r o m o s o m e s 1 6 c h r o m o s o m e sw e r ed e t e c t e dw i t hg r e e ns i g n a l sb ya ，i r r a d i a n s - g e n o m ed n aa s p r o b e s ；1 9c h r o m o s o m e sw e r ed e t e c t e dw i t hg r e e ns i g n a l sb ycf a r r e r i - g e n o m ed n a a sp r o b e s ，c o r r e s p o n d i n gt ot h es u mo fc h r o m o s o m e sf r o mt h eh a p l o i dg e n o m e so f a ti r r a d i a n s ( n 2 1 6 ) a n dc 何陀r i g e n o m ed n a a sar e s u l t ，b yt h ed e v e l o p m e n t a l s t a g eo ft r o c h o p h o r e ，m o s th y b r i d ss t i l lh a dt h ek a r y o t y p eo f2 n = 3 m + 5 s m + 1 5 s t + 1 2 t ， a c c o r d i n gw i t ht h e o r e t i c a le x p e c t a t i o no fh y b r i d s ，w h i c hc r e d i b l e l yp r o v e dt ob ea c o m b i n a t i o no f h a p l o i dg e n o m e s o f b i p a r e n t si nh y b r i d s k a yw o r d s ：s e a ii o p ，h y b r i d i z a t i o r ，k a r y o t y p e b a n d i n g f i s h 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 l 逵；垫遗直基 他盂要挂别重盟的：奎拦卫窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名书蕊奸 签字r 期：7 叩年6 , e l6 同 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签字： 签字r 期： 电话： 邮编： 叼厶 扇m 染色体的鸯胞遗传学研究 0 引言 第一章文献综述弟一早义j 瓢综尬 海洋约占地球总面积的7 1 ，孕育着丰富的生物资源，每年向全世界提供约 9 0 0 0 多力- 吨的渔业产品，为人类的物质生活做出了巨大的贡献。然而，随着海 洋生物资源的大量开发和过度利用以及海洋生态环境的破坏，近年来海洋自然资 源总量呈现出同益衰竭的念势，有些物种甚至到了濒临灭绝的边缘，因此作为开 发和利用海洋生物资源的另一重要途径，海水养殖业越柬越受到世界各国的重 视。我国是海洋大国，海水养殖业有着悠久的历史。但长期以来人们对许多种类 的养殖仍处于半野生半养殖状态，还很少像农作物那样培育出稳定的品系，而另 一些养殖物种则又因累代养殖后出现了种质退化、品质下降及抗逆性降低等问 题，大大制约了我国海水养殖业的发展。 海洋经济贝类是海洋生物中的重要类群，海水贝类的养殖在我国海水养殖业 中扮演着重要角色，据农业部渔业局统计，2 0 0 5 年我国扇贝产量达1 0 3 万吨。 随着近年来海洋贝类养殖业的持续发展，作为其细胞遗传学基础的染色体研究也 同益受到人们的重视。细胞遗传学是贝类遗传育种研究的基础，也是丌展遗传育 种工作的重要理论依据。歼展扇贝染色体的细胞遗传学研究不仅能了解其遗传组 成、遗传变异规律和发育机理，而且有助于近缘物种的鉴定，群落结构的分析、 种族关系及系统分类等有关问题的研究，同时对研究种间杂交和多倍体育种在理 论和实际应用方面都具有重要的意义。栉孔扇贝( 劬a 慢旧f a r r e r i ) ，虾夷扇贝 ( 尸a t i n o p e e t e ny e s s o e n s i s ) ，海湾扇贝( a r g o p e c t e n ，a d i a n s ，r 阳d i a n s ) 和华贵栉孔扇贝( m i m a c h l a m y sn o b i l i s ) 为我国主要的扇贝养殖种类。为了深 入地研究这四种经济贝类的遗传变异和繁殖发育规律，我们必须要有相应细胞遗 传学方面的基础性研究，利用现代生物技术改良我国海水养殖贝类种质资源，培 育生长速度快，抗逆性强的新品种，与前期积累的研究结果相辅相成，为长期的 良种选育打下降实的理论基础。 扇必染色埘= 的细胞遗传学研究 1 细胞遗传学研究的基础染色体研究 无论是病毒、细菌还是高等动物，它们的遗传物质都是以特定形式组织起来， 成为一条或数条染色体。染色体是细胞生理功能的发动者，是主要遗传物质的载 体，它在细胞分裂过程中的形态和结构均表现出一系列规律性的变化。在尚未分 裂的核中，可以见到许多被碱性染料染成较深的、纤维状的网状物，这就是细胞 分裂间期遗传物质的存在形式，被称为染色质。当细胞分裂时，核内的染色质便 凝缩成现为一定数目和形态的染色体。 染色体研究包括核型分析和带型分析，核型分析不仅有助于阐明物种的亲缘 关系、系统分类、群体遗传结构等，而且也是育种学的基础；带型分析可以明确 鉴别一个核型中的任何一条染色体或某个易位片段，帮助探讨物种的核型进化关 系及可能的进化机制，带型分析与荧光原位杂交技术( f i s h ) 结合还可用于染 色体基因定位，提高基因定位的准确性。近年发展起来的染色体显带微切割技术， 已成为细胞遗传学与分子遗传学之i 日j 的重要联系纽带。 传统细胞遗传学随着染色体制备技术和观察方法的发展而建立，并不断吸收 现代分子生物学的思想和技术，发展非常迅速。染色体研究正是作为遗传学的一 个分支成为细胞遗传学研究的中心。上世纪七十年代染色体显带技术及八十年代 高分辨率染色体制备技术的出现和应用，为加速细胞遗传学的发展提供了又一契 机：八十年代末九十年代初期染色体原位杂交及其相关分子生物技术的发展为人 们研究染色体提供了更为有效的手段，将再一次大大的加快细胞遗传学的发展步 伐，使经典细胞遗传学研究进入了一个崭新的时期分子细胞遗传学时期。 1 1 染色体核型分析 所谓核型( k a r y o t y p e ) 是指把动物、植物、真菌等的某一种有机体或某一 分类群的体细胞内整套染色体拍摄下来，按照他们相对恒定特征排列起来的图 像。核型模式图是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按 长短、形态等特征排列起来的图像。 在染色体核型分析时，首先将分散好的中期染色体进行显微摄影，测量每一 条染色体的短臂和长臂的长度，计算相对长度( r e l a t i v el e n g t h ) 、臂比( a r m 扇贝染色体的细胞遗传学研究 r a t i o ) 和着丝粒指数( c e n t r o m e r i cin d e x ) 等参数束描述每条染色体。计算 公式如下：染色体相对长度= 染色体绝对长度( p + q ) 染色体组总长度1 0 0 ：着 丝粒指数= 短臂长度( p ) 染色体长度( p + q ) 1 0 0 ；臂比= 长臂短臂( q p ) 。 染色体的形态按照l e v a n 等( 1 9 6 4 ) 的标准划分为四类( 表卜1 ) ：臂比指数在 1 ，0 一1 7 之间称之为中部着丝粒染色体( m ) ；在1 7 3 o 之间称之为亚中部着 丝粒染色体( s m ) ；在3 o 一7 0 之问称之为亚端部着丝粒染色体( s t ) ；指数 7 o 称之为端部着丝粒染色体( t ) 。然后，根据染色体的特征找到同源染色体。染色 体核型排列一般是把常染色体排列在前，性染色体排列在后；中部着丝粒染色体 和亚中部着丝粒排列在前，亚端部着丝粒染色体和端部着丝粒染色体排列在后： 同类染色体大的排在前，小的排列在后。 表卜2 染色体类型与臂比，着丝粒指数的关系 染色体核型分析是细胞遗传学研究的基础。核型分析对于研究种内或种间的 核型变化，染色体的数量或结构的变异，生物的起源和进化，以及鉴定染色体疾 病等具有重要的作用。从现存物种的染色体组型研究和比较中来探讨种群的进化 路线和亲缘关系，不仅对于分类学和系统发生研究有着十分重要的意义，而且对 于杂交育种中的杂种鉴定也起到重要作用。 1 2 染色体带型分析 染色体显带技术是一项借助于某些特殊的染色程序使染色体在定部位内 出现深浅不一带纹的细胞学方法。其实质是d n a 、蛋白质和染料之间相互作用 的结果。染色体经过碱、酸、盐或酶等处理后，引起染色体崩解或d n a 片段的 断裂及丢失：由d n a 或蛋白质的差别提取及随后染料在d n a 侧面的堆积导致 带纹产生。 染色体显带技术的建立是细胞遗传学研究中的一项重大突破。1 9 6 9 年瑞典 扇贝染色体的细胞遗传学研究 科学家c a s p e r s s o n 用荧光染料氮芥喹吖因( q u i n a c r i n em u s t a r d ) 技术处理染色体， 使染色体显示出特殊的荧光带型( q 带) ，实验证明亮区相当于d n a 分子中a t 含量相对丰富的区段，暗带则g c 含量相对丰富。该项技术的确立标志了现代 细胞遗传学的建立和发展( c a s p e r s s o n e la 1 1 9 6 8 ) 。从7 0 年代初起，染色体的研 究又盛极一时，许多学者从事染色体显带技术的研究，建立了各种显带方法，常 用的染色体显带技术有：c 带技术( 采用着丝粒英文单词c e n t r o m e r e 的第一个字 母表示) ，n 带或n o r 带技术( 采用核仁组织区英文n u c l e o l a r o r g a n i z e r s 的第一 个字母表示或再加上第二个单词的前两个字母) ，q 带技术( 采用荧光染料氮芥 喹吖因英文单词q u i n a c r i n e 的第一字母表示) ，g 带技术( 采用吉姆萨染料英文 单词g i e m s a 的第一个字母表示) ，r 带技术( 采用相反英文单词r e v e r s e 的第一 个字母表示) ，t 带技术( 采用末端英文单词t e r m i n a l 的第一个字母表示) ，c d 带技术( 采用c e n t r o m e r i cd o t s 的第一个字母表示) ，b g 带技术( 采用5 一溴脱氧 尿嘧啶核苷处理细胞和吉姆萨染色英文单词5 - b r o m o d e o x y u r i n e 和g i e m s a 的第一 个字母表示) ，g 1 1 带技术( 采用吉姆萨英文单词第一个字母在p h i l 条件下染色) 及核酸酶显带技术，d n a 杂交显带技术，抗体显带技术等。 1 2 1c 显带技术 c 带最初是着丝粒异染色质( c e n t r o m e r eh e t e r o c h r o m a t i n ) 带纹的简称。后来为 结构异染色质( c o n s t i t u t i v eh e t e r o c h r o m a t i n ) 带的简称，因主要显示着丝粒处及其 他部位的异染色质，故而得名。c 带技术是2 0 世纪7 0 年代初兴起的一项细胞生 物学技术，它包括对染色体的一系列酸碱处理、热标准枸椽酸溶液( s t a n d a r ds h i n e c i t r a t e ，s s c ) 温育以及随后的吉姆萨染色过程( s u m n e r ，1 9 7 2 ) 。由于结构异染色 质具有大量的d n a 重复序列并且c 显带时染色体要经高温处理，特别是该显带 技术来自于原位杂交，因此人们最初认为c 带中的d n a 虽然也发生了变性，但 由于有较多的重复序列，能快速复性且易被染色。后来人们发现一些作用于蛋白 质而对d n a 无影响的试剂也能产生c 带。现在认为交性d n a 不同程度的退火 仅仅是c 带产生的一个因素，c 带产生的关键原因在于c 显带技术处理过程中， 由于酸、碱、盐溶液的作用，使染色体上的常染色质中的d n a 被抽提掉，而结 构异染色体中的d n a 无论是哪种类型因其同蛋白质结合紧密而被大部分留下 4 扇蚍染色体的细胞遗传学研究 束，从而导致结构异染色质区域被深然显示为c 带( s u m n e r , 1 9 9 0 ) 。 c 带按照其在染色体上位置可分为四种：着丝粒区( c e n t r o m e r i er e g i o n s ) 、近 着丝粒区( p e r i c e n t r i cr e g i o n s ) 、中j 日j 区( i n t e r s t i t i a lr e g i o n s ) 和术端区( t e r m i n a l r e g i o n s ) 。这些带纹具有物种和染色体特异性，即每条染色体上带的数目、部位、 宽窄及深浅等均具有相对的稳定性，可被用束更加有效地鉴别染色体和研究染色 体的结构与功能。其优点是：准确性高，能使特殊的异染色质染色，可用来进行 性别鉴定，以区别某些动物的雌雄，也是当前分带的主要方法。 1 2 2n o r 显带技术 n o r 显带技术是用于显示核仁组织者( n o r s ) 的方法，最初由m a t s u i 和 s a s a k i 报道( m a t s u i 和s a s a k1 9 7 3 ) 。1 9 7 5 年，g o o d p a s t u r e 和b l o o m 发现用操 作较为简单的银染技术既可显示核仁组织区( g o o d p a s t u r e 和b l o o m1 9 7 5 ) 。目前 有多种n o r s 银染色方法，被大家认为方法简便，效果稳定的是h o w e l l 和b l a c k 方法( h o w e l l 和b l a c k ，1 9 8 0 ) 。一般认为硝酸银染色的主要原理为：硝酸银能特 异的染色n o r s 结合的酸性蛋白，使该区域呈黑色。银染色的不是核糖体基因本 身，而是与r d n a 转录有关的一种酸性蛋白。 g o o d p a s t u r e 和b l o o m ( 1 9 7 5 ) 应用称为a g a s 的银染色技术，使9 种哺乳 动物的核仁组织者区( n o r s ) 特异的染为黑色，与h s u 等( 1 9 7 5 ) 用原位分子 杂交得到的结果比较，证明a g - n o r s 也就是1 8 s + 2 8 s 核糖体基因( r d n a ) 的 分布区。不同物种a g n o r s 的位置和数目均不同，甚至同一种动物的不同品种 a g - n o r s 出现的频率也存在多念性。因此，常用这种方法研究物种进化、亲缘 关系，亦有入用做肿瘤、理化因子损伤等的研究。 1 2 30 显带技术 自c a s p e r s s o n 用荧光染料氦芥喹吖咽进行染色体显带后不久，就相继发现了 许多荧光染料用于显示染色体的带型，现有的荧光染料可分为两类：一类是g c 特异性荧光染料，包括色霉素a 3 ( c h r o m o m y c i na 3 ，c m a ) 、光神霉素 ( m i t h r a m y c i n ，m m ) 、及橄榄霉素( o l i v o m y c i n ) ：另一类是a t 特异性荧光染料， 包括喹吖咽( q u i n a e r i n e ) 、道诺霉素( d a u n o m y c i n ) 、d a p i 、h o e c h s t 3 3 2 5 8 ( 王 扇贝粲色体的绑胞遗传学研究 昌留2 0 0 3 ) 。 荧光显带技术应用的前提是染色体的碱基组成是非均匀性的，从而荧光染料 可以专一地同a t 或o c 区段结合。采用荧光显带技术已完成人类全套染色体核 型分析( c a s p e r s s o n 等，1 9 7 0 ) 。另外，多种荧光染料的联合使用加速了染色体 荧光显带技术的发展。比如s c h n e d l 等( 1 9 8 1 ) 等以色霉素a 3 和d a p i 联合染色， 证明猪染色体上分布有两类不同的异染色质。 应用显带技术可以较容易地鉴别每一条染色体，并能深入观察每条染色体上 的区、带及其变异。有了显带技术，不仅能更准确地进行同源染色体的配对和核 型排列，而且能精确的辨认染色体的结构变化，并能正确的识别特定的染色体以 及追溯标记性染色体或超数染色体的来源，探讨生物种属染色体的进化与分化等 问题。 1 3 荧光原位杂交技术 1 3 1 荧光原位杂交技术的原理 荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c e ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 是8 0 年代发展起 来的一种非放射性原位杂交技术，它被广泛用于动、植物的细胞遗传学研究。其 基本原理( 图1 1 ) 是根据d n a 碱基的配对原则，将某d n a 分子标记后，使其 与染色体上相对应的序列杂交。当进行原位杂交时，d n a 分子经过高温或者碱 处理后，发生变性，双链解链产生两条单链；当温度下降或者p h 值恢复到中性， 单链会按照碱基互补配对原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条 单链的来源不同，只要它们之间的碱基序列部分同源，就可以全部或者部分复性， 产生分子杂交。再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检 测d n a 序列在染色体上的位置。目前广泛应用生物素、地高辛等标记d n a 为 探针，其基本方法如下图所示( 王永平2 0 0 1 ) ： 扇贝染色体的细胞遗传学研究 染色体制片，组织切片 j r 探针( 生物素或者地高辛标记) 杂交混合液 l 探针与染色体进行d n a - d n a 杂交 亲合素( 或者抗地高辛抗体) 一荧光素检测系统 j 荧光显微镜观察杂交信号 f i s h 技术弥补了经典原位杂交和染色体带型技术的不足，可以在分子水平 上进行细胞遗传学分析。它除了与放射性原位杂交同样具有灵敏度较高的特